TW202305008A - 三特異性抗體、其製備方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供了一種結構新穎的六價三特異性抗體。本發明中的六價三特異性抗體具有良好的穩定性，不需要進行Fc修飾，不會產生錯誤配對問題，製備方法簡便，並且與單抗相似甚至更優的生物學活性和理化性質。
Description
本發明涉及抗體領域，具體地，涉及一種三特異性抗體、其製備方法和用途。
抗PD-1/PD-L1單株抗體是最早獲得廣泛使用的癌症免疫療法。隨後，雙特異性抗體作為癌症免疫療法出現在人們的視野裡，這些抗體的一端可以與癌細胞表面的抗原結合，另一端與T細胞表面的CD3結合，招募並活化T細胞毒殺癌細胞(例如安進公司的Blinatumomab)。Blinatumomab是一款同時標靶癌細胞表面的CD19抗原和T細胞表面CD3受體的雙特異性抗體，它在治療晚期B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)患者時，能夠將患者的緩解率和生存期翻倍。這類雙特異性抗體能夠有效活化T細胞的抗癌活性。
然而，通常T細胞被活化時，不但CD3媒介的訊息途徑被活化，一種稱為CD28的共刺激受體媒介的訊息途徑也被活化。這種雙重活化能夠保證T細胞維持更長久的抗腫瘤活性。近日在Nature Cancer雜誌上發表的一項研究中(參考文獻：Wu et al., (2019). Trispecific antibodies enhance the therapeutic efficacy of tumor-directed T cells through T cell receptor co-stimulation. Nature Cancer, https://doi.org/10.1038/s43018-019-0004-z)，賽諾菲(Sanofi)公司的研發團隊開發出一款三特異性抗體，它不但能夠與腫瘤相關抗原和T細胞CD3相結合，還能夠與T細胞表面的CD28相結合，從而增強T細胞的抗癌活性。活化CD28受體能夠刺激Bcl-xL蛋白的表現，Bcl-xL可以防止T細胞凋亡，從而延長T細胞的活性。CD28作為共刺激受體已經在CAR-T療法中得到應用。某些CAR-T細胞表現的受體包含著CD3和CD28的共刺激蛋白域。在體外試驗中，與已經獲得批准的抗CD38單株抗體Daratumumab相比，三特異性抗體裂解的癌細胞比例提高了3-4倍。而且在小鼠的多發性骨髓瘤模型中，這款三特異性抗體也能夠劑量依賴性縮小移植到小鼠體內腫瘤的大小。
研究人員仍然需要檢驗這一創新抗體的安全性，刺激T細胞活性的癌症免疫療法的常見副作用是細胞激素釋放症候群，這是由於T細胞被過度活化而造成的。在非人靈長類模型中，這款三特異性療法表現出可控的安全性，不過它的安全性需要在人體和MM (多發性骨髓瘤)患者中得到驗證。
在《Nature》發表的評論(參考文獻：Garfall and June. (2019). Trispecific antibodies offer a third way forward for anticancer immunotherapy. Nature, doi: 10.1038/d41586-019-03495-3)表示，多發性骨髓瘤患者一直需要新的治療手段，因為即使是像CAR-T這樣有效的治療手段，也只能給大多數患者帶來暫時的緩解。三特異性抗體可能提供一種靈活的平臺，根據腫瘤的微環境遞送精準的免疫調節信號組合，從而比由三種單特異性抗體構成的組合療法更為安全和有效。
此外，Numab在US20180355024A1中揭示了其三特異性抗體的設計方法，其特點是由多個ScFv片段和Fv組成。Xencor公司在US20190352416A1中揭示了其三特異性抗體的設計方法，其特點是使用了重鏈異源二聚化技術和ScFv片段。
除了上述產品和涉足公司外，另外還有一些早期研究曾發表在國際知名期刊上。在2017年，一項發表在《Science》期刊上的研究(參考文獻：Liang Xu et al. Trispecific broadly neutralizing HIV antibodies mediate potent SHIV protection in macaques. Science, Published online:20 Sep 2017, doi:10.1126/science.aan8630.)顯示，科學家們已在實驗室開發出一種三特異性抗體，可以讓猴子免受兩種人猴嵌合免疫缺陷病毒(SHIV)菌株的感染。據介紹，這種三特異性抗體將廣泛中和HIV抗體VRC01、PGDM1400和10E8v4的獨特結構結合在一起，三種HIV結合片段源自於三種天然的抗體，每種天然的抗體都強效地中和很多HIV病毒株。使用三特異性抗體治療癌症將是非常重要的概念性突破。由於三特異性抗體是一個靈活的載體，可以在腫瘤微環境中特異性地傳遞免疫調節信號組合，這可能比多個特異性免疫調節單抗的組合更安全有效。因此，這種組合策略有望提高目前免疫療法的精準性和療效，並進一步擴大免疫療法的適用範圍。三特異性抗體能夠同時結合三種不同標的，有望為開發針對HIV感染、其他的傳染病、自身免疫疾病和癌症的治療方法提供有力基礎。
因此，本領域需要開發新型有效的三特異性抗體。
本發明的目的在於提供一種三特異性抗體、其製備方法和用途。
在本發明的第一方面，提供了一種六價三特異性抗體，所述的六價三特異性抗體為二個單體形成的二聚體，其中，每個單體包含重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈；
所述的重鏈從N端至C端包括串聯的針對第一標的的抗體重鏈可變區元件Z1、針對第二標的的抗體重鏈可變區元件Z2、針對第三標的的抗體重鏈可變區元件Z3以及抗體重鏈恆定區Z4；
所述的第一輕鏈和第二輕鏈分別與所述重鏈配合，使得所述的六價三特異性抗體特異性結合於第一標的、第二標的和第三標的。
在另一優選例中，所述的第一輕鏈從N端至C端包括串聯的針對第一標的的抗體輕鏈可變區元件Z5以及針對第二標的的抗體輕鏈可變區元件Z6。
在另一優選例中，所述的第二輕鏈從N端至C端包括串聯的針對第三標的的抗體輕鏈可變區元件Z7以及抗體輕鏈恆定區Z8。
在另一優選例中，所述的抗體重鏈恆定區Z4包括CH1區、CH2區和CH3區。
在另一優選例中，所述的第一輕鏈與抗體重鏈可變區元件Z1和抗體重鏈可變區元件Z2配合；並且所述的第二輕鏈與抗體重鏈可變區元件Z3配合。
在另一優選例中，所述的第二輕鏈還進一步與抗體重鏈恆定區Z4中的CH1區配合。
在另一優選例中，所述的抗體重鏈恆定區Z4來源於標靶第一標的的抗體、標靶第二標的的抗體、或標靶第三標的的抗體。
在另一優選例中，所述的抗體重鏈可變區元件Z1、抗體重鏈可變區元件Z2、抗體重鏈可變區元件Z3和抗體重鏈恆定區Z4各自獨立地為全人的或人源化的。
在另一優選例中，所述的抗體輕鏈可變區元件Z5、抗體輕鏈可變區元件Z6、抗體輕鏈可變區元件Z7和抗體輕鏈恆定區Z8各自獨立地為全人的或人源化的。
在另一優選例中，在所述的抗體重鏈可變區元件Z1、抗體重鏈可變區元件Z2、抗體重鏈可變區元件Z3和抗體重鏈恆定區Z4中相鄰的兩個元件可直接相連或透過連接子連接。
在另一優選例中，所述的抗體輕鏈可變區元件Z5和抗體輕鏈可變區元件Z6可直接相連或透過連接子連接。
在另一優選例中，所述的抗體輕鏈可變區元件Z7和抗體輕鏈恆定區Z8可直接相連或透過連接子連接。
在另一優選例中，所述的連接子包括柔性連接子和剛性連接子。
在另一優選例中，所述的連接子為長度為1-35個胺基酸的胜肽連接子，較佳地6-30個胺基酸的胜肽連接子。
在另一優選例中，所述第一標的、第二標的和第三標的為PD-1、HER-2和LAG-3。
在另一優選例中，第一標的為PD-1，第二標的為HER-2，第三標的為LAG-3。
在另一優選例中，第一標的為HER-2，第二標的為PD-1，第三標的為LAG-3。
在另一優選例中，第一標的為PD-1，第二標的為LAG-3，第三標的為HER-2。
在另一優選例中，第一標的為LAG-3，第二標的為PD-1，第三標的為HER-2。
在另一優選例中，第一標的為HER-2，第二標的為LAG-3，第三標的為PD-1。
在另一優選例中，第一標的為LAG-3，第二標的為HER-2，第三標的為PD-1。
在另一優選例中，所述六價三特異性抗體包含重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈；其中，每個所述的重鏈具有下式I的結構：
Z1-Z2-Z3-Z4 (I)
Z1為針對第一標的的重鏈可變區元件；
Z2為針對第二標的的重鏈可變區元件；
Z3為針對第三標的的重鏈可變區元件；
Z4為抗體重鏈恆定區CH1、CH2和CH3；
“-”各自獨立地為鍵或連接子(linker)；
其中，所述的第一輕鏈和第二輕鏈分別與重鏈配合，使得所述的六價三特異性抗體特異性結合於第一標的、第二標的和第三標的。
在另一優選例中，所述的第一輕鏈與Z1和Z2配合，而第二輕鏈與Z3配合。
在另一優選例中，所述的第一輕鏈還與Z2透過二硫鍵連接。
在另一優選例中，所述的第二輕鏈與Z3和CH1配合，並且第二輕鏈還與CH1透過二硫鍵連接。
在另一優選例中，所述第一輕鏈具有下式II的結構：
Z5-Z6 (II)；
其中，Z5為針對第一標的的輕鏈可變區元件；Z6為針對第二標的的輕鏈可變區元件。
在另一優選例中，所述第二輕鏈具有下式III的結構：
Z7-Z8 (III)；
其中，Z7為針對第三標的的輕鏈可變區元件和Z8為輕鏈恆定區。
在另一優選例中，第一標的為PD-1，第二標的為HER-2，第三標的為LAG-3。
在另一優選例中，第一標的為HER-2，第二標的為PD-1，第三標的為LAG-3。
在另一優選例中，第一標的為PD-1，第二標的為LAG-3，第三標的為HER-2。
在另一優選例中，第一標的為LAG-3，第二標的為PD-1，第三標的為HER-2。
在另一優選例中，第一標的為HER-2，第二標的為LAG-3，第三標的為PD-1。
在另一優選例中，第一標的為LAG-3，第二標的為HER-2，第三標的為PD-1。
在另一優選例中，所述的第一輕鏈具有選自下組的胺基酸序列：SEQ ID NO：15、17或19。
在另一優選例中，所述的第二輕鏈具有如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述重鏈具有選自下組的胺基酸序列：SEQ ID NO：14、16或18。
在另一優選例中，所述六價三特異性抗體為二聚體。
在另一優選例中，所述六價三特異性抗體為同源或異源二聚體。
在另一優選例中，所述六價三特異性抗體包含兩個單體，每個單體含有重鏈和第一輕鏈、和第二輕鏈，其中每個單體具有下式IV結構：
(IV)
式中，
VH
A-L1-VH
B-L2-VH
C-CH1-CH2-CH3為重鏈；
VL
A-L3-VL
B為第一輕鏈；
VL
C-CL為第二輕鏈；
VH
A為針對第一標的的重鏈可變區；
VH
B為針對第二標的的重鏈可變區；
VH
C為針對第三標的的重鏈可變區；
CH1、CH2和CH3分別為抗體重鏈恆定區CH1、CH2和CH3；
VL
A為針對第一標的的輕鏈可變區；
VL
B為針對第二標的的輕鏈可變區；
VL
C為針對第三標的的輕鏈可變區；
CL為抗體的輕鏈恆定區；
L1、L2、L3各自獨立地為連接子(linker)；
“-”各自獨立地為鍵；
“～”代表二硫鍵或共價鍵；
其中，所述的六價三特異性抗體同時結合於第一標的、第二標的和第三標的。
在另一優選例中，第一標的為HER-2，第二標的為PD-1，第三標的為LAG-3。
在另一優選例中，第一標的為PD-1，第二標的為LAG-3，第三標的為HER-2。
在另一優選例中，第一標的為LAG-3，第二標的為PD-1，第三標的為HER-2。
在另一優選例中，第一標的為HER-2，第二標的為LAG-3，第三標的為PD-1。
在另一優選例中，第一標的為LAG-3，第二標的為HER-2，第三標的為PD-1。
在另一優選例中，所述六價三特異性抗體包含兩個單體，每個單體含有重鏈和第一輕鏈、和第二輕鏈，其中每個單體具有下式IV結構：
(IV)
式中，
VH
A-L1-VH
B-L2-VH
C-CH1-CH2-CH3為重鏈；
VL
A-L3-VL
B為第一輕鏈；
VL
C-CL為第二輕鏈；
VH
A為抗PD-1抗體的重鏈可變區；
VH
B為抗HER-2抗體的重鏈可變區；
VH
C為抗LAG-3抗體的重鏈可變區；
CH1、CH2和CH3分別為抗體重鏈恆定區CH1、CH2和CH3；
VL
A為抗PD-1抗體的輕鏈可變區；
VL
B為抗HER-2抗體的輕鏈可變區；
VL
C為抗LAG-3抗體的輕鏈可變區；
CL為抗體的輕鏈恆定區；
L1、L2、L3各自獨立地為連接子(linker)；
“-”各自獨立地為鍵；
“～”代表二硫鍵或共價鍵；
其中，所述的六價三特異性抗體同時結合於PD-1、HER-2和LAG-3。
在另一優選例中，所述連接子為柔性胜肽連接子。
在另一優選例中，所述的柔性胜肽連接子包括6-30個胺基酸，較佳地10-25個胺基酸。
在另一優選例中，所述的柔性胜肽連接子包括2-6個G4S。
在另一優選例中，所述的L1、L2或L3各自獨立地為2-4個G4S。
在另一優選例中，所述的重鏈恆定區為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體的重鏈恆定區，或由其衍生。
在另一優選例中，所述的重鏈恆定區選自人IgG1或人IgG4的重鏈恆定區。
在另一優選例中，所述的人IgG4的重鏈恆定區包含S228P突變。
在另一優選例中，所述的輕鏈恆定區為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體的輕鏈恆定區，或由其衍生。
在另一優選例中，所述的輕鏈恆定區選自人IgG1或人IgG4的輕鏈恆定區。
在另一優選例中，所述的六價三特異性抗體包含兩條重鏈、兩條第一輕鏈和兩條第二輕鏈，
其中，所述重鏈選自下組：胺基酸序列SEQ ID NO：14、16或18所示的重鏈；
所述第一輕鏈選自下組：胺基酸序列如SEQ ID NO：15、17或19所示的第一輕鏈；和/或
所述的第二輕鏈選自下組：胺基酸序列如SEQ ID NO：13所示的第二輕鏈。
在另一優選例中，所述的六價三特異性抗體中的重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID No: 14、15和13所示。
在另一優選例中，所述的六價三特異性抗體中的重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID No: 16、17和13所示。
在另一優選例中，所述的六價三特異性抗體中的重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID No: 18、19和13所示。
在本發明的第二方面，提供了一種分離的核酸分子，所述的核酸分子編碼如本發明的第一方面所述的六價三特異性抗體。
在另一優選例中，所述的核酸分子分別編碼所述重鏈和所述第一輕鏈、第二輕鏈。
在本發明的第三方面，提供了一種表現載體，所述的表現載體含有如本發明的第二方面所述的核酸分子。
在本發明的第四方面，提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞含有如本發明的第三方面所述的表現載體。
在本發明的第五方面，提供了本發明的第一方面所述的六價三特異性抗體的製備方法，所述方法包含以下步驟：
(a)在表現條件下，培養如本發明的第四方面所述的宿主細胞，從而表現所述的六價三特異性抗體；
(b)分離並純化(a)所述的六價三特異性抗體。
在本發明的第六方面，提供了一種藥物組成物，所述藥物組成物含有如本發明的第一方面所述的六價三特異性抗體和藥學上可接受的載劑。
在另一優選例中，所述藥物組成物中還含有抗腫瘤劑。
在另一優選例中，所述藥物組成物為單元劑型。
在另一優選例中，所述的抗腫瘤劑可以與所述三特異性抗體單獨存在於獨立的包裝內，或所述抗腫瘤劑可以與所述三特異性抗體偶聯。
在另一優選例中，所述藥物組成物的劑型包括胃腸給藥劑型或胃腸外給藥劑型。
在另一優選例中，所述的胃腸外給藥劑型包括靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤內注射、腹腔內注射、顱內注射、或腔內注射。
在本發明的第七方面，提供了如本發明的第一方面所述的六價三特異性抗體或如本發明的第六方面所述的藥物組成物在製備治療癌症的藥物中的用途。
在另一優選例中，所述癌症選自下組：黑色素瘤、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤及其它贅生性惡性疾病。
在本發明的第八方面，提供了一種治療癌症的方法，包括向有需要的受試者施用如本發明的第一方面所述的六價三特異性抗體、或其免疫偶聯物、或如本發明的第六方面所述的藥物組成物。
在另一優選例中，所述癌症選自下組：黑色素瘤、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤及其它贅生性惡性疾病。
在本發明的第九方面，提供了一種免疫偶聯物，所述免疫偶聯物包括：
(a) 如本發明的第一方面所述的六價三特異性抗體；和
(b) 選自下組的偶聯部分：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞激素、放射性核種、或酵素。
在另一優選例中，所述偶聯物部分選自：螢光或發光標記物、放射性標記物、MRI (核磁共振成像)或CT (電腦X射線斷層掃描技術)造影劑、或能夠產生可檢測產物的酵素、放射性核種、生物毒素、細胞激素。
在另一優選例中，所述的免疫偶聯物包括抗體-藥物偶聯物(ADC)。
在另一優選例中，所述的免疫偶聯物用於製備治療腫瘤的藥物組成物。
應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。
具體實施方式
本發明人經過廣泛而深入地研究，經過大量的篩選，首次成功獲得一種結構新穎的抗PD-1、HER-2和LAG-3的六價三特異性抗體。本發明的六價三特異性抗體為二個單體形成的二聚體，其中，每個單體包含重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈。具體地，以天然抗體的結構為基礎，設計並最佳化了第一輕鏈以及重鏈的結構，使在本發明三特異性抗體在保留抗PD-1、HER-2和LAG-3三特異性的同時，具有與單抗相似甚至更優的生物學活性和理化性質。在此基礎上完成了本發明。
術語
本發明中，術語“抗體(Antibody，縮寫Ab)”和“免疫球蛋白G (Immunoglobulin G，縮寫IgG)”是有相同結構特徵的異四聚糖蛋白，其由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈透過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型(isotype)的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH)，其後是恆定區，重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2、以及CH3構成。每條輕鏈的一端有可變區(VL)，另一端有恆定區，輕鏈恆定區包括一個結構域CL；輕鏈的恆定區與重鏈恆定區的CH1結構域配對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區配對。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體依賴的細胞媒介的細胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)等。重鏈恆定區包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亞型；輕鏈恆定區包括κ (Kappa)或λ (Lambda)。抗體的重鏈和輕鏈透過重鏈的CH1結構域和輕鏈的CL結構域之間的二硫鍵共價連接在一起，抗體的兩條重鏈透過樞紐區之間形成的多肽間二硫鍵共價連接在一起。
本發明中，術語“三特異性抗體(或三抗)”是指能同時特異性結合三種抗原(標的)或三種表位的抗體分子。根據對稱性，三特異性抗體可以分為結構對稱的和不對稱的分子。根據結合位址的多少，三特異性抗體可以分為三價、四價和多價分子。
本發明中，術語“單株抗體(單抗)”指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中包含的單個抗體是相同的，除少數可能存在的天然發生的突變外。單株抗體高特異性地針對單個抗原位址。而且，與常規多株抗體製劑(通常是具有針對不同抗原決定簇的不同抗體的混合物)不同，各單株抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性外，單株抗體的好處還在於它們可以透過融合瘤培養來合成，不會被其它免疫球蛋白污染。修飾語“單株”表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應被解釋成需要用任何特殊方法來生產抗體。
本發明中，術語“人源化”是指其CDR來源於非人物種(優選小鼠)抗體，抗體分子中殘餘的部分(包括框架區和恆定區)來源於人抗體。此外，框架區殘基可被改變以維持結合親和性。
本發明中，術語“Fab”和“Fc”是指木瓜蛋白酶可將抗體裂解為兩個完全相同的Fab段和一個Fc段。Fab段由抗體的重鏈的VH和CH1以及輕鏈的VL和CL結構域組成。Fc段即可結晶片段(fragment crystallizable，Fc)，由抗體的CH2和CH3結構域組成。Fc段無抗原結合活性，是抗體與效應分子或細胞相互作用的部位。
本發明中，術語“可變”表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性並不均勻地分佈在整個抗體可變區中。它集中於重鏈可變區和輕鏈可變區中稱為互補決定區(complementarity-determining region，CDR)或高度變異區中的三個片段中。可變區中較保守的部分稱為框架區(frame region，FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區，它們大致上呈β-折疊構型，由形成連接環的三個CDR相連，在某些情況下可形成部分β折疊結構。每條鏈中的CDR透過FR區緊密地靠在一起並與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結合部位(參見Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669頁(1991))。
如本文所用，術語“框架區”(FR)指插入CDR間的胺基酸序列，即指在單一物種中不同的免疫球蛋白間相對保守的免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變區的那些部分。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各具有四個FR，分別稱為FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相應地，輕鏈可變結構域可因此稱作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重鏈可變結構域可因此表示為(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。優選地，本發明的FR是人抗體FR或其衍生物，所述人抗體FR的衍生物與天然存在的人抗體FR基本相同，即序列相同性達到85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。
獲知CDR的胺基酸序列，本領域的技術人員可輕易確定框架區FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
如本文所用，術語“人框架區”是與天然存在的人抗體的框架區基本相同的(約85%或更多，具體地90%、95%、97%、99%或100%)框架區。
如本文所用，術語“連接子”或“胜肽連接子”或是指插入免疫球蛋白結構域中為輕鏈和重鏈的結構域提供足夠的可動性以折疊成交換雙重可變區免疫球蛋白的一個或多個胺基酸殘基。在本發明中，優選的連接子是指連接子L1、L2和L3，其中，L1連接第一抗體的重鏈可變區與第二抗體的重鏈可變區，L2連接第二抗體的重鏈可變區與第三抗體的重鏈可變區，L3連接第一抗體的輕鏈可變區與第二抗體的輕鏈可變區。
合適的連接子實例包括單甘胺酸(Gly)、或絲胺酸(Ser)殘基，連接子中胺基酸殘基的標識和序列可隨著連接子中需要實現的次級結構要素的類型而變化。
三特異性抗體
本發明的三特異性抗體是一種抗PD-1、HER-2和LAG-3的六價三特異性抗體，包括抗PD-1抗體部分、抗HER-2抗體部分和抗LAG-3抗體部分。
優選地，本發明抗PD-1抗體的序列如專利申請WO 2018/137576 A1中所述，本領域技術人員也可以透過本領域熟知的技術對本發明抗PD-1抗體進行修飾或改造，例如添加、缺失和/或取代一個或幾個胺基酸殘基，從而進一步增加抗PD-1的親和力或結構穩定性，並透過常規的測定方法獲得修飾或改造後的結果。
在本發明中，本發明的三特異性抗體還包括其保守性變異體，指與本發明三特異性抗體的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表A進行胺基酸替換而產生。
表A
| 最初的殘基 | 代表性的取代 | 優選的取代 |
| Ala (A) | Val； Leu； Ile | Val |
| Arg (R) | Lys； Gln； Asn | Lys |
| Asn (N) | Gln； His； Lys； Arg | Gln |
| Asp (D) | Glu | Glu |
| Cys (C) | Ser | Ser |
| Gln (Q) | Asn | Asn |
| Glu (E) | Asp | Asp |
| Gly (G) | Pro； Ala | Ala |
| His (H) | Asn； Gln； Lys； Arg | Arg |
| Ile (I) | Leu； Val； Met； Ala； Phe | Leu |
| Leu (L) | Ile； Val； Met； Ala； Phe | Ile |
| Lys (K) | Arg； Gln； Asn | Arg |
| Met (M) | Leu； Phe； Ile | Leu |
| Phe (F) | Leu； Val； Ile； Ala； Tyr | Leu |
| Pro (P) | Ala | Ala |
| Ser (S) | Thr | Thr |
| Thr (T) | Ser | Ser |
| Trp (W) | Tyr； Phe | Tyr |
| Tyr (Y) | Trp； Phe； Thr； Ser | Phe |
| Val (V) | Ile； Leu； Met； Phe； Ala | Leu |
在本發明的一個優選實施例中，所獲得的抗體的序列資訊如下表1所示。
表1. 本發明的抗體的序列資訊
| SEQ ID NO： | 序列名稱 |
| 1 | 609-IgG4重鏈可變區胺基酸序列 |
| 2 | 609-IgG4輕鏈可變區胺基酸序列 |
| 3 | 609-IgG4重鏈恆定區胺基酸序列 |
| 4 | 609-IgG4輕鏈恆定區胺基酸序列(即人Kappa輕鏈恆定區胺基酸序列) |
| 5 | 609-IgG4重鏈胺基酸序列 |
| 6 | 609-IgG4輕鏈胺基酸序列 |
| 7 | 302-IgG1重鏈可變區胺基酸序列 |
| 8 | 302-IgG1輕鏈可變區胺基酸序列 |
| 9 | 人IgG1重鏈恆定區胺基酸序列 |
| 10 | 302-IgG1重鏈胺基酸序列 |
| 11 | 302-IgG1輕鏈胺基酸序列 |
| 12 | 134-IgG4重鏈胺基酸序列 |
| 13 | 134-IgG4輕鏈胺基酸序列 |
| 14 | 609VH-302VH-134-IgG4胺基酸序列 |
| 15 | 609VL-302VL胺基酸序列 |
| 16 | 609VH-302VH(44C)-134-IgG4胺基酸序列 |
| 17 | 609VL-302VL(100C)胺基酸序列 |
| 18 | 609VH-302VH(105C)-134-IgG4胺基酸序列 |
| 19 | 609VL-302VL(43C)胺基酸 |
其中，上述胺基酸序列中任意一種胺基酸序列還包括經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個(如1-5個、1-3個，較佳地1-2個，更佳地1個)胺基酸的具有PD-1、HER-2和LAG-3結合親和力的衍生序列。
在另一優選例中，所述經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸序列所形成的序列優選為同源性為至少80%，較佳地至少85%，更佳地至少為90%，最佳地至少95%的胺基酸序列。
在本發明中，所述添加、缺失、修飾和/或取代的胺基酸數量通常是1、2、3、4或5個，較佳地為1-3個，更佳地為1-2個，最佳地為1個。
在本發明中，優選的取代包括，在本發明的三特異性抗體609VH-302VH-134-IgG4中，將302重鏈可變區的第44位的G替換為C；將609VL-302VL中的302輕鏈可變區的100位Q突變成C；
將609VH-302VH-134-IgG4中的302重鏈可變區的105位的Q突變成C；將609VL-302VL中的302輕鏈可變區的43位Q突變成C。
本發明中，術語“抗”、“結合”和“特異性結合”是指兩分子間的非隨機的結合反應，如抗體和其所針對的抗原之間的反應。通常，抗體以小於大約10
-7M，例如小於大約10
-8M、10
-9M、10
-10M、10
-11M或更小的平衡解離常數(KD)結合該抗原。本發明中，術語“KD”是指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數，其用於描述抗體與抗原之間的結合親和力。平衡解離常數越小，抗體-抗原結合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。例如，使用表面電漿共振術(Surface Plasmon Resonance，縮寫SPR)在BIACORE儀中測定抗體與抗原的結合親和力或使用ELISA測定抗體與抗原結合的相對親和力。
