JP2020510407A - 抗ｐｄ−１／抗ｈｅｒ２天然抗体構造形態のヘテロダイマー系二重特異性抗体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２天然抗体構造形態のヘテロダイマー系二重特異性抗体、及びその製造方法に関する。具体的には、天然ＩｇＧの特性を有している上に、重鎖と軽鎖とのミスマッチングがない、高度に安定したヘテロダイマー系抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体、及びその製造方法を提供し、該二重特異性抗体は、同時に２つの標的分子と結合することができ、複合病治療面においても、さらにすぐれた効果を示す。

Description

本発明は、抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２天然抗体構造形態のヘテロダイマー系二重特異性抗体及びその製造に関する。具体的には、本発明によれば、天然ＩｇＧの特性を有している上に、重鎖と軽鎖とのミスマッチングがない、高度に安定したヘテロダイマー系抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体及びその製造方法が提供される。

本出願は、２０１６年１１月１８日提出された中国特許出願番号２０１６１１０１６４３５．０の優先権を主張し、その全ての内容は、引用として本明細書に取り込まれる。

単一クローン抗体は、単一抗原決定基にのみ作用する高特異性抗体であり、癌、炎症及び自家免疫疾患、感染性疾患などにすでに広範囲に利用されている。しかし、そのような治療分子は、単独で使用された場合には、十分な薬効を示すことができない。それは、疾病の複雑性によるものであり、例えば、癌または炎症性疾病は、通常、多様な疾病を媒介させる分子経路と信号経路との相互作用と係わりがある。その場合、単一標的を有する分子は、最適の治療効果を提供することができず、同時に、多数の標的、または同一標的中の多くのサイトに位置した分子を遮断することにより、治療効果を改善させることができる。同時に、二重特異性分子のような多特異性を利用する二重標的治療は、二重特異性分子が単一分子であるので、新薬開発過程を簡素化させることができる。多数の単一特異性分子の組み合わせを使用することと比較すると、それは、患者と医療提供者とのいずれにおいても、さらに便利な方法である。

多くの異なる形式の二重特異性抗体または二重機能分子が、当該分野において、すでに知られている。最初の二重特異性抗体は、化学的方法を応用し、二重機能カップリング試薬を使用し、従来のＩｇＧ分子、Ｆａｂ’断片または（Ｆａｂ’）２断片の二つを連結したものである。しかし、そのように化学的にカップリングされた二重特異性抗体には、生産作業の強度、異種カップリング産物の精製、同種カップリング産物、及び本来の単一特異性抗体または断片の除去における複雑性、及び低い効率など多くの制限がある。

二重特異性抗体生産に使用される他の方法は、ハイブリッド・ハイブリドーマ（または、クアドローマ）技術を使用するものであり、それは、異なる抗体を分泌する２種のハイブリドーマ細胞株を体細胞融合し、二重特異性抗体を生産する方法である。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖との任意的ペアリングにより、抗体混合物の１／１０のみが必要とされる機能性二重特異性抗体であるので、精製過程が複雑になり、生産収率が減少する。

ＷＯ２０１３０６０８６７においては、ヘテロダイマー二重特異性抗体の大規模生産方法を記述している。前記方法においては、まず、２種の混合されたホモダイマー系抗体を還元させた後、前記２種のホモダイマー抗体のＣＨ３区域に、非対称アミノ酸突然変異を導入することにより、異なる抗体のＦａｂアームの交換を促進させた後、最後に、ヒンジ領域の鎖間の二硫化結合を酸化させ、安定した二重特異性抗体を形成する。

ＷＯ２００９０８９００４は、ヘテロダイマータンパク質製造方法を記述している。前記方法は、ＣＨ３−ＣＨ３界面に位置するアミノ酸を、電荷を帯びるアミノ酸に突然変異させることにより、静電作用を介して、ヘテロダイマー形成を促進させ、ホモダイマー形成を不利にさせるのである。

ＵＳ５７３１１６８は、「杵（突起）−臼（空洞）」戦略を利用し、ヘテロダイマーＩｇＧを製造する方法を記述している。前記方法は、第１鎖ＣＨ３領域の界面にある小さいアミノ酸を大きいアミノ酸に置き換え、「杵」を形成し、同時に第２鎖ＣＨ３領域の、それに対応する大きいアミノ酸を小さいアミノ酸に突然変異させ、「臼」を形成するのである。杵と臼との相互作用は、ヘテロダイマーＩｇＧ形成には有利であるが、ホモダイマー形成には不利である。

ＷＯ２０１２０５８７６８は、安定した高特異性ヘテロダイマーＩｇＧの製造方法を記述している。前記方法においては、陰性及び陽性の設計及び構造と、コンピュータモデル志向タンパク質工程技術を組み合わせて使用し、ＩｇＧ１ ＣＨ３構造領域の多数のアミノ酸を突然変異させることにより、安定しており、ホモダイマー不純物含量が低いヘテロダイマーＩｇＧを形成する。

プログラムされた細胞死滅受容体（ＰＤ−１： ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１）は、近来脚光を浴びている免疫チェックポイント（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）であり、主に、Ｔ細胞の活性化制御に関与し、免疫反応の強度及び持続時間を調節することができる。正常な状況において、ＰＤ−１は、身体組織の自家免疫寛容を媒介させて維持し、炎症反応過程において、免疫系統が過度に活性化されて自家組織を損傷させることを防止し、自家免疫性疾病を発生させないところに肯定的な作用を行う。病理状況において、ＰＤ−１は、腫瘍免疫、及び多様な自家免疫疾患の発生過程及び発展過程に関与する（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ２０１５； １５（３）： ３０７−１３． Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒ． ２０１４ Ｍａｒ； ７（１）： １−１７． Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ． ２０１５ Ｊａｎ； ２１（１）： ２４−３３． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２０１３ Ｊｕｌ ２５； ３９（１）： ６１−７３． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２０１５ Ｊｕｎ １０； ３３（１７）： １９７４−８）。

ＰＤ−１は、ＣＤ２８ファミリーに属するが、ＣＴＬＡ４などのＣＤ２８科の他の構成要素とは異なり、二硫化結合により共有ダイマーを形成することができる。ＰＤ−１は、モノマー形態で存在する。ＰＤ−１の構造は、主に、細胞外免疫グロブリン可変部位構造領域と、疎水性の膜貫通領域と細胞内領域とを含み、細胞内領域は、２つの独立したリン酸化作用サイトを含む。リン酸化作用サイトは、それぞれ免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）と、免疫受容体チロシン転移モチーフ（ＩＴＳＭ）である。ＰＤ−