JP2022546002A

JP2022546002A - ４価の対称型二重特異性抗体

Info

Publication number: JP2022546002A
Application number: JP2022501314A
Authority: JP
Inventors: 張敬; 方麗娟; 厳永祥; 曾亮; 周鵬飛
Original assignee: 武▲漢▼友芝友生物制▲薬▼有限公司
Priority date: 2019-07-11
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2022-11-02
Also published as: EP3998286A4; EP3998286A1; US20230080842A1; CA3146381A1; CN112513097A; AU2019456113A1; KR20220044748A; CN112513097B; ZA202201796B; MX2022000456A; CN114539419A; WO2021003739A1; CN113968910A; BR112022000416A2

Abstract

【要約】本発明は、2つの同じ融合重鎖及び2つの同じ融合軽鎖を含み、F（ab）2－（Fv）2－Fc構造を持つ4価の対称型二重特異性抗体に関する。

Description

本発明は抗体分野に属する。具体的には、本発明は、二重特異性抗体、それを含む医薬組成物、及びそれらの使用に関する。

二重特異性抗体（Bispecific antibody、BsAb）は、2種の異なる結合特異性を有する抗体又は抗体類の分子である。二重特異性抗体は、生物医学に汎用され、特に、腫瘍に対する免疫治療に応用されている。

二重特異性抗体は、例えば化学工学、細胞工学ならびに遺伝子工学の方法で調製することができる。遺伝子工学の優勢は、容易に抗体を改変することができ、二重特異性 IgG（BsIgG）、添付IgG（appended IgG）、二重特異性抗体断片（BsAb fragments）、二重特異性融合タンパク質（Bispecific fusion protein）及び二重特異性抗体コンジュゲート（BsAb conjugates）の五つの類を含み、様々な形式の二重特異性抗体断片がをデザイン・生産する事ができる（Christoph Spiess, Qianting Zhai, Paul J. Carter, Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Molecular Immunology 67（2015）95-106を参照）。

第１類：天然モノクローナル抗体と似ている構造と分子量を有し、２つの異なるFabを含む二重特異性 IgGである。（1）早期のTriomab技術では、ラットとマウスのハイブリドーマを再融合させることで「ハイブリッド-ハイブリドーマ」を形成して、マウス-ラットキメラ二重特異性抗体を得て、ラット、マウスのFcによる親和性フィラー選択性によって、精製して目的生成物が得られる。この技術は、発現量が低く、精製収率が低い欠点がある。（2）後期には、抗体工学技術、例えばロイシンジッパー（Lucine zipper）、「突起-空隙ペアリング構造」（Knobs-into-holes）又は静電ステアリング（electrostatic steering）によってFcを改変して、２つの異なる重鎖でヘテロダイマーを形成し、さらに共用軽鎖（common light chain）、「Knobs-into-holes」又は静電ステアリング技術を利用して、軽-重鎖が正しくペアリングさせ、あるいは異なる軽鎖サブタイプであるκ鎖とλ鎖をデザインし、それぞれ、κ鎖とλ鎖に対する特異的な親和性フィラーにより精製して、正しい目的生成物が得られる。この類の二重特異性抗体は、天然抗体に近い薬物動態学を有しているが、不純物の同定と除去が難しいという欠点がある。

第2類：天然モノクローナル抗体IgGを骨格として、抗体の重鎖又は軽鎖のN末端又はC末端に、例えば可変領域断片（Fv）、単鎖可変領域フラグメント（ScFv）、抗原結合断片（Fab）又はポリペプチドのような抗原結合ドメインを融合している添付IgGである。この類の二重特異性抗体は、150kDaより大きい分子量を有し、主として対称な構造を持って、その薬物動態学が天然抗体に類似し、より長い半減期さえを有している。精製の面から一定の利点を有するが、発現量が低く、分子の安定性が低いという欠点がある。

第3類：抗体可変領域断片が保有され、部分又は全部の抗体定常領域までが欠失され、重鎖可変領域断片（VH）と軽鎖可変領域断片（VL）が一般にリンカー（linker）たんぱく質を介して連結してScFvを形成し、あるいは自発にペアリングになってFvを形成している、二重特異性抗体断片である。この類の二重特異性抗体は、150kDaを超えない分子量を有し、半減期が短い。発現量がモノクローナル抗体のレベルを達成することは困難であり、分子の安定性が低く、精製時の収率が低いという欠点がある。

第4類：抗体可変領域断片が保有され、同時に他のたんぱく質又はドラッグの分子、例えばT細胞受容体の定常領域、ヒト血清アルブミン又は毒素蛋白などを融合する二重特異性融合タンパク質。この類の二重特異性抗体は、75～160kDaの間の分子量を有し、精製プロセスへの挑戦になり、分子の安定性も一定なリスクがある。

第5類：２つの異なるモノクローナル抗体又はScFvを、化学方法にてコンジュゲートし合った、二重特異性抗体コンジュゲート。この類の抗体は、プロセスが煩雑で、終収率が低いため、現在、世界にはほぼ使用されていない。

上に述べた各類の二重特異性抗体は、いずれも多少の欠点があるので、その製品が臨床に用いられば、潜在的なリスクがある。これらのリスクを解消するために、本出願は新規な二重特異性抗体を提供する。

本出願は、新規な二重特異性抗体の構築及び製造方法を提供する。具体的構造を図１に示す。本出願のすべての抗体は、ヒトIgG定常領域を有し、添付IgG又は二重特異性抗体断片に属するものである。

本出願には、新規な二重特異性抗体の親和性、安定性、生物学活性及び薬効を検出し、さらに、3種の既存技術の二重特異性抗体を比較した。結果から、新規な二重特異性抗体がより良好な安定性、生物学活性及び薬効を有し、かつ、その発現と調製も簡便になることがわかった。

課題を解決するための技術案
本発明の二重特異性抗体は、2つの同じ融合重鎖及び2つの同じ融合軽鎖を有し、2つの融合重鎖をペアリングして、融合軽鎖と融合重鎖をペアリングする。

ある態様において、前記抗体は、融合重鎖の間の一つ又は複数のジスルフィド結合を含む。

ある態様において、前記抗体は、融合軽鎖と融合重鎖の間の一つ又は複数のジスルフィド結合を含む。

ある態様において、前記抗体の融合重鎖は、抗体a重鎖可変領域（VHa）、第一定常領域（CH1）、抗体b軽鎖可変領域（VLb）及びFc断片を有している。ここで、VLbがCH1とFcの間に位置して、リンカー又はペプチド結合を介して連結されている。前記抗体の融合軽鎖が、抗体a軽鎖可変領域（VLa）、軽鎖定常領域（CL）及び抗体b重鎖可変領域（VHb）を有している。ここで、VHbがCLのC末端に位置して、リンカー又はペプチド結合を介して連結されている。

ある態様において、前記抗体の融合重鎖は、抗体a重鎖可変領域（VHa）、第一定常領域（CH1）、抗体b重鎖可変領域（VHb）及びFc断片を有している。ここで、VHbがCH1とFcの間に位置して、リンカー又はペプチド結合を介して連結されている。前記抗体の融合軽鎖は、抗体a軽鎖可変領域（VLa）、軽鎖定常領域（CL）及び抗体b軽鎖可変領域（VLb）を有している。ここで、VLbがCLのC末端に位置して、リンカー又はペプチド結合を介して連結されている。

ある態様において、VHa-VLaペアリングは抗原Aに対する特異性を有し、前記抗原Aが、腫瘍細胞表面抗原、免疫細胞表面抗原、ウィルス、細菌、エンドトキシン、サイトカイン、例えばCD3、SLAMF7、CD38、BCMA、CD16a、CEA、PD-L1、PD-1、CTLA-4、TIGIT、LAG-3、VEGF、B7-H3、TGF-β、IL-10などを含むが、これらに限定されない。

ある態様において、VHb-VLbペアリングは抗原Bに対する特異性を有し、前記抗原Bが腫瘍細胞表面抗原、免疫細胞表面抗原、ウィルス、細菌、エンドトキシン、サイトカイン、例えばCD3、SLAMF7、CD38、BCMA、CD16a、CEA、PD-L1、PD-1、CTLA-4、TIGIT、LAG-3、VEGF、B7-H3、TGF-β、IL-10などを含むが、これらに限定されない。

具体的に、一の態様において、本発明は、以下の二重特異性抗体を提供する：二重特異性抗体であって、2つの同じ融合重鎖及び2つの同じ融合軽鎖を含み、前記2つの融合重鎖がペアリングを形成し、前記融合軽鎖及び前記融合重鎖がペアリングを形成し、前記融合重鎖が抗体a重鎖可変領域VHa、第一定常領域CH1、抗体b可変領域1及びFc断片を含み、前記抗体b可変領域1がリンカー2又はペプチド結合によりCH1と連結しており、かつ、リンカー3又はペプチド結合によりFcと連結しており、前記二重特異性抗体の融合軽鎖が抗体a軽鎖可変領域VLa、軽鎖定常領域CL及び抗体b可変領域2を含み、前記抗体b可変領域2がリンカー1又はペプチド結合によりCLのC末端と連結しており、ここで、
（1）前記抗体b可変領域1が抗体bの重鎖可変領域VHbである場合、前記抗体b可変領域2が抗体bの軽鎖可変領域VLbであり、又は
（2）前記抗体b可変領域1が抗体bの軽鎖可変領域VLbである場合、前記抗体b可変領域2が抗体bの重鎖可変領域VHbであり、
VHa-VLaペアリングが抗原Aを標的とし、VHb-VLbペアリングが抗原Bを標的とする二重特異性抗体。

一つの態様において、本発明の二重特異性抗体がF（ab）₂－（Fv）₂－Fc構造を持つ抗体であり、ここで、F（ab）₂が2つのVHa、2つのCH1、2つのVLa及び2つのCLを含み、（Fv）₂が2つのVH／VLb及び2つのVL／VHbを含み、前記VH／VLb及び前記VL／VHbの位置は互換性があり、前記Fc断片がヒンジ領域、第二定常領域CH2及び第三定常領域CH3を含む。

一つの態様において、前記二重特異性抗体が、N末端からC末端まで、式Iで示される構造を対称的に有し：

式中、
「～」はジスルフィド結合又は共有結合であり、
「-」はペプチド結合であり、
L1、L2、L3は、それぞれ独立にペプチド結合又はリンカー又はヒンジであり、
VHaは抗体aの重鎖可変領域であり、
VLaは抗体aした軽鎖可変領域であり、
CH1は第一定常領域であり、
Fcはヒンジ領域を含むFc断片であり、
CLは軽鎖定常領域であり、
Vb1は抗体b可変領域1であり、
Vb2は抗体b可変領域2である。

一つの態様において、前記二重特異性抗体は、N末端からC末端まで、式II又は式IIIで示される構造を対称的に有し：

式中、
「～」はジスルフィド結合又は共有結合であり、
「-」はペプチド結合であり、
L1、L2、L3は、それぞれ独立にペプチド結合又はリンカーであり、
VHaは抗体aの重鎖可変領域であり、
VLaは抗体aした軽鎖可変領域であり、
CLは軽鎖定常領域であり、
Hはヒンジ領域であり、
CH1、CH2、CH3は、それぞれ第一定常領域、第二定常領域及び第三定常領域であり、
VHbは抗体bの重鎖可変領域であり、
VLbは抗体bの軽鎖可変領域である。

一つの態様において、前記二重特異性抗体は、以下を含む：
（1）N末端からC末端まで順に抗体a重鎖可変領域VHa、第一定常領域CH1、リンカー2（又はペプチド結合）、抗体b重鎖可変領域VHb、リンカー3（又はペプチド結合）及びFc断片を含む融合重鎖；及び
（2）N末端からC末端まで順に抗体a軽鎖可変領域VLa、軽鎖定常領域CL、リンカー1（又はペプチド結合）及び抗体b軽鎖可変領域VLbを含む融合軽鎖。

一つの態様において、前記二重特異性抗体は、以下を含む：
（1）N末端からC末端まで、順に抗体a重鎖可変領域VHa、第一定常領域CH1、リンカー2（又はペプチド結合）、抗体b軽鎖可変領域VLb、リンカー3（又はペプチド結合）及びFc断片を含む融合重鎖；及び
（2）N末端からC末端まで、順に抗体a軽鎖可変領域VLa、軽鎖定常領域CL、リンカー1（又はペプチド結合）及び抗体b重鎖可変領域VHbを含む融合軽鎖。

一つの態様において、VHa-VLaペアリングが一つ又は複数の鎖間ジスルフィド結合を含み、VHb-VLbペアリングが一つ又は複数の鎖間ジスルフィド結合を含む。

一つの態様において、前記抗体b可変領域1が抗体bの軽鎖可変領域VLbであり、前記抗体b可変領域2が抗体bの重鎖可変領域VHbである。

一つの態様において、前記リンカー1～3が同一又は異なってもよく、前記リンカー1～3が、それぞれ独立に、SEQ ID NO:69-90からなる群から選択され、好ましくはSEQ ID NO:71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、82、83、85、86、87、88、89又は90からなる群から選択される。

一つの態様において、ヒンジ領域の配列はSEQ ID NO:91-103からなる群から選択される。

一つの態様において、CLの配列はSEQ ID NO:104-110からなる群から選択される。

一つの態様において、CH1の配列はSEQ ID NO:111-114からなる群から選択される。

一つの態様において、CH2の配列はSEQ ID NO:115-119からなる群から選択される。

一つの態様において、CH3の配列はSEQ ID NO:120-128からなる群から選択される。

一つの態様において、抗原A及び抗Bは同一又は異なってもよく、好ましくは、抗原A又は抗原Bが異なり、又は同じ抗原の異なるエピトープを表す。

一つの態様において、前記抗原A及び前記抗原Bがそれぞれ独立に、免疫細胞表面抗原、腫瘍抗原、ウィルス、細菌、エンドトキシン、サイトカイン、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

一つの態様において、前記抗原A及び/又は前記抗原BがPD-L1、PD-1、VEGFA、IL-10、IL-10R、BCMA、VEGF、TGF-β、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CEA、CD38、SLAMF7、B7-H3、Her2、EpCAM、CD19、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、EGFR、GD2、GD3、GM2、RANKL、CD3及び/又はCD16aからなる群から選択される。

一つの態様において、前記抗原A及び/又は抗原Bが、SEQ ID NO:129-145からなる群から選択される。

一つの態様において、前記抗原A及び/又は抗原BはPD-1であり、好ましくは、前記抗原A及び抗Bの一つはPD-1であり、もう一つはPD-L1、PD-1、VEGFA、IL-10、IL-10R、BCMA、VEGF、TGF-β、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CEA、CD38、SLAMF7、B7-H3、HER2、CD3又はCD16aからなる群から選択される。

一つの態様において、前記抗原A及び前記抗原Bが、以下からなる群から選択される：
PD-L1及びVEGF；
PD-1及びVEGF；
PD-L1及びTGF-β；
PD-1及びTGF-β；
PD-1及びCTLA-4；
PD-1及びLAG-3；
PD-1及びTIGIT；
PD-1及びIL-10；
SLAMF7及びCD16a；並びに、
er2及びHer2。

一つの態様において、前記VHa、VLa、VHb及び/又はVLbは、動物由来の抗体（例えば、ネズミ由来の抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体からなる群から選択される抗体由来のものであり、好ましくは、前記ヒト化抗体が完全ヒト化抗体と部分ヒト化抗体を含む。

