CN115536749A - 三特异性抗体、其制备方法和用途 - Google Patents

三特异性抗体、其制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN115536749A
CN115536749A CN202110726683.9A CN202110726683A CN115536749A CN 115536749 A CN115536749 A CN 115536749A CN 202110726683 A CN202110726683 A CN 202110726683A CN 115536749 A CN115536749 A CN 115536749A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
val
gly
thr
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110726683.9A
Other languages
English (en)
Inventor
赵杰
黄浩旻
朱祯平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Original Assignee
Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd filed Critical Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Priority to CN202110726683.9A priority Critical patent/CN115536749A/zh
Priority to PCT/CN2022/100105 priority patent/WO2023273958A1/zh
Priority to EP22831776.4A priority patent/EP4365205A1/en
Priority to TW111123904A priority patent/TW202305008A/zh
Publication of CN115536749A publication Critical patent/CN115536749A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种结构新颖的六价三特异性抗体。本发明中的六价三特异性抗体具有良好的稳定性，不需要进行Fc修饰，不会产生错配问题，制备方法简便，并且与单抗相似甚至更优的生物学活性和理化性质。

Description

三特异性抗体、其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及抗体领域，具体地，涉及一种三特异性抗体、其制备方法和用途。
背景技术
抗PD-1/PD-L1单克隆抗体是最早获得广泛使用的癌症免疫疗法。随后，双特异性抗体作为癌症免疫疗法出现在人们的视野里，这些抗体的一端可以与癌细胞表面的抗原结合，另一端与T细胞表面的CD3结合，招募并激活T细胞杀伤癌细胞(例如安进公司的Blinatumomab)。Blinatumomab是一款同时靶向癌细胞表面的CD19抗原和T细胞表面CD3受体的双特异性抗体，它在治疗晚期B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患者时，能够将患者的缓解率和生存期翻倍。这类双特异性抗体能够有效激活T细胞的抗癌活性。
然而，通常T细胞被激活时，不但CD3介导的信号通路被激活，一种称为CD28的共刺激受体介导的信号通路也被激活。这种双重激活能够保证T细胞维持更长久的抗肿瘤活性。近日在Nature Cancer杂志上发表的一项研究中(参考文献：Wu et al.,(2019).Trispecific antibodies enhance the therapeutic efficacy of tumor-directed Tcells through T cell receptor co-stimulation.Nature Cancer,https://doi.org/10.1038/s43018-019-0004-z)，赛诺菲(Sanofi)公司的研发团队开发出一款三特异性抗体，它不但能够与肿瘤相关抗原和T细胞CD3相结合，还能够与T细胞表面的CD28相结合，从而增强T细胞的抗癌活性。激活CD28受体能够刺激Bcl-xL蛋白的表达，Bcl-xL可以防止T细胞凋亡，从而延长T细胞的活性。CD28作为共刺激受体已经在CAR-T疗法中得到应用。某些CAR-T细胞表达的受体包含着CD3和CD28的共刺激蛋白域。在体外试验中，与已经获得批准的抗CD38单克隆抗体Daratumumab相比，三特异性抗体裂解的癌细胞比例提高了3-4倍。而且在小鼠的多发性骨髓瘤模型中，这款三特异性抗体也能够剂量依赖性缩小移植到小鼠体内肿瘤的大小。
研究人员仍然需要检验这一创新抗体的安全性，刺激T细胞活性的癌症免疫疗法的常见副作用是细胞因子释放综合征，这是由于T细胞被过度激活而造成的。在非人灵长类模型中，这款三特异性疗法表现出可控的安全性，不过它的安全性需要在人体和MM患者中得到验证。
在《Nature》发表的评论(参考文献：Garfall and June.(2019).Trispecificantibodies offer a third way forward for anticancer immunotherapy.Nature,doi:10.1038/d41586-019-03495-3)表示，多发性骨髓瘤患者一直需要新的治疗手段，因为即使是像CAR-T这样有效的治疗手段，也只能给大多数患者带来暂时的缓解。三特异性抗体可能提供一种灵活的平台，根据肿瘤的微环境递送精准的免疫调节信号组合，从而比由三种单特异性抗体构成的组合疗法更为安全和有效。
此外，Numab在US20180355024A1中公开了其三特异性抗体的设计方法，其特点是由多个ScFv片段和Fv组成。Xencor公司在US20190352416A1中公开了其三特异性抗体的设计方法，其特点是使用了重链异源二聚化技术和ScFv片段。
除了上述产品和涉足公司外，另外还有一些早期研究曾发表在国际知名期刊上。在2017年，一项发表在《Science》期刊上的研究(参考文献：Liang Xu et al.Trispecificbroadly neutralizing HIV antibodies mediate potent SHIV protection inmacaques.Science,Published online:20Sep 2017,doi:10.1126/science.aan8630.)显示，科学家们已在实验室开发出一种三特异性抗体，可以让猴子免受两种人猴嵌合免疫缺陷病毒(SHIV)菌株的感染。据介绍，这种三特异性抗体将广泛中和HIV抗体VRC01、PGDM1400和10E8v4的独特结构结合在一起，三种HIV结合片段源自于三种天然的抗体，每种天然的抗体都强效地中和很多HIV毒株。使用三特异性抗体治疗癌症将是非常重要的概念性突破。由于三特异性抗体是一个灵活的载体，可以在肿瘤微环境中特异性地传递免疫调节信号组合，这可能比多个特异性免疫调节单抗的组合更安全有效。因此，这种组合策略有望提高目前免疫疗法的精准性和疗效，并进一步扩大免疫疗法的适用范围。三特异性抗体能够同时结合三种不同靶标，有望为开发针对HIV感染、其他的传染病、自身免疫疾病和癌症的治疗方法提供有力基础。
因此，本领域需要开发新型有效的三特异性抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三特异性抗体、其制备方法和用途。
在本发明的第一方面，提供了一种六价三特异性抗体，所述的六价三特异性抗体为二个单体形成的二聚体，其中，每个单体包含重链、第一轻链和第二轻链；
所述的重链从N端至C端包括串联的针对第一靶标的抗体重链可变区元件Z1、针对第二靶标的抗体重链可变区元件Z2、针对第三靶标的抗体重链可变区元件Z3以及抗体重链恒定区Z4；
所述的第一轻链和第二轻链分别与所述重链配合，使得所述的六价三特异性抗体特异性结合于第一靶标、第二靶标和第三靶标。
在另一优选例中，所述的第一轻链从N端至C端包括串联的针对第一靶标的抗体轻链可变区元件Z5以及针对第二靶标的抗体轻链可变区元件Z6。
在另一优选例中，所述的第二轻链从N端至C端包括串联的针对第三靶标的抗体轻链可变区元件Z7以及抗体轻链恒定区Z8。
在另一优选例中，所述的抗体重链恒定区Z4包括CH1区、CH2区和CH3区。
在另一优选例中，所述的第一轻链与抗体重链可变区元件Z1和抗体重链可变区元件Z2配合；并且所述的第二轻链与抗体重链可变区元件Z3配合。
在另一优选例中，所述的第二轻链还进一步与抗体重链恒定区Z4中的CH1区配合。
在另一优选例中，所述的抗体重链恒定区Z4来源于靶向第一靶标的抗体、靶向第二靶标的抗体、或靶向第三靶标的抗体。
在另一优选例中，所述的抗体重链可变区元件Z1、抗体重链可变区元件Z2、抗体重链可变区元件Z3和抗体重链恒定区Z4各自独立地为全人的或人源化的。
在另一优选例中，所述的抗体轻链可变区元件Z5、抗体轻链可变区元件Z6、抗体轻链可变区元件Z7和抗体轻链恒定区Z8各自独立地为全人的或人源化的。
在另一优选例中，在所述的抗体重链可变区元件Z1、抗体重链可变区元件Z2、抗体重链可变区元件Z3和抗体重链恒定区Z4中相邻的两个元件可直接相连或通过接头连接。
在另一优选例中，所述的抗体轻链可变区元件Z5和抗体轻链可变区元件Z6可直接相连或通过接头连接。
在另一优选例中，所述的抗体轻链可变区元件Z7和抗体轻链恒定区Z8可直接相连或通过接头连接。
在另一优选例中，所述的接头包括柔性接头和刚性接头。
在另一优选例中，所述的接头为长度为1-35个氨基酸的肽接头，较佳地6-30个氨基酸的肽接头。
在另一优选例中，所述第一靶标、第二靶标和第三靶标为PD-1、HER-2和LAG-3。
在另一优选例中，第一靶标为PD-1，第二靶标为HER-2，第三靶标为LAG-3。
在另一优选例中，第一靶标为HER-2，第二靶标为PD-1，第三靶标为LAG-3。
在另一优选例中，第一靶标为PD-1，第二靶标为LAG-3，第三靶标为HER-2。
在另一优选例中，第一靶标为LAG-3，第二靶标为PD-1，第三靶标为HER-2。
在另一优选例中，第一靶标为HER-2，第二靶标为LAG-3，第三靶标为PD-1。
在另一优选例中，第一靶标为LAG-3，第二靶标为HER-2，第三靶标为PD-1。
在另一优选例中，所述六价三特异性抗体包含重链、第一轻链和第二轻链；其中，每个所述的重链具有下式I的结构：
Z1-Z2-Z3-Z4 (I)
Z1为针对第一靶标的重链可变区元件；
Z2为针对第二靶标的重链可变区元件；
Z3为针对第三靶标的重链可变区元件；
Z4为抗体重链恒定区CH1、CH2和CH3；
“-”各自独立地为键或接头(linker)；
其中，所述的第一轻链和第二轻链分别与重链配合，使得所述的六价三特异性抗体特异性结合于第一靶标、第二靶标和第三靶标。
在另一优选例中，所述的第一轻链与Z1和Z2配合，而第二轻链与Z3配合。
在另一优选例中，所述的第一轻链还与Z2通过二硫键连接。
在另一优选例中，所述的第二轻链与Z3和CH1配合，并且第二轻链还与CH1通过二硫键连接。
在另一优选例中，所述第一轻链具有下式II的结构：
Z5-Z6 (II)；
其中，Z5为针对第一靶标的轻链可变区元件；Z6为针对第二靶标的轻链可变区元件。在另一优选例中，所述第二轻链具有下式III的结构：
Z7-Z8 (III)；
其中，Z7为针对第三靶标的轻链可变区元件和Z8为轻链恒定区。
在另一优选例中，第一靶标为PD-1，第二靶标为HER-2，第三靶标为LAG-3。
在另一优选例中，第一靶标为HER-2，第二靶标为PD-1，第三靶标为LAG-3。
在另一优选例中，第一靶标为PD-1，第二靶标为LAG-3，第三靶标为HER-2。
在另一优选例中，第一靶标为LAG-3，第二靶标为PD-1，第三靶标为HER-2。
在另一优选例中，第一靶标为HER-2，第二靶标为LAG-3，第三靶标为PD-1。