本發明中，術語“價”是指抗體分子中存在指定數量的抗原結合位址。優選的，本發明的三特異性抗體具有六個抗原結合位址，是六價的。本發明中，抗原結合位址包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。
本發明中，術語“表位”是指與抗體特異性結合的多肽決定簇。本發明的表位是抗原中被抗體結合的區域。
如本文所用，術語“第一輕鏈”是指包含針對不同標的的抗體的輕鏈可變區的輕鏈。具體地，所述“第一輕鏈”包含針對第一標的的抗體的輕鏈可變區和針對第二標的的抗體的輕鏈可變區，其能夠與針對第一標的的抗體重鏈可變區和針對第二標的的抗體重鏈可變區配對，形成特異性結合第一標的的第一結合位址和特異性結合第二標的的第二結合位址。
優選的，本發明中的“第一輕鏈”包含透過連接子或直接連接的兩個針對不同標的的抗體輕鏈可變區。進一步的，本發明中的“第一輕鏈”可以透過柔性連接子或鍵在不同的位置與重鏈配對。具體地，本發明中的“第一輕鏈”可以透過非共價鍵或共價鍵與三特異性抗體的重鏈配對。較佳地，本發明中的“第一輕鏈”透過共價鍵(如二硫鍵)與重鏈配對。
本發明的三特異性抗體可以單獨使用，也可與可檢測標記物(為診斷目的)、治療劑、或任何以上這些物質的組合結合或偶聯。
編碼核酸和表現載體
本發明還提供了編碼上述抗體或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
本發明中，術語“表現載體”指攜帶表現匣用於表現特定目的蛋白或其他物質的載體，如質體、病毒載體(如腺病毒、反轉錄病毒)、噬菌體、酵母質體或其他載體。代表性的例子包括但並不限於：pTT5，pSECtag系列，pCGS3系列，pcDNA系列載體等，以及其它用於哺乳動物表現系統的載體等。表現載體中包括連接於合適的轉錄和轉譯調節序列的融合DNA序列。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其選殖入載體，再轉入細胞，然後透過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用於轉形適當的宿主細胞，以使其能夠表現蛋白質。
本發明中，術語“宿主細胞”是指適用於表現上述表現載體的細胞，可以是真核細胞，如哺乳動物或昆蟲宿主細胞培養系統均可用於本發明的融合蛋白的表現，CHO (中國倉鼠卵巢，Chinese Hamster Ovary)，HEK293，COS，BHK以及上述細胞的衍生細胞均可適用於本發明。
藥物組成物和應用
本發明還提供了一種組成物。優選地，所述的組成物是藥物組成物，它含有上述的抗體或其活性片段或其融合蛋白，以及藥學上可接受的載劑。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載劑介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組成物可以透過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)：靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤內注射、腹腔內注射(如腹膜內)、顱內注射、或腔內注射。
本發明中，術語“藥物組成物”是指本發明的六價三特異性抗體可以和藥學上可以接受的載劑一起組成藥物製劑組成物從而更穩定地發揮療效，這些製劑可以保證本發明揭示的結合人PD-1的抗體或其抗原結合片段或六價三特異性抗體的胺基酸核心序列的構形完整性，同時還保護蛋白質的多官能基防止其降解(包括但不限於凝聚、脫氨或氧化)。
本發明的藥物組成物含有安全有效量(如0.001-99 wt%，較佳地0.01-90 wt%，更佳地0.1-80 wt%)的本發明上述的六價三特異性抗體(或其偶聯物)以及藥學上可接受的載劑或賦形劑。這類載劑包括(但並不限於)：鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組成物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他佐劑的水溶液透過常規方法進行製備。藥物組成物如針劑、溶液宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約10微克/千克體重-約50毫克/千克體重。此外，本發明的六價三特異性抗體還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組成物時，是將安全有效量的六價三特異性抗體或其免疫偶聯物施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約50毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約10毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
免疫偶聯物
本發明還提供了基於本發明三特異性抗體的免疫偶聯物。
典型地，所述免疫偶聯物包括所述抗體、以及效應分子，所述抗體與所述效應分子偶聯，並優選為化學偶聯。其中，所述效應分子優選為具有治療活性的藥物。此外，所述效應分子可以是毒蛋白、化療藥物、小分子藥物或放射性核種中的一種或多種。
本發明三特異性抗體所述效應分子之間可以是透過偶聯劑進行偶聯。所述偶聯劑的例子可以是非選擇性偶聯劑、利用羧基的偶聯劑、肽鏈、利用二硫鍵的偶聯劑中的任意一種或幾種。所述非選擇性偶聯劑是指使效應分子和抗體形成共價鍵連接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶聯劑可以是順烏頭酸酐類偶聯劑(如順烏頭酸酐)、醯基腙類偶聯劑(偶聯位址為醯基腙)中的任意一種或幾種。
抗體上某些殘基(如Cys或Lys等)用於與多種功能基團相連，其中包括成像試劑(例如發色基團和螢光基團)，診斷試劑(例如MRI對比劑和放射性同位素)，穩定劑(例如乙二醇聚合物)和治療劑。抗體可以被偶聯到功能劑以形成抗體-功能劑的偶聯物。功能劑(例如藥物，檢測試劑，穩定劑)被偶聯(共價連接)至抗體上。功能劑可以直接地、或者是透過連接子間接地連接於抗體。
抗體可以偶聯藥物從而形成抗體藥物偶聯物(antibody-drug conjugate，ADC)。典型地，ADC包含位於藥物和抗體之間的連接子。連接子可以是可降解的或者是不可降解的連接子。可降解的連接子典型地在細胞內環境下容易降解，例如在目標位址處連接子發生降解，從而使藥物從抗體上釋放出來。合適的可降解的連接子包括，例如酵素降解的連接子，其中包括可以被細胞內蛋白酶(例如溶酶體蛋白酶或者胞內體蛋白酶)降解的含有肽基的連接子，或者醣連接子例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的連接子。肽基連接子可以包括，例如二肽，例如纈胺酸-瓜胺酸，苯丙胺酸-離胺酸或者纈胺酸-丙胺酸。其它合適的可降解的連接子包括，例如，pH敏感連接子(例如pH小於5.5時水解的連接子，例如腙連接子)和在還原條件下會降解的連接子(例如二硫鍵連接子)。不可降解的連接子典型地在抗體被蛋白酶水解的條件下釋放藥物。
連接到抗體之前，連接子具有能夠和某些胺基酸殘基反應的活性反應基團，連接透過活性反應基團實現。巰基特異性的活性反應基團是優選的，並包括：例如馬來醯亞胺類化合物，鹵代醯胺(例如碘、溴或氯代的)；鹵代酯(例如碘、溴或氯代的)；鹵代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基鹵代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基碸，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六環，而對離子是醋酸根、氯離子或者硝酸根；和聚亞甲基二甲基硫醚硫代磺酸鹽。連接子可以包括，例如，透過硫代丁二醯亞胺連接到抗體上的馬來醯亞胺。
藥物可以是任何細胞毒性，抑制細胞生長或者免疫抑制的藥物。在實施方式中，連接子連接抗體和藥物，而藥物具有可以和連接子成鍵的功能性基團。例如，藥物可以具有可以和連接物成鍵的胺基，羧基，巰基，羥基，或者酮基。在藥物直接連接到連接子的情況下，藥物在連接到抗體之前，具有反應的活性基團。
有用的藥物類別包括，例如，抗微管蛋白藥物、DNA小溝結合試劑、DNA複製抑制劑、烷化試劑、抗生素、葉酸拮抗物、抗代謝藥物、化療增敏劑、拓撲異構酶抑制劑、長春花生物鹼等。特別有用的細胞毒性藥物類的例子包括，例如，DNA小溝結合試劑、DNA烷基化試劑、和微管蛋白抑制劑、典型的細胞毒性藥物包括、例如奧瑞他汀(auristatins)、喜樹鹼(camptothecins)、多卡黴素/倍癌黴素(duocarmycins)、依託泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素類化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓類(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的藥物(benzodiazepine containing drugs)(例如吡咯並[1,4]苯二氮卓類(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓類(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓類(oxazolidinobenzodiazepines))和長春花生物鹼(vinca alkaloids)。
在本發明中，藥物-連接子可以用於在一個簡單步驟中形成ADC。在其它實施方式中，雙功能連接物化合物可以用於在兩步或多步方法中形成ADC。例如，半胱胺酸殘基在第一步驟中與連接子的反應活性部分反應，並且在隨後的步驟中，連接子上的功能性基團與藥物反應，從而形成ADC。
通常，選擇連接子上功能性基團，以利於特異性地與藥物部分上的合適的反應活性基團進行反應。作為非限制性的例子，基於疊氮化合物的部分可以用於特異性地與藥物部分上的反應性炔基基團反應。藥物透過疊氮和炔基之間的1,3-偶極環加成，從而共價結合於連接子。其它的有用的功能性基團包括，例如酮類和醛類(適合與醯肼類和烷氧基胺反應)，膦(適合與疊氮反應)；異氰酸酯和異硫氰酸酯(適合與胺類和醇類反應)；和活化的酯類，例如N-羥基琥珀醯亞胺酯(適合與胺類和醇類反應)。這些和其它的連接策略，例如在《生物偶聯技術》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本領域技術人員所熟知的。本領域技術人員能夠理解，對於藥物部分和連接子的選擇性反應，當選擇了一個互補對的反應活性功能基團時，該互補對的每一個成員既可以用於連接子，也可以用於藥物。
本發明還提供了製備ADC的方法，可進一步地包括：將抗體與藥物-連接子化合物，在足以形成抗體偶聯物(ADC)的條件下進行結合。
在某些實施方式中，本發明方法包括：在足以形成抗體-連接子偶聯物的條件下，將抗體與雙功能連接子化合物進行結合。在這些實施方式中，本發明方法還進一步地包括：在足以將藥物部分透過連接子共價連接到抗體的條件下，將抗體連接子偶聯物與藥物部分進行結合。
在一些實施方式中，抗體藥物偶聯物ADC如下分子式所示：
其中：
Ab是抗體，
LU是連接子；
D是藥物；
而且下標p是選自1到8的值。
本發明的主要優點包括：
(1)本發明提供了一種結構新穎的六價三特異性抗體；
(2)本發明的三特異性抗體不需要進行Fc修飾，不會產生錯誤配對問題，製備方法簡便。(3)本發明的三特異性抗體在保留抗PD-1、HER-2和LAG-3三特異性的同時，具有與單抗相似甚至更優的生物學活性和理化性質。
下面結合具體實施例，進一步陳述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明詳細條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子選殖：實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
實施例中使用的蛋白表現和純化方法說明如下：將目的基因建構到表現載體pcDNA3.4中，利用PEI (Polyethylenimine)將建構好的表現載體或表現載體的組合轉入FreeStyle™ 293-F Cells細胞(後文簡稱HEK293F，購自Thermo Fisher Scientific)中以表現抗體或重組蛋白，HEK293F細胞在Free Style 293 Expression Medium (購自Thermo Fisher Scientific)中培養5天後收取細胞上清液，然後用Protein A親和層析純化抗體。
以下實施例中使用的ELISA檢測方法說明如下：用對應的重組蛋白塗佈微量井培養盤，用含有1%牛血清白蛋白的PBST (PBST為含0.05% Tween-20的磷酸鹽緩衝液)封阻微量井培養盤。將待測抗體進行梯度稀釋，然後轉移到上述塗佈重組蛋白的微量井培養盤中，室溫培育半小時後洗滌培養盤；加入適當稀釋的HRP (Horseradish Peroxidase)標記的羊抗人抗體(Fc specific，購自Sigma)，室溫培育半小時後洗滌培養盤；每孔加入100 μl以TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine)為受質的顯色液，室溫培育1～5 min；加50 μl終止液(2 M H
2SO
4)終止反應；酵素標示讀取儀(SpectraMax 190)讀取OD450，用GraphPad Prism7進行作圖和數據分析，並計算EC50。
以下實施例中使用的理化性質檢測方法說明如下：
HPLC-SEC
抗體是高分子量蛋白質，具有高度複雜的二級和三級結構。由於轉譯後修飾、聚集和降解等變化，抗體在生物化學和生物物理特性方面是異質的。當透過分離技術分析三特異性抗體時，通常會觀察到變異體、聚集體和降解片段，它們的存在可能會損害安全性和有效性。在生產和存儲抗體的過程中容易出現聚集體、降解片段和不完整組裝的分子。本發明使用高效液相層析法-尺寸排除層析法(High-performance liquid chromatography-size exclusion chromatography，HPLC-SEC)檢測樣品中上述雜質的含量。聚集體的分子量要大於單體，因此相應峰的保留時間較短；降解片段或不完整組裝分子的分子量要小於單體，因此相應峰的保留時間較長。HPLC-SEC所用層析儀為Dionex Ultimate 3000；流動相配製方法如下：取適量20 mM磷酸二氫鈉母液，用20 mM磷酸氫二鈉調節PH至6.8±0.1；進樣量：20 µg；層析管柱為TSK G3000SWXL，規格為7.8 × 300 mm 5 μm；流速0.5 ml/min，洗提時間30 min；管柱溫度25℃，樣品室溫度10℃；檢測波長214 nm。
HPLC-IEC
許多轉譯後修飾(例如N醣基化、C末端離胺酸殘基修飾、N末端麩醯胺酸或麩胺酸環化、天冬醯胺脫醯胺化、天冬胺酸異構化和胺基酸殘基氧化等)會直接或間接地引起抗體表面電荷的改變，導致電荷異質性的產生。基於所帶電荷可對電荷變異體進行分離和分析，常用的分析方法有陽離子交換層析法(cation exchange chromatography，CEX)和陰離子交換層析法(anionexchange chromatography，AEX)。當透過基於層析法的方法分析時，酸性種類(acidic species)和鹼性種類(basic species)基於它們相對於主峰(main peak)的保留時間來定義。酸性種類是早於CEX的主峰或晚於AEX的主峰洗提出來的變異體，而鹼性種類是晚於CEX的主峰或早於AEX的主峰洗提出來的變異體。酸性種類和鹼性種類所對應的峰分別稱作酸性峰和鹼性峰。在生產和存儲抗體的過程中容易產生電荷變異體。在此使用高效液相層析法-離子交換層析法(High-performance liquid chromatography-ionexchange chromatography，HPLC-IEC)分析樣品的電荷異質性。HPLC-IEC所用層析儀為Dionex Ultimate 3000；流動相A：20 mM PB pH6.3，流動相B：20 mM PB+200 mM NaCl pH6.3，兩種流動相混合的比例按照預先設置的程式隨時間而改變，流速1.0 ml/min；層析管柱：Thermo PropacTM WCX-10；管柱溫度30℃，樣品室溫度10℃；進樣量：20 µg；檢測波長：214 nm。
CE-SDS
本發明使用CE-SDS (Capillary Electrophoresis-Sodium Dodecyl Sulfate)分析樣品中降解片段或不完整組裝的分子的含量。CE分為非還原和還原兩種類型，用於前者的樣品在變性時不需要用還原劑DTT將分子內的二硫鍵破壞，而用於後者的樣品在變性時需要用還原劑DTT將分子內的二硫鍵破壞。非還原和還原CE-SDS分別記作NR-CE-SDS和R-CE-SDS。所用Maurice CE-SDS分析系統購自ProteinSimple，配備UV 214 nm檢測器。
實施例 1 建構抗 PD-1 、 HER-2 和 LAG-3 的三特異性抗體 實施例 1.1 序列
mAb1-25-Hu (後文簡稱為609-IgG4)是抗PD-1人源化單株抗體，其重鏈和輕鏈胺基酸序列來自於WO 2018/137576 A1中的SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10 (即本發明中的SEQ ID NO：5和6)。609-IgG4的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：1和2所示。609-IgG4重鏈恆定區為人IgG4 (SEQ ID NO：3，樞紐區含S228P突變)，輕鏈恆定區為人Kappa (SEQ ID NO：4)。在此，將609-IgG4重鏈和輕鏈的編碼基因分別命名為609-IgG4-HC和609-IgG4-LC。將609-IgG4-HC和609-IgG4-LC基因分別建構到pcDNA3.4表現載體中，兩種載體組合後表現並純化抗體，所得抗體命名為609-IgG4。
609-IgG4重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO： 1)：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRYTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSHYLQMNSLRAEDTAVYFCASPYGGYFDVWGQGTLVTVSS
609-IgG4輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO： 2)：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNFLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNSWPHTFGQGTKVEIK
609-IgG4重鏈恆定區胺基酸序列((SEQ ID NO： 3)：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
609-IgG4輕鏈恆定區胺基酸序列(SEQ ID NO： 4)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
609-IgG4重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO： 5)：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRYTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSHYLQMNSLRAEDTAVYFCASPYGGYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
609-IgG4輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO： 6)：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNFLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNSWPHTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
從揭示的文獻(Magdelaine-Beuzelin C, Kaas Q, Wehbi V, et al. Structure-function relationships of the variable domains of monoclonal antibodies approved for cancer treatment[J]. Critical reviews in oncology/hematology, 2007, 64(3)：210-225.)中獲得Trastuzumab (抗HER-2人源化單株抗體)的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列(SEQ ID NO：7和8)。該重鏈可變區和輕鏈可變區分別與人IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO：9)和人Kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO：4)相連，獲得全長的重鏈和輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：10和11)。在此，將全長重鏈和輕鏈的編碼基因分別命名為302-HC和302-LC。將302-HC和302-LC的編碼基因分別建構到pcDNA3.4表現載體中，兩種載體組合後表現並純化抗體，所得抗體命名為302-IgG1。
302-IgG1的重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO： 7)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS
302-IgG1的輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO： 8)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
人IgG1重鏈恆定區胺基酸序列(SEQ ID NO： 9)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
302-IgG1的重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO： 10)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
302-IgG1的輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO： 11)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
134-Hu-IgG4-C91S (後文簡稱為134-IgG4)是抗人LAG-3人源化單株抗體，其重鏈和輕鏈胺基酸序列來自於WO 2020/173378 A1中的SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：36 (即本發明中的SEQ ID NO：12和13)。134-IgG4單抗的重鏈恆定區為人IgG4 (樞紐區含有S228P突變)，輕鏈恆定區為人Kappa。在此，將134-IgG4重鏈和輕鏈的編碼基因分別命名為134-IgG4-HC和134-IgG4-LC。將134-IgG4-HC和134-IgG4-LC的基因分別建構到pcDNA3.4表現載體中，兩種載體組合後表現並純化抗體，所得抗體命名為134-IgG4。
134人源化重鏈134-IgG4-HC的胺基酸序列(SEQ ID NO： 12)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLT
AYYMNWVRQAPGQSLEWIG
VINPYNGDSSYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
DDGYYRWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(其中下劃線部分為重鏈互補決定區)
134人源化輕鏈134-IgG4-LC的胺基酸序列(SEQ ID NO： 13)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
RASQDIGSRLNWLQQKPGKSIKRLIY
ATSSLESGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDFATYYC
LQSGSSPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (其中下劃線部分為輕鏈互補決定區)。
實施例 1.2 三特異性抗體的建構
將609-IgG4的重鏈可變區透過人工連接子(三個串聯的GGGGS)連接302-IgG1的重鏈可變區，再透過人工連接子(三個串聯的GGGGS)連接人134-IgG4的重鏈(樞紐區含有S228P突變)，透過此程序建構成的含有三個重鏈可變區的長重鏈基因命名為609VH-302VH-134-IgG4 (SEQ ID NO：14)。將609的輕鏈可變區透過人工連接子(三個串聯的GGGGS)連接302-IgG1的輕鏈可變區，透過此程序建構成的含有兩個輕鏈可變區的長輕鏈基因命名為609VL-302VL (SEQ ID NO：15)。
將上述序列的編碼基因分別建構到pcDNA3.4表現載體中，將609VH-302VH-134-IgG4、609VL-302VL和134-IgG4-LC的表現載體組合，表現並純化抗體，所得抗體命名為609-302-134-IgG4。
609VH-302VH-134-IgG4胺基酸序列：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRYTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSHYLQMNSLRAEDTAVYFCASPYGGYFDVWGQGTLVTVSS
GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS
GGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTAYYMNWVRQAPGQSLEWIGVINPYNGDSSYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDGYYRWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO： 14)
609VL-302VL胺基酸序列：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNFLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNSWPHTFGQGTKVEIK
GGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO： 15)
為增強三特異性抗體的穩定性，在此嘗試在609VH-302VH-134-IgG4和609VL-302VL之間引入一對二硫鍵。根據文獻(Cho, Hyun-Soo & Mason, Karen & Ramyar, Kasra & Stanley, Ann & Gabelli, Sandra & Denney, Dan & Leahy, Daniel. (2003). Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 421. 756-60. 10.1038/nature01392.)報導的Trastuzumab的晶體結構(相關資訊見https://www.rcsb.org/structure/1N8Z)，在此選擇處於VH和VL界面上的並且空間上相近的胺基酸殘基對並突變成半胱胺酸，這些配對的胺基酸殘基分別是：VH上的44位胺基酸和VL上的100位胺基酸，VH上的105位胺基酸和VL上的43位胺基酸(上述胺基酸殘基按照Kabat規則編碼)。
在此，將609VH-302VH-134-IgG4中的302重鏈可變區的44位的G突變成C，所得序列命名為609VH-302VH(44C)-134-IgG4；同時將609VL-302VL中的302輕鏈可變區的100位Q突變成C，所得序列命名為609VL-302VL(100C)；
609VH-302VH(44C)-134-IgG4胺基酸序列：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRYTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSHYLQMNSLRAEDTAVYFCASPYGGYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGK
CLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTAYYMNWVRQAPGQSLEWIGVINPYNGDSSYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDGYYRWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO：16，其中下劃線處為突變位址)
609VL-302VL(100C)胺基酸序列：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNFLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNSWPHTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFG
CGTKVEIK (SEQ ID NO： 17，其中下劃線處為突變位址)
在此，將609VH-302VH-134-IgG4中的302重鏈可變區的105位的Q突變成C，所得序列命名為609VH-302VH(105C)-134-IgG4；同時將609VL-302VL中的302輕鏈可變區的43位A突變成C，所得序列命名為609VL-302VL(43C)；
609VH-302VH(105C)-134-IgG4胺基酸序列：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRYTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSHYLQMNSLRAEDTAVYFCASPYGGYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWG
C GTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTAYYMNWVRQAPGQSLEWIGVINPYNGDSSYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDGYYRWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO：18，其中下劃線處為突變位址)
609VL-302VL(43C)胺基酸：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNFLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNSWPHTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGK
C PKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO： 19，其中下劃線處為突變位址)
將上述序列的編碼基因分別建構到pcDNA3.4表現載體中，對應的載體組合後(609VH-302VH-134-IgG4、609VL-302VL和134-IgG4-LC組合，609VH-302VH(44C)-134-IgG4、609VL-302VL(100C)和134-IgG4-LC組合，609VH-302VH(105C)-134-IgG4、609VL-302VL(43C)和134-IgG4-LC組合)表現並純化抗體，所得抗體分別命名為609-302-134-IgG4、609-302-(44CC)-134-IgG4和609-302-(105CC)-134-IgG4。
本發明中的抗體名稱如表2所示：
表2. 本發明的抗體名稱
實施例 1.3 ELISA 測定相對親和力
| 抗體 | 名稱 | 重鏈 | 輕鏈 |
| 抗PD-1抗體 | 609-IgG4 | 609-IgG4-HC | 609-IgG4-LC |
| 抗HER-2抗體 | 302-IgG1 | 302-HC | 302-LC |
| 抗LAG-3抗體 | 134-IgG4 | 134-IgG4-HC | 134-IgG4-LC |
| 抗PD-1、HER-2和LAG-3的三特異性抗體 | 609-302-134-IgG4 | 609VH-302VH-134-IgG4 | 609VL-302VL |
| 609-302-(44CC)-134-IgG4 | 609VH-302VH(44C)-134-IgG4 | 609VL-302VL(100C) | |
| 609-302-(105CC)-134-IgG4 | 609VH-302VH(105C)-134-IgG4 | 609VL-302VL(43C) |
在此分別用帶有多聚組胺酸標籤的HER2胞外段重組蛋白(記作HER2-His，購自Sino Biological Inc.)、PD-1胞外段重組蛋白(記作PD1-His，購自Sino Biological Inc.)和LAG-3胞外段重組蛋白(記作LAG3-His，購自ACROBiosystems)塗佈微量井培養盤，塗佈濃度分別為20 ng/孔、20 ng/孔和10 ng/孔。
表3. ELISA測定相對親和力的EC
50結果
| 抗體 | EC 50(nM) | ||
| PD-1 | HER-2 | LAG-3 | |
| 609-IgG4 | 0.1085 | NA | NA |
| 302-IgG1 | NA | 0.08564 | NA |
| 134-IgG4 | NA | NA | 0.122 |
| 609-302-134-IgG4 | 0.1251 | 0.4918 | 0.2598 |
| 609-302-(44CC)-134-IgG4 | 0.09111 | 0.3549 | 0.226 |
| 609-302-(105CC)-134-IgG4 | 0.104 | 0.4196 | 0.2865 |
如圖2A-C所示，609-302-134-IgG4、609-302-(44CC)-134-IgG4和609-302-(105CC)-134-IgG4均能夠有效結合PD-1、HER-2和LAG-3，這表明它們是三特異性抗體，EC
50匯總於表3。
實施例 1.4 物理化學性質的特徵 1.4.1 HPLC-SEC
圖3A表示單抗609-IgG4的HPLC-SEC圖譜，主峰占比99.87%。
圖3B表示609-302-134-IgG4的HPLC-SEC圖譜，主峰占比98.24%。
圖3C表示609-302-(44CC)-134-IgG4的HPLC-SEC圖譜，主峰占比98.4%。
圖3D表示609-302-(105CC)-134-IgG4的HPLC-SEC圖譜，主峰占比98.06%。
上述結果表明，經過一步Protein A親和層析純化之後，三特異性抗體的SEC純度可以達到98%以上，尺寸異質性接近單株抗體。
1.4.2 HPLC-IEC
圖4A表示單抗609-IgG4的HPLC-IEC圖譜，主峰占比71.45%。
圖4B表示609-302-(44CC)-134-IgG4的HPLC-IEC圖譜，主峰占比71.62%。
圖4C表示609-302-(105CC)-134-IgG4的HPLC-IEC圖譜，主峰占比66.12%。
上述結果表明，經過一步Protein A親和層析純化之後，三特異性抗體的IEC主峰可以達到66%以上，電荷異質性與單株抗體相當。
1.4.3 CE-SDS
圖5A和圖5B分別表示單抗609-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS圖譜，NR-CE-SDS圖譜中主峰Peak2.672占比98.9%；R-CE-SDS圖譜中兩個主峰Peak1.499 (對應輕鏈)和Peak1.888 (對應重鏈)分別占比31.3%和67.7%，兩主峰占比之和為99.0%。
圖5C和圖5D分別表示609-302-134-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS的圖譜，NR-CE-SDS圖譜中兩個主峰Peak1.525和Peak2.893分別占比18.6%和80.8%，在609-302-134-IgG4分子中609VL-302VL沒有與609VH-302VH-134-IgG4形成共價二硫鍵，因此認為Peak1.525對應的多肽鏈為609VL-302VL；R-CE-SDS圖譜中兩個主峰Peak1.518 (對應輕鏈)和Peak2.158 (對應重鏈)分別占比34.8%和62.5%，兩主峰占比之和為97.3%。
圖5E和圖5F分別表示609-302-(44CC)-134-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS的圖譜，NR-CE-SDS圖譜中主峰Peak3.018占比96.4%；R-CE-SDS圖譜中兩個主峰Peak1.515 (對應輕鏈)和Peak2.159 (對應重鏈)分別占比34.9%和62.0%，兩主峰占比之和為96.9%。圖5G和圖5H分別表示609-302-(105CC)-134-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS的圖譜，NR-CE-SDS圖譜中主峰Peak3.020占比91.8%；R-CE-SDS圖譜中兩個主峰Peak1.508 (對應輕鏈)和Peak2.147 (對應重鏈)分別占比36.6%和56.9%，兩主峰占比之和為93.5%。
上述結果表明，經過一步Protein A親和層析純化之後，三特異性抗體609-302-(44CC)-134-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS純度均可以達到96%以上，與單抗609-IgG4最為相近。
實施例 2 測定本發明的三特異性抗體刺激免疫反應的功能活性
在RPMI 1640中加入以下添加劑：10%胎牛血清；1% MEM Non-Essential Amino Acids Solution；1% Sodium Pyruvate；1% HEPES；1‰ 2-Mercaptoethanol；1% Penicillin-Streptomycin；1% GlutaMAX (上述培養基和添加劑購自Thermo Fisher Scientific)。用上述RPMI 1640完全培養基將新鮮分離的人周邊血液單核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC。PBMC購自Allcells，貨號：PB005-C)洗滌並重新懸浮，加入一定量的超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)。SEB為實驗室內部製備，序列來自Uniprot (Entry: P01552)，使用大腸桿菌表現，用Ni-NTA親和層析法純化。將PBMC細胞懸浮液接種到圓底96孔細胞培養盤中，每孔150 μl懸浮液和20萬個細胞；在上述96孔盤中加入50 μl梯度稀釋的相關抗體；將96孔盤置於37℃細胞培養箱中培育4天。從96孔盤中取適量細胞培養上清液。用雙抗體夾心法(sandwich ELISA)檢測上清液中的IL-2 (相關檢測用的配對抗體購自BD Biosciences)。用酵素標示讀取儀(SpectraMax 190)讀取OD450，用GraphPad Prism7進行數據分析、作圖並計算EC
50。
表4. 本發明的三特異性抗體的功能活性參數
| 抗體 | EC 50(nM) | Top |
| 609-IgG4 | 0.04091 | 5363 |
| 134-IgG4 | 0.8398 | 3369 |
| 609-302-(44CC)-134-IgG4 | 0.3217 | 10281 |
| 609-302-(105CC)-134-IgG4 | 0.1834 | 8795 |
如圖6和表4所示，609-IgG4比134-IgG4表現出更小的EC
50和更高的Top (高平臺)，表明609-IgG4功能活性比134-IgG4高。609-302-(44CC)-134-IgG4和609-302-(105CC)-134-IgG4展現出相近的EC
50和Top，說明這兩種三特異性抗體的功能活性相當。與609-IgG4相比，609-302-(44CC)-134-IgG4和609-302-(105CC)-134-IgG4展現出更高的Top，大致在抗體濃度大於1 nM時(即Log值大於0時)，兩種三特異性抗體刺激PBMC分泌IL-2的能力明顯強於單株抗體609-IgG4和134-IgG4。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附申請專利範圍所限定的範圍。
圖1為本發明的三特異性抗體的結構示意圖，其中，VH-A表示第一抗體的重鏈可變區，VH-B表示第二抗體的重鏈可變區，VH-C表示第三抗體的重鏈可變區；VL-A表示第一抗體的輕鏈可變區，VL-B表示第二抗體的輕鏈可變區，VL-C表示第三抗體的輕鏈可變區。CH1、CH2和CH3是重鏈恆定區的三個結構域，CL是輕鏈恆定區。兩條重鏈之間的線段表示二硫鍵，重鏈和輕鏈之間的線段也表示二硫鍵，其中VH-B和VL-B之間的線段表示人工設計的二硫鍵。VH-A與VH-B、VH-B與VH-C以及VL-A與VL-B之間的線段表示人工設計的連接子，CH1和CH2之間的線段表示抗體天然的連接子和樞紐區(如果重鏈是人IgG4亞型，樞紐區會含有S228P點突變)。
圖2為本發明的三特異性抗體的ELISA結果。其中，圖2A、圖2B、圖2C分別為ELISA測定本發明的三特異性抗體對PD-1、HER-2和LAG-3的親和力結果。
圖3為單抗609-IgG4及本發明的三特異性抗體的HPLC-SEC圖譜。其中，圖3A表示單抗609-IgG4的HPLC-SEC圖譜；圖3B表示609-302-134-IgG4的HPLC-SEC圖譜；圖3C表示609-302-(44CC)-134-IgG4的HPLC-SEC圖譜；圖3D表示609-302-(105CC)-134-IgG4的HPLC-SEC圖譜。
圖4為單抗609-IgG4及本發明的三特異性抗體的HPLC-IEC圖譜。其中，圖4A表示單抗609-IgG4的HPLC-IEC圖譜；圖4B表示609-302-(44CC)-134-IgG4的HPLC-IEC圖譜；圖4C表示609-302-(105CC)-134-IgG4的HPLC-IEC圖譜。
圖5為單抗609-IgG4及本發明的三特異性抗體的HPLC-IEC圖譜。其中，圖5A和圖5B分別表示單抗609-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS圖譜；圖5C和圖5D分別表示609-302-134-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS的圖譜；圖5E和圖5F分別表示609-302-(44CC)-134-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS的圖譜；圖5G和圖5H分別表示609-302-(105CC)-134-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS的圖譜。
圖6為本發明的三特異性抗體的刺激免疫反應的功能活性圖。
Claims (15)
- 一種六價三特異性抗體，其特徵在於，所述的六價三特異性抗體為二個單體形成的二聚體，其中，每個單體包含重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈； 所述的重鏈從N端至C端包括串聯的針對第一標的的抗體重鏈可變區元件Z1、針對第二標的的抗體重鏈可變區元件Z2、針對第三標的的抗體重鏈可變區元件Z3以及抗體重鏈恆定區Z4； 所述的第一輕鏈和第二輕鏈分別與所述重鏈配合，使得所述的六價三特異性抗體特異性結合於第一標的、第二標的和第三標的。
- 如請求項1所述的六價三特異性抗體，其特徵在於，包含重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈；其中，每個所述的重鏈具有下式I的結構： Z1-Z2-Z3-Z4 (I) Z1為針對第一標的的重鏈可變區元件； Z2為針對第二標的的重鏈可變區元件； Z3為針對第三標的的重鏈可變區元件； Z4為抗體重鏈恆定區CH1、CH2和CH3； “-”各自獨立地為鍵或連接子(linker)； 其中，所述的第一輕鏈和第二輕鏈分別與重鏈配合，使得所述的六價三特異性抗體特異性結合於第一標的、第二標的和第三標的；所述第一輕鏈具有下式II的結構： Z5-Z6(II)； 其中，Z5為針對第一標的的輕鏈可變區元件；Z6為針對第二標的的輕鏈可變區元件； 所述第二輕鏈具有下式III的結構： Z7-Z8(III)； 其中，Z7為針對第三標的的輕鏈可變區元件；Z8為輕鏈恆定區。
- 如請求項1或2所述的六價三特異性抗體，其特徵在於，所述第一標的、第二標的和第三標的為PD-1、HER-2和LAG-3。
- 如請求項1-3中任一項所述的六價三特異性抗體，其特徵在於，所述的連接子為長度為1-35個胺基酸的胜肽連接子，較佳地6-30個胺基酸的胜肽連接子。
- 如請求項1-4中任一項所述的六價三特異性抗體，其特徵在於，所述六價三特異性抗體包含兩個單體，每個單體含有重鏈和第一輕鏈、和第二輕鏈，其中每個單體具有下式IV結構：(IV) 式中， VH A-L1-VH B-L2-VH C-CH1-CH2-CH3為重鏈； VL A-L3-VL B為第一輕鏈； VL C-CL為第二輕鏈； VH A為抗PD-1抗體的重鏈可變區； VH B為抗HER-2抗體的重鏈可變區； VH C為抗LAG-3抗體的重鏈可變區； CH1、CH2和CH3分別為抗體重鏈恆定區CH1、CH2和CH3； VL A為抗PD-1抗體的輕鏈可變區； VL B為抗HER-2抗體的輕鏈可變區； VL C為抗LAG-3抗體的輕鏈可變區； CL為抗體的輕鏈恆定區； L1、L2、L3各自獨立地為連接子(linker)； “-”各自獨立地為鍵； “～”代表二硫鍵或共價鍵； 其中，所述的六價三特異性抗體同時結合於PD-1、HER-2和LAG-3。
- 如請求項1-5中任一項所述的六價三特異性抗體，其特徵在於，所述連接子為柔性胜肽連接子；其中，所述的柔性胜肽連接子包括6-30個胺基酸，較佳地10-25個胺基酸。
- 如請求項1-6中任一項所述的六價三特異性抗體，其特徵在於，所述的六價三特異性抗體包含兩條重鏈、兩條第一輕鏈和兩條第二輕鏈， 其中，所述的六價三特異性抗體中的重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID No: 14、15和13所示；或 所述的六價三特異性抗體中的重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID No: 16、17和13所示；或 所述的六價三特異性抗體中的重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID No: 18、19和13所示。
- 一種分離的核酸分子，其特徵在於，所述的核酸分子編碼如請求項1-7中任一項所述的六價三特異性抗體。
- 一種表現載體，其特徵在於，所述的表現載體含有如請求項8所述的核酸分子。
- 一種宿主細胞，其特徵在於，所述的宿主細胞含有如請求項9所述的表現載體。
- 如請求項1-7中任一項所述的六價三特異性抗體的製備方法，其特徵在於，所述方法包含以下步驟： (a)在表現條件下，培養如請求項10所述的宿主細胞，從而表現所述的六價三特異性抗體； (b)分離並純化(a)所述的六價三特異性抗體。
- 一種藥物組成物，其特徵在於，所述藥物組成物含有如請求項1-7中任一項所述的六價三特異性抗體和藥學上可接受的載劑。
- 如請求項1-7中任一所述的六價三特異性抗體或如請求項12所述的藥物組成物在製備治療癌症的藥物中的用途。
- 如請求項13所述的用途，其特徵在於，所述癌症選自下組：黑色素瘤、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤及其它贅生性惡性疾病。
- 一種免疫偶聯物，其特徵在於，所述免疫偶聯物包括： (a)如請求項1-7中任一項中所述的六價三特異性抗體；和 (b)選自下組的偶聯部分：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞激素、放射性核種、或酵素。
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