一つの態様において、前記VHa及び/又はVHbは、下記のいずれか1項に記載の配列を含む:
a）SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、146、148のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するもの；
b） a）に記載のアミノ酸配列と80%、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；
c） a）に記載のアミノ酸配列と、一つ又は複数（好ましくは一つ又は数個、より好ましくは1、2又は3つ）の異なるアミノ酸を含むアミノ酸配列；及び/又は
前記VLa及び/又はVLbが、下記のいずれか1項に記載の配列を含む：
d）SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、147、149のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するもの；
e） d）に記載のアミノ酸配列と80%、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；
f） d）に記載のアミノ酸配列と一つ又は複数（好ましくは一つ又は数個、より好ましくは1、2又は3つ））の異なるアミノ酸を含むアミノ酸配列。

一つの態様において、前記二重特異性抗体は、Y100-A1、Y100-A2、Y100-A3、Y100-A4、Y100-A5、Y100-A6、Y100-A7、Y100-A8、Y100-A9、Y100-A10、Y100-A11、Y100-AC1、Y100-AC2、Y100-AC3、Y101-A1、Y101-A2、Y101-A3、Y101-A4、Y101-A5、Y103-A1、Y103-A2、Y103-A3、Y104-A1、Y104-A2、Y104-A3、Y105-A1、Y105-A2、Y105-A3、Y106-A1、Y106-A2、Y106-A3、Y106-A4、Y106-A5、Y110-A1、Y110-A2、Y110-A3、Y110-A4、Y116-A1、Y116-A2、Y116-A3、Y100-B1、Y100-B2、Y100-B3、Y100-B4、Y100-B5、Y100-B6、Y100-B7、Y100-B8、Y100-B9、Y100-B10、Y100-B11、Y100-B12、Y100-B13、Y100-BC1、Y100-BC2、Y100-BC3、Y101-B1、Y101-B2、Y101-B3、Y101-B4、Y101-B5、Y101-B6、Y103-B1、Y103-B2、Y103-B3、Y104-B1、Y104-B2、Y104-B3、Y105-B1、Y105-B2、Y105-B3、Y106-B1、Y106-B2、Y106-B3、Y106-B4、Y106-B5、Y110-B1、Y110-B2、Y110-B3、Y110-B4、Y110-B5、Y116-B1、Y116-B2、Y116-B3、Y140-A1、Y140-A2、Y140-A3、Y140-A4、Y140-B1、Y140-B2、Y140-B3、Y140-B4、又はそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。

一つの態様において、前記二重特異性抗体は、表27と表34のいずれかで示される二重特異性抗体から選択される。

一つの態様において、前記二重特異性抗体は、Y100-B6、Y100-B7、Y100-B8、Y100-B9、Y100-B10、Y100-B11、Y100-B12、Y100-BC1、Y100-BC2、Y100-BC3、Y101-B1、Y101-B2、Y101-B3、Y101-B4、Y101-B5、Y101-B6、Y103-B1、Y103-B2、Y103-B3、Y104-B1、Y104-B2、Y104-B3、Y105-B1、Y105-B2、Y105-B3、Y106-B1、Y106-B2、Y106-B3、Y106-B4、Y106-B5、Y110-B1、Y110-B2、Y110-B3、Y110-B4、Y110-B5、Y116-B1、Y116-B2、Y116-B3、Y140-B1、Y140-B2、Y140-B3、Y140-B4、又はそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。

一つの態様において、前記二重特異性抗体は、Y100-B7、Y100-B9、Y101-B2、Y101-B4、Y103-B2、Y104-B2、Y105-B2、Y106-B2、Y106-B4、Y110-B2、Y110-B4、Y116-B2、又はそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。

一つの態様において、前記二重特異性抗体は、以下からなる群から選択される：
（1）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:82及びSEQ ID NO:42を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（2）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:42を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（3）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:42を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（4）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:46を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（5）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:46を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（6）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:58を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（7）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:58を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（8）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:58を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（9）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:58を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（10）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:54を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（11）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:58を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（12）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:68を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（13）融合軽鎖がSEQ ID NO:68、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:58を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:67、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（14）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:60を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（15）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:60を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（16）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:60を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（17）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:60を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（18）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:60を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（19）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:34を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（20）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:34を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（21）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:34を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（22）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:28を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（23）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:28を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（24）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:28を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（25）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:30を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（26）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:30を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（27）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:30を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（28）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:58を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（29）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:58を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（30）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:60を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（31）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:60を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（32）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:60を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（33）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:64を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（34）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:64を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（35）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:64を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（36）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:64を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（37）融合軽鎖がSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:48を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:49、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（38）融合軽鎖がSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:48を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:49、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（39）融合軽鎖がSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:48を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:49、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（40）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:82及びSEQ ID NO:4１を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（41）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:4１を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（42）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:4１を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（43）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:45を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（44）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:45を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（45）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（46）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（47）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（48）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（49）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:5３を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（50）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:84及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（51）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:86及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（52）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（53）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:67を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（54）融合軽鎖がSEQ ID NO:68、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:67、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（55）融合軽鎖がSEQ ID NO:68、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:67、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（56）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:59を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（57）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:59を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（58）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:59を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（59）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:59を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（60）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:84及びSEQ ID NO:59を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（61）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:86及びSEQ ID NO:59を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（62）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:3３を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（63）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:86及びSEQ ID NO:3３を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（64）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:86及びSEQ ID NO:3３を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（65）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:27を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（66）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:27を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（67）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:27を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（68）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:29を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（69）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:29を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（70）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:29を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（71）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（72）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（73）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:59を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（74）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:59を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（75）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:59を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（76）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:6３を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（77）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:6３を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（78）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:6３を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（79）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:6３を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（80）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:6３を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（80）融合軽鎖がSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:47を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:49、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（81）融合軽鎖がSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:47を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:49、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（82）融合軽鎖がSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:47を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:49、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（83）融合軽鎖がSEQ ID NO:147、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:149を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:146、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（84）融合軽鎖がSEQ ID NO:149、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:147を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:148、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（85）融合軽鎖がSEQ ID NO:147、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:149を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:146、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（86）融合軽鎖がSEQ ID NO:149、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:147を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:148、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120。
（87）融合軽鎖がSEQ ID NO:147、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:148を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:146、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（88）融合軽鎖がSEQ ID NO:149、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:146を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:148、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（89）融合軽鎖がSEQ ID NO:147、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:148を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:146、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；又は
（90）融合軽鎖がSEQ ID NO:149、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:146を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:148、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体。

一つの態様において、前記二重特異性抗体は、抗原Aと抗原Bとともに結合する活性を有する。

一つの態様において、前記二重特異性抗体はバイパラトピック抗体（biparatopic antibody）である。

一つの方面において、本発明は、本発明の二重特異性抗体を含むコンジュゲート又は融合タンパク質を提供する。

具体的な態様において、前記コンジュゲート又は融合タンパク質は、前記抗体とコンジュゲート又は融合されている物質Aを含み、前記物質Aが、治療剤、プロドラッグ、プロテイン（例えば酵素）、ウィルス、脂質、生物反応調整剤（例えば、免疫調整剤）、PEG、ホルモン、オリゴヌクレオチド、診断剤、細胞傷害性薬剤（例えばドラッグまたは毒素）、超音波増強剤、非放射性標識、検出可能な標識、例えば化学発光物標識化合物（例えば、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、イミダゾール、アアクリジニウム塩とシュウ酸エステル）、または蛍光発光金属（例えば、152Eu、またはランタン系標識）から選択される。

一つの態様において、前記コンジュゲート又は融合タンパク質は単量体、二量体又は多量体である。

もう一つの態様において、本発明は、本発明の二重特異性抗体、本発明のコンジュゲート又は融合タンパク質を含む、医薬組成物を提供する。

一つの態様において、前記医薬組成物は、さらに医薬的に許容し得る担体を含む。

一つの態様において、前記医薬組成物の剤型が経口投与剤型又は非経口投与剤型を含み、より好ましくは、前記医薬組成物の剤型は、静脈注射、静脈滴注、皮下注射、局所注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、腹腔内注射、頭蓋内注射、又は腔内注射を含む注射剤である。

もう一つの態様において、本発明は、本発明の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。

一つの態様において、前記ポリヌクレオチドは、前記二重特異性抗体の融合軽鎖をコードする第一ポリヌクレオチド及び融合重鎖をコードする第二ポリヌクレオチドを有し、好ましくは、前記第一ポリヌクレオチド及び前記第二ポリヌクレオチドの割合は1:1である。

もう一つの態様において、本発明は本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。好ましくは、前記ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウィルス、哺乳動物細胞ウィルス（例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウィルス）、又はそれらの組み合わせを含む。

もう一つの態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。

一つの態様において、前記細胞は、本発明のポリヌクレオチドを組み込んだ本発明のベクター又はゲノムを含む。

一つの態様において、前記細胞は、エシェリヒア・コリ、バチルス・サブチルス、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、又はそれらの組み合わせ、かななる群から選択される。そのうち、哺乳動物細胞、例えばCHO-S細胞又は293E細胞が好ましい。

もう一つの態様において、本発明は、前記二重特異性抗体又は本発明のコンジュゲート又は融合タンパク質の、腫瘍（癌）を治療するための使用、又は腫瘍（癌）の治療用医薬品を調製するための使用を提供する。

一つの態様において、前記疾患は癌又は腫瘍であり、好ましくは、前記腫瘍は、血液腫瘍、実体瘤、又はそれらの組み合わせ、ならなる群から選択される。

もう一つの態様において、本発明は、前記二重特異性抗体又は本発明のコンジュゲート又は融合タンパク質の、腫瘍（癌）の検出用試薬又はキットを調製するための使用を提供する。

もう一つの態様において、本発明は、本発明の二重特異性抗体を調製する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む：
（i）適当な条件下で、本発明の細胞を培養して、本発明の二重特異性抗体を含む混合物を得る工程；及び
（ii）工程（i）で得た混合物を精製及び/又は単離して、本発明の二重特異性抗体を得る工程。

一つの態様において、前記精製は、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせを含む。

もう一つの態様において、本発明は疾患の治療方法を提供し、該方法には、その必要のある対象に対して、治療上有効量の本発明の二重特異性抗体、本発明のコンジュゲート又は融合タンパク質、本発明の医薬組成物、又はそれらの組み合わせを投与する工程が含くまれる。

一つの態様において、前記対象はヒト又は非ヒト哺乳動物である。

図1は、二重特異性抗体構造1の抗体構造の模式図（A）及び抗体の各成分であるタンパク質の一次構造の模式図（B）であり、抗体b可変領域1がVL／Hbを表し、抗体b可変領域2がVH／Lbを表す。図2は、二重特異性抗体構造2の抗体構造の模式図（A）及び抗体の各成分であるタンパク質の一次構造の模式図（B）である。図3は、二重特異性抗体構造3の抗体構造の模式図（A）及び抗体の各成分であるタンパク質の一次構造の模式図（B）である。図4は、二重特異性抗体構造4の抗体構造の模式図（A）及び抗体の各成分であるタンパク質の一次構造の模式図（B）である。図5は、二重特異性抗体構造1の抗体に関する。（A）が、Y100-Aシリーズ及びY100-Bシリーズの抗体の、CHO細胞において一過性トランスフェクションした後の発現レベルを示す。（B）が、Y101/Y103/Y104/Y105-Aシリーズ及びY101/Y103/Y104/Y105-Bシリーズの抗体の、CHO細胞において一過性トランスフェクションした後の発現レベルを示す。（C）が、Y106/Y110/Y116-Aシリーズ及びY106/Y110/Y116-Bシリーズの抗体の、CHO細胞において一過性トランスフェクションした後の発現レベルを示す。図5Dは、Y100/Y101/Y103/Y104/Y105/Y106/Y110/Y116-Bシリーズの抗体のうち、発現量が5mg/Lを超える抗体に対して、タンパク質Aフィニティークロマトグラフィーを実施した後のHPLC-SEC検出純度を示す。図6は、二重特異性抗体構造2を持つY200／Y201／Y203／Y204／Y205／Y206／Y210／Y216-Aシリーズ及びBシリーズの抗体の、CHO細胞において一過性トランスフェクションした後の発現レベル、ならびにタンパク質Aフィニティークロマトグラフィーを実施した後のHPLC-SEC検出純度である。図7は二重特異性抗体構造3を持つY300/Y304/Y316-Aシリーズ、Bシリーズ、Cシリーズ及びDシリーズの抗体の、CHO細胞において一過性トランスフェクションした後の発現レベル、ならびにタンパク質Aフィニティークロマトグラフィーを実施した後のHPLC-SEC検出純度である。図8は二重特異性抗体構造4を持つY400/Y404/Y416-Aシリーズ及びBシリーズの抗体の、CHO細胞において一過性トランスフェクションした後の発現レベル、ならびにタンパク質Aフィニティークロマトグラフィーを実施した後のHPLC-SEC検出純度である。図9は、標的が同一であり、且つ同じ抗体可変領域配列を含む二重特異性抗体構造1-4の抗体の間の、発現レベル及び純度の比較である。（A）は、S70抗体可変領域配列（SEQ ID NO：41と42）とG631抗体可変領域配列（SEQ ID NO：57と58）を含む二重特異性抗体構造1-4の抗体の、発現レベル及び純度である。（B）は、S70抗体可変領域配列（SEQ ID NO：41と42）と3G12抗体可変領域配列（SEQ ID NO：59と60）を含む二重特異性抗体構造1と2の抗体の、発現レベル及び純度である。（C）12A4抗体可変領域配列（SEQ ID NO：45と46）と3G12抗体可変領域配列（SEQ ID NO：59と60）を含む二重特異性抗体構造1と2の抗体の、発現レベル及び純度である。（D）S70抗体可変領域配列（SEQ ID NO：41と42）とLAG35抗体可変領域配列（SEQ ID NO：33と34）を含む二重特異性抗体構造1と2の抗体の、発現レベル及び純度である。（E）5C4抗体可変領域配列（SEQ ID NO：37と38）及びYervoy抗体可変領域配列（SEQ ID NO：27と28）を含む二重特異性抗体構造1、3と4の抗体の、発現レベル及び純度である。（F）5C4抗体可変領域配列（SEQ ID NO：37と38）と10A7抗体可変領域配列（SEQ ID NO：29と30）を含む二重特異性抗体構造1と2の抗体の、発現レベル及び純度である。（G）5C4抗体可変領域配列（SEQ ID NO：37と38）とG631抗体可変領域配列（SEQ ID NO：57と58）を含む二重特異性抗体構造1と2の抗体の、発現レベル及び純度である。（H）5C4抗体可変領域配列（SEQ ID NO：37と38）及びB-N10抗体可変領域配列（SEQ ID NO：63と64）を含む二重特異性抗体構造1と2の抗体の、発現レベル及び純度である。（I）エロツズマブ（Elotuzumab）抗体可変領域配列（SEQ ID NO：49と50）とNM3E2抗体可変領域配列（SEQ ID NO：47と48）を含む二重特異性抗体構造1-4の抗体の、発現レベル及び純度である。図10は、異なる二重特異性抗体構造に対しての40^oC加速熱安定性試験である。（A）Y100-B6、Y100-B7、Y200-A1、Y200-B1、Y200-B3、Y300-A1及びY400-B1が、0日間、7日間及び14日間の40℃での処理をした後のHPLC-SEC純度試験であり：（B）Y101-B1、Y101-B2、Y201-A1、Y201-B1、Y101-B3、Y101-B4、Y201-A2及びY201-B2が、0日間、7日間及び14日間の40℃での処理をした後のHPLC-SEC純度試験であり、（C）Y103-B1、Y103-B2、Y203-A1、Y203-B1、Y104-B1、Y104-B2、Y304-A1及びY404-B1が、0日間、7日間及び14日間の40℃での処理をした後のHPLC-SEC純度試験であり、（D）Y105-B1、Y105-B2、Y205-A2、Y205-B2、Y106-B1、Y106-B2、Y206-A2、Y206-B1及びY206-B2が、0日間、7日間及び14日間の40℃での処理をした後のHPLC-SEC純度試験であり、（E）Y110-B1、Y110-B2、Y210-A1、Y210-B1、Y116-B1、Y116-B2、Y216-A1、Y216-B1、Y316-A1、Y416-B1が、0日間、7日間及び14日間の40℃での処理をした後のHPLC-SEC純度試験である。図11は、異なる二重特異性抗体構造についての耐酸性試験であり、使用した酸性溶液のpH値は3.5である。図11Aは、Y100-B6、Y100-B7、Y200-A1、Y200-B1、Y200-B3、Y300-A1及びY400-B1に対して、0分間、30分間と60分間の低pH処理をした後のHPLC-SEC純度試験であり：図11Bは、Y101-B1、Y101-B2、Y201-A1、Y201-B1、Y101-B3、Y101-B4、Y201-A2及びY201-B2に対して、0分間、30分間と60分間の低pH処理をした後のHPLC-SEC純度試験であり、図11Cは、Y103-B1、Y103-B2、Y203-A1、Y203-B1、Y104-B1、Y104-B2、Y304-A1及びY404-B1に対して、0分間、30分間と60分間の低pH処理をした後のHPLC-SEC純度試験であり、図11Dは、Y105-B1、Y105-B2、Y205-A2、Y205-B2、Y106-B1、Y106-B2、Y206-A2、Y206-B1及びY206-B2に対して、0分間、30分間と60分間の低pH処理をした後のHPLC-SEC純度試験であり、図11Eは、Y110-B1、Y110-B2、Y210-A1、Y210-B1、Y116-B1、Y116-B2、Y216-A1、Y216-B1、Y316-A1、Y416-B1に対して、0分間、30分間と60分間の低pH処理をした後のHPLC-SEC純度試験である。図12は、二重特異性抗体構造1を持つY100-B7のIn vivo薬効実験の結果であり、使用した腫瘍細胞株はマウス大腸癌であるMC38であり、使用したマウスの種類はメス C57BL/6マウスである。図13は、二重特異性抗体構造1を持つY101-B2のIn vivo薬効実験の結果であり、使用した腫瘍細胞株はマウス大腸癌であるMC38であり、使用したマウスの種類はメス C57BL/6マウスである。

定義
なお、数には明確な制限がない場合、実体は、一つ又は複数（種）の当該実体を指すと理解される。例えば、「二重特異性抗体」は一つ又は複数（種）の二重特異性抗体を指すと理解される。同様に、数には明確な制限がない場合、用語「一つ又は複数」と「少なくとも一つ」は、本出願において互換的に使用できる。

本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、単数形の「ポリペプチド」だけでなく、複数形の「ポリペプチド」も含まれ、また、アミド結合（ペプチド結合とも称する）を介して線状に連結される単量体（アミノ酸）を含む分子を指す。用語「ポリペプチド」とは、２つ又は複数のアミノ酸を含む一つ又は複数の鎖を意味し、特定長さのものを意味するものではない。このため、ペプチド、ジペプチド、ターペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸の鎖」、又は２つ又は複数のアミノ酸からなる1つ又は複数の鎖を指す他のいかなる用語は、いずれも「ポリペプチド」の定義に含まれる。また、用語「ポリペプチド」は、これらの用語に代えて、又はこれらと互換的に使用することができる。用語「ポリペプチド」とは、ポリペプチドの発現後修飾の生成物も指し、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質の加水分解的溶解、又は、非自然発生したアミノ酸の修飾を含むが、これらに限定されない。ポリペプチドは、天然の生物から誘導されるもの、又は相同組み換え技術にて作製するものであってもよいが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるものではない。それらは、化学合成を含むいかなる方法で作製することができる。

本明細書で使用される用語「組み換え」とは、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関連する場合に、天然状態では存在しないポリペプチド又はポリヌクレオチドの形態を指す。ここで、非限定的な例の一つは、通常一緒に存在しないポリヌクレオチド、又はポリペプチドを組み合わせることによって達成され得る。

「相同性」又は「同一性」又は「類似性」とは、２つのペプチド鎖分子の間、又は２つの核酸分子の間に、配列の類似の程度を指す。相同性は、各配列の位置を比較することで測ることができる。比較は、アラインメントにより行うことができる。比較対象の配列において、ある位置に同じ塩基又はアミノ酸が存在する場合、その位置の分子は相同性を有すると見なされる。複数の配列の間の相同性の程は、これらの配列が共有しているペアリング、又は相同位置数の関数である。「非関連性」又は「非相同性」の配列は、本出願の配列の一つと、40％以下の相同性、好ましくは25％以下の相同性を有する。

ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域（又は、ポリペプチド又はポリペプチド領域）が、他の一つの配列と、所定のパーセンタイル（例えば、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％又は99％）の「配列同一性」を含むとは、アラインメントする時に、この２つの配列を比較すれば、当該パーセンタイルで同様の塩基（又はアミノ酸）を持つことを意味している。上述のようなアラインメント、パーセンタイル相同性又は配列同一性は、当業界で知られているソフトプログラム、例えば、Ausubelらが編集した（2007）Current Protocols in Molecular Biologyに記載されているものにより測定できる。好ましくは、アラインメントとしては、初期設定パラメータを使用する。BLASTは、初期設定パラメータを使用するアラインメントプログラムの一つである。具体的に、プログラムとして、BLASTN及びBLASTPを使用し、初期設定パラメータとして以下のものを使用する：Genetic code = standard; filter = none; strand = both; cutoff = 60; expect = 10; Matrix = BLOSUM62; Descriptions = 50 sequences; sort by = HIGH SCORE; Databases = non-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR。これらのプログラムの詳しい情報は、以下のホームページより、入手可能である：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi（最近訪問： 2008年5月21日）。生物学的に等価なポリヌクレオチドとは、上に述べられた特定のパーセンタイルの相同性を有し、且つ、同じ又は類似の生物活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを指す。

ポリヌクレオチドに適用される場合、用語「コードする」は、特定のポリペプチドを「コードする」と考えられるポリヌクレオチドを指す。前記ポリヌクレオチドが、天然の状態で、又は当業者が知られている方法で作業されると、トランスクリプトーム及び/又は翻訳されて当該ポリペプチドのmRNA及び/又はその断片を生成できる。アンチセンス鎖とは、そのような核酸の相補体である。当該コード配列は前記アンチセンス鎖から導き出すことができる。

本明細書で使用される「抗体」又は「抗原結合ポリペプチド」は、抗原に特異的に認識して結合するポリペプチド又はポリペプチド複合体を指す。抗体は、完全抗体であってもよいし、任意の抗原結合断片又はその単鎖であってもよい。このため、用語「抗体」には、抗原への結合する生物活性を持つ免疫グロブリン分子の一部を、少なくとも含む特定の分子を含有する、任意のタンパク質又はペプチドが含まれている。そのような実施形態の例には、重鎖又は軽鎖又はそのリガンド結合部の相補性決定領域（CDR）、重鎖又は軽鎖の可変領域、重鎖又は軽鎖の定常領域、フレーム（FR）領域又はその任意の部分、又は結合タンパク質の少なくとも一部が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される用語「抗体断片」又は「抗原結合断片」は、抗体の一部であり、例えばF（ab'）2、F（ab）₂、Fab'、Fab、Fv、Fd、Fv、dAb、Fab／c、相補性決定領域（CDR）断片、ジスルフィド結合で連結されるFvs（sdFv）、単鎖抗体（例えば、scFv）、二価抗体又はドメイン抗体などである。構造にかかわらず、同様の抗原に結合する抗体断片は、完全な抗体とみなされている。用語「抗体断片」は、アプタマー、アプタマーのエナンチオマー（シュピーゲルマー、spiegelmers）及びディアボディ（diabodies）を含む。用語「抗体断片」には、抗体のように特定の抗原に結合して、複合体を形成することができる、合成タンパク質又は遺伝子改変タンパク質も含まれる。

「単鎖可変領域フラグメント」又は「scFv」とは、免疫グロブリンの重鎖（VH）と軽鎖（VL）の可変領域の融合タンパク質を指す。ある態様においてには、これらの領域は、10～約25つのアミノ酸の短いリンカーペプチドによって連結されている。当該リンカーは、柔軟性を有するためにグリシンに富むでもよいし、可溶性を有するためにセリン又はスレオニンを含んでもよい。また、VHのN-末端がVLのC末端に連結されることはできるが、逆にも可能である。当該タンパク質は、元の免疫グロブリンの特性が保留されており、定常領域が除去されてリンカーを導入しているだけである。ScFv分子は、公知であり、米国特許5，892，019に記載したものである。

用語「抗体」には、生化学的認識ことができる、様々な広い種類のポリペプチドが含まれる。当業者が理解されるべき、重鎖は、gamma、mu、alpha、delta、及びepsilon（γ、μ、α、δ、ε）に分けており、いくつかのサブ類（例えば、γl-4）を含む。抗体の「類」、例えば、IgG、IgM、IgA、IgG、又はIgEは、当該鎖の特性により決められる。免疫グロブリンのサブ類（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等は、よく特徴づけられたものであり、機能的に特異的である。本出願を参照し、当業者は、これらの類とアイソタイプの全ての変形を容易に認識することができ、したがって、これらの形態は、本出願の範囲内である。全ての免疫グロブリンの類は、明らかに本願の範囲内に含まれ、以下の説明は一般的に、免疫グロブリン分子のIgG類について説明する。IgGの標準的な免疫グロブリン分子は、（約23,000Daの分子量を含む）2つの同じの軽鎖ポリペプチドと、（53,000-70,000の分子量有する）2つの同じの重鎖ポリペプチドを含む。これらの4本の鎖は、典型的には、ジスルフィド結合によって「Y」型になるように連結する。ここで、軽鎖は、「Y」構造の口部から重鎖を支持して、さらに、延ばされて可変領域を通過している。

本出願の抗体、抗原結合ポリペプチド、これらの変異体又は誘導体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化した抗体、霊長類化（primatized）抗体、又はキメラ抗体、単鎖抗体、抗原エピトープ結合断片、例えば、Fab、Fab'とF（ab'）2、Fd、Fvs、単鎖Fvs（scFv）、単鎖抗体、ジスルフィド結合で連結されるFvs（sdFv）、VLドメインもしくはVHドメインを含む断片、Fab発現ライブラリにより産生した断片、及び抗イディオタイプ（idiotypic）（抗-Id）抗体を含むが、これらに限定されない。本出願の免疫グロブリン分子又は抗体分子は、任意のタイプ（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAとIgY）、任意の類の免疫グロブリン分子（例えば、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAlとIgA2）又はサブ類のものでもよい。

軽鎖は、kappa又はlambda（κ、λ）に分けている。重鎖の各クラスは、いずれもkappa又はlambda軽鎖に結合することができる。一般的には、軽鎖と重鎖は共有結合的に結合している。さらに、これらの免疫グロブリンがハイブリドーマ、B細胞又は遺伝子改変された宿主細胞によって産生される場合、2本の重鎖の「尾部」の部分は、共有結合であるジスルフィド結合又は非共有結合によって結合している。前記重鎖において、アミノ酸配列は、Y型構造のフォークのN末端から各鎖の底部のC末端に向かって伸びている。

軽鎖と重鎖の両方は、構造領域と機能的ホモログ領域に分けられる。用語「定常」と「可変」は、機能的な目的で使用されている。ここで、軽鎖可変ドメイン（VL）と重鎖可変ドメイン（VH）と共により、抗原認識性と特異性を決めることを認識べきである。一方、軽鎖定常ドメイン（CL）と重鎖定常ドメイン（CH1、CH2又はCH3）により、重要な生物学特性、例えば分泌、胎盤を通過する移動性、Fc受容体への結合、補体への結合等を提供している。一般的に、定常領域ドメインの数は、抗体の抗原結合サイト又はアミノ端の末端位置から離れるにつれて大きいになる。N末端部分は可変領域であり、C末端部分は定常領域であり、CH3及びCLドメインは、実際には、それぞれ重鎖と軽鎖のカルボキシ末端を含んでいる。

上述したように、かかる可変領域により、抗体は抗原の抗原エピトープを選択的に認識して特異的に結合することができる。すなわち、3次元抗原結合サイトを定義する可変領域は、抗体のVLドメインとVHドメイン、又は相補性決定領域（CDR）のサブ類の組み合わせにより構成している。当該4価の抗体構造は、抗原結合サイトを形成している。当該抗原結合サイトは、Y字型の各アームの末端に存在している。より詳細には、当該抗原結合サイトは、すべてのVHとVL鎖（すなわち、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3）の三つのCDRで定義されている。いくつかの例において、例えば、ある種の駱駝種から誘導された又は駱駝免疫グロブリンに基づいて改変された免疫グロブリンには、完全な免疫グロブリン分子が重鎖だけで構成され、軽鎖を含まないでもよい。例えば、Hamers-Castermanなど、Nature 363:446-448（1993）を参照。

天然に産生する抗体には、各抗原結合ドメインに存在する六つの「相補性決定領域」又は「CDR」が短くで、非連続的なアミノ酸配列であり、これらは抗原結合ドメインを形成するために、特定的に位置されている。当該抗原結合ドメインの残りのアミノ酸は「フレームワーク」領域と呼び、より少ないの分子内変更可能を持っている。前記フレームワーク領域は、主としてβ-フォールディングシート構造を取り、かつ、CDRは環を形成する。前記環は、前記β-フォールディングシート構造と連結し、前記β-フォールディングシート構造の一部になることがある。このように、フレームワーク領域は、鎖内の非共価作用でCDRを正しく方向に位置するための足場を形成している。前記位置されたCDRによって抗原結合ドメインを形成し、免疫活性抗原エピトープに相補的な表面を定義している。当該相補表面は、抗体とそのホモログエピトープとの間の非共価結合を寄与する。CDRとフレームワーク領域に属するアミノ酸は、すでに明らかに定義されており、当業者は、任意の所定の重鎖又は軽鎖可変領域から、これらを容易に認識できる。（「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」Kabat,E.,ら, 米国衛生と公共サービス部門（U．S．Department of Health And Human Services,）,（1983）; ChothiaとLesk,J．MoI． Biol．,196:901-917（1987）を参照し、それは引用により本出願に組み込まれる。）
本技術分野内で使用可能、及び/又は許容される範囲で、１つの用語が２つ又は２つ以上の定義を含む際、特に反面記載がある場合を除き、本明細書で使用される用語の定義には、そのあらゆる意味が含まれる。ひとつの具体的な例は、用語「相補性決定領域」（「CDR」）が用いられ、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域に存在する、非連続的な抗原結合サイトを説明している。このような特異的領域は、Kabatらにより米国衛生と公共サービス部門、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」（1983）に記載されており、また、ChothiaらによりJ．MoI．Biol．196:901-917（1987）に記載され、それらは、引用により本出願に組み込まれる。Kabat及びChothiaによって定義されるように、CDRは、互いに比較したときにオーバーラップするアミノ酸残基、又はアミノ酸のサブ構造を含む。しかし、抗体又はその変異体のCDRに関する定義の全ての応用は、本出願で定義、使用される用語の範囲内に含まれる。比較として、上文に引用した全ての参考文献により定義されるCDRを含む適当なアミノ酸残基が、以下の表に示す。特定のCDRを含む精確な残基数は、前記CDRの配列と大きさによって変化する。当該抗体の可変領域アミノ酸配列が指定されると、一般に、当業者はどのくらいの残基が特定のCDRを含むのを決めることができる。

Kabatらはまた、いずれの抗体にも適用可能な、可変ドメインの配列に向けるナンバリング付けシステムを定義した。当業者は、当該「Kabatナンバリング付け」システムを、何の疑いもなしに、当該配列自体以外の一切実験データも依存しなくで、任意の可変ドメイン配列に使用されることができる。本明細書で使用される「Kabatナンバリング」とは、Kabatらが作り出すナンバリング付けシステムである。その内容は米国衛生と公共サービス部門、「Sequence of Proteins of Immunological Interest」（1983）に記載されている。

上表の内容を除き、Kabatナンバリングシステムで説明されたCDRエリアは以下の通りである：CDR-H1は、およそ31番目のアミノ酸（すなわち、1番目のシステイン残基から約9つの残基であり）の位置から始まり、次のトリプトファン残基まで終了し、約5-7つのアミノ酸を含む。CDR-H2は、CDR-H1の末端から15番目の残基の位置に始まり、次のアルギニン又はリジン残基まで終了し、約16-19つのアミノ酸を含む。CDR-H3は、CDR-H2の末端後からおよそ33番目のアミノ酸残基の位置から始まり、配列W-G-X-Gの位置まで終了し、3-25つのアミノ酸を含み、ここで、Xは任意のアミノ酸である。CDR-L1は、およそ24番目の残基の位置（すなわち、システイン残基の後）から始まり、次のトリプトファン残基まで終了し、約10-17つの残基を含む。CDR-L2は、CDR-L1の末端後から約16つの残基から始まり、約7つの残基を含む。CDR-L3は、CDR-L2の末端後からおよそ33番目の残基の位置（すなわち、システイン残基の後）から始まり、約7-11つの残基を含み、配列F又はW-G-X-Gまでに終了し、ここで、Xは任意のアミノ酸である。

本出願に記載される抗体は、任意の動物由来のものでもよく、前記動物として、鳥類と哺乳動物が挙げられる。好ましくは、抗体は、ヒト、ネズミ、ロバ、ウサギ、ヤギ、ギニアピッグ、ラクダ、アルパカ、馬又は鶏の抗体である。もう一つの態様において、可変領域は軟骨魚（condricthoid）由来（例えば、サメ由来）のものである。

本明細書で使用される用語「重鎖定常領域」は、免疫グロブリンの重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖定常領域を含むポリペプチドは、少なくとも、CH1ドメイン、ヒンジ（例えば、上部ヒンジ領域、中間ヒンジ領域、及び/又は下部ヒンジ領域）ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、又はその変異体又は断片のいずれを含む。例えば、本出願に用いる抗原結合ポリペプチドには、CH1ドメインを含むポリペプチド鎖；CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部及びCH2ドメインを含むポリペプチド；CH1ドメイン及びCH3ドメインを含むポリペプチド鎖；CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部及びCH3ドメインを含むポリペプチド鎖、又は、CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、CH2ドメイン、CH3ドメインを含むポリペプチド鎖、を含んでよい。もう一つの態様において、本出願のポリペプチドが、CH3ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。また、本出願に用いる抗体は、少なくとも一部のCH2ドメイン（例えば、CH2ドメインの全部又は一部）を欠いていてもよい。前述した通り、重鎖定常領域は、天然に存在する免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列が異なるように改変されてもよいことは、本分野の普通当業者が理解されるべきである。

本出願に記載される抗体の重鎖定常領域は、異なる免疫グロブリン分子に由来するものであってもよい。例えば、ポリペプチドの重鎖定常領域は、IgGl分子由来のCH1ドメインとIgG3の分子由来のヒンジ領域を含んでいてもよい。もう一つの形態では、重鎖定常領域が、部分的にIgGl分子由来、かつ部分的にIgG3分子由来であるヒンジ領域を含んでいてもよい。もう一つの形態では、重鎖部は、一部がIgGl分子由来、且つ一部がIgG4分子由来であるキメラヒンジを含んでよい。

本明細書で使用される用語「軽鎖定常領域」は、抗体軽鎖由来のアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記軽鎖定常領域はkappa定常ドメインとlambda定常ドメインの少なくとも一つを含む。

「軽鎖-重鎖のペア」とは軽鎖と重鎖の集合体を指す。軽鎖-重鎖のペアは、軽鎖のCLドメイン及びCH1ドメインとの間のジスルフィド結合を介して二量体を形成することができる。

また、上述したように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブイル構造と3次元構造は、既知である。本明細書で使用される用語「VHドメイン」は、免疫グロブリンの重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、用語「CH1ドメイン」は、免疫グロブリンの重鎖の1番目の（多くはアミノ末端である）定常領域を含む。CH1ドメインは、VHドメインに近接しており、免疫グロブリンの重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端である。

本明細書で使用される用語「CH2ドメイン」は一部の重鎖分子を含む。当該部分の範囲として、例えば、一般的なナンバリング付けスキームによると、抗体のおよそ244番目の残基から360番目の残基までの範囲である（Kabatナンバリング付けシステムによる：244番目の残基から360番目であり、EUナンバリング付けシステムによる：231～340番目の残基であり、Kabatら、米国衛生と公共サービス部門、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」（1983）を参照する）。CH2ドメインは、他方のドメインと緊密にペアリングしていないという点でユニークである。代わりに、２つのN-連結の側鎖の糖鎖が、無傷の天然IgG分子の２つのCH2ドメインの間に挿入されている。文献により、CH3ドメインは、CH2ドメインからIgG分子のC-末端に延ばされ、約108つの残基を含むことが記載されている。

本明細書で使用される用語「ヒンジ領域」は、重鎖分子のうちの、CH1ドメインをCH2ドメインに連結する一部を含む。当該ヒンジ領域は約25つの残基を含み、柔軟性があるので、２つのN-末端抗原結合領域が独立に移動可能である。ヒンジ領域は、三つの異なるドメイン：上部、中部、及び下部ヒンジドメインに分けることができる（Rouxら、J．Immunol、161:4083（1998））。

本明細書で使用される用語「ジスルフィド結合」は、２つの硫黄原子の間に形成する共有結合を含む。アミノ酸であるシステインは、もう一つのスルフヒドリル基とジスルフィド結合を形成する又は架橋できるスルフヒドリル基を含む。天然に存在するIgG分子の大多数は、CH1及びCLエリアがジスルフィド結合で連結し、２つの重鎖が、Kabatナンバリング付けシステムによると、239と242番目に対応する位置（EUナンバリング付けシステムによる、226又は229番目の位置）で、２つのジスルフィド結合によって連結されている。

本明細書で使用される用語「キメラ抗体」は、以下のいかなる抗体を意味する：ここで、その免疫反応領域又はサイトは、第一物種由来又は第一物種より得られるものであり、かつ、その定常領域（当該定常領域は、完整であってもよく、部分的又は本出願で改変されたものでもよい）は、第二物種由来である。一部の形態には、標的結合領域又はサイトが非ヒト（例えば、マウス又は霊長類）由来であり、かつ、定常領域がヒト由来である。

本明細書で使用される「ヒト化パーセンタイル」は、ヒト化ドメインと、その種のドメインとの間のフレームアミノ酸の差値の数（すなわち、非CDRでの差値）を測定して、当該数をアミノ酸の総数から引いて、アミノ酸総数で割った値に100を乗じることによって算出する。

用語「特異的に結合する」又は「・・・に特異性を有する」とは、一般的、抗体がその抗原結合ドメインにより抗原エピトープと結合し、当該結合によって、抗原結合ドメインと抗原エピトープとの間にいくらかの相補性を有するようにすることを意味している。この定義により、当該抗原エピトープに結合するとき、ランダムの、無関係な抗原エピトープに対する結合より、抗原結合ドメインによる結合がよりも容易である抗体は、抗原エピトープに「特異的に結合する」と認められる。本出願において、用語「特異性」は、ある抗体が特定の抗原エピトープに結合する親和性の判断に用いられる。例えば、特定の抗原エピトープに対して、抗体「A」は、抗体「B」よりも高い特異性を有すると見なされる場合がある。又は、抗体「A」は、抗原エピトープ「C」と比べて、相関抗原エピトープ「D」への結合が高い特異性を有すると言われる場合がある。

本明細書で使用される用語「治療」とは、被験者に対して望ましくない生理変化又は疾患、例えば癌の進行を予防又は遅らせる（軽減する）、治療的治療と予防、又は予防・治癒的処置を意味する。有益又は所望の臨床結果としては、検出可能かどうかにかかわらず、症状の軽減、病気のステージの低減、疾患状態の安定化（例えば、増悪しないようにする）、疾患の進行の遅延又は遅らせ、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分又は全体的かどうかにかかわらず）を含むが、これらに限定されない。「治療」とは、治療を受けていない場合の予想生存期間と比べて、生存期間は延長されることを指す場合もある。治療を必要とする状態は、既に病気又は症状があったもの、病気又は症状になりやすいもの、又は病気又は症状を予防するものを含む。

本出願の実施態様は、2つの同一又は異なる抗原結合ポリペプチド単位を含む、複数種の二重特異性抗体を提供する。抗原に結合する抗体ドメインは、Fab、又はScFv、又は重鎖可変領域（VH）-軽鎖可変領域（VL）との間の非共価ペアリング（Fv）である。特に、これらの二重特異性抗体はいずれも抗体の重鎖定常領域のFc断片を有し、前記Fcは：（1）ヒンジ、（2）重鎖第二定常領域（CH2）及び重鎖第三定常領域（CH3）を含む。

前述のいかなる抗体又はポリペプチドは、また、追加のポリペプチドを含んでよい。追加のポリペプチドとしては、例えば、本出願に記載のコードポリペプチド、分泌を指導するための抗体のN末端のシグナルペプチド、又は本出願に記載の他の異種ポリペプチドが挙げられる。

本分野の普通当業者が理解すべきように、本出願に記載の抗体は、天然に存在する結合ポリペプチド由来である場合、これらのアミノ酸配列が、天然に存在する結合ポリペプチドとは異なるように改変されてもよい。例えば、特定のタンパク質由来のポリペプチド又はアミノ酸配列は、出発配列と類似していてもよく、例えば、出発配列と一定の割合の同一性を有する。例えば、出発配列とは60％、70％、75％、80％、85％、 90％、95％、98％又は99％の同一性を有することができる。

また、「非必須」アミノ酸領域に対して保存的な置換又は変更を行うために、ヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を行われてもよい。例えば、特定のタンパク質由来のポリペプチド又はアミノ酸配列は、一つ又は複数の独立したアミノ酸の置換、挿入、又は欠失、例えば、1つ、2つの、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10つ、15つ、20つ以上の独立したアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を含む以外、出発配列と同一であることができる。一の態様において、特定のタンパク質由来のポリペプチド又はアミノ酸配列は、出発配列と1～5つ、1～10つ、1～15つ又は1～20つの独立したアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を含む。

他の態様において、本出願の抗原結合ポリペプチドは、保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。

「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を含むアミノ酸残基に置換されるのである。類似の側鎖を含むアミノ酸残基の群は、当業界で定義されており、それは塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、スレオニン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β-分岐の側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）と芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。そのため、免疫グロブリンポリペプチドの非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖群からの他のアミノ酸残基で置換されることが好ましい。別の実施形態において、連続のアミノ酸セグメントは、順序及び/又は側鎖群の組成が異なる、構造的に類似した連続のアミノ酸セグメントで置換されることができる。

保存的アミノ酸置換の非限定的な例は、以下の表で提供しており、ここで、類似性のスコアが0以上であることは、この２つのアミノ酸の間に保存的置換があることを表す。

一部の実施態様には、前記抗体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウィルス、脂質、生物学的応答修飾剤（Biological response modifier）、薬剤又はPEGに結合されていてもよい。

当該抗体が、治療剤に連結又は融合されていてもよい。ここで、治療剤は、放射性標識のような検出可能な標識、免疫調整剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療剤又は診断剤、細胞傷害性薬剤（医薬、又はケモカインであってもよい）、超音波増強剤、非放射性標識、それらの組み合わせ、及び他の当業界が既知の同類成分を含んでよい。

当該抗体が化学発光化合物とコンジュゲートすることで、検出可能に標識される。そして、化学反応の過程に発生するルミネッセンスを検出することで、化学発光物で標識された抗原結合ポリペプチドの存在を判定する。特に有用な化学発光物標識化合物としては、イソルミノール、アクリジニウムエステル、イミダゾール、アアクリジニウム塩及びシュウ酸エステルが挙げられる。

前記抗体は、蛍光発光金属例えば152Eu、又は他のランタン系標識を用いて、検出可能に標識されてもよい。これら金属は、金属キレート基、例えば、ジエチレン－トリアミン五酢酸（DTPA）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）で抗体に連結されてもよい。多様な基を抗体に連結する技術は公知のものであり、例えば、Arnonら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」，in Monoclonal AntibodiesアンドCancer Therapy，Reisfeldら（編集．），pp．243-56（Alan R．Liss，Inc．（1985）;Hellstrom ら、“Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery （第二版）, Robinsonら（編集）, Marcel Dekker, Inc., pp. 623- 53 （1987）; Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pincheraら（編集）, pp. 475-506 （1985）; “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin ら（編集）, Academic Press pp. 303-16 （1985）, 及びThorpeら、“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev. （52:119-58 （1982））。

抗体の製造方法
抗体の製造方法は、本技術分野が公知であり、ここで説明する。一の態様において、本出願の抗原結合ポリペプチドの可変領域と定常領域は、完全ヒトのものである。完全ヒト抗体は、従来技術に記載された技術で調製することができ、本出願に記載した通りである。例えば、特定抗原に対する完全ヒト抗体は、当該抗原を、この種の抗原刺激を応答する抗体を産生するように改変され、その内因性遺伝子座が禁止された遺伝子改変動物に投与することで調製することができる。当該抗体の調製に使用できる例示的な技術は、米国特許：6,150,584、6,458,592、6,420,140に記載し、その全体が引用により本出願に組み込まれる。

本出願の抗原結合ポリペプチドの結合特異性は、インビトロ実験、例えば免疫沈殿、放射免疫測定（RIA）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）にて測定することができる。

又は、本出願の単鎖ユニットの調製には、（米国特許番号4,694,778;Bird、Science 242:423-442（1988）;Hustonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 55:5879-5883（1988）;Wardら、Nature 334:544-554（1989））に記載された単鎖ユニットを調製する技術が使用できる。単鎖融合ペプチドは、アミノ酸架橋を介してFv領域の重鎖と軽鎖断片を結合し、単鎖ユニットを形成することにより得られる。また、大腸菌（E．coli）において機能性Fv断片を合成する技術（Skerraら、Science 242:1038-1041（1988））は使用できる。

単鎖Fvs（scFvs）及び抗体の産生に用いられる技術の例は、米国特許番号4,946,778と5,258,498;Hustonら、Methods in Enzymology 203:46-88（1991）;Shuら、Proc． Natl． Sci． USA 90:1995-1999（1993）;とSkerraら、Science 240:1038-1040（1988）に記載されたものを含む。ある特定の応用（ヒト体内において抗体を使用し、体外で検出して分析することを含む）では、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体が好適に用いられる。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、ネズミモノクローナル抗体からの可変領域と、ヒト免疫グロブリンの定常領域とを含む抗体である。キメラ抗体の製造方法は、当業界で知られている。例えば、Morrison、Science 229:1202（1985）;Oiら、BioTechniques 4:214（1986）;Gilliesら、J． Immunol． Methods 125:191-202（1989）；米国特許番号5,807,715;4,816,567と4、816397号を参照し、その全体が引用により本出願に組み込まれる。

ヒト化抗体は所要の抗原に結合する、非ヒト物種由来の抗体分子であり、当該抗体分子は、一つ又は複数の非ヒト物種由来の相補性決定領域（CDR）と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を含む。一般的には、ヒトフレームワーク領域におけるフレーム残基は、CDRドナー抗体からの対応する残基の置換によって、好ましくは、抗原結合能を上げるように改変される。これらのフレームの置換は、当業界が知られている方法で認識できる。例えば、CDRとフレーム残基の相互作用モデルを樹立することで、抗原結合と配列にとって比較的重要なフレーム残基を同定して、特定位置での異常なフレーム残基を求める（例えば、Queenら、米国特許番号5,585,089；Riechmannら、Nature 332:323 （1988）を参照し、その全体が引用により本出願に組み込まれる）。抗体のヒト化には、当業界が知られている複数種の技術が使用される。前記技術としては、例えば、CDR-移植（EP239,400；PCT公開番号WO 91/09967；米国特許番号5,225,539；5,530,101と5,585,089）、ベニアリング（veneering）又は表面置換（resurfacing）（EP592,106;EP519,596;Padlan、Molecular Immunology 28（4/5）:489-498（1991）;Studnickaら、Protein Engineering 7（6）:805-814（1994）;Roguskaら、Proc．Natl．Sci．USA 91:969-973（1994））、及び、チェーンシャッフル（shuffling）（米国特許 US 5,565,332、その全体が引用により本出願に組み込まれる）が挙げられる。

従来の組み換えDNA技術によって、本出願の抗原結合ポリペプチドの一つ又は複数CDRは、フレームワーク領域に挿入されることができる。例えば、ヒトのフレームワーク領域に挿入されて非ヒト抗体をヒト化される。当該フレームワーク領域としては、天然に存在する又は共有するフレームワーク領域であってもよく、好ましくはヒトのフレームワーク領域である（例えば、Chothiaら、J．Mol．Biol．278:457-479（1998）、ヒトのフレームワーク領域のリスト、を参照する）。好ましくは、当該フレームワーク領域とCDRとを組み合わせることで産生するポリヌクレオチドは、所要のポリペプチドの少なくとも一つの抗原エピトープ（例えば、LIGHT）に特異性的に結合するポリペプチドをコードする。好ましくは、フレームワーク領域内で、一つ又は複数のアミノ酸置換が行われてもよい。ここで、好ましくは、当該アミノ酸置換が、当該抗体の抗原に対する結合能を向上させる置換である。また、当該方法により、一つ又は複数の可変領域のシステイン残基（鎖内のジスルフィド結合の形成を関与するシステイン残基）に対するアミノ酸置換、又は欠失を得ることができる。そして、一つ又は複数の鎖内のジスルフィド結合を欠いた抗体分子が得られる。当該ポリヌクレオチドに対して行われる他の変更は、一切本願の範囲、さらに先行技術の範囲内に含まれる。

また、適当な抗原特異性を有するマウス由来の抗体分子と、適切な生物活性を有するヒト抗体分子遺伝子とを組み合わせて、遺伝子スプライシングすることで、「キメラ抗体」を生産する技術（Morrisonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA:851-855（1984）;Neubergerら、Nature 372:604-608（1984）;Takedaら、Nature 314:452-454（1985））も、用いることができる。本明細書で使用されるように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、ネズミのモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を含む抗体である。

しかし、組み換え抗体の産生に使用されるもう一つの効率的な方法は、Newman、Biotechnology 10:1455-1460（1992）により開示される。具体的には、当該技術は、サル可変ドメインとヒト定常配列とを含む霊長類化した抗体を作り出す。該書類は、引用により本出願に組み込まれる。また、当該技術は、共同譲渡された米国特許番号5,658,570、5,693,780と5,756,096にも記載され、各文献は引用により本出願に組み込まれる。

また、抗体を産生する細胞株が、当業者熟知の技術で選択され、培養されてもよい。このような技術は、様々なラボラトリーマニュアル、主要な刊行物に記載されている。これに関して、本明細書に適用する技術は、例えば、下記のように、Current Protocols in Immunology、Coliganら編集、Green Publishing Associates And Wiley-Interscience、John WileyとSons、New York（1991）に記載されており、それは、引用により本出願（補足的な参照を含む）に組み込まれる。

また、当業者の公知の標準的な技術は、本出願の抗体をコードするヌクレオチド配列へ変異の導入に使用できる。前記変異としては、アミノ酸置換を産生する、部位特異的変異誘発やPCRによる変異を含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記変異体（誘導体を含む）は、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、軽鎖可変領域、CDR-L1、CDR-L2又はCDR-L3は、参照の可変重鎖領域に比べて、50つ未満のアミノ酸置換、40つ未満のアミノ酸置換、30つ未満のアミノ酸置換、25つ未満のアミノ酸置換、20つ未満のアミノ酸置換、15つ未満のアミノ酸置換、10つ未満のアミノ酸置換、5つ未満のアミノ酸置換、4つ未満のアミノ酸置換、3つ未満アミノ酸置換、又は2つ未満のアミノ酸置換をコードする。又は、変異は、コード配列の全部又は一部に沿って、ランダムに導入されてもよい。例えば、飽和変異誘発（saturation mutagenesis）を利用している場合、得られた変異体を、活性を持つ変異の保有を確保する目的で、バイオ活性についてスクリーニングすることができる。

抗体の構造情報
単一特異性抗体は：２つの同じ軽鎖と２つの同じ重鎖を含む抗体であって、軽鎖と重鎖との間にジスルフィド結合で連結して対応する抗原を標的とし、重鎖と重鎖との間にジスルフィド結合で連結し、抗体全体は「Y」型の構造を呈している対称的な抗体である。軽鎖は軽鎖可変領域（VL）と軽鎖定常領域（Lc）を有し、重鎖は重鎖可変領域（VH）及び重鎖定常領域を有し、重鎖定常領域はCH1とFcを含み、Fcはヒンジ、CH2及びCH3を含む。

二重特異性抗体構造1は、F（ab）₂－（Fv）₂－Fcであり、4価の対称型二重特異性抗体であり、2つの同じ融合重鎖及び2つの同じ融合軽鎖を有し、2つの融合重鎖をペアリングして、融合軽鎖と融合重鎖をペアリングして、前記ペアリングが、それぞれ、一つ又は複数の鎖間ジスルフィド結合を含む。前記抗体の融合重鎖が抗体a重鎖可変領域（VHa）、第一定常領域（CH1）、抗体b可変領域1及びFc断片を含む。抗体b可変領域1が、CH1とFcとの間にリンカーを介して連結して位置している。前記抗体の融合軽鎖が抗体a軽鎖可変領域（VLa）、軽鎖定常領域（CL）及び抗体b可変領域2を含む。ここで、抗体b可変領域2がCLのC末端にリンカーを介して連結して位置し；ここで、（1）抗体b可変領域1が重鎖可変領域（VHb）であり、抗体b可変領域2が軽鎖可変領域（VLb）であり、二重特異性抗体構造1のAシリーズと称され；又は、（2）抗体b可変領域1が軽鎖可変領域（VLb）であり、抗体b可変領域2が重鎖可変領域（VHb）であり、二重特異性抗体構造1のBシリーズと称される。ここで、VHa-VLaペアリングが抗原Aを標的とし、VHb-VLbペアリングが抗原Bを標的とする。

図1Aは二重特異性抗体構造1の構造の模式図であり、図1Bは抗体の各成分であるタンパク質の一次構造の模式図である。

二重特異性抗体構造2は、IgG（H）-ScFvであり、4価の対称型二重特異性抗体であり、2つの同じ融合重鎖及び2つの同じ軽鎖を有し、2つの融合重鎖をペアリングして、軽鎖-融合重鎖をペアリングして、前記ペアリングが、それぞれ、一つ又は複数の鎖間ジスルフィド結合を含み、融合重鎖は重鎖可変領域（VHa）、重鎖第一定常領域（CH1）、Fc及びScFvを有し、ScFvはFcのC末端にリンカーを介して連結して位置し、軽-重鎖ペアリングが抗原Aを標的とし、ScFvが抗原Bを標的とする。

図2Aは、二重特異性抗体構造2を持つ構造の模式図であり、図2Bは抗体の各成分であるタンパク質の一次構造の模式図である。

二重特異性抗体構造3は、Tandem-ScFv-Fcであり、4価の対称型二重特異性抗体であり、２つの同じ融合ペプチドを含む。融合ペプチドは、標的抗原AのScFv（ScFv-a）、標的抗原Bの（ScFv-b）及びFcを有し、ScFv-bは、ScFv-aとFcとの間に位置して、リンカー又はヒンジを介して連結されている。

図3Aは二重特異性抗体構造3の構造の模式図であり、図3Bは抗体の各成分であるタンパク質の一次構造の模式図である。

二重特異性抗体構造4は、DVD-IgGであり、4価の対称型二重特異性抗体であり、2つの同じ融合軽鎖及び2つの同じ融合重鎖を有し、2つの融合重鎖をペアリングして、2つの融合軽鎖と融合重鎖をペアリングして、前記ペアリングが、それぞれ、一つ又は複数の鎖間ジスルフィド結合を形成し、融合軽鎖が、抗体b可変領域1とリンカーを介して連結される抗体a軽鎖を含み、ここで、抗体a軽鎖がC末端に位置し；融合重鎖が、抗体b可変領域2とリンカーを介して連結される抗体a重鎖を含み、ここで、抗体a重鎖がC末端に位置する。ここで、（1）抗体b可変領域1が軽鎖可変領域（VLb）であり、抗体b可変領域2が重鎖可変領域（VHb）であり、又は（2）抗体b可変領域1が重鎖可変領域（VHb）であり、抗体b可変領域2が軽鎖可変領域（VLb）である。VHa-VLaペアリングが抗原Aを標的とし、VHb-VLbペアリングが抗原Bを標的とする。

図4Aは二重特異性抗体構造4の構造の模式図であり、図4Bは抗体の各成分であるタンパク質の一次構造の模式図である。

上に述べた4つ種類の二重特異性抗体構造は、いずれもFc断片を含む対称的な構造であり、同時にいずれも4価であり、ここで、2価は抗原Aを標的とし、他の2価は抗原Bを標的とする。

抗体配列の可変領域

他のドメインの配列
（1）リンカードメインのアミノ酸配列

（2）ヒンジドメインのアミノ酸配列

（3）軽鎖定常領域CLドメインのアミノ酸配列

（4）重鎖定常領域CH1ドメインのアミノ酸配列

抗原の具体的な配列

抗体の調製及び抗体活性アッセイ
実施例1．二重特異性抗体の調製
1．プラスミドの構築方法
使用したベクターはpcDNA 3.1（invitrogenより購入）又はpCHO 1.0（Gibcoより購入）であった。

1.1 ポリメラーゼ鎖式反応（PCR）で目的断片DNAを増幅した。

*鋳型DNAは、ＷｕｈａｎＧｅｎｅＣｒｅａｔｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏ．，Ｌｔｄ．より合成した。DNA配列は、配列番号1-145のアミノ酸配列を反向翻訳することで得た。

得られたPCR生成物は、目的断片DNAである。

1.2 ベクタープラスミドは、制限エンドヌクレアーゼで酵素消化した。

最適な温度で4時間酵素消化した。
得られた酵素消化生成物は、酵素により切断されたベクターDNAである。
*ベクターは、重鎖発現ベクターと軽鎖発現ベクターの2種に分けている。ここで、重鎖発現ベクターはシグナルペプチド及びヒトIgG1（GenBank登録番号：MG920253.1）の重鎖定常領域のDNA配列（CH1、ヒンジ、CH2及びCH3を含み）を有しており、酵素消化サイトは、シグナルペプチドの3’とCH1の5’端との間に位置した。ここで、軽鎖発現ベクターはシグナルペプチド及びヒトkappa又はlambda軽鎖定常領域のDNA配列を有しており、酵素消化サイトは、シグナルペプチドの3’と軽鎖定常領域の5’端との間に位置した。

1.3 PCR生成物又は酵素消化生成物の精製
DNA精製試薬（Tiangen）を用いた。具体的な作業手順は、Tiangenのキット添付明細書に参照した。得られた精製生成物は、精製した目的断片DNAと、精製した酵素消化ベクターのDNAであった。

（1）目的断片の組み換え

組み換え条件：37℃、30分間。得られる組み換え生成物を氷の上に載せて、形質転換に待っていた。

重鎖断片は、酵素消化した重鎖発現ベクターDNAと組み換えられ、軽鎖断片は、酵素消化の軽鎖発現ベクターDNAと組み換えられた。

1.4 熱ショックによる形質転換
常法に従って、10μl 組み換え生成物を取って、熱ショックにより100μl Trans10コンピテント細胞に形質転換した。単独のコロニーをピックアップし、サンプルとしてＷｕｈａｎｇｅｎｅｃｒｅａｔｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏ．，Ｌｔｄ.に送ってシークエンサーした。重鎖断片を酵素消化した発現ベクターDNAに組み換えたプラスミドは、重鎖発現プラスミドと称した。軽鎖断片を酵素消化した発現ベクターDNAに組み換えたプラスミドは、軽鎖発現プラスミドと称した。融合ペプチド断片を酵素消化した発現ベクターDNAに組み換えたプラスミドは、融合ペプチド発現プラスミドと称した。融合重鎖断片を酵素消化した発現ベクターDNAに組み換えたプラスミドは、融合重鎖発現プラスミドと称した。融合鎖断片を酵素消化した発現ベクターDNAに組み換えたプラスミドは、融合鎖発現プラスミドと称した。

具体的には、以下のプラスミドを構築した。

1）図1の二重特異性抗体構造1は、2種のプラスミドの構築にした。2種のプラスミドは、それぞれ、融合軽鎖発現プラスミド（pFL）と、融合重鎖発現プラスミド（pFH）であった。

2）図2の二重特異性抗体構造2は、2種のプラスミドの構築にした。2種のプラスミドは、それぞれ、軽鎖発現プラスミド（pL）と、融合重鎖2発現プラスミド（pFH2）であった。

3）図3の二重特異性抗体構造3は、1種のプラスミドの構築にした。前記プラスミドは、融合ペプチド発現プラスミド（pFP）であった。

4）図4の二重特異性抗体構造4は、2種のプラスミドの構築にした。2種のプラスミドは、それぞれ、融合軽鎖2発現プラスミド（pFL2）と、融合重鎖3発現プラスミド（pFH3）であった。

1.5 二重特異性抗体の発現方法：
前記方法は、CHO-Sと293Eの2種の一過性トランスフェクション発現系を使用し、具体的は、以下であった：
（1）CHO-S 一過性トランスフェクション工程（例として、トランスフェクション総ボリュームが100ml）
a）トランスフェクション前日、細胞を継代した。ここで、例えば、CD-CHO培地（Thermo Fisher会社より購入）が使用できる。浮遊細胞の密度を1×10⁶細胞／ml、ボリューム90mlになるように調整した。これは、細胞が対数増殖期であることを保証し、二日目のトランスフェクション際までに、細胞の密度が2×10⁶ 細胞／mlに達することができた。

b）37℃、125rpmで、5%CO2でロータリーシェーカーにてオーバーナイト培養した。

c）トランスフェクション当日は、FectoPROトランスフェクション試薬（Polyplus transfection会社より購入）を室温に予熱して、軽く混ぜた。10mlの無血清培地（例えば、opti PRO-SFM（Thermo Fisher公司より購入））にて50μg プラスミドDNAを希釈し、軽く混ぜて、100μlのトランスフェクション試薬に加えて、均一に混合して、室温で10分間インキュベートし、トランスフェクション複合体を形成した。トランスフェクションの際は、２種又は3種のプラスミドDNAをコトランスフェクションした。

d）トランスフェクション複合体を均一にするように、準備しておいた90mlの対数増殖期の細胞に加えた。添加直後に均一にまでに振盪し、ロータリーシェーカーにて37℃、125rpm、5%CO2で培養した。

e）トランスフェクションした後2～4時間に、75μlのトランスフェクション補強剤であるFecto PRO(R)Booster（Polyplus transfection会社より購入）を加えた。

f）トランスフェクションした後18-24時間に、温度を32℃までに低下されて培養した。

g）トランスフェクションした後の3、5、7日目に材料補充を行って、材料補充のボリュームは、細胞の総ボリュームの3.5%であった。

h）細胞の活力が70%まで下回る時に収穫した。発現時間は9-13日間であった。

（2）293E一過性トランスフェクション工程（例として、トランスフェクション総ボリュームが20ml）
a）トランスフェクション前日、細胞を継代した。ここで、例えば、FreeStyle^TM293（Thermo Fisher会社より購入）に使用できる。浮遊細胞の密度を0.6-0.8×10⁶細胞／ml、ボリューム20mlになるように調整した。これは、細胞が対数増殖期であることを保証し、二日目のトランスフェクション際までに、細胞の密度が1.2-1.6×10⁶細胞／mlに達することができた。

c）トランスフェクション当日は、LPEIを使用の前に、室温までに予熱して、軽く混ぜた。

d）0.67 ml無血清培地（例えばFreeStyle^TM293）に、20μg DNAを希釈し、よく混ぜた。

e）0.67 ml の無血清培地（例えば、FreeStyle^TM293）にて、40μg LPEIを希釈し、よく混ぜた。

f）工程eで希釈したLPEIを、工程ｄで希釈したDNAに加えて、速やかに混ぜて、室温で15分間培養して、複合体を形成させた。

g）工程ｆのトランスフェクション複合体を均一にするように、準備しておいた20mlの対数増殖期の細胞に加えた。添加直後に均一にまでに振盪し、ロータリーシェーカーにて37℃、125rpm、5%CO2で培養した。

h）トランスフェクションした後1日目、3日目に材料補充を行って、材料補充のボリュームは、細胞総ボリュームの5%であった。

i）6日目までに発現して、抗体を収穫した。

（3）具体的は、コトランスフェクションしたプラスミドDNAは、以下であった：
1）図1に示す二重特異性抗体1を発現するために、プラスミドpFLとpFHを、CHO-S又は293E細胞にコトランスフェクションして発現することが必要であった。

2）図2に示す二重特異性抗体2を発現するために、プラスミドpLとpFH2を、CHO-S又は293E細胞にコトランスフェクションして発現することが必要であった。

3）図3に示す二重特異性抗体3を発現するために、プラスミドpFPを、CHO-S又は293E細胞にトランスフェクションして発現することが必要であった。

4）図4に示す二重特異性抗体4を発現するために、プラスミドpFL2とpFH3を、CHO-S又は293E細胞にコトランスフェクションして発現することが必要であった。

一般的に、2種のプラスミドをコトランスフェクションで発現する場合、前記2種のプラスミドのモル数の比は、1:1であってもよいし、他の任意の割合であってもよい。

2．二重特異性抗体の精製方法：
抗体の精製は、主にアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ及びモレキュラシーブを用いた。具体的には以下の通りであった：
（1）収穫：抗体を発現した細胞培養液を、3000×gで10分間遠心し、上清を取って、0.22μmのフィルターでろ過して、4^oCに保存し、使用まで予備した。

（2）フィニティークロマトグラフィー（MabSelect SuRe GE 17-5438-01、例として、カラムボリュームが18ml）
a）平衡化：結合バッファー（25 mM トリメチロールアミノメタン、pH 7.0-7.4）で、UV検出器、電導度の数値が安定した又はベースラインを維持していたまでカラムを平衡化し、少なくとも5倍のカラム体積を平衡化した。

b）ローディング：ろ過した上清を5ml/minの流速でローディングした。

c）洗浄・平衡化：結合バッファーで5倍のカラム体積を洗い流した。

d）溶出：溶出バッファー（50mM クエン酸、pH 3.4±0.1）でサンプルを溶出した。5ml/minの流速で、5倍のカラム体積を溶出して、溶出したピークを収集した。

e）中和：1M Tris/トリメチロールアミノメタン（pH 8.0）で溶出液を中和し、サンプルをpH6.0±0.1に調整した。

（3）イオン交換クロマトグラフィ（カチオン交換クロマトグラフィーを例として、HiTrap SP-HP GE 17-1151-01、5mlのカラム体積）
a）サンプルの準備：アフィニティクロマトグラフィーのサンプルを精密濾過した後、超純水で電導度が5 mS／cm以下になるように希釈した。その後、pHを6.0±0.1に調整した。

b）平衡化及びローディング：まず、5倍のカラム体積のバッファーB（25mM クエン酸+1M塩化ナトリウム、電導度が80～90 mS／cmであるべき、pHが6.0±0.1であった）で平衡化した。さらに、少なくとも5倍のカラム体積のバッファーA（25mM クエン酸、電導度が5 mS／cm以下であるべき、pHが6.0±0.1であった）にて、電導度、pH、紫外ベースラインが安定したまでカラムを平衡化し、その後、3ml/minの流速でローディングした。

c）洗浄・平衡化：5倍のカラム体積のバッファーAにて、5ml/minの流速で洗浄した。

d）溶出：0-30%のバッファーB、20倍のカラム体積で溶出し、100%のバッファーB、10倍のカラム体積で溶出した。全過程において、流速は3ml/minであった。異なるチューブに溶離液を収集して検出した。

（4）疎水性クロマトグラフィ（Capto phenyl ImpRes、フィラーGE XK16/20 11.5 cm／23ml）
a）サンプル処理：5M塩化ナトリウムで、塩化ナトリウムが1Mになるようにサンプルを調節し、pHを6.0に調節した。

b）平衡化及びローディング：まず、バッファーA（25mM クエン酸塩+1M塩化ナトリウム、pHが6.0±0.1）にて5倍のカラム体積を用いて、5ml/minの流速で平衡化した。そして、3.3 ml／minの流速でローディングした。

c）洗浄・平衡化：5倍のカラム体積のバッファーAにて、5ml/minの流速で洗浄した。10%バッファーB（25mM クエン酸塩、pHは6.0±0.1であった）にて、5倍のカラム体積を用いて、5ml/minの流速で洗浄した。

d）溶出：90%バッファーBを用いて5ml/minの流速で溶出し、異なるチューブに溶出ピークを収集して検出した。

（5）モレキュラシーブス（HiLoad Superdex 200pg GE 28989336 26/600）
a）平衡化及びローディング：バッファー（20mM ヒスチジン+0.15M塩化ナトリウム、PH6.0±0.1）にて2倍のカラム体積を用いて平衡化した後、3ml/minの流速でローディングした。

b）溶出：バッファーにて2倍のカラム体積で溶出し、異なるチューブに溶出ピークを収集して検出した。

具体的に発現された抗体の一部の略称、及び対応する抗体アミノ酸配列は、下表に示す。

本発明の二重特異性抗体構造1の一部の発現を図5A-Dに示した。図5Aは、Y100-Aシリーズ及びY100-Bシリーズの抗体の、CHO細胞において一過性トランスフェクションした後の発現レベルを示した。図5Bは、Y101/Y103/Y104/Y105-Aシリーズ及びY101/Y103/Y104/Y105-Bシリーズの抗体の、CHO細胞において一過性トランスフェクションした後の発現レベルを示した。図5Cは、Y106/Y110/Y116-Aシリーズ及びY106/Y110/Y116-Bシリーズの抗体の、CHO細胞において一過性トランスフェクションした後の発現レベルを示した。図5Dは、Y100/Y101/Y103/Y104/Y105/Y106/Y110/Y116-A及びBシリーズの抗体のうち、発現量が5mg/Lを超える抗体に対して、タンパク質Aフィニティークロマトグラフィーを実施した後のHPLC-SEC検出純度を示した。

図5A-Cから分かるように、二重特異性抗体構造1の２つのシリーズであるAシリーズ及びBシリーズは、一過性トランスフェクションの発現レベルに有意な差異が認められ、Aシリーズは10mg/Lを超える発現量をごくまれに有し、Bシリーズは、より高い発現量を有した。また、図5Dから分かるように、二重特異性抗体構造1のBシリーズの抗体の純度は、全部70%を超えており、二重特異性抗体構造1のAシリーズの抗体の純度は、Bシリーズとほぼ一致した。発現量5mg/L未満の抗体に対して、検出純度がなかった。

比較としての二重特異性抗体構造2の一部の発現状况を図6に示し、Y200/Y201/Y203/Y204/Y205/Y206/Y210/Y216-Aシリーズ及びBシリーズの抗体の、CHO細胞において一過性トランスフェクションした後の発現レベル、ならびにタンパク質Aフィニティークロマトグラフィーを実施した後のHPLC-SEC検出純度を示した。

図6から分かるように、二重特異性抗体構造2の２つのシリーズであるAシリーズ及びBシリーズは、一過性トランスフェクションの発現レベルに有意な差異が認められず、発現量はいずれも20mg/Lを超えなかった。また、二重特異性抗体構造2は、タンパク質Aフィニティークロマトグラフィーを経ってHPLC-SECにて純度を検出したところ、異なる分子の間に差異が極めて大きく、30%-90%にわたって分布した。一部の抗体は、発現量が低すぎるため、純度の検出を行わなかった。

比較としての二重特異性抗体構造3の一部の発現状况を図7に示し、Y300/Y304/Y316-Aシリーズ、Bシリーズ、Cシリーズ及びDシリーズの抗体の、CHO細胞において一過性トランスフェクションした後の発現レベル、ならびにタンパク質Aフィニティークロマトグラフィーを実施した後のHPLC-SEC検出純度を示した。

図7から分かるように、二重特異性抗体構造3の4つのシリーズ：Aシリーズ、Bシリーズ、Cシリーズ及びDシリーズは、一過性トランスフェクションの発現レベルが高くなく、発現量はいずれも12mg/Lを超えなかった。また、二重特異性抗体構造3は、タンパク質Aフィニティークロマトグラフィーを経ってHPLC-SECにて純度を検出したところ、純度が低く、いずれも50%を超えなかった。一部の抗体は、発現量が低すぎるため、純度の検出を行わなかった。

比較としての二重特異性抗体構造4の一部の発現状况を図8に示し、Y400/Y404/Y416-Aシリーズ及びBシリーズの抗体の、CHO細胞において一過性トランスフェクションした後の発現レベル、ならびにタンパク質Aフィニティークロマトグラフィーを実施した後のHPLC-SEC検出純度を示した。

図8から分かるように、二重特異性抗体構造4の２つのシリーズであるAシリーズ及びBシリーズは、一過性トランスフェクションの発現レベルがいないが高くなく、発現量はいずれも6mg/Lを超えなかった。また、二重特異性抗体構造4は、タンパク質Aフィニティークロマトグラフィーを経ってHPLC-SECにて純度を検出したところ、純度に大きい差異があって、30%-90%にわたって分布した。一部の抗体は、発現量が低すぎるため、純度の検出を行わなかった。

標的及び抗体可変領域配列が同じである二重特異性抗体構造1-4の抗体の間の、発現レベル及び純度の比較を図9A-Iに示した。図9Aは、S70抗体可変領域配列（SEQ ID NO：41と42）とG631抗体可変領域配列（SEQ ID NO：57と58）を含む二重特異性抗体構造1-4の抗体の、発現レベル及び純度であった。図9Bは、S70抗体可変領域配列（SEQ ID NO：41と42）と3G12抗体可変領域配列（SEQ ID NO：59と60）を含む二重特異性抗体構造1と2の抗体の、発現レベル及び純度であった。図9Cは、12A4抗体可変領域配列（SEQ ID NO：45と46）と3G12抗体可変領域配列（SEQ ID NO：59と60）を含む二重特異性抗体構造1と2の抗体の、発現レベル及び純度であった。図9Dは、S70抗体可変領域配列（SEQ ID NO：41と42）とLAG35抗体可変領域配列（SEQ ID NO：33と34）を含む二重特異性抗体構造1と2の抗体の、発現レベル及び純度であった。図9Eは、5C4抗体可変領域配列（SEQ ID NO：37と38）及びYervoy抗体可変領域配列（SEQ ID NO：27と28）を含む二重特異性抗体構造1、3と4の抗体の、発現レベル及び純度であった。図9Fは、5C4抗体可変領域配列（SEQ ID NO：37と38）と10A7抗体可変領域配列（SEQ ID NO：29と30）を含む二重特異性抗体構造1と2の抗体の、発現レベル及び純度であった。図9Gは、5C4抗体可変領域配列（SEQ ID NO：37と38）とG631抗体可変領域配列（SEQ ID NO：57と58）を含む二重特異性抗体構造1と2の抗体の、発現レベル及び純度であった。図9Hは、5C4抗体可変領域配列（SEQ ID NO：37と38）及びB-N10抗体可変領域配列（SEQ ID NO：63と64）を含む二重特異性抗体構造1と2の抗体の、発現レベル及び純度であった。図9Iは、エロツズマブ抗体可変領域配列（SEQ ID NO：49と50）とNM3E2抗体可変領域配列（SEQ ID NO：47と48）を含む二重特異性抗体構造1-4の抗体の、発現レベル及び純度であった。

図9Aから分かるように、二重特異性抗体構造1の抗体は、他の構造よりも高い抗体発現純度を有し、Y100-B6及びY100-B7他の構造の抗体より優れた発現レベル及び/又は純度を有し、ここで、Y100-B7は、最も優れた発現レベルと純度を有した。図9Bから分かるように、二重特異性抗体構造1の抗体は、他の構造よりも高い抗体発現純度を有し、Y101-B1及びY101-B2は、他の構造の抗体より優れた発現レベルと純度を有し、ここで、Y101-B2は、最も優れた発現レベルと純度を有し；図9Cから分かるように、二重特異性抗体構造1の抗体は、他の構造より高い発現レベル及び/又は抗体の純度を有し、Y101-B3及びY101-B4は、二重特異性抗体構造2の抗体より優れた発現レベルと純度を有し、ここで、Y101-B4は、最も優れた発現レベルと純度を有した。図9Dから分かるように、二重特異性抗体構造1の抗体は、他の構造より高い発現レベル及び/又は抗体の純度を有し、Y103-B1及びY103-B2は、二重特異性抗体構造2の抗体より優れた発現レベルと純度を有し、ここで、Y103-B2は、最も優れた発現レベルと純度を有した。図9Eから分かるように、二重特異性抗体構造1の抗体は、他の構造より高い発現レベル及び/又は抗体の純度を有し、Y104-B1及びY104-B2は、二重特異性抗体構造3と構造4の抗体より優れた発現レベル及び/又は純度を有し、ここで、Y104-B2は、最も優れた発現レベルと純度を有した。図9Fから分かるように、二重特異性抗体構造1の抗体は、他の構造より高い発現レベル及び/又は抗体の純度を有し、Y105-B1及びY105-B2は、二重特異性抗体構造2の抗体より優れた発現レベルと純度を有し、ここで、Y105-B2は、最も優れた発現レベルと純度を有した。図9Gから分かるように、二重特異性抗体構造1の抗体は、他の構造より高い発現レベル及び/又は抗体の純度を有し、Y106-B1及びY106-B2は、二重特異性抗体構造2の抗体より優れた発現レベル及び/又は純度を有し、ここで、Y106-B2は、最も優れた発現レベルと純度を有した。図9Hから分かるように、二重特異性抗体構造1の抗体は、他の構造よりも高い抗体発現純度を有し、Y110-B1及びY110-B2は、二重特異性抗体構造2の抗体より優れた発現レベルと純度を有し、ここで、Y110-B2は、最も優れた発現レベルと純度を有した。図9Iから分かるように、二重特異性抗体構造1の抗体は、他の構造より高い発現レベル及び/又は抗体の純度を有し、Y116-B1及びY116-B2は、他の二重特異性抗体構造より優れた発現レベルと純度を有し、ここで、Y116-B2は、最も優れた発現レベルと純度を有した。

それぞれの前記抗体は、ヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインが、一斉に、IgG2（GenBank accession number MH025834.2）、IgG3（GenBank accession number AJ390278）又はIgG4（GenBank accession number KJ901516）に対応する配列に置換されて、抗体可変領域とリンカー配列が変更しない場合、置換された抗体と元の抗体との間は、発現レベル、純度に有意な差異が認められなかった。以上のデータに基づいて、二重特異性抗体構造1は、発現レベルと純度の面で、他の二重特異性抗体構造により有利であることが分かった。

また、Y100-B7、Y101-B2及びY101-B4などの抗体は、CHO細胞による安定発現プールにおいて、発現レベルがいずれも700mg/Lを超え、純度がいずれも85%を超えた。タンパク質Aフィニティークロマトグラフィーから始めて、一般的なアニオン性/カチオン性交換クロマトグラフィーなどのモノクローナル抗体精製プロセスを経って、最後、95%超の純度を含む標的生成物を得るまで、計算した総回収率がいずれも40%であった。これは、モノクローナル抗体と、完全に一致な発現、精製プロセスであった。

実施例2．二重特異性抗体の生物学活性アッセイ
1．抗原との親和性
1）抗原の準備：抗原たんぱく質であるVEGFA、TGF-β1、IL-10、PD-1、CTLA-4、TIGIT、SLAMF7、LAG-3及びCD16a（それらの配列は、それぞれ表26に示す）などは、全部、Hisタグを持つ発現プラスミドpcDNA 3.1（invitrogen会社より購入）に構築した。ここで、PD-1、CTLA-4、TIGIT、SLAMF7及びCD16aの五つのタンパクは、胞外ドメインを選んで構築に用いて、293E細胞に一過性トランスフェクションして発現、精製した。精製方法は、ニッケルカラムによる精製と、モレキュラシーブス精製の２つの段階を含み、最終得られた抗原たんぱく質は、95%以上のSDS-PAGE検出純度を有した。抗原たんぱく質の全ては、濃度が2μg/mlに調整されて、100μl／ウェルでマイクロプレートを、4度で一晩コートした。上清を捨て、各ウェルにブロッキング液（3%BSAしたPBS）を250μlずつ加えた。

2）抗体の添加：実験デザインの通り、作業は室温で行われ、抗体が階段希釈され、希釈液は1%BSAのPBSであった。例えば、希釈する際、抗体の初濃度が3000nMであり、3倍希釈で、11つの濃度階段に希釈した。希釈した抗体を、マイクロプレートのウェルへ、各ウェルに200μlずつ加え、室温で2h培養して静置し、その後、上清を捨た。

3）洗浄：200μl／ウェルのPBST（0.1%Tween20含PBS）で3回洗浄した。

4）第二抗体のインキュベーション：希釈した第二抗体であるHRP標識抗ヒトIgG（シグマ，A8792）を加えた。第二抗体は、使用に1：40000で希釈し、希釈液は1%BSAのPBSであり、ボリュームは100μl／ウェルであった。これと共に、対照として、コート抗原及び第二抗体しかコートしないウェルを設け、室温で1h培養した。

5）洗浄：200μl／ウェルのPBST（0.1%Tween20含PBS）で5回洗浄した。

6）発色：TMB発色液（A、B発色液（Boster biological Technology co.Ltdより購入）を配製し、A：B=1：1でよく混ぜ、使用直前まで配製した）100μl／孔を添加し、37℃で5min発色した。

7）2M HCl停止液を、100μl／孔で加えた。マイクロプレートリーダーの450nmでの読み取りは、必ず停止液を加えた30min内に行われ、Graphpad Prism 5で図を作って、横軸は抗体濃度（nM）であり、縦軸は平均蛍光強さであり、One site--Specific binding法でEC50値を算出した。この値は、該抗体と対応する標的抗原との親和性であった。結果を表32に示した。結果から、抗体の可変領域の配列が同一である条件で、本発明の二重特異性抗体（二重特異性抗体構造1）は、対応する標的抗原との親和性が二重特異性抗体構造2-4よりも有意に高いことがわかった。さらに、本発明の二重特異性抗体（二重特異性抗体構造1）は、いかなる標的に対して最も強い抗原結合活性を有した。

2．細胞との親和性
1）細胞の準備：二重特異性抗体分子のPD-L1端細胞に対する結合活性のアッセイは、PD-L1陽性であるH358細胞（中国科学院上海生命科学研究所細胞資源センターより購入）を用いた。十分な量の細胞を取って、300×gで5min遠心し、上清を捨て、1%FBS-PBSで細胞を再縣濁し、密度が4×10⁶／mlになるように調整した。ウェル毎に50μlを加えて、ウェル毎に2×10⁵個になるように、細胞をプレートに播種した。4°C、300×gで、5min遠心した、上清を廃棄した。なお、細胞の播種は氷上で行った。

2）抗体の添加：実験デザインに従って、抗体を階段希釈した。なお、抗体の希釈は、氷上で行った。例えば、希釈する際、抗体の初濃度が3000nMであり、3倍希釈で、11つの濃度階段に希釈した。希釈した抗体は、細胞が存在しているウェルへ、ウェル毎に50μlを加え、軽くピペッティングしてよく混ぜ、4°C、1100rpm/minで振盪しながら2h培養した。

3）洗浄：150μl 1%FBS-PBSで細胞を再縣濁し、4°C、300×gで5min遠心し、上清を廃棄した。1回の洗浄を繰り返した。

4）第二抗体インキュベーション：第二抗体の終濃度は8μg/mlで、ボリュームは50μl／ウェルになるように、希釈した第二抗体であるPE抗ヒトIgG FC（Biolegend，409304）を加えた。これと共に、対照として細胞及び第二の抗体のみを添加したウェルを設け、軽くピペッティングしてよく混ぜ、4°Cで避光下、1100rpm/minで振盪しながら1hインキュベーションした。

5）洗浄：150μl 1%FBS-PBSで細胞を再縣濁し、4°C、300gで5min遠心し、上清を廃棄した。1回の洗浄を繰り返した。

6）固定：ウェル毎に200μlの2%パラホルムアルデヒドを加えて、細胞を再縣濁し、室温で細胞を20min固定した。300×gで5min遠心し、上清を廃棄した。

7）細胞の再縣濁：200μl 1%FBS-PBSで細胞を再縣濁し、300×gで5min遠心し、上清を廃棄した。

8）フローサイトメーターへのローディング：150μl 1%FBS-PBSで細胞を再縣濁し、フローサイトメーターにセットしてテストした。

9）データの分析：データは、フローサイトメーター解析ソフトであるFlowJo 7.6で解析し、特定の抗体濃度の平均蛍光強さが得られ、Graphpad Prism 5で図を作って、横軸は抗体濃度（nM）であり、縦軸は平均蛍光強さであり、One site--Specific binding法でEC50値を算出した。この値は、該抗体と対応する標的抗原との細胞親和性であった。結果を表32に示した。

表32のデータから分かるように、抗体の可変領域の配列が同一である条件で、異なる二重特異性抗体構造は、標的抗原との結合活性に有意な差異があった。ここで、いかなる標的に対して、二重特異性抗体構造1の抗体は、最も強い抗原結合活性を有した。前記抗体のおのおのは、ヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインが、一斉に、IgG2、IgG3又はIgG4に対応する配列（同）に置換されて、抗体可変領域とリンカー配列が変更しない場合、置換された抗体と元の抗体との間は、抗原結合活性に有意な差異が認められなかった。

実施例3．抗体の安定性試験
実験手順：
1．40^oCの熱加速安定性試験の具体的作業手順は、以下であった。

1）サンプルを、20mM クエン酸、pH 5.5の組成を含む特定のバッファーのうちに置換されて、サンプル濃度を1mg/mLに調整した。

2）各サンプルは、チューブ毎に500μL（合計6本のチューブ）を入れて、封止して40^oCの水浴に乗せて、それぞれ、第0日間、3日間、5日間、7日間、10日間及び14日間にサンプリングしてHPLC-SEC検出に供し、水浴時間は合計14日間であった。

2．耐酸性試験は、低pHでの安定性とも称し、抗体分子が酸性環境で一定期間に処理された後、再度生理学的条件までに中和された際に、元の状態を維持できるかどうかを調査する指標であった。具体的作業手順は、以下であった：
抗体分子に対してタンパク質Aフィニティークロマトグラフィーを行う時に、酸溶出する工程で（pH 3.5のクエン酸バッファーを用いた）せれた抗体溶液は、中和せず前記バッファーにおいて一定時間をキープし、その後、30min目、60min目にサンプリングしてボリュームの1/10の1M Tris-HCl（pH 8.0）を加えて中和して、このサンプルをHPLC-SECテストを行った。

3.1 二重特異性抗体構造1の安定性試験
（1）異なる二重特異性抗体構造に対しての40^oC加速熱安定性試験
検出結果を図10A-Eに示した。図10Aは、Y100-B6、Y100-B7、Y200-A1、Y200-B1、Y200-B3、Y300-A1及びY400-B1が、0日間、7日間及び14日間の40℃での処理をした後のHPLC-SEC純度試験であり：図10Bは、Y101-B1、Y101-B2、Y201-A1、Y201-B1、Y101-B3、Y101-B4、Y201-A2及びY201-B2が、0日間、7日間及び14日間の40℃での処理をした後のHPLC-SEC純度試験であり、図10Cは、Y103-B1、Y103-B2、Y203-A1、Y203-B1、Y104-B1、Y104-B2、Y304-A1及びY404-B1が、0日間、7日間及び14日間の40℃での処理をした後のHPLC-SEC純度試験であり、図10Dは、Y105-B1、Y105-B2、Y205-A2、Y205-B2、Y106-B1、Y106-B2、Y206-A2、Y206-B1及びY206-B2が、0日間、7日間及び14日間の40℃での処理をした後のHPLC-SEC純度試験であり、図10Eは、Y110-B1、Y110-B2、Y210-A1、Y210-B1、Y116-B1、Y116-B2、Y216-A1、Y216-B1、Y316-A1、Y416-B1が、0日間、7日間及び14日間の40℃での処理をした後のHPLC-SEC純度試験であった。

図10から分かるように、二重特異性抗体構造1を持つ異なる抗体は、40^oCで14日間処理した後の純度が、いずれも90%以上であり、大規模な凝集又は分解の状況が見られなく、二重特異性抗体構造1は良好な熱安定性を有することを示した。他の二重特異性抗体構造は、40^oCで14日間処理した後の純度が、有意に低減した。

（2）異なる二重特異性抗体構造の耐酸性試験
検出結果を図11A-Eに示した。図11Aは、Y100-B6、Y100-B7、Y200-A1、Y200-B1、Y200-B3、Y300-A1及びY400-B1に対して、0分間、30分間と60分間の低pH処理をした後のHPLC-SEC純度試験であり：図11Bは、Y101-B1、Y101-B2、Y201-A1、Y201-B1、Y101-B3、Y101-B4、Y201-A2及びY201-B2に対して、0分間、30分間と60分間の低pH処理をした後のHPLC-SEC純度試験であり、図11Cは、Y103-B1、Y103-B2、Y203-A1、Y203-B1、Y104-B1、Y104-B2、Y304-A1及びY404-B1に対して、0分間、30分間と60分間の低pH処理をした後のHPLC-SEC純度試験であり、図11Dは、Y105-B1、Y105-B2、Y205-A2、Y205-B2、Y106-B1、Y106-B2、Y206-A2、Y206-B1及びY206-B2に対して、0分間、30分間と60分間の低pH処理をした後のHPLC-SEC純度試験であり、図11Eは、Y110-B1、Y110-B2、Y210-A1、Y210-B1、Y116-B1、Y116-B2、Y216-A1、Y216-B1、Y316-A1、Y416-B1に対して、0分間、30分間と60分間の低pH処理をした後のHPLC-SEC純度試験であった。

図11A-Eから分かるように、二重特異性抗体構造1の抗体の方は、低pH条件下で60分間処理した後、全ての抗体の純度は明確な改変がなかった。二重特異性抗体構造1は良好な耐酸性を有することを証明した。他の二重特異性抗体構造の抗体は、低pH条件下で60分間処理した後に純度が有意に低減したことを、各構造に一部の抗体に発見した。

図10と図11を総合して、二重特異性抗体構造1の抗体は、他の二重特異性抗体構造によりもう優れた熱安定性と耐酸性を有することが分かった。

前記抗体のおのおのは、ヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインが、一斉に、IgG2、IgG3又はIgG4に対応する配列（同）に置換されて、抗体可変領域とリンカー配列が変更しない場合、置換された抗体と元の抗体との間は、安定性に有意な差異が認められなかった。

実施例4．二重特異性抗体のIn vivo薬効実験1
1）.試験材料：
細胞：MC38（マウス大腸癌細胞株，ATCCより購入）であった。

マウス：C57BL/6マウス、メス、Beijing Vital River laboratory Animal Technology Co,. Ltdより購入であった。

接種方法：MC38細胞を培養して収集し、細胞の濃度を調整し、1*10⁶個／匹（0.1 ml／匹）で背中の皮下に接種した。腫瘍が100-200mm³まで成長した時に、群を分けて細胞を投与し、グループ毎に8匹であった。

試験用薬：Y100-B7であった；
陰性対照：生理食塩水；
陽性対照：Tecentriq（PD-L1モノクローナル抗体、Roche会社）；
投与方法：Y100-B7は、複数の剤量（13.3 mg／kg、4mg/kg）に設けて、Tecentriqは、10mg/kgの投与剤量で、腹腔内投与した。投与は、0日目から始まって、週毎に3回、1週間投与した。

腫瘍ボリューム：2-3日間毎に、腫瘍の長さ、幅を計測した。また、各群について、一つの群全体の腫瘍体積が2000mm³に接近した時、又はある一つのマウスの腫瘍体積が3000mm³に達した時、当該群を終止した。

2）．実験結果
Y100-B7のIn vivo薬効実験の結果を図12に示した。図12は、マウス腫瘍モデルにおいて、二重特異性抗体Y100-B7の、In vivo薬効及び腫瘍ボリュームについてのモニタリングを示した。結果から、Y100-B7の高剤量グループ（13.3 mg／kg）は、著しい腫瘍抑制効果を有し、また、Tecentriqよりも優れたことを示した。

実施例5．二重特異性抗体のIn vivo薬効実験2
1）.試験材料：
細胞：MC38（マウス大腸癌細胞株，ATCCより購入）；
マウス：C57BL/6マウス、メス、Beijing Vital River laboratory Animal Technology Co,. Ltdより購入であった。

試験用薬：Y101-B2。

陰性対照：生理食塩水。

陽性対照：Tecentriq（PD-L1モノクローナル抗体、Roche会社）。

投与方法：Y101-B2は、複数の剤量（13.3 mg／kg、4.4mg/kg）に設けて、Tecentriqは、10mg/kgの投与剤量で、腹腔内投与した。投与は、0日目から始まって、週毎に3回、3週間投与した。

腫瘍ボリューム：週毎に3回、腫瘍の長さ、幅を計測した。また、各群について、一つの群全体の腫瘍体積が2000mm³に接近した時、又はある一つのマウスの腫瘍体積が3000mm³に達した時、当該群を終止した。

2）．実験結果
Y101-B2のIn vivo薬効実験の結果を図13に示した。図13は、マウス腫瘍モデルにおいて、二重特異性抗体Y101-B2の、In vivo薬効及び腫瘍ボリュームについてのモニタリングを示した。結果から、Y101-B2の高剤量グループ（13.3 mg／kg）は、著しい腫瘍抑制効果を有し、また、Tecentriqよりも優れたことが分かった。

実施例6：バイパラトピック抗体の調製、及び生物学活性アッセイ
バイパラトピック抗体（biparatopic antibody）は、二重特異性抗体の一種であり、同一の抗原の２つの異なるエピトープに結合できる。

発現プラスミドの構築、293E細胞への一過性トランスフェクション及び抗体の製造方法は、前に同じであった。

相関する抗原は、ヒトHer2の胞外ドメイン（配列ソース：UniProtKB-P04626）であった。

相関する抗体可変領域配列は以下の表に示す。

構築された抗体配列は、以下の表に示す：

一過性トランスフェクション発現レベルについては、モノクローナル抗体であるHerceptin mAbとPerjeta mAbがいずれも30mg/Lであり、二重特異性抗体であるY140-B1/B2/B3/B4がいずれも25mg/L以上であり、二重特異性抗体であるY140-A1/A2/A3/A4の発現は7-20mg/Lとの間に分布した。すべての抗体のSEC検出純度は80%以上であった。

二、生物学活性アッセイ
細胞との親和性
1）細胞の準備：二重特異性抗体分子Her2端の親和性のアッセイは、Her2陽性であるBT-474細胞（中国科学院典型的培養物寄託委員会細胞ライブラより購入）を用いた。十分な量の細胞を、300×gで5min遠心し、上清を捨て、1%FBS-PBSで細胞を再縣濁し、密度が2×10⁶／mlになるように調整した。ウェル毎に50μlを加えて、ウェル毎に1×10⁵個になるように、細胞をプレートに播種した。4°C、300×gで、5min遠心した、上清を廃棄した。なお、細胞の播種は、氷上で行った。

2）抗体の添加：実験デザインに従って、表34の抗体を階段希釈した。なお、抗体の希釈は、氷上で行った。例えば、希釈する際、抗体の初濃度が3000nMであり、3倍希釈で、11つの濃度階段に希釈した。希釈した抗体は、細胞が存在しているウェルへ、ウェル毎に50μlを加え、軽くピペッティングしてよく混ぜ、4°C、1100rpm/minで振盪しながら2h培養した。

4）第二抗体の抗体インキュベーション：第二抗体の終濃度は8μg/mlで、ボリュームが50μl／ウェルになるように、希釈した第二抗体であるPE抗ヒトIgG FC（Biolegend，409304）を加えた。これと共に、対照として細胞及び第二の抗体のみを添加したウェルを設け、軽くピペッティングしてよく混ぜ、4°Cで避光下、1100rpm/minで振盪しながら1hインキュベーションした。

9）データの分析：データは、フローサイトメーター解析ソフトであるFlowJo 7.6で解析し、特定の抗体濃度の平均蛍光強さが得られ、Graphpad Prism 5で図を作って、横軸は抗体濃度（nM）であり、縦軸は平均蛍光強さであり、One site--Specific binding法でEC50値を算出した。この値は、該抗体と対応する標的抗原との細胞親和性であった。

上表から分かるように、抗原が同一でエピトープが異なる2種の抗体により組み立てた二重特異性抗体は、親和性が、２つのモノクローナル抗体より顕著に高まり、同時に、Bシリーズの二重抗体の親和性が、Aシリーズの抗体より顕著に高まった。

一つの態様において、本発明の二重特異性抗体がF（ab）₂－（Fv）₂－Fc構造を持つ抗体であり、ここで、F（ab）₂が2つのVHa、2つのCH1、2つのVLa及び2つのCLを含み、（Fv）₂が2つのVHb及び2つのVLbを含み、前記VHb及び前記VLbの位置は互換性があり、前記Fc断片がヒンジ領域、第二定常領域CH2及び第三定常領域CH3を含む。

Claims

二重特異性抗体であって、2つの同じ融合重鎖及び2つの同じ融合軽鎖を含み、前記2つの融合重鎖がペアリングを形成し、前記融合軽鎖及び前記融合重鎖がペアリングを形成し、前記融合重鎖が抗体a重鎖可変領域VHa、第一定常領域CH1、抗体b可変領域1及びFc断片を含み、前記抗体b可変領域1がリンカー2又はペプチド結合によりCH1と連結しており、かつ、リンカー3又はペプチド結合によりFcと連結しており、前記二重特異性抗体の融合軽鎖が抗体a軽鎖可変領域VLa、軽鎖定常領域CL及び抗体b可変領域2を含み、前記抗体b可変領域2がリンカー1又はペプチド結合によりCLのC末端と連結しており、ここで、
（1）前記抗体b可変領域1が抗体bの重鎖可変領域VHbであり、前記抗体b可変領域2が抗体bの軽鎖可変領域VLbであり、又は
（2）前記抗体b可変領域1が抗体bの軽鎖可変領域VLbであり、前記抗体b可変領域2が抗体bの重鎖可変領域VHbであり、
VHa-VLaペアリングが抗原Aを標的とし、VHb-VLbペアリングが抗原Bを標的とし、
好ましくは、前記二重特異性抗体がF（ab）₂－（Fv）₂－Fc構造を持つ4価の対称型二重特異性抗体であり、F（ab）₂が2つのVHa、2つのCH1、2つのVLa及び2つのCLを含み、（Fv）₂が2つのVH／VLb及び2つのVL／VHbを含み、前記VH／VLb及び前記VL／VHbの位置は互換性があり、前記Fc断片がヒンジ領域、第二定常領域CH2及び第三定常領域CH3を含む、二重特異性抗体である。
前記VHa-VLaペアリングが一つ又は複数の鎖間ジスルフィド結合を含み、前記VHb-VLbペアリングが一つ又は複数の鎖間ジスルフィド結合を含む、請求項1に記載の二重特異性抗体。
前記抗体b可変領域1が抗体bの軽鎖可変領域VLbであり、前記抗体b可変領域2が抗体bの重鎖可変領域VHbである、請求項1又は2に記載の二重特異性抗体。
リンカー1～3が同一又は異なってもよく、前記リンカー1～3が、それぞれ独立に、SEQ ID NO:69-90からなる群から選択され、好ましくはSEQ ID NO:71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、82、83、85、86、87、88、89又は90からなる群から選択される、請求項1-3のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
前記CLの配列はSEQ ID NO:104-110からなる群から選択される、請求項1-4のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
前記CH1の配列はSEQ ID NO:111-114からなる群から選択される、請求項1-5のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
前記CH2の配列はSEQ ID NO:115-119からなる群から選択される、請求項1-6のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
前記CH3の配列はSEQ ID NO:120-128からなる群から選択される、請求項1-7のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
前記抗原A及び前記抗原Bは同一又は異なってもよく、好ましくは、前記抗原A及び前記抗原Bがそれぞれ独立に、免疫細胞表面抗原、腫瘍抗原、ウィルス、細菌、エンドトキシン、サイトカイン、又はそれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくは、抗原A又は抗原Bが異なり、又は同じ抗原の異なるエピトープを表す、請求項1-8のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
前記抗原A及び/又は前記抗原BがPD-L1、PD-1、VEGFA、IL-10、IL-10R、BCMA、VEGF、TGF-β、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CEA、CD38、SLAMF7、B7-H3、Her2、EpCAM、CD19、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、EGFR、GD2、GD3、GM2、RANKL、CD3及び/又はCD16aからなる群から選択され、好ましくは、前記抗原A及び/又は前記抗原Bが、SEQ ID NO:129-145からなる群から選択される、請求項1-9のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
前記抗原A及び前記抗原Bが、以下からなる群から選択される、請求項1-10のいずれか1項に記載の二重特異性抗体：
PD-L1及びVEGF；
PD-1及びVEGF；
PD-L1及びTGF-β；
PD-1及びTGF-β；
PD-1及びCTLA-4；
PD-1及びLAG-3；
PD-1及びTIGIT；
PD-1及びIL-10；
SLAMF7及びCD16a；並びに、
Her2及びHer2。
以下からなる群から選択される、請求項1-10のいずれか1項に記載の二重特異性抗体：
（1）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:82及びSEQ ID NO:42を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（2）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:42を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（3）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:42を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（4）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:46を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（5）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:46を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（6）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:58を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（7）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:58を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（8）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:58を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（9）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:58を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（10）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:54を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（11）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:58を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（12）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:68を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（13）融合軽鎖がSEQ ID NO:68、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:58を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:67、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（14）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:60を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（15）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:60を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（16）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:60を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（17）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:60を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（18）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:60を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（19）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:34を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（20）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:34を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（21）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:34を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（22）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:28を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（23）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:28を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（24）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:28を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（25）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:30を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（26）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:30を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（27）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:30を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（28）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:58を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（29）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:58を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（30）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:60を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（31）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:60を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（32）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:60を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（33）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:64を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（34）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:64を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（35）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:64を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（36）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:64を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（37）融合軽鎖がSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:48を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:49、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（38）融合軽鎖がSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:48を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:49、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（39）融合軽鎖がSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:48を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:49、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（40）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:82及びSEQ ID NO:4１を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（41）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:4１を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（42）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:4１を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（43）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:45を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（44）融合軽鎖がSEQ ID NO:58、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:45を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:57、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（45）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（46）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（47）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（48）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（49）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:5３を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（50）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:84及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（51）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:86及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（52）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（53）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:67を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（54）融合軽鎖がSEQ ID NO:68、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:67、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（55）融合軽鎖がSEQ ID NO:68、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:67、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（56）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:59を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（57）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:59を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（58）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:59を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（59）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:59を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（60）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:84及びSEQ ID NO:59を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（61）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:86及びSEQ ID NO:59を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（62）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:3３を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（63）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:86及びSEQ ID NO:3３を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（64）融合軽鎖がSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:86及びSEQ ID NO:3３を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（65）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:27を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（66）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:27を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（67）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:27を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（68）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:29を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（69）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:29を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（70）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:29を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（71）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（72）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:57を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（73）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:59を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（74）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:59を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（75）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:59を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（76）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:6３を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（77）融合軽鎖がSEQ ID NO:38、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:6３を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:37、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（78）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:6３を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（79）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:6３を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（80）融合軽鎖がSEQ ID NO:46、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:6３を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:45、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（80）融合軽鎖がSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:89及びSEQ ID NO:47を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:49、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（81）融合軽鎖がSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:47を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:49、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（82）融合軽鎖がSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:47を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:49、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（83）融合軽鎖がSEQ ID NO:147、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:149を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:146、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（84）融合軽鎖がSEQ ID NO:149、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:147を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:148、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（85）融合軽鎖がSEQ ID NO:147、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:149を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:146、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（86）融合軽鎖がSEQ ID NO:149、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:147を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:148、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120。
（87）融合軽鎖がSEQ ID NO:147、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:148を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:146、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（88）融合軽鎖がSEQ ID NO:149、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:146を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:148、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:117及びSEQ ID NO:120を含む抗体；
（89）融合軽鎖がSEQ ID NO:147、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:148を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:146、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体；又は
（90）融合軽鎖がSEQ ID NO:149、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:85及びSEQ ID NO:146を含み；融合重鎖がSEQ ID NO:148、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:115及びSEQ ID NO:120を含む抗体。
請求項1-12のいずれか1項に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物であって、好ましくは、前記医薬組成物の剤型が経口投与の剤型又は非経口投与の剤型を含み、より好ましくは、前記医薬組成物の剤型が、静脈射注、静脈滴注、皮下注射、局所注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、腹腔内注射、頭蓋内注射、又は腔内注射を含む注射剤である、医薬組成物。
請求項1-12のいずれか1項に記載の二重特異性抗体を含む、コンジュゲート又は融合タンパク質。
請求項14に記載のコンジュゲート又は融合タンパク質であって、前記抗体とコンジュゲート又は融合されている物質Aを含み、前記物質Aが、治療剤、プロドラッグ、プロテイン（例えば酵素）、ウィルス、脂質、生物反応調整剤（例えば、免疫調整剤）、PEG、ホルモン、オリゴヌクレオチド、診断剤、細胞障害剤（例えばドラッグまたは毒素）、超音波増強剤、非放射性標識、検出可能な標識、例えば化学発光物標識化合物（例えば、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、イミダゾール、アアクリジニウム塩及びシュウ酸エステル）、または蛍光発光金属（例えば、152Eu、またはランタン系標識）から選択される、コンジュゲート又は融合タンパク質。
請求項1-12のいずれか1項に記載の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド。
請求項16に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
請求項1-12のいずれか1項に記載の二重特異性抗体又は請求項14-15のいずれか1項に記載のコンジュゲート又は融合タンパク質の、腫瘍（癌）を治療するための使用、又は腫瘍（癌）の治療用医薬品を調製するための使用。
請求項1-12のいずれか1項に記載の二重特異性抗体又は請求項14-15のいずれか1項に記載のコンジュゲート又は融合タンパク質の、腫瘍（癌）の検出用試薬又はキットを調製するための使用。