JP2023503479A - Ｃ－ｋｉｔに対する抗体及びその用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、ｃ－ｋｉｔに対する抗体又はその抗原結合断片、これをコーディングする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法、これを含む血管新生疾患の予防又は治療用組成物、及び癌の予防又は治療用組成物に関する。

Description

発明の詳細な説明

〔技術分野〕
本発明は、ｃ－ｋｉｔに対する抗体又はその抗原結合断片、これをコーディングする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法、これを含む血管新生疾患の予防又は治療用組成物、及び癌の予防又は治療用組成物に関する。

〔背景技術〕
血管の生成及び血管透過性の調節は、低酸素症（ｈｙｐｏｘｉａ）と密接な連関性を有する。特に、胚発生段階や、細胞増殖が活発な癌組織、或いは血管が損傷した組織で表れる低酸素症状態は、既存の血管と内皮細胞との間の結合が切れ、透過性が増加する不安定な状態になり、このような状況で血管内皮細胞の増殖及び移動が促進されることによって新たな血管が形成される。このような血管不安定化及び血管新生過程を調節するメカニズムには、低酸素状態でＨＩＦ－１（ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ－１）などの転写因子を通じて差次的に発現される多様な遺伝子が関与すると知られており、これらの遺伝子の相当数は、成長因子／サイトカインで血管内皮細胞の細胞間の結合を減少させ、血管の透過性を高めたり、血管内皮細胞の成長／移動能を促進することによって新生血管を形成する。

非正常的な血管新生及び血管透過性調節過程は、胚発生過程での器官形成のみならず、出生後、成人での数多くの疾病の発生と直結されている。血管新生は、腫瘍の成長のみならず、腫瘍の良性から悪性に発展する原因の一つであり、その他にも、加齢黄斑変性（Ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、糖尿病性網膜症（Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、緑内障（Ｇｌａｕｃｏｍａ）などの眼疾患と、関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、乾癬（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、慢性炎症（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）などの多様な疾患で新生血管の過多形成が報告されている（Ｃａｍｅｌｉｅｔ ａｎｄ Ｊａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，４０７：２４９，２０００）。

一方、血管内皮細胞の成長、移動、分化などの血管形成過程に関与する多数の新生血管促進及び抑制因子が発見された。新生血管形成抑制剤は、作用メカニズムによってマトリックス－分解抑制剤（Ｍａｔｒｉｘ－ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、内皮細胞抑制剤（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、血管生成抑制剤（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）などのいくつかのカテゴリーに分けられるが、このうち、前記血管生成抑制剤には、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ１、ＰＤＧＦＲ、ｃ－ＫＩＴ、ＦＬＴ３などをターゲットにして、これらの活性、信号伝逹、生産などを阻害する各薬物が含まれ得る。

特に、ｃ－ｋｉｔをターゲットにする市販薬物として、グリベック（イマチニブメシル酸塩）及びステント（スニチニブリンゴ酸塩）があるが、これらは、多くのキナーゼを抑制する多重標的治療剤であり、これによる多くの副作用、低い特異性及び生体利用率、抗原性及び不適切な薬物動態などの治療的限界点が報告されている。よって、ｃ－ｋｉｔの活性化による血管新生と関連する疾患に対して、ｃ－ｋｉｔに特異的でありながら副作用がなく、有効な治療剤の開発が要求されている。

このような技術的な背景下で、本出願の発明者等は、ｃ－ｋｉｔに特異的に結合する抗体を開発するために努力した。その結果、本発明者等は、ｃ－ｋｉｔに特異的に結合する抗ｃ－ｋｉｔ抗体を開発し、目的とする血管新生疾患、特に黄斑変性の治療剤としての役割を果たし得ることを確認し、本発明を完成した。

〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明の目的は、ｃ－ｋｉｔに対する新規抗体又はその抗原結合断片を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記核酸を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞及びその製造方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む血管新生疾患の予防又は治療用組成物を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕
前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１の配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４の配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号６の配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、ｃ－ｋｉｔに結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。

また、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸を提供する。

また、本発明は、前記核酸を含むベクターを提供する。

また、本発明は、前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。

また、本発明は、次の段階を含む前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供する：（ａ）前記細胞を培養する段階；及び（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。

また、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む血管新生疾患の予防又は治療用組成物、及び癌の予防及び治療用組成物を提供する。

〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕ＨＵＶＥＣにおいてＳＣＦによる細胞増殖をｃ－ｋｉｔ抗体が濃度依存的に抑制することを示す結果を示した図である。

〔図２〕ｉｎ ｖｉｔｒｏ血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）抑制に対する効能を検証するためにＨＵＶＥＣにｃ－ｋｉｔ抗体を濃度別に処理した結果を示した図である。

〔図３〕ｃ－ｋｉｔ抗体を濃度別に処理した後、ＫＤ値を確認した結果を示した図である。

〔図４〕ｃ－ｋｉｔ抗体のｃ－ｋｉｔに対する結合部位を確認した結果を示した図である。

〔図５〕ｃ－ｋｉｔ抗体のドメインマッピング結果を示した図である。

〔図６〕ｃ－ｋｉｔ抗体の競争ＥＬＩＳＡ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ）結果を示した図である。

〔図７〕ｃ－ｋｉｔ抗体の糖尿病性網膜症及び未熟児網膜症のモデルであるＯＩＲマウスモデルでのｉｎ ｖｉｖｏ効能検証結果を示した図である。

〔図８〕ｃ－ｋｉｔ抗体が黄斑変性モデルで非正常的血管形成を減少させた結果を示した図である。

〔図９〕ｃ－ｋｉｔ抗体が濃度依存的に、ｃ－ｋｉｔ、ａｋｔ、ＥＲＫのリン酸化抑制、ｃ－ｋｉｔのタンパク質及びβ－カテニンタンパク質の減少を示す結果を示した図である。

〔図１０〕ｃ－ｋｉｔ抗体を濃度別に処理した結果、白血病細胞株及び血管内皮細胞においてＳＣＦによる細胞増殖を効果的に抑制することを示す結果を示した図である。

〔発明を実施するための形態〕
別の方式で定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野で熟練した専門家によって通常的に理解されるものと同一の意味を有する。一般に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野でよく知られており、通常的に使用されるものである。

本発明は、一観点において、配列番号１の配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４の配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号６の配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、ｃ－ｋｉｔに結合する抗体又はその抗原結合断片に関する。

本明細書の「ｃ－ｋｉｔ」は、ＣＤ１１７又はＳＣＦＲ（幹細胞因子受容体：ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と命名され得る。ＳＣＦは、細胞と細胞膜関連チロシンキナーゼ受容体を介して信号する糖タンパク質であり、このような信号伝達経路は、陽性及び陰性調節子として造血作用をする。ｃ－ｋｉｔは、リンパ系及び赤血球系に属する成熟細胞の前駆体である多能性造血幹細胞上で発現する。他の造血細胞とは異なり、肥満細胞前駆体及び成熟肥満細胞は、高い水準のｃ－ｋｉｔ発現を維持する。よって、ｃ－ｋｉｔを通じて、ＳＣＦ信号は肥満細胞の発達、機能、生存において必須である。ヒトｃ－ｋｉｔ変異活性化は肥満細胞疾患と関連している。肥満細胞は、血管新生などの持続的供給源を提供できることが報告されている。

本明細書で使用された「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、ｃ－ｋｉｔ、特にｃ－ｋｉｔのドメインＩに特異的に結合する抗ｃ－ｋｉｔ抗体を意味する。本発明の範囲には、ｃ－ｋｉｔ、特にｃ－ｋｉｔのドメインＩ及び／又はＩＩに特異的に結合する完全な抗体形態のみならず、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる。

完全な抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の定常領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。

抗体の抗原結合断片又は抗体断片とは、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）、Ｆ（ａｂ'）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域及び重鎖の１番目の定常領域（ＣＨ１）を有する構造であり、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ'は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ－末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと相違する。Ｆ（ａｂ'）２抗体は、Ｆａｂ'のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有している最小の抗体断片である。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ、ｓｃＦｖ）は、一般に、ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とが共有結合で連結されたり、又はＣ－末端で直ぐ連結されており、二重鎖Ｆｖのようにダイマーと同じ構造をなすことができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体の抗体をパパインで制限・切断するとＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ'）２断片を得ることができる。）、遺伝子組換え技術を通じて製作することもできる。

一つの実施例において、本発明に係る抗体は、Ｆｖ形態（例えば、ｓｃＦｖ）であったり、完全な抗体形態である。また、重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）のうちいずれか一つのアイソタイプから選択され得る。例えば、定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）又はガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ型であり得る。

本明細書で使用される「重鎖」という用語は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ＶＨ、及び３個の定常領域ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びその断片を全て意味する。また、本明細書で使用される「軽鎖」という用語は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ＶＬ及び定常領域ＣＬを含む全長軽鎖及びその断片を全て意味する。

本発明の抗体は、単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、又は前記各抗体のエピトープ結合断片などを含むが、これに限定されない。

前記単一クローン抗体は、実質的に同質的抗体集団から収得した抗体、すなわち、集団を占めている個々の抗体が微量で存在する可能性のある天然発生的突然変異を除いては、同一のものを称する。単一クローン抗体は、高度に特異的であるので、単一抗原部位に対抗して誘導される。典型的に相違する決定因子（エピトープ）に対して指示された相違する抗体を含む通常の（ポリクロナール）抗体製剤とは対照的に、それぞれのモノクロナール抗体は、抗原上の単一決定因子に対して指示される。

「エピトープ」は、抗体が特異的に結合できるタンパク質決定部位（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を意味する。エピトープは、通常、化学的に活性である表面分子群、例えば、アミノ酸又は糖側鎖で構成され、一般に、特定の３次元の構造的特徴のみならず、特定の電荷特性を有する。立体的エピトープ及び非立体的エピトープは、変性溶媒の存在下で電子に対する結合は消失するが、後者に対しては消失しないという点で区別される。

本発明に係る抗体は、ｃ－ｋｉｔのドメインＩ及び／又はドメインＩＩに結合し、例えば、配列番号１１のｃ－ｋｉｔのうちドメインＩのＲ４９からドメインＩＩのＣ１８６の部位まで結合することを確認した。

前記「ヒト化」形態の非ヒト（例：ミュリン）抗体は、非ヒト免疫グロブリンから由来した最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、受容者の超可変領域からの残基を、目的とする特異性、親和性及び能力を保有している非ヒト種（供与者抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類の超可変領域からの残基に取り替えたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。

前記「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンから由来する分子であり、相補性決定領域及び構造領域を含む抗体を構成する全てのアミノ酸配列全体がヒトの免疫グロブリンで構成されていることを意味する。

重鎖及び／又は軽鎖の一部が特別な種から由来したり、特別な抗体のクラス又はサブクラスに属する抗体内の相応する配列と同一であったり、これと相同性を有する一方で、残りの鎖が他の種から由来したり、他の抗体のクラス又はサブクラスに属する抗体内の相応する配列と同一であったり、これと相同性を有する「キメラ」抗体（免疫グロブリン）のみならず、目的とする生物学的活性を示す前記抗体の断片が含まれる。

本願に使用された「抗体可変領域」は、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及び骨格領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖及び重鎖部分を称する。ＶＨは重鎖の可変領域を称し、ＶＬは軽鎖の可変領域を称する。

「相補性決定領域」（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、抗原結合のために必要な存在である、抗体可変領域のアミノ酸残基を称する。各可変領域は、典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として確認された３個のＣＤＲ領域を有する。

本発明において、前記ｃ－ｋｉｔに結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１の配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号４の配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号６の配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。

「骨格領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変領域残基である。各可変領域は、典型的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として確認された４個のＦＲを有する。

「Ｆｖ」断片は、完全な抗体認識及び結合部位を含有する抗体断片である。このような領域は、１個の重鎖可変領域と１個の軽鎖可変領域が、例えば、ｓｃＦｖで堅固に事実上共有的に連合された二量体からなる。

「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変及び定常領域と、重鎖の可変及び第１定常領域（ＣＨ１）とを含有する。Ｆ（ａｂ'）２抗体断片は、一般に、それらの間にヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端付近に共有的に連結される一対のＦａｂ断片を含む。

「単一鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含むが、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖内に存在する。Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために目的とする構造を形成できるようにするＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含むことができる。

ｃ－ｋｉｔ抗体は、１価又は２価であり、単鎖又は二重鎖を含む。機能的に、ｃ－ｋｉｔ抗体のｃ－ｋｉｔ、特にｃ－ｋｉｔのドメインＩ及び／又はドメイン２に対する結合親和性は、１０^－５Ｍ乃至１０^－１２Ｍの範囲内にある。例えば、ｃ－ｋｉｔ抗体の結合親和性は、１０^－６Ｍ乃至１０^－１２Ｍ、１０^－７Ｍ乃至１０^－１２Ｍ、１０^－８Ｍ乃至１０^－１２Ｍ、１０^－９Ｍ乃至１０^－１２Ｍ、１０^－５Ｍ乃至１０^－１１Ｍ、１０^－６Ｍ乃至１０^－１１Ｍ、１０^－７Ｍ乃至１０^－１１Ｍ、１０^－８Ｍ乃至１０^－１１Ｍ、１０^－９Ｍ乃至１０^－１１Ｍ、１０^－１０Ｍ乃至１０^－１１Ｍ、１０^－５Ｍ乃至１０^－１０Ｍ、１０^－６Ｍ乃至１０^－１０Ｍ、１０^－７Ｍ乃至１０^－１０Ｍ、１０^－８Ｍ乃至１０^－１０Ｍ、１０^－９Ｍ乃至１０^－１０Ｍ、１０^－５Ｍ乃至１０^－９Ｍ、１０^－６Ｍ乃至１０^－９Ｍ、１０^－７Ｍ乃至１０^－９Ｍ、１０^－８Ｍ乃至１０^－９Ｍ、１０^－５Ｍ乃至１０^－８Ｍ、１０^－６Ｍ乃至１０^－８Ｍ、１０^－７Ｍ乃至１０^－８Ｍ、１０^－５Ｍ乃至１０^－７Ｍ、１０^－６Ｍ乃至１０^－７Ｍ又は１０^－５Ｍ乃至１０^－６Ｍである。

前記ｃ－ｋｉｔに結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号７の配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含むことができる。また、前記ｃ－ｋｉｔに結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８の配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含むことができる。

本発明の抗体又は抗体断片は、ｃ－ｋｉｔを特異的に認識できる範囲内で、本明細書に記載した本発明の抗ｃ－ｋｉｔ抗体の配列のみならず、その生物学的均等物も含むことができる。例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他の生物学的特性をさらに改善させるために、抗体のアミノ酸配列に追加的な変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいて行われる。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、形状及び種類に対する分析により、アルギニン、リシン及びヒスチジンはいずれも陽電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシン及びセリンは類似する大きさを有し；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは類似する形状を有することが分かる。よって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リシン及びヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；そして、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは生物学的に機能均等物であると言える。

上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すると、本発明の抗体又はこれをコーディングする核酸分子は、配列番号に記載した配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解釈される。前記実質的な同一性は、前記のような本発明の配列と任意の他の配列とを最大限対応するようにアラインし、当業界で通常的なアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合、最小９０％の相同性、最も好ましくは、最小９５％の相同性、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を示す配列を意味する。配列を比較するためのアラインメント方法は、当業界に公知となっている。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）は、ＮＢＣＩなどで接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘなどの配列分析プログラムと連動して用いることができる。ＢＬＡＳＴは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能である。このプログラムを用いた配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認することができる。

これに基づいて、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、明細書に記載の明示された配列又は全体と比較して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の相同性を有することができる。このような相同性は、当業界に公知となった方法による配列比較及び／又は整列によって決定され得る。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ ２．０）、手動整列、肉眼検査を用いて本発明の核酸又はタンパク質のパーセント配列相同性を決定することができる。

本発明は、他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸に関する。

本発明の抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸を分離し、抗体又はその抗原結合断片を組換えて生産することができる。核酸を分離し、これを複製可能なベクター内に挿入して追加的にクローニングしたり（ＤＮＡの増幅）又は追加的に発現させる。これを基にして、本発明は、更に他の観点において、前記核酸を含むベクターに関する。

「核酸」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸での基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドのみならず、糖又は塩基部位が変形した類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖及び軽鎖可変領域をコーディングする核酸の配列は変形し得る。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換又は保存的置換を含む。

前記抗体を暗号化するＤＮＡは、通常の過程を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖を暗号化するＤＮＡと特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に分離又は合成する。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分には、一般に、次のうち一つ以上が含まれるが、それに制限されない：信号配列、複製起点、一つ以上のマーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、及び転写終決配列。

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であり、プラスミドベクター；コズミドベクター；バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ随伴ウィルスベクターなどのウイルスベクター；を含む。前記ベクターで抗体をコーディングする核酸は、プロモーターと作動的に連結されている。

「作動的に連結」は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節するようになる。

原核細胞を宿主とする場合は、転写を進行できる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合位置及び転写／解読終決配列を含むことが一般的である。また、例えば、真核細胞を宿主とする場合は、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例：メタロチオニンプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘログロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が利用可能であり、転写終決配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。

場合によって、ベクターは、それから発現される抗体の精製を容易にするために他の配列と融合されることもある。融合される配列としては、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）などがある。

前記ベクターは、選択標識として当業界で通常的に用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含む。

本発明は、更に他の観点において、前記言及したベクターで形質転換された細胞に関する。本発明の抗体を生成させるために使用された細胞は、原核生物、酵母又は高等真核生物細胞であり得るが、これに制限されない。

エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・サブティリス及びバチルス・チューリンゲンシスなどのバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）及びスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ））などの原核宿主細胞を用いることができる。

ただ、動物細胞に対する関心が最も大きく、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、又はＨＴ１０８０であり得るが、これに制限されない。

本発明は、更に他の観点において、（ａ）前記細胞を培養する段階；及び（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階；を含む前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法に関する。

前記細胞は、各種培地で培養することができる。市販用培地であれば、制限なく培養培地として使用することができる。当業者に公知となっているその他の全ての必須補充物が適当な濃度で含まれる場合もある。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどが、発現のために選別された宿主細胞と共に既に使用されており、これは当業者にとって明白であろう。

前記抗体又はその抗原結合断片の回収時には、例えば、遠心分離又は限外ろ過によって不純物を除去し、その結果物を、例えば、親和性クロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。その他の追加的な精製技術としては、例えば、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどが使用され得る。

本発明は、更に他の観点において、前記抗体を有効成分として含む血管新生疾患の予防又は治療用組成物に関する。

本発明は、例えば、（ａ）本発明に係るｃ－ｋｉｔに対する抗体又はその抗原結合断片の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体；を含む血管新生疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物であり得る。また、本発明は、患者に必要な有効量で本発明に係るｃ－ｋｉｔに対する抗体又はその抗原結合断片を投与する段階を含む血管新生疾患の予防又は治療方法に関する。

血管新生疾患は、血管新生の発生又は進行と関連する疾患を意味する。前記抗体で治療できるなら、その疾病は、限定なく血管新生関連疾患の範囲に含まれ得る。血管新生疾患の例としては、糖尿病性網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、未熟児網膜症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）、角膜移植拒否（ｃｏｒｎｅａｌ ｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、血管新生性緑内障（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ｇｌａｕｃｏｍａ）、全身紅色症（ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｓ）、増殖性網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、血友病性関節症（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、動脈硬化性プラーク（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ）の毛細血管形成、ケロイド（ｋｅｌｏｉｄ）、創部の肉芽形成 （ｗｏｕｎｄ ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）、血管癒着（ｖａｓｃｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ）、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、退行性関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、レステノーシス（ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、腸管癒着（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎｓ）、猫ひっかき病（ｃａｔ ｓｃｒａｔｃｈ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍（ｕｌｃｅｒ）、肝硬変症（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、腎臓炎（ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、糖尿病性腎臓疾患（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、真性糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）、炎症疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ）及び神経変性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）を含むが、これに限定されない。

本発明は、更に他の観点において、前記抗体を有効成分として含む癌の予防又は治療用組成物に関する。

本発明は、例えば、（ａ）本発明に係るｃ－ｋｉｔに対する抗体又はその抗原結合断片の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体；を含む癌の予防又は治療用薬剤学的組成物であり得る。また、本発明は、患者に必要な有効量で本発明に係るｃ－ｋｉｔに対する抗体又はその抗原結合断片を投与する段階を含む癌の予防又は治療方法に関する。

前記癌は、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、大腸癌（ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、直腸癌（ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、睾丸癌（ｔｅｓｔｉｓ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、骨癌（ｂｏｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、結合組織癌（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキンリンパ種（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、リンパ種（ｌｙｍｐｈｏｍａ）及び多発性骨髓血液癌（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｂｌｏｏｄ ｃａｎｃｅｒ）で構成された群から選択されるが、これに限定されない。場合によって、前記癌は、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）状態の癌も含むことができる。

本発明によると、ｃ－ｋｉｔ遺伝子増幅、ｃ－ｋｉｔタンパク質過剰発現、ｃ－ｋｉｔ突然変異によるグリベック抵抗性癌を治療することができる。前記グリベック抵抗性癌は、例えば、白血病、ＧＩＳＴ（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｔｕｍｏｒｓ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）、ＳＣＬＣ（Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ）、ＮＳＣＬＣ（Ｎｏｎ Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ）、神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）、ＧＢＭ（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）、結腸・直腸癌、又は肥満細胞症（ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）であり得る。

場合によって、前記組成物は、線維症（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）の予防又は治療に使用され得る。ｃ－ｋｉｔ陽性細胞（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌ）である肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）が線維症を誘発し得るという多数の研究結果が報告されている。

前記組成物は、上述した本発明の抗ｃ－ｋｉｔ抗体又はその抗原結合断片を有効成分として用いるので、これらの二つの間の共通した内容に対する記載は省略する。

「予防」は、本発明に係る組成物の投与で血管新生疾患を抑制させたり、進行を遅延させる全ての行為を意味し、「治療」は、血管新生疾患発展の抑制、血管新生疾患の軽減又は除去を意味する。

本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されない。本発明の組成物は、前記各成分以外に、湿潤剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。

本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与することができ、非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与及び直腸内投与などがあり得る。

経口投与時、タンパク質又はペプチドが消化されるので、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。また、薬剤学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与され得る。

本発明に係る組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性などの各要因によって多様であり、通常、熟練した医師は、所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。例えば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は０．０００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇである。本明細書において、「薬剤学的有効量」という用語は、癌を予防又は治療するのに十分な量を意味する。

本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量の形態で製造されたり、又は大容量容器内に入り込ませて製造され得る。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であったり、エキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

また、本発明は、抗体又はその抗原結合断片を含む併用投与用組成物に関する。

本発明の組成物は、抗腫瘍Ｔ細胞活性を増加させ、腫瘍細胞を標的化する免疫反応を増大させることができる。その他の抗新生物剤又は免疫原性製剤［（例えば、弱化された癌細胞、腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド及び炭水化物分子を含む）、抗原伝達細胞、例えば、腫瘍起源の抗原又は核酸でパルスされた樹状細胞、免疫刺激サイトキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮα２、ＧＭ－ＣＳＦ）、及び免疫刺激サイトキンを暗号化する遺伝子で形質感染された細胞（例えば、ＧＭ－ＣＳＦを含むが、これに制限されない）]；標準癌治療療法（例えば、化学治療療法、放射線治療療法又は手術）；又はその他の抗体（ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦ受容体、その他の成長因子受容体、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ－４０、４－ＩＢＢ、及びＩＣＯＳを含むが、これに制限されない）と共に使用され得る。

本発明の組成物は、個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次的に又は同時に投与することができる。投与量、投与方法及び他の薬物の種類は、患者の状態によって適宜処方され得る。

本発明は、他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片を含む多重特異的抗体に関する。多重特異的（Ｍｕｌｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体は、四重特異的（Ｔｅｔｒａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、三重特異的（Ｔｒｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体又は二重特異的（Ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を含む。一例として、二重特異的抗体とは、互いに異なる二つの種類の抗原（標的タンパク質）に結合できる抗体を意味し、遺伝工学又は任意の方法によって製造された形態である。

多重特異的抗体は、少なくとも２以上の相違する抗原に対して結合特異性を有する抗体であり、多重特異的抗体に属する各抗体は、ｓｃＦｖ基盤の抗体、Ｆａｂ基盤の抗体及びＩｇＧ基盤の抗体などに区分することができる。二重特異的抗体の場合、二つの信号を同時に抑制又は増幅できるので、一つの信号を抑制／増幅する場合に比べてさらに効果的であり、それぞれの信号をそれぞれの信号抑制剤で処理した場合に比べて低用量投薬が可能であり、同一の時間及び空間での二つの信号を抑制／増幅させることができる。

二重特異的抗体の製造方法は、広く公知となっている。伝統的に、二重特異的抗体の組換え生産は、二つの重鎖が相違する特異性を有するという条件で二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖ペアの共同発現をベースとする。

ｓｃＦｖを基盤にする二重特異的抗体の場合、相違する各ｓｃＦｖのＶＬとＶＨをそれぞれ互いに組み合わせ、混成ｓｃＦｖをヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ）形態で製造することによってダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）を作ることができ、相違するｓｃＦｖを互いに連結することによってテンデム（ｔｅｎｄｅｍ）ＳｃＦｖを製造することができ、ＦａｂのＣＨ１とＣＬをそれぞれのｓｃＦｖの末端に発現させることによってヘテロ二量体のミニ抗体（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）を製造することができ、Ｆｃのホモ二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃ）ドメインであるＣＨ３ドメインの一部のアミノ酸を置換して「ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ」形態のヘテロ二量体構造に変更させ、これらの変更されたＣＨ３ドメインを相違するそれぞれのｓｃＦｖ末端に発現させることによってヘテロ二量体のｓｃＦｖ形態のミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）を製造することができる。

Ｆａｂを基盤にする二重特異的抗体の場合、特定の抗原に対する個別Ｆａｂ'を二硫化結合又は媒介体を用いて互いに組み合わせることによってヘテロ二量体のＦａｂ形態で製造することができ、特定のＦａｂの重鎖又は軽鎖の末端に相違する抗原に対するｓｃＦｖを発現させることによって抗原結合価（ｖａｌｅｎｃｙ）を２個にしたり、ＦａｂとｓｃＦｖとの間にヒンジ部位（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を置くことによってホモ二量体形態で４個の抗原結合価を有するように製造することができる。また、Ｆａｂの軽鎖末端と重鎖末端に相違する抗原に対するｓｃＦｖを融合させることによって抗原に対する結合価を３個にした二重標的バイボディー（ｂｉｂｏｄｙ）、Ｆａｂの軽鎖末端と重鎖末端に相違するｓｃＦｖをそれぞれ融合させることによって抗原に対する結合価を３個にした三重標的バイボディー、相違する３個のＦａｂを化学的に接合させることによって収得することができる。

ＩｇＧを基盤にする二重特異的抗体の場合、Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ社によってマウスとラットハイブリドーマを再び交配し、ハイブリッドハイブリドーマ、いわゆる、クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａｓ）を製造することによって二重特異的抗体を生産する方法が知られている。また、軽鎖部分は共有しながら、相違する重鎖に対してＦｃのＣＨ３ホモ二量体ドメインの一部のアミノ酸を変形させることによってヘテロ二量体形態で製作した、いわゆる、「Ｈｏｌｅｓ ａｎｄ Ｋｎｏｂ」の形態で二重特異的抗体を製造することができる。ヘテロ二量体形態の二重特異的抗体以外に、相違する２種のｓｃＦｖをＩｇＧの軽鎖と重鎖の可変領域の代わりに定常領域にそれぞれ融合・発現させることによってホモ二量体形態の（ｓｃＦｖ）４－ＩｇＧに製造することができる。また、ＩｍＣｌｏｎｅ社は、ヒトＶＥＧＦＲ－２に対するキメリック単クローン抗体であるＩＭＣ－１Ｃ１１を基盤にして、この抗体の軽鎖アミノ末端にマウス血小板誘導成長因子受容体－アルファ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－α）に対する単一可変領域のみを融合させ、二重特異的抗体を製作して報告した。また、タンパク質キナーゼＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ、ＰＫＡ）ＲサブユニットのＤＤＤ（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｏｃｋｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）とＰＫＡのアンカー領域（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を用いた、いわゆる、「ｄｏｃｋ ａｎｄ ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）」方法を通じてＣＤ２０に対する多数の抗原結合価を有する抗体に製作することができる。

本発明は、更に他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片及び薬物を含む抗体－薬物接合体に関する。

抗体－薬物接合体は、ターゲット癌細胞に坑癌薬物を伝達する前まで、坑癌薬物が抗体に安定的に結合されていなければならない。ターゲットに伝達された薬物は、抗体から遊離され、ターゲット細胞の死滅を誘導しなければならない。このために、薬物は、抗体に安定的に結合すると同時に、ターゲット細胞から遊離されるときは、ターゲット細胞の死滅を誘導する十分な細胞毒性を有さなければならない。

前記薬物は、薬理学的効果を示す製剤であり、本発明の抗体又はその切片に結合可能であり、酸性条件によって前記抗体又はその切片と分離され得る。また、前記薬物は、標的細胞に対する治療効果を示す化合物を意味するが、特にこれに制限されなく、細胞毒素（ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ）、放射性同位元素、抗増殖剤、アポトーシス促進剤（ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｇｅｎｔ）、化学療法剤及び治療用核酸になり得るが、これに限定されない。

前記抗体－薬物接合体は、細胞に内在化することができ、抗体依存性細胞毒性を媒介することができる。

「細胞毒性活性」という用語は、抗体－薬物接合体又は抗体－薬物接合体の細胞内代謝物質の細胞－死滅、細胞増殖抑制又は成長抑制効果を意味する。細胞毒性活性は、１／２の細胞が生存する単位体積当たりの濃度（モル又は質量）であるＩＣ５Ｏ値として表現され得る。

「細胞毒素」という用語は、一般に、細胞の機能を抑制したり防止し／したり、細胞を破壊する製剤を言う。代表的な細胞毒素には、抗生剤、チューブリン重合抑制剤、ＤＮＡに結合してこれを破壊するアルキル化剤、タンパク質キナーゼ、ホスファターゼ、トポイソメラーゼ、酵素及びサイクリンなどの必須な細胞タンパク質の機能又はタンパク質合成を破壊する製剤が含まれる。細胞毒素の例は、タキソール、サイトカラシンＢ（ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ Ｂ）、グラミシジンＤ（ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ Ｄ）、エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、エメチン（ｅｍｅｔｉｎｅ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ジヒドロキシアントラセンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ミトラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、１－ジヒドロテストステロン（１－ｄｅｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）、グルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ）、プロカイン（ｐｒｏｃａｉｎｅ）、テトラカイン（ｔｅｔｒａｃａｉｎｅ）、リドカイン（ｌｉｄｏｃａｉｎｅ）、プロプラノロール（ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ）、及びピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）及びこれらの類似体又は同族体が含まれるが、これに制限されない。

放射線療法を適用するために、本発明の抗体は、高エネルギー放射性同位元素を含むことができる。当該同位元素は、例えば、抗体内に存在するシステイン残基で抗体に直接結合できたり、又はキレートを用いて抗体と放射性同位元素との結合を媒介することができる。放射線療法に適した放射性同位元素には、α－放射体、β－放射体及びオージェ電子（ａｕｇｅｒ ｅｌｅｃｔｒｏｎ）が含まれるが、これに制限されない。診断上、適用に有用な放射性同位元素には、陽電子放射体及びγ－放射体が含まれる。

抗増殖剤及びアポトーシス促進剤には、ＰＰＡＲ－ガンマ（例えば、シクロペンテノン型プロスタグランジン（ｃｙＰＧｓ））、レチノイド、トリテルペノイド（例えば、シクロアルタン、ルパン、ウルサン、オレアナン、プリエデラン、ダンマラン、ククルビタシン及びリモノイドトリテルペノイド）、ＥＧＦ受容体の抑制剤（例えば、ＨＥＲ４）、ラパマイシン、ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬ（１，２５－ヒドロキシコレカルシフェロール（ビタミンＤ））、アロマターゼ抑制剤（ＦＥＭＡＲＡ（レトロゾーン））、テロメラーゼ抑制剤、鉄キレート剤（例えば、３－アミノピリジン－２－カルボキシアルデヒドチオセミカルバゾン（トリアピン））、アポプチン（ウイルスタンパク質３－鶏貧血ウイルスからのＶＰ３）、Ｂｃｌ－２及びＢｃｌ－Ｘ（Ｌ）の抑制剤、ＴＮＦ－アルファ、ＦＡＳリガンド、ＴＮＦ－関連アポトーシス－誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）、ＴＮＦ－アルファ／ＦＡＳリガンド／ＴＮＦ－関連アポトーシス－誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）信号伝逹の活性化剤、及びＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ生存経路信号伝逹の抑制剤（例えば、ＵＣＮ－０１及びゲルダナマイシン）が含まれる。

「化学療法剤」は、作用のメカニズムとは関係なく、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の部類は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、紡錘体毒性植物アルカロイド、細胞毒性／抗腫瘍抗生剤、局所異性化酵素抑制物質、抗体、感光剤、そして、キナーゼ抑制物質を含むが、これらに制限されない。化学療法剤は、「標的化された療法」及び伝統的な化学療法に用いられる化合物を含む。

前記接合体は、薬物を抗体又は機能的均等物と結合し、公知の方法で製作することができる。抗体と薬物は、それら自身が有する連結基などを通じて直接結合することもでき、又はリンカーや他の物質を介して間接的に結合することができる。薬物が抗体から切断されるようにする主要メカニズムには、リソソーム（ヒドラゾン、アセタール及びシース－アコニテート－類似アミド）の酸性ｐＨでの加水分解、リソソーム酵素（カテプシン及びその他のリソソーム酵素）によるペプチド切断及びジスルフィドの還元が含まれる。このような多様な切断メカニズムの結果として、薬物を抗体に連結するメカニズムは非常に多様であり、如何なる適切なリンカーも使用可能である。

抗体と薬物とを結合するための適切な連結基は、当該分野に広く公知となっており、例として、二硫化基、チオエーテル基、酸分解性基、光分解性基、ペプチダーゼ分解性基及びエステラーゼ分解性基を含む。

薬物が直接結合される場合、連結基（ｌｉｎｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）は、例として、ＳＨ基を用いた二硫化結合やマレイミドを媒介する結合を挙げることができる。例えば、抗体Ｆｃ領域の分子内の二硫化結合と薬物の二硫化結合を還元し、両者を二硫化結合で連結する。また、マレイミドを通じた方法、及び抗体内にシステインを遺伝工学的に導入する方法もある。

抗体と薬物とを他の物質（リンカー）を介して間接的に結合することもできる。リンカーとしては、抗体、薬物又はこれらの全てと反応する官能基を１又は２種類以上有することが好ましい。官能基の例としては、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、マレイミド基、ピリジニル基などを挙げることができる。

〔実施例〕
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎなく、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。

実施例１．ｃ－ｋｉｔ抗体の製造
１．抗原免疫
Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅから購買した組換えｃ－ｋｉｔタンパク質（ｃａｔ＃ＰＫＳＨ０３０９３９）５０μｇ／マウスを同一の体積の完全フロイントアジュバント（Ｆｒｅｎｄ'ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）（ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）と混合し、エマルジョンを製造した。エマルジョンを７週齢雌ヒト（ｈｕｍａｎ）ＣＤ３４＋細胞注射で製作されたヒト化ＮＳＧマウス６匹の腹腔内に注入した。抗原５０μｇを総体積５００μｌでそれぞれのマウスに注入した。１週及び２週後、それぞれ不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）と抗原とを混合したエマルジョンをマウスの腹腔内に注入した。酵素免疫測定法を実施し、抗体生成を確認した後、細胞融合３日前に再度不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）と抗原とを混合したエマルジョンをマウスの腹腔内に注入した。

２．抗体－生成細胞の確認及び選別
前記記載した方法によって免疫化されたマウスの眼球から血液を採取し、これを１．５ｍｌの微細遠心分離チューブに入れ、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血清を分離し、抗体生成を確認する実験を実施するまで－２０℃で保管した。抗原タンパク質を用いて酵素免疫測定法を実施し、抗体生成を確認した後、抗体－生成マウスの脾臓細胞の融合を実施した。

３．ハイブリドーマの製造
抗体生成を確認した後、マウスを犠牲させ、脾臓細胞を分離して骨髓種細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８０）と融合させた。１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、培養プレート内でマウスのＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞を培養した。細胞融合を実施するために、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳＡ）で２回洗浄し、１Ｘ１０⁷細胞濃度になるように調整した。マウスを頚椎脱臼によって犠牲させ、脾臓を採取した後、メッシュ容器（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）に入れて細胞を分離した。脾臓細胞の懸濁液を製造した後、懸濁液を遠心分離を用いて洗浄した。脾臓細胞溶液をトリス－ＮＨ_４Ｃｌ（トリス２０．６ｇ／Ｌ、ＮＨ_４Ｃｌ ８．３ｇ／Ｌ）に露出させ、赤血球細胞を溶解した。完全に分離された抗体－生成細胞を４００ｇで５分間遠心分離した後、これらは、無血清培地で２回洗浄し、１０ｍｌ培地で再懸濁した。リンパ細胞を血球計を用いて計数し、リンパ球１ｘ１０^８を無血清培地内でＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞１ｘ１０⁷（１０：１）と混合した。遠心分離は、４００ｘｇで５分間実施した。

３７℃で暖められた５０％（Ｍ／Ｖ）ポリエチレングリコール１５００（ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を用いて、１ｍｌの溶液を滴下して１分間混合した。前記製造された融合混合溶液を無血清ＲＰＭＩ１６４０で希釈し、４００ｇで３分間遠心分離した。細胞を２０％ウシ胎児血清及びＨＡＴ（１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジン）を補充したＲＰＭＩ１６４０選択培地３５ｍｌで懸濁した。

懸濁液１００μｌを１日前にフィーダー細胞（ＲＰＭＩ１６４０を使用した腹腔から分離された大食細胞）をコーティングした９６ウェルプレートにローディングし、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。５日後、ＨＡＴ培地は、２日～３日の間隔で交替し、細胞を１４日間培養した。１４日後、２０％ウシ胎児血清及びＨＴ（ＨＡＴから０．４μＭのアミノプテリンを除去した培地）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地を交替して２次培養した。

４．抗体生成融合細胞の選択及び分離
上で融合された細胞培養液の上澄み液を収集し、酵素免疫測定法を実施し、前記製造された抗原に特異的な抗体の製造を確認した。陰性対照群に比べて４倍以上の適正な濃度を示した融合細胞の培養液を選択し、これを２４ウェル培養プレートに移して培養した。さらに、９６ウェルプレートに１ウェル当たり１個の細胞が入るように希釈して（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）培養した後、培養液を回収し、９６ウェルプレートに抗原として使用したｃ－ｋｉｔタンパク質を１ウェル当たり０．１μｇコーティングした後、酵素免疫測定法を実施し、単クローン抗体を生産する融合細胞を選択した。

図１によると、ＨＵＶＥＣでのＳＣＦによる細胞増殖を抗体が濃度依存的に抑制することが示された。

図２によると、抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ血管新生抑制に対する効能を検証するために、ＨＵＶＥＣに抗体を濃度別に処理した結果、０．１μｇ／ｍｌでも強力にｉｎ ｖｉｔｒｏ血管新生を抑制することが示された。

実施例２．ｃ－ｋｉｔ抗体クローニング、分離及び精製
１．抗体配列
抗体をコーディングするＣＤＲ遺伝子をＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔで表１のように確認した。

２．フル（Ｆｕｌｌ）ヒト化抗体クローニング
上で得られた抗ｃ－ｋｉｔ抗体の可変領域をヒトＦｃアミノ酸配列に移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）し、ｐＣＨＯベクター（ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）内にクローニングした。

軽鎖可変領域は、ヒトカッパ定常領域に対するフレーム内に融合させ、重鎖可変領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域に対するフレーム内に融合させた。全長ＩｇＧ１抗体の培地内分泌のためのリーダーペプチド配列を二つの遺伝子に添加し、遺伝子を合成した後、配列分析を通じて再度検証した。ＣＨＯ細胞内で発現試験のために３個のクローンを選択した。３個のクローンに対するグリセロールストックを製造し、エンドトキシンのないプラスミドＤＮＡをＣＨＯ細胞内で発現試験のために製造した。

３．ＣＨＯ細胞への形質感染後、抗体の分離精製
上で得られたプラスミドＤＮＡをＣＨＯ－Ｓ細胞内に形質感染させた。形質感染する１週間前にＣＨＯ－Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０７４３－０２９）をＤＭＥＭ補充血清内の単層培養物内に移した。形質感染する１日前に、細胞を分注した後、形質感染試料に対してＤＮＡ－リポフェクタミン複合体を準備し、一晩中インキュベーターで５％ＣＯ２、３７℃で細胞をインキュベートし、培地を２日～３日に１回ずつ添加しながら一週間にわたって培養した後、培養液を回収し、プロテインＡ／Ｇアガロース（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合した後、ＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．８）で溶出した後、１Ｍのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和させ、再度ＰＢＳで透析した後、－７０℃で保管した。分離・精製された４Ｃ９抗体を６％のＳＤＳ－ＰＡＧＥに非還元及び還元条件で流し、抗体の純度及びサイズを確認した。

実施例３．ｃ－ｋｉｔ抗体親和力検証
抗ｃ－ｋｉｔ抗体がｃ－ｋｉｔに結合する能力を確認するためにＳＰＲを実施した。ＳＲ７５００ＤＣ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ、ＵＳＡ）を用いて、抗体製作のために使用されたヒトｃ－ｋｉｔ（ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ、ＰＫＳＨ０３０９３９）２０μｇをＰＥＧ（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ、ＵＳＡ）チップに固定し、抗体を濃度別に流した後、ＫＤ値をＳｃｒｕｂｂｅｒ２プログラムを用いて分析した。その結果を図３に示した。

実施例４．ドメインマッピング
ヒトｃ－ｋｉｔ遺伝子（ＮＭ＿０００２２２）の欠失変異体（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）（Ｑ２６－Ｐ５２０、Ｄ１１３－Ｐ５２０ＤドメインＩ、Ａ２０７－Ｐ５２０ＤドメインＩ－ＩＩ、Ｋ３１０－Ｐ５２０ＤドメインＩ－ＩＩＩ、Ｔ４１１－Ｐ５２０ＤドメインＩ－ＩＶ）を、ｃ－末端へのＦＬＡＧタグによってＨＥＫ２９３に形質感染した後、培養液で分泌させ、ＦＬＡＧ抗体ビード（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｅａｄ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて精製した後、ＥＬＩＳＡを実施した。その結果を図４に示した。図４によると、抗体は、ドメインＩが欠失したとき、ｃ－ｋｉｔを認知できないことが示され、抗体のｃ－ｋｉｔに対する結合部位はドメインＩであることが示された。

実施例５．ドメインマッピング
ヒトｃ－ｋｉｔ遺伝子（ＮＭ＿０００２２２、配列番号１１）の欠失変異体（Ｑ２６－Ｐ５２０、Ｒ４９－Ｐ５２０、Ｉ７０－Ｐ５２０、Ｋ１００－Ｐ５２０、Ｋ１１６－Ｐ５２０、Ｎ１３０－Ｐ５２０、Ｓ１８７－Ｐ５２０）を、ｃ－末端へのＦＬＡＧタグによってＨＥＫ２９３に形質感染した後、培養液で分泌させ、ＦＬＡＧ抗体ビード（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて精製した後、ＥＬＩＳＡを実施した。

その結果を図５に示した。図５によると、抗体は、ドメインＩのＲ４９からドメインＩＩのＣ１８６の部位まで結合することが示された。特に、ＳＣＦ（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ）の場合、ドメインＩＩのＲ１２２、Ｙ１２５、Ｒ１８１部位に結合することが示されたが、これも、ＳＣＦとｃ－ｋｉｔに対して競争的に結合すると判断される。

９６ウェルプレートに２０ｎｇのｃ－ｋｉｔをコーティングし、ＳＣＦに対して濃度別（２、５、１０、２０、５０、１００μｇ／ｍｌの１００μｌ）に前記抗体（５ｎｇ）を３０分間予め混ぜながら４℃でインキュベートした後、９６ウェルプレートに添加し、抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰを用いてｃ－ｋｉｔに対する競争的なＥＬＩＳＡを実施した。

その結果を図６に示した。図６によると、抗体がＳＣＦと競争的にｃ－ｋｉｔに結合することが示され、ＳＣＦの濃度を１００μｇ／ｍｌまで処理したにもかかわらず、抗体のｃ－ｋｉｔに対する結合を完全に抑制することはできなかった。

実施例６．ｉｎ ｖｉｖｏ効能検証
マウスのＯＩＲ（ｏｘｙｇｅｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）モデルは、 増殖性糖尿病性網膜症と未熟児網膜症の動物モデルに広く用いられている。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを出生後７日から５日間７５％の高酸素環境に露出させた後、再度正常酸素濃度に露出させると非正常的血管が形成されるようになるが、本発明に係るｃ－ｋｉｔ抗体（２μｇ／ｅｙｅ）がＥＹＬＥＡ（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）（２μｇ／ｅｙｅ）より優れた水準で非正常的血管形成を抑制することが示された（図７）。

また、黄斑変性モデルである茶色のノルウェーラット（ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙ ｒａｔ）にレーザーでＣＮＶ（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を誘発した後、ＥＹＬＥＡと本発明に係るｃ－ｋｉｔ抗体に対して硝子体内注入（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を行った結果、４Ｃ９抗体の投与濃度がＥＹＬＥＡに比べて適応容量であるにもかかわらず、黄斑変性による非正常的血管形成をＥＹＬＥＡと同等な水準に減少させた（図８）。

実施例７．抗体によるＳＣＦ／ｃ－ｋｉｔシグナリング抑制能検証
ＳＣＦ／ｃ－ｋｉｔシグナリングは、基本的にＡｋｔのＥＲＫリン酸化を誘導すると知られている。白血病細胞株であるＴＦ－１にＳＣＦを処理したとき、受容体であるｃ－ｋｉｔのリン酸化及びＡｋｔ／ＥＲＫのリン酸化が増加し、本発明に係る抗体によってｃ－ｋｉｔのリン酸化及びＡｋｔとＥＲＫのリン酸化が抑制されることを確認した。特に、前記抗体が濃度依存的にｃ－ｋｉｔのタンパク質を減少させる結果を示した（図９）。

β－カテニンの場合、Ａｋｔ下流シグナル（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｓｉｇｎａｌ）であり、細胞の増殖に重要な因子として知られている。本発明に係る抗体が濃度依存的にβ－カテニンの発現を効果的に抑制することが示された（図９）。

実施例８．抗体によるＨＵＶＥＣとＴＦ－１細胞増殖抑制効果
ＴＦ－１とＨＵＶＥＣに抗体を濃度別に３０分間前処理し、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを処理した後、７２時間後にそれぞれの細胞増殖に対する細胞数のカウント（ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）を通じて細胞増殖率を比較した。

その結果を図１０に示した。図１０によると、ＳＣＦは、陰性対照群に比べて、ＴＦ－１で約２６％、ＨＵＶＥＣで約３０％の細胞数が増加することを観察した。その一方で、前記抗体を濃度別に処理した結果、ＳＣＦによる細胞の増殖を効果的に抑制することを確認した。

〔産業上の利用可能性〕
本発明に係るｃ－ｋｉｔに結合する抗体又はその抗原結合断片は、ｃ－ｋｉｔ、特にドメインＩ及び／又はドメインＩＩに高い親和力で結合しながらも、優れた水準で非正常的血管形成を抑制することができる。これを通じて、本発明に係るｃ－ｋｉｔに結合する抗体又はその抗原結合断片は、目的とする血管新生疾患の予防又は治療に有用に使用可能である。

以上では、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界で通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は好ましい実施様態に過ぎなく、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。よって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物によって定義され得る。

〔配列表フリーテキスト〕
電子ファイルを添付した。

ＨＵＶＥＣにおいてＳＣＦによる細胞増殖をｃ－ｋｉｔ抗体が濃度依存的に抑制することを示す結果を示した図である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）抑制に対する効能を検証するためにＨＵＶＥＣにｃ－ｋｉｔ抗体を濃度別に処理した結果を示した図である。 ｃ－ｋｉｔ抗体を濃度別に処理した後、ＫＤ値を確認した結果を示した図である。 ｃ－ｋｉｔ抗体のｃ－ｋｉｔに対する結合部位を確認した結果を示した図である。 ｃ－ｋｉｔ抗体のドメインマッピング結果を示した図である。 ｃ－ｋｉｔ抗体の競争ＥＬＩＳＡ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ）結果を示した図である。 ｃ－ｋｉｔ抗体の糖尿病性網膜症及び未熟児網膜症のモデルであるＯＩＲマウスモデルでのｉｎ ｖｉｖｏ効能検証結果を示した図である。 ｃ－ｋｉｔ抗体が黄斑変性モデルで非正常的血管形成を減少させた結果を示した図である。 ｃ－ｋｉｔ抗体が濃度依存的に、ｃ－ｋｉｔ、ａｋｔ、ＥＲＫのリン酸化抑制、ｃ－ｋｉｔのタンパク質及びβ－カテニンタンパク質の減少を示す結果を示した図である。 ｃ－ｋｉｔ抗体を濃度別に処理した結果、白血病細胞株及び血管内皮細胞においてＳＣＦによる細胞増殖を効果的に抑制することを示す結果を示した図である。

Claims (11)

1. 配列番号１の配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
   配列番号２の配列を含む重鎖ＣＤＲ２、
   配列番号３の配列を含む重鎖ＣＤＲ３、
   配列番号４の配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
   配列番号５の配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
   配列番号６の配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、ｃ－ｋｉｔに結合する抗体又はその抗原結合断片。
2. 前記抗体は、配列番号１１のｃ－ｋｉｔのうちドメインＩのＲ４９からドメインＩＩのＣ１８６の部位に特異的に結合することを特徴とする、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
3. 前記抗体は、配列番号７の配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
4. 前記抗体は、配列番号８の配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
5. 請求項１乃至請求項４のいずれか１項の抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸。
6. 配列番号９又は配列番号１０の配列を含む、請求項５に記載の核酸。
7. 請求項５の核酸を含む発現ベクター。
8. 請求項７の発現ベクターで形質転換された細胞。
9. 次の段階を含むｃ－ｋｉｔに結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法：
   （ａ）請求項８の細胞を培養する段階；及び
   （ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。
10. 請求項１乃至請求項４のいずれか１項の抗体又はその抗原結合断片を含む血管新生疾患の予防又は治療用組成物。
11. 請求項１乃至請求項４のいずれか１項の抗体又はその抗原結合断片を含む癌の予防又は治療用組成物。

Images