在另一优选例中，第一靶标为LAG-3，第二靶标为HER-2，第三靶标为PD-1。
在另一优选例中，所述的第一轻链具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：15、17或19。
在另一优选例中，所述的第二轻链具有如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：14、16或18。
在另一优选例中，所述六价三特异性抗体为二聚体。
在另一优选例中，所述六价三特异性抗体为同源或异源二聚体。
在另一优选例中，所述六价三特异性抗体包含两个单体，每个单体含有重链和第一轻链、和第二轻链，其中每个单体具有下式IV结构：
Figure BDA0003138926190000051
式中，
VHA-L1-VHB-L2-VHC-CH1-CH2-CH3为重链；
VLA-L3-VLB为第一轻链；
VLC-CL为第二轻链；
VHA为针对第一靶标的重链可变区；
VHB为针对第二靶标的重链可变区；
VHC为针对第三靶标的重链可变区；
CH1、CH2和CH3分别为抗体重链恒定区CH1、CH2和CH3；
VLA为针对第一靶标的轻链可变区；
VLB为针对第二靶标的轻链可变区；
VLC为针对第三靶标的轻链可变区；
CL为抗体的轻链恒定区；
L1、L2、L3各自独立地为接头(linker)；
“-”各自独立地为键；
“～”代表二硫键或共价键；
其中，所述的六价三特异性抗体同时结合于第一靶标、第二靶标和第三靶标。
在另一优选例中，第一靶标为HER-2，第二靶标为PD-1，第三靶标为LAG-3。
在另一优选例中，第一靶标为PD-1，第二靶标为LAG-3，第三靶标为HER-2。
在另一优选例中，第一靶标为LAG-3，第二靶标为PD-1，第三靶标为HER-2。
在另一优选例中，第一靶标为HER-2，第二靶标为LAG-3，第三靶标为PD-1。
在另一优选例中，第一靶标为LAG-3，第二靶标为HER-2，第三靶标为PD-1。
在另一优选例中，所述六价三特异性抗体包含两个单体，每个单体含有重链和第一轻链、和第二轻链，其中每个单体具有下式IV结构：
Figure BDA0003138926190000061
式中，
VHA-L1-VHB-L2-VHC-CH1-CH2-CH3为重链；
VLA-L3-VLB为第一轻链；
VLC-CL为第二轻链；
VHA为抗PD-1抗体的重链可变区；
VHB为抗HER-2抗体的重链可变区；
VHC为抗LAG-3抗体的重链可变区；
CH1、CH2和CH3分别为抗体重链恒定区CH1、CH2和CH3；
VLA为抗PD-1抗体的轻链可变区；
VLB为抗HER-2抗体的轻链可变区；
VLC为抗LAG-3抗体的轻链可变区；
CL为抗体的轻链恒定区；
L1、L2、L3各自独立地为接头(linker)；
“-”各自独立地为键；
“～”代表二硫键或共价键；
其中，所述的六价三特异性抗体同时结合于PD-1、HER-2和LAG-3。
在另一优选例中，所述接头为柔性肽接头。
在另一优选例中，所述的柔性肽接头包括6-30个氨基酸，较佳地10-25个氨基酸。
在另一优选例中，所述的柔性肽接头包括2-6个G4S。
在另一优选例中，所述的L1、L2或L3各自独立地为2-4个G4S。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的重链恒定区，或由其衍生。
在另一优选例中，所述的重链恒定区选自人IgG1或人IgG4的重链恒定区。
在另一优选例中，所述的人IgG4的重链恒定区包含S228P突变。
在另一优选例中，所述的轻链恒定区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的轻链恒定区，或由其衍生。
在另一优选例中，所述的轻链恒定区选自人IgG1或人IgG4的轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的六价三特异性抗体包含两条重链、两条第一轻链和两条第二轻链，
其中，所述重链选自下组：氨基酸序列SEQ ID NO：14、16或18所示的重链；
所述第一轻链选自下组：氨基酸序列如SEQ ID NO：15、17或19所示的第一轻链；和/或
所述的第二轻链选自下组：氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示的第二轻链。
在另一优选例中，所述的六价三特异性抗体中的重链、第一轻链和第二轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID No:14、15和13所示。
在另一优选例中，所述的六价三特异性抗体中的重链、第一轻链和第二轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID No:16、17和13所示。
在另一优选例中，所述的六价三特异性抗体中的重链、第一轻链和第二轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID No:18、19和13所示。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸分子，所述的核酸分子编码如本发明的第一方面所述的六价三特异性抗体。
在另一优选例中，所述的核酸分子分别编码所述重链和所述第一轻链、第二轻链。
在本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体含有如本发明的第二方面所述的核酸分子。
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明的第三方面所述的表达载体。
在本发明的第五方面，提供了本发明的第一方面所述的六价三特异性抗体的制备方法，所述方法包含以下步骤：
(a)在表达条件下，培养如本发明的第四方面所述的宿主细胞，从而表达所述的六价三特异性抗体；
(b)分离并纯化(a)所述的六价三特异性抗体。
在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如本发明的第一方面所述的六价三特异性抗体和药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物中还含有抗肿瘤剂。
在另一优选例中，所述药物组合物为单元剂型。
在另一优选例中，所述的抗肿瘤剂可以与所述三特异性抗体单独存在于独立的包装内，或所述抗肿瘤剂可以与所述三特异性抗体偶联。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括胃肠给药剂型或胃肠外给药剂型。
在另一优选例中，所述的胃肠外给药剂型包括静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射、颅内注射、或腔内注射。
在本发明的第七方面，提供了如本发明的第一方面所述的六价三特异性抗体或如本发明的第六方面所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。
在另一优选例中，所述癌症选自下组：黑素瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤及其它赘生性恶性疾病。
在本发明的第八方面，提供了一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用如本发明的第一方面所述的六价三特异性抗体、或其免疫偶联物、或如本发明的第六方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述癌症选自下组：黑素瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤及其它赘生性恶性疾病。
在本发明的第九方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：
(a)如本发明的第一方面所述的六价三特异性抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中，所述偶联物部分选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子。
在另一优选例中，所述的免疫偶联物包括抗体-药物偶联物(ADC)。
在另一优选例中，所述的免疫偶联物用于制备治疗肿瘤的药物组合物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为本发明的三特异性抗体的结构示意图，其中，VH-A表示第一抗体的重链可变区，VH-B表示第二抗体的重链可变区，VH-C表示第三抗体的重链可变区；VL-A表示第一抗体的轻链可变区，VL-B表示第二抗体的轻链可变区，VL-C表示第三抗体的轻链可变区。CH1、CH2和CH3是重链恒定区的三个结构域，CL是轻链恒定区。两条重链之间的线段表示二硫键，重链和轻链之间的线段也表示二硫键，其中VH-B和VL-B之间的线段表示人工设计的二硫键。VH-A与VH-B、VH-B与VH-C以及VL-A与VL-B之间的线段表示人工设计的连接子，CH1和CH2之间的线段表示抗体天然的连接子和铰链区(如果重链是人IgG4亚型，铰链区会含有S228P点突变)。
图2为本发明的三特异性抗体的ELISA结果。其中，图2A、图2B、图2C分别为ELISA测定本发明的三特异性抗体对PD-1、HER-2和LAG-3的亲和力结果。
图3为单抗609-IgG4及本发明的三特异性抗体的HPLC-SEC图谱。其中，图3A表示单抗609-IgG4的HPLC-SEC图谱；图3B表示609-302-134-IgG4的HPLC-SEC图谱；图3C表示609-302-(44CC)-134-IgG4的HPLC-SEC图谱；图3D表示609-302-(105CC)-134-IgG4的HPLC-SEC图谱。
图4为单抗609-IgG4及本发明的三特异性抗体的HPLC-IEC图谱。其中，图4A表示单抗609-IgG4的HPLC-IEC图谱；图4B表示609-302-(44CC)-134-IgG4的HPLC-IEC图谱；图4C表示609-302-(105CC)-134-IgG4的HPLC-IEC图谱。
图5为单抗609-IgG4及本发明的三特异性抗体的HPLC-IEC图谱。其中，图5A和图5B分别表示单抗609-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS图谱；图5C和图5D分别表示609-302-134-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS的图谱；图5E和图5F分别表示609-302-(44CC)-134-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS的图谱；图5G和图5H分别表示609-302-(105CC)-134-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS的图谱。
图6为本发明的三特异性抗体的刺激免疫反应的功能活性图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，经过大量的筛选，首次成功获得一种结构新颖的抗PD-1、HER-2和LAG-3的六价三特异性抗体。本发明的六价三特异性抗体为二个单体形成的二聚体，其中，每个单体包含重链、第一轻链和第二轻链。具体地，以天然抗体的结构为基础，设计并优化了第一轻链以及重链的结构，使在本发明三特异性抗体在保留抗PD-1、HER-2和LAG-3三特异性的同时，具有与单抗相似甚至更优的生物学活性和理化性质。在此基础上完成了本发明。
术语
本发明中，术语“抗体(Antibody，缩写Ab)”和“免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，缩写IgG)”是有相同结构特征的异四聚糖蛋白，其由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型(isotype)的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是恒定区，重链恒定区由三个结构域CH1、CH2、以及CH3构成。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区，轻链恒定区包括一个结构域CL；轻链的恒定区与重链恒定区的CH1结构域配对，轻链的可变区与重链的可变区配对。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)等。重链恒定区包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚型；轻链恒定区包括κ(Kappa)或λ(Lambda)。抗体的重链和轻链通过重链的CH1结构域和轻链的CL结构域之间的二硫键共价连接在一起，抗体的两条重链通过铰链区之间形成的多肽间二硫键共价连接在一起。
本发明中，术语“三特异性抗体(或三抗)”是指能同时特异性结合三种抗原(靶点)或三种表位的抗体分子。根据对称性，三特异性抗体可以分为结构对称的和不对称的分子。根据结合位点的多少，三特异性抗体可以分为三价、四价和多价分子。
本发明中，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同抗原决定簇的不同抗体的混合物)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们可以通过杂交瘤培养来合成，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明中，术语“人源化”是指其CDR来源于非人物种(优选小鼠)抗体，抗体分子中残余的部分(包括框架区和恒定区)来源于人抗体。此外，框架区残基可被改变以维持结合亲和性。
本发明中，术语“Fab”和“Fc”是指木瓜蛋白酶可将抗体裂解为两个完全相同的Fab段和一个Fc段。Fab段由抗体的重链的VH和CH1以及轻链的VL和CL结构域组成。Fc段即可结晶片段(fragment crystallizable，Fc)，由抗体的CH2和CH3结构域组成。Fc段无抗原结合活性，是抗体与效应分子或细胞相互作用的部位。
本发明中，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于重链可变区和轻链可变区中称为互补决定区(complementarity-determining region，CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为框架区(frame region，FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。
如本文所用，术语“框架区”(FR)指插入CDR间的氨基酸序列，即指在单一物种中不同的免疫球蛋白间相对保守的免疫球蛋白的轻链和重链可变区的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各具有四个FR，分别称为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相应地，轻链可变结构域可因此称作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重链可变结构域可因此表示为(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。优选地，本发明的FR是人抗体FR或其衍生物，所述人抗体FR的衍生物与天然存在的人抗体FR基本相同，即序列同一性达到85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
获知CDR的氨基酸序列，本领域的技术人员可轻易确定框架区FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
如本文所用，术语“人框架区”是与天然存在的人抗体的框架区基本相同的(约85％或更多，具体地90％、95％、97％、99％或100％)框架区。
如本文所用，术语“接头”或是指插入免疫球蛋白结构域中为轻链和重链的结构域提供足够的可动性以折叠成交换双重可变区免疫球蛋白的一个或多个氨基酸残基。在本发明中，优选的接头是指接头L1、L2和L3，其中，L1连接第一抗体的重链可变区与第二抗体的重链可变区，L2连接第二抗体的重链可变区与第三抗体的重链可变区，L3连接第一抗体的轻链可变区与第二抗体的轻链可变区。
合适的接头实例包括单甘氨酸(Gly)、或丝氨酸(Ser)残基，连接子中氨基酸残基的标识和序列可随着接头中需要实现的次级结构要素的类型而变化。
三特异性抗体
本发明的三特异性抗体是一种抗PD-1、HER-2和LAG-3的六价三特异性抗体，包括抗PD-1抗体部分、抗HER-2抗体部分和抗LAG-3抗体部分。
优选地，本发明抗PD-1抗体的序列如专利申请WO 2018/137576 A1中所述，本领域技术人员也可以通过本领域熟知的技术对本发明抗PD-1抗体进行修饰或改造，例如添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基，从而进一步增加抗PD-1的亲和力或结构稳定性，并通过常规的测定方法获得修饰或改造后的结果。
在本发明中，本发明的三特异性抗体还包括其保守性变异体，指与本发明三特异性抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
Figure BDA0003138926190000121
Figure BDA0003138926190000131
在本发明的一个优选实施例中，所获得的抗体的序列信息如下表1所示。
表1.本发明的抗体的序列信息
Figure BDA0003138926190000132
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-5个、1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸的具有PD-1、HER-2和LAG-3结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。
在本发明中，优选的取代包括，在本发明的三特异性抗体609VH-302VH-134-IgG4中，将302重链可变区的第44位的G替换为C；将609VL-302VL中的302轻链可变区的100位Q突变成C；
将609VH-302VH-134-IgG4中的302重链可变区的105位的Q突变成C；将609VL-302VL中的302轻链可变区的43位Q突变成C。
本发明中，术语“抗”、“结合”和“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。通常，抗体以小于大约10-7M，例如小于大约10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或更小的平衡解离常数(KD)结合该抗原。本发明中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。例如，使用表面等离子体共振术(Surface Plasmon Resonance，缩写SPR)在BIACORE仪中测定抗体与抗原的结合亲和力或使用ELISA测定抗体与抗原结合的相对亲和力。
本发明中，术语“价”是指抗体分子中存在指定数量的抗原结合位点。优选的，本发明的三特异性抗体具有六个抗原结合位点，是六价的。本发明中，抗原结合位点包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
本发明中，术语“表位”是指与抗体特异性结合的多肽决定簇。本发明的表位是抗原中被抗体结合的区域。
如本文所用，术语“第一轻链”是指包含针对不同靶标的抗体的轻链可变区的轻链。具体地，所述“第一轻链”包含针对第一靶标的抗体的轻链可变区和针对第二靶标的抗体的轻链可变区，其能够与针对第一靶标的抗体重链可变区和针对第二靶标的抗体重链可变区配对，形成特异性结合第一靶标的第一结合位点和特异性结合第二靶标的第二结合位点。
优选的，本发明中的“第一轻链”包含通过接头或直接连接的两个针对不同靶标的抗体轻链可变区。进一步的，本发明中的“第一轻链”可以通过柔性接头或键在不同的位置与重链配对。具体地，本发明中的“第一轻链”可以通过非共价键或共价键与三特异性抗体的重链配对。较佳地，本发明中的“第一轻链”通过共价键(如二硫键)与重链配对。
本发明的三特异性抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
编码核酸和表达载体
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明中，术语“表达载体”指携带表达盒用于表达特定目的蛋白或其他物质的载体，如质粒、病毒载体(如腺病毒、逆转录病毒)、噬菌体、酵母质粒或其他载体。代表性的例子包括但并不限于：pTT5，pSECtag系列，pCGS3系列，pcDNA系列载体等，以及其它用于哺乳动物表达系统的载体等。表达载体中包括连接于合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
本发明中，术语“宿主细胞”是指适用于表达上述表达载体的细胞，可以是真核细胞，如哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统均可用于本发明的融合蛋白的表达，CHO(中国仓鼠卵巢，Chinese Hamster Ovary)，HEK293，COS，BHK以及上述细胞的衍生细胞均可适用于本发明。
药物组合物和应用
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射(如腹膜内)、颅内注射、或腔内注射。
本发明中，术语“药物组合物”是指本发明的六价三特异性抗体可以和药学上可以接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的结合人PD-1的抗体或其抗原结合片段或六价三特异性抗体的氨基酸核心序列的构象完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的六价三特异性抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的六价三特异性抗体还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的六价三特异性抗体或其免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明提供了一种结构新颖的六价三特异性抗体；
(2)本发明的三特异性抗体不需要进行Fc修饰，不会产生错配问题，制备方法简便。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例中使用的蛋白表达和纯化方法说明如下：将目的基因构建到表达载体pcDNA3.4中，利用PEI(Polyethylenimine)将构建好的表达载体或表达载体的组合转入FreeStyleTM 293-F Cells细胞(后文简称HEK293F，购自Thermo Fisher Scientific)中以表达抗体或重组蛋白，HEK293F细胞在Free Style 293Expression Medium(购自ThermoFisher Scientific)中培养5天后收取细胞上清，然后用Protein A亲和层析纯化抗体。
以下实施例中使用的ELISA检测方法说明如下：用相应的重组蛋白包被微孔板，用含有1％牛血清白蛋白的PBST(PBST为含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液)封闭微孔板。将待测抗体进行梯度稀释，然后转移到上述包被重组蛋白的微孔板中，室温孵育半小时后洗板；加入适当稀释的HRP(Horseradish Peroxidase)标记的羊抗人抗体(Fc specific，购自Sigma)，室温孵育半小时后洗板；每孔加入100μl以TMB(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine)为底物的显色液，室温孵育1～5min；加50μl终止液(2M H2SO4)终止反应；酶标仪(SpectraMax 190)读取OD450，用GraphPad Prism7进行作图和数据分析，并计算EC50。
以下实施例中使用的理化性质检测方法说明如下：
HPLC-SEC
抗体是高分子量蛋白质，具有高度复杂的二级和三级结构。由于翻译后修饰、聚集和降解等变化，抗体在生物化学和生物物理特性方面是异质的。当通过分离技术分析三特异性抗体时，通常会观察到变体、聚集体和降解片段，它们的存在可能会损害安全性和有效性。在生产和存储抗体的过程中容易出现聚集体、降解片段和不完整组装的分子。本发明使用高效液相色谱-尺寸排阻色谱(High-performance liquid chromatography-sizeexclusion chromatography，HPLC-SEC)检测样品中上述杂质的含量。聚集体的分子量要大于单体，因此相应峰的保留时间较短；降解片段或不完整组装分子的分子量要小于单体，因此相应峰的保留时间较长。HPLC-SEC所用色谱仪为Dionex Ultimate 3000；流动相配制方法如下：取适量20mM磷酸二氢钠母液，用20mM磷酸氢二钠调节PH至6.8±0.1；进样量：20μg；色谱柱为TSK G3000SWXL，规格为7.8×300mm 5μm；流速0.5ml/min，洗脱时间30min；柱温25℃，样品室温度10℃；检测波长214nm。
HPLC-IEC
许多翻译后修饰(例如N糖基化、C末端赖氨酸残基修饰、N末端谷氨酰胺或谷氨酸环化、天冬酰胺脱酰胺化、天冬氨酸异构化和氨基酸残基氧化等)会直接或间接地引起抗体表面电荷的改变，导致电荷异质性的产生。基于所带电荷可对电荷变体进行分离和分析，常用的分析方法有阳离子交换色谱法(cation exchange chromatography，CEX)和阴离子交换色谱法(anionexchange chromatography，AEX)。当通过基于色谱法的方法分析时，酸性种类(acidic species)和碱性种类(basic species)基于它们相对于主峰(main peak)的保留时间来定义。酸性种类是早于CEX的主峰或晚于AEX的主峰洗脱出来的变体，而碱性种类是晚于CEX的主峰或早于AEX的主峰洗脱出来的变体。酸性种类和碱性种类所对应的峰分别称作酸性峰和碱性峰。在生产和存储抗体的过程中容易产生电荷变体。在此使用高效液相色谱-离子交换色谱(High-performance liquid chromatography-ionexchangechromatography，HPLC-IEC)分析样品的电荷异质性。HPLC-IEC所用色谱仪为DionexUltimate 3000；流动相A：20mM PB pH6.3，流动相B：20mM PB+200mM NaCl pH6.3，两种流动相混合的比例按照预先设置的程序随时间而改变，流速1.0ml/min；色谱柱：ThermoPropacTM WCX-10；柱温30℃，样品室温度10℃；进样量：20μg；检测波长：214nm。
CE-SDS
本发明使用CE-SDS(Capillary Electrophoresis-Sodium Dodecyl Sulfate)分析样品中降解片段或不完整组装的分子的含量。CE分为非还原和还原两种类型，用于前者的样品在变性时不需要用还原剂DTT将分子内的二硫键破坏，而用于后者的样品在变性时需要用还原剂DTT将分子内的二硫键破坏。非还原和还原CE-SDS分别记作NR-CE-SDS和R-CE-SDS。所用Maurice CE-SDS分析系统购自ProteinSimple，配备UV214nm检测器。
实施例1构建抗PD-1、HER-2和LAG-3的三特异性抗体
实施例1.1序列
mAb1-25-Hu(后文简称为609-IgG4)是抗PD-1人源化单克隆抗体，其重链和轻链氨基酸序列来自于WO 2018/137576 A1中的SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10(即本发明中的SEQID NO：5和6)。609-IgG4的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1和2所示。609-IgG4重链恒定区为人IgG4(SEQ ID NO：3，铰链区含S228P突变)，轻链恒定区为人Kappa(SEQ ID NO：4)。在此，将609-IgG4重链和轻链的编码基因分别命名为609-IgG4-HC和609-IgG4-LC。将609-IgG4-HC和609-IgG4-LC基因分别构建到pcDNA3.4表达载体中，两种载体组合后表达并纯化抗体，所得抗体命名为609-IgG4。
609-IgG4重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRYTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSHYLQMNSLRAEDTAVYFCASPYGGYFDVWGQGTLVTVSS
609-IgG4轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：2)：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNFLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNSWPHTFGQGTKVEIK
609-IgG4重链恒定区氨基酸序列((SEQ ID NO：3)：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
609-IgG4轻链恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO：4)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
609-IgG4重链氨基酸序列(SEQ ID NO：5)：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRYTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSHYLQMNSLRAEDTAVYFCASPYGGYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
609-IgG4轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：6)：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNFLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNSWPHTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
从公开的文献(Magdelaine-Beuzelin C,Kaas Q,Wehbi V,et al.Structure-function relationships of the variable domains of monoclonal antibodiesapproved for cancer treatment[J].Critical reviews in oncology/hematology,2007,64(3)：210-225.)中获得Trastuzumab(抗HER-2人源化单克隆抗体)的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：7和8)。该重链可变区和轻链可变区分别与人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：9)和人Kappa轻链恒定区(SEQ ID NO：4)相连，获得全长的重链和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：10和11)。在此，将全长重链和轻链的编码基因分别命名为302-HC和302-LC。将302-HC和302-LC的编码基因分别构建到pcDNA3.4表达载体中，两种载体组合后表达并纯化抗体，所得抗体命名为302-IgG1。
302-IgG1的重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：7)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS
302-IgG1的轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：8)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
人IgG1重链恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO：9)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
302-IgG1的重链氨基酸序列(SEQ ID NO：10)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
302-IgG1的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：11)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
134-Hu-IgG4-C91S(后文简称为134-IgG4)是抗人LAG-3人源化单克隆抗体，其重链和轻链氨基酸序列来自于WO 2020/173378 A1中的SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：36(即本发明中的SEQ ID NO：12和13)。134-IgG4单抗的重链恒定区为人IgG4(铰链区含有S228P突变)，轻链恒定区为人Kappa。在此，将134-IgG4重链和轻链的编码基因分别命名为134-IgG4-HC和134-IgG4-LC。将134-IgG4-HC和134-IgG4-LC的基因分别构建到pcDNA3.4表达载体中，两种载体组合后表达并纯化抗体，所得抗体命名为134-IgG4。
134人源化重链134-IgG4-HC的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTAYYMNWVRQAPGQSLEWIGVINPYNGDSSYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDGYYRWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(其中下划线部分为重链互补决定区)
134人源化轻链134-IgG4-LC的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSRLNWLQQKPGKSIKRLIYATSSLESGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDFATYYCLQSGS SPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(其中下划线部分为轻链互补决定区)。
实施例1.2三特异性抗体的构建
将609-IgG4的重链可变区通过人工连接子(三个串联的GGGGS)连接302-IgG1的重链可变区，再通过人工连接子(三个串联的GGGGS)连接人134-IgG4的重链(铰链区含有S228P突变)，通过此程序构建成的含有三个重链可变区的长重链基因命名为609VH-302VH-134-IgG4(SEQ ID NO：14)。将609的轻链可变区通过人工连接子(三个串联的GGGGS)连接302-IgG1的轻链可变区，通过此程序构建成的含有两个轻链可变区的长轻链基因命名为609VL-302VL(SEQ ID NO：15)。
将上述序列的编码基因分别构建到pcDNA3.4表达载体中，将609VH-302VH-134-IgG4、609VL-302VL和134-IgG4-LC的表达载体组合，表达并纯化抗体，所得抗体命名为609-302-134-IgG4。
609VH-302VH-134-IgG4氨基酸序列：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRYTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSHYLQMNSLRAEDTAVYFCASPYGGYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTAYYMNWVRQAPGQSLEWIGVINPYNGDSSYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDGYYRWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：14)
609VL-302VL氨基酸序列：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNFLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNSWPHTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：15)
为增强三特异性抗体的稳定性，在此尝试在609VH-302VH-134-IgG4和609VL-302VL之间引入一对二硫键。根据文献(Cho,Hyun-Soo&Mason,Karen&Ramyar,Kasra&Stanley,Ann&Gabelli,Sandra&Denney,Dan&Leahy,Daniel.(2003).Structure of theextracellular region of HER2 alone and in complex with the HerceptinFab.Nature.421.756-60.10.1038/nature01392.)报道的Trastuzumab的晶体结构(相关信息见https://www.rcsb.org/structure/1N8Z)，在此选择处于VH和VL界面上的并且空间上相近的氨基酸残基对并突变成半胱氨酸，这些配对的氨基酸残基分别是：VH上的44位氨基酸和VL上的100位氨基酸，VH上的105位氨基酸和VL上的43位氨基酸(上述氨基酸残基按照Kabat规则编码)。
在此，将609VH-302VH-134-IgG4中的302重链可变区的44位的G突变成C，所得序列命名为609VH-302VH(44C)-134-IgG4；同时将609VL-302VL中的302轻链可变区的100位Q突变成C，所得序列命名为609VL-302VL(100C)；
609VH-302VH(44C)-134-IgG4氨基酸序列：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRYTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSHYLQMNSLRAEDTAVYFCASPYGGYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKCLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTAYYMNWVRQAPGQSLEWIGVINPYNGDSSYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDGYYRWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：16，其中下划线处为突变位点)
609VL-302VL(100C)氨基酸序列：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNFLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNSWPHTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGCGTKVEIK(SEQ ID NO：17，其中下划线处为突变位点)
在此，将609VH-302VH-134-IgG4中的302重链可变区的105位的Q突变成C，所得序列命名为609VH-302VH(105C)-134-IgG4；同时将609VL-302VL中的302轻链可变区的43位A突变成C，所得序列命名为609VL-302VL(43C)；
609VH-302VH(105C)-134-IgG4氨基酸序列：
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRYTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSHYLQMNSLRAEDTAVYFCASPYGGYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGCGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTAYYMNWVRQAPGQSLEWIGVINPYNGDSSYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDGYYRWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：18，其中下划线处为突变位点)
609VL-302VL(43C)氨基酸：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNFLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNSWPHTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKCPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：19，其中下划线处为突变位点)
将上述序列的编码基因分别构建到pcDNA3.4表达载体中，对应的载体组合后(609VH-302VH-134-IgG4、609VL-302VL和134-IgG4-LC组合，609VH-302VH(44C)-134-IgG4、609VL-302VL(100C)和134-IgG4-LC组合，609VH-302VH(105C)-134-IgG4、609VL-302VL(43C)和134-IgG4-LC组合)表达并纯化抗体，所得抗体分别命名为609-302-134-IgG4、609-302-(44CC)-134-IgG4和609-302-(105CC)-134-IgG4。
本发明中的抗体名称如表2所示:
表2.本发明的抗体名称
Figure BDA0003138926190000231
实施例1.3 ELISA测定相对亲和力
在此分别用带有多聚组氨酸标签的HER2胞外段重组蛋白(记作HER2-His，购自Sino Biological Inc.)、PD-1胞外段重组蛋白(记作PD1-His，购自Sino BiologicalInc.)和LAG-3胞外段重组蛋白(记作LAG3-His，购自ACROBiosystems)包被微孔板，包被浓度分别为20ng/孔、20ng/孔和10ng/孔。
表3.ELISA测定相对亲和力的EC50结果
Figure BDA0003138926190000232
Figure BDA0003138926190000241
如图2A-C所示，609-302-134-IgG4、609-302-(44CC)-134-IgG4和609-302-(105CC)-134-IgG4均能够有效结合PD-1、HER-2和LAG-3，这表明它们是三特异性抗体，EC50汇总于表3。
实施例1.4物理化学性质的表征
1.4.1 HPLC-SEC
图3A表示单抗609-IgG4的HPLC-SEC图谱，主峰占比99.87％。
图3B表示609-302-134-IgG4的HPLC-SEC图谱，主峰占比98.24％。
图3C表示609-302-(44CC)-134-IgG4的HPLC-SEC图谱，主峰占比98.4％。
图3D表示609-302-(105CC)-134-IgG4的HPLC-SEC图谱，主峰占比98.06％。
上述结果表明，经过一步Protein A亲和层析纯化之后，三特异性抗体的SEC纯度可以达到98％以上，尺寸异质性接近单克隆抗体。
1.4.2 HPLC-IEC
图4A表示单抗609-IgG4的HPLC-IEC图谱，主峰占比71.45％。
图4B表示609-302-(44CC)-134-IgG4的HPLC-IEC图谱，主峰占比71.62％。
图4C表示609-302-(105CC)-134-IgG4的HPLC-IEC图谱，主峰占比66.12％。
上述结果表明，经过一步Protein A亲和层析纯化之后，三特异性抗体的IEC主峰可以达到66％以上，电荷异质性与单克隆抗体相当。
1.4.3 CE-SDS
图5A和图5B分别表示单抗609-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS图谱，NR-CE-SDS图谱中主峰Peak2.672占比98.9％；R-CE-SDS图谱中两个主峰Peak1.499(对应轻链)和Peak1.888(对应重链)分别占比31.3％和67.7％，两主峰占比之和为99.0％。
图5C和图5D分别表示609-302-134-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS的图谱，NR-CE-SDS图谱中两个主峰Peak1.525和Peak2.893分别占比18.6％和80.8％，在609-302-134-IgG4分子中609VL-302VL没有与609VH-302VH-134-IgG4形成共价二硫键，因此认为Peak1.525对应的多肽链为609VL-302VL；R-CE-SDS图谱中两个主峰Peak1.518(对应轻链)和Peak2.158(对应重链)分别占比34.8％和62.5％，两主峰占比之和为97.3％。
图5E和图5F分别表示609-302-(44CC)-134-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS的图谱，NR-CE-SDS图谱中主峰Peak3.018占比96.4％；R-CE-SDS图谱中两个主峰Peak1.515(对应轻链)和Peak2.159(对应重链)分别占比34.9％和62.0％，两主峰占比之和为96.9％。图5G和图5H分别表示609-302-(105CC)-134-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS的图谱，NR-CE-SDS图谱中主峰Peak3.020占比91.8％；R-CE-SDS图谱中两个主峰Peak1.508(对应轻链)和Peak2.147(对应重链)分别占比36.6％和56.9％，两主峰占比之和为93.5％。
上述结果表明，经过一步Protein A亲和层析纯化之后，三特异性抗体609-302-(44CC)-134-IgG4的NR-CE-SDS和R-CE-SDS纯度均可以达到96％以上，与单抗609-IgG4最为相近。
实施例2测定本发明的三特异性抗体刺激免疫反应的功能活性
在RPMI 1640中加入以下添加剂：10％胎牛血清；1％MEM Non-Essential AminoAcids Solution；1％Sodium Pyruvate；1％HEPES；1‰2-Mercaptoethanol；1％Penicillin-Streptomycin；1％GlutaMAX(上述培养基和添加剂购自Thermo FisherScientific)。用上述RPMI 1640完全培养基将新鲜分离的人外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC。PBMC购自Allcells，货号：PB005-C)洗涤并重悬，加入一定量的超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)。SEB为实验室内部制备，序列来自Uniprot(Entry:P01552)，使用大肠杆菌表达，用Ni-NTA亲和层析法纯化。将PBMC细胞悬液接种到圆底96孔细胞培养板中，每孔150μl悬液和20万个细胞；在上述96孔板中加入50μl梯度稀释的相关抗体；将96孔板置于37℃细胞培养箱中孵育4天。从96孔板中取适量细胞培养上清。用双抗体夹心法(sandwich ELISA)检测上清中的IL-2(相关检测用的配对抗体购自BD Biosciences)。用酶标仪(SpectraMax 190)读取OD450，用GraphPad Prism7进行数据分析、作图并计算EC50。
表4.本发明的三特异性抗体的功能活性参数
Figure BDA0003138926190000251
Figure BDA0003138926190000261
如图6和表4所示，609-IgG4比134-IgG4表现出更小的EC50和更高的Top(高平台)，表明609-IgG4功能活性比134-IgG4高。609-302-(44CC)-134-IgG4和609-302-(105CC)-134-IgG4展现出相近的EC50和Top，说明这两种三特异性抗体的功能活性相当。与609-IgG4相比，609-302-(44CC)-134-IgG4和609-302-(105CC)-134-IgG4展现出更高的Top，大致在抗体浓度大于1nM时(即Log值大于0时)，两种三特异性抗体刺激PBMC分泌IL-2的能力明显强于单克隆抗体609-IgG4和134-IgG4。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 三生国健药业（上海）股份有限公司
<120> 三特异性抗体、其制备方法和用途
<130> P2021-1251
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser His Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 5
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser His Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 6
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 10
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 11
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 12
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Arg Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 13
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Gly Ser Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 14
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser His Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
130 135 140
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn
145 150 155 160
Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr
180 185 190
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys
195 200 205
Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp
225 230 235 240
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val
260 265 270
Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser
275 280 285
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ala Tyr Tyr Met Asn Trp Val
290 295 300
Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Asn Pro
305 310 315 320
Tyr Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr
325 330 335
Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser
340 345 350
Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Gly
355 360 365
Tyr Tyr Arg Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
370 375 380
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
385 390 395 400
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
405 410 415
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
420 425 430
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
435 440 445
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
450 455 460
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
465 470 475 480
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
485 490 495
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
500 505 510
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
515 520 525
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
530 535 540
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
545 550 555 560
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
565 570 575
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
580 585 590
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
595 600 605
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
610 615 620
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
625 630 635 640
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
645 650 655
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
660 665 670
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
675 680 685
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
690 695 700
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
705 710
<210> 15
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
115 120 125
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
130 135 140
Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln
145 150 155 160
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp
180 185 190
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
195 200 205
Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
210 215 220
Lys Val Glu Ile Lys
225
<210> 16
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser His Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
130 135 140
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn
145 150 155 160
Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys
165 170 175
Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr
180 185 190
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys
195 200 205
Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp
225 230 235 240
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val
260 265 270
Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser
275 280 285
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ala Tyr Tyr Met Asn Trp Val
290 295 300
Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Asn Pro
305 310 315 320
Tyr Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr
325 330 335
Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser
340 345 350
Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Gly
355 360 365
Tyr Tyr Arg Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
370 375 380
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
385 390 395 400
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
405 410 415
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
420 425 430
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
435 440 445
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
450 455 460
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
465 470 475 480
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
485 490 495
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
500 505 510
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
515 520 525
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
530 535 540
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
545 550 555 560
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
565 570 575
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
580 585 590
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
595 600 605
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
610 615 620
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
625 630 635 640
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
645 650 655
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
660 665 670
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
675 680 685
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
690 695 700
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
705 710
<210> 17
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
115 120 125
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
130 135 140
Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln
145 150 155 160
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp
180 185 190
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
195 200 205
Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Cys Gly Thr
210 215 220
Lys Val Glu Ile Lys
225
<210> 18
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser His Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
130 135 140
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn
145 150 155 160
Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr
180 185 190
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys
195 200 205
Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp
225 230 235 240
Tyr Trp Gly Cys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val
260 265 270
Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser
275 280 285
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ala Tyr Tyr Met Asn Trp Val
290 295 300
Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Asn Pro
305 310 315 320
Tyr Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr
325 330 335
Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser
340 345 350
Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Gly
355 360 365
Tyr Tyr Arg Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
370 375 380
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
385 390 395 400
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
405 410 415
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
420 425 430
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
435 440 445
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
450 455 460
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
465 470 475 480
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
485 490 495
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
500 505 510
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
515 520 525
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
530 535 540
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
545 550 555 560
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
565 570 575
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
580 585 590
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
595 600 605
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
610 615 620
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
625 630 635 640
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
645 650 655
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
660 665 670
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
675 680 685
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
690 695 700
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
705 710
<210> 19
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
115 120 125
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
130 135 140
Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln
145 150 155 160
Lys Pro Gly Lys Cys Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp
180 185 190
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
195 200 205
Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
210 215 220
Lys Val Glu Ile Lys
225

Claims (15)

1.一种六价三特异性抗体，其特征在于，所述的六价三特异性抗体为二个单体形成的二聚体，其中，每个单体包含重链、第一轻链和第二轻链；
所述的重链从N端至C端包括串联的针对第一靶标的抗体重链可变区元件Z1、针对第二靶标的抗体重链可变区元件Z2、针对第三靶标的抗体重链可变区元件Z3以及抗体重链恒定区Z4；
所述的第一轻链和第二轻链分别与所述重链配合，使得所述的六价三特异性抗体特异性结合于第一靶标、第二靶标和第三靶标。
2.如权利要求1所述的六价三特异性抗体，其特征在于，包含重链、第一轻链和第二轻链；其中，每个所述的重链具有下式I的结构：
Z1-Z2-Z3-Z4 (I)
Z1为针对第一靶标的重链可变区元件；
Z2为针对第二靶标的重链可变区元件；
Z3为针对第三靶标的重链可变区元件；
Z4为抗体重链恒定区CH1、CH2和CH3；
“-”各自独立地为键或接头(linker)；
其中，所述的第一轻链和第二轻链分别与重链配合，使得所述的六价三特异性抗体特异性结合于第一靶标、第二靶标和第三靶标；所述第一轻链具有下式II的结构：
Z5-Z6 (II)；
其中，Z5为针对第一靶标的轻链可变区元件；Z6为针对第二靶标的轻链可变区元件；
所述第二轻链具有下式III的结构：
Z7-Z8 (III)；
其中，Z7为针对第三靶标的轻链可变区元件；Z8为轻链恒定区。
3.如权利要求1或2所述的六价三特异性抗体，其特征在于，所述第一靶标、第二靶标和第三靶标为PD-1、HER-2和LAG-3。
4.如权利要求1-3中任一项所述的六价三特异性抗体，其特征在于，所述的接头为长度为1-35个氨基酸的肽接头，较佳地6-30个氨基酸的肽接头。
5.如权利要求1-4中任一项所述的六价三特异性抗体，其特征在于，所述六价三特异性抗体包含两个单体，每个单体含有重链和第一轻链、和第二轻链，其中每个单体具有下式IV结构：
Figure FDA0003138926180000021
式中，
VHA-L1-VHB-L2-VHC-CH1-CH2-CH3为重链；
VLA-L3-VLB为第一轻链；
VLC-CL为第二轻链；
VHA为抗PD-1抗体的重链可变区；
VHB为抗HER-2抗体的重链可变区；
VHC为抗LAG-3抗体的重链可变区；
CH1、CH2和CH3分别为抗体重链恒定区CH1、CH2和CH3；
VLA为抗PD-1抗体的轻链可变区；
VLB为抗HER-2抗体的轻链可变区；
VLC为抗LAG-3抗体的轻链可变区；
CL为抗体的轻链恒定区；
L1、L2、L3各自独立地为接头(linker)；
“-”各自独立地为键；
“～”代表二硫键或共价键；
其中，所述的六价三特异性抗体同时结合于PD-1、HER-2和LAG-3。
6.如权利要求1-5中任一项所述的六价三特异性抗体，其特征在于，所述接头为柔性肽接头；其中，所述的柔性肽接头包括6-30个氨基酸，较佳地10-25个氨基酸。
7.如权利要求1-6中任一项所述的六价三特异性抗体，其特征在于，所述的六价三特异性抗体包含两条重链、两条第一轻链和两条第二轻链，
其中，所述的六价三特异性抗体中的重链、第一轻链和第二轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID No:14、15和13所示；或
所述的六价三特异性抗体中的重链、第一轻链和第二轻链的氨基酸序列分别如SEQ IDNo:16、17和13所示；或
所述的六价三特异性抗体中的重链、第一轻链和第二轻链的氨基酸序列分别如SEQ IDNo:18、19和13所示。
8.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子编码如权利要求1-7中任一项所述的六价三特异性抗体。
9.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有如权利要求8所述的核酸分子。
10.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有如权利要求9所述的表达载体。
11.如权利要求1-7中任一项所述的六价三特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
(a)在表达条件下，培养如权利要求10所述的宿主细胞，从而表达所述的六价三特异性抗体；
(b)分离并纯化(a)所述的六价三特异性抗体。
12.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有如权利要求1-7中任一项所述的六价三特异性抗体和药学上可接受的载体。
13.如权利要求1-7中任一所述的六价三特异性抗体或如权利要求12所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述癌症选自下组：黑素瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、食道癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤及其它赘生性恶性疾病。
15.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包括：
(a)如权利要求1-7中任一项中所述的六价三特异性抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
CN202110726683.9A 2021-06-29 2021-06-29 三特异性抗体、其制备方法和用途 Pending CN115536749A (zh)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110726683.9A CN115536749A (zh) 2021-06-29 2021-06-29 三特异性抗体、其制备方法和用途
PCT/CN2022/100105 WO2023273958A1 (zh) 2021-06-29 2022-06-21 三特异性抗体、其制备方法和用途
EP22831776.4A EP4365205A1 (en) 2021-06-29 2022-06-21 Trispecific antibody and preparation method therefor and use thereof
TW111123904A TW202305008A (zh) 2021-06-29 2022-06-27 三特異性抗體、其製備方法和用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110726683.9A CN115536749A (zh) 2021-06-29 2021-06-29 三特异性抗体、其制备方法和用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115536749A true CN115536749A (zh) 2022-12-30

Family

ID=84691286

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110726683.9A Pending CN115536749A (zh) 2021-06-29 2021-06-29 三特异性抗体、其制备方法和用途

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP4365205A1 (zh)
CN (1) CN115536749A (zh)
TW (1) TW202305008A (zh)
WO (1) WO2023273958A1 (zh)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3237449A2 (en) 2014-12-22 2017-11-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
EP3307776A1 (en) 2015-06-15 2018-04-18 Numab Innovation AG Hetero-dimeric multi-specific antibody format
CN108341871A (zh) 2017-01-24 2018-07-31 三生国健药业（上海）股份有限公司 抗pd-1单克隆抗体及其制备方法和应用
JP2021509896A (ja) * 2018-01-08 2021-04-08 ナンジン レジェンド バイオテック カンパニー，リミテッドＮａｎｊｉｎｇ Ｌｅｇｅｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． 多重特異性抗原結合タンパク質及びその使用方法
WO2019148412A1 (en) * 2018-02-01 2019-08-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-pd-1/lag3 bispecific antibodies
EP3774910A1 (en) * 2018-04-05 2021-02-17 Novartis AG Trispecific binding molecules against cancers and uses thereof
CN111620949A (zh) 2019-02-28 2020-09-04 三生国健药业（上海）股份有限公司 结合人lag-3的抗体、其制备方法和用途

Also Published As

Publication number Publication date
TW202305008A (zh) 2023-02-01
EP4365205A1 (en) 2024-05-08
WO2023273958A1 (zh) 2023-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200164077A1 (en) Design and development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects
EP2566895B1 (en) Anti-erbb3 antibodies
WO2020043184A1 (zh) 抗pd-1-抗vegfa的双功能抗体、其药物组合物及其用途
CN113166220A (zh) 创新细胞因子前药
TWI631136B (zh) 單特異性及雙特異性抗ｉｇｆ－１ｒ及抗ｅｒｂｂ３抗體
JP7258556B2 (ja) Ｅｇｆｒ及びｈｅｒ２をターゲティングする二重特異性抗体
KR20080096827A (ko) 항체 제제
JP2023538945A (ja) 抗ｒｏｒ１抗体及び関連の二重特異性結合タンパク質
JP2022116166A (ja) Ｃｄ３８及びｐｄ－ｌ１に対する結合分子
TWI815305B (zh) Pd-1/vegf四價雙特異性抗體、其製備方法和用途
CN116096897A (zh) 抗4-1bb-抗pd-l1双特异性抗体、其药物组合物及用途
JP2022546002A (ja) ４価の対称型二重特異性抗体
WO2021244553A1 (zh) 一种抗pd-l1和egfr的四价双特异性抗体
CN111788229A (zh) Csf1r结合剂
CN112500491B (zh) 一种特异性中和辅助性T细胞TGF-β信号的双特异性抗体、其药物组合及其用途
EP4155318A1 (en) Bispecific antibody and use thereof
CN115536749A (zh) 三特异性抗体、其制备方法和用途
JP2022545925A (ja) 抗ｔｆｐｉモノクローナル抗体
WO2022111535A1 (zh) 结合her2的多价双特异性抗体、其制备方法和用途
WO2024032617A1 (zh) 异多聚体蛋白质及其制备方法
WO2023166098A1 (en) Bispecific antibodies binding to her-3 and to either her-2 or egfr
CN116284427A (zh) 抗muc17/cd3双特异性抗体、其制备方法及用途
CN115698087A (zh) 抗pdl1×kdr的双特异性抗体
CN116284408A (zh) 结合人muc17的抗体、其制备方法及用途
CN115724985A (zh) 一种cdc平台抗体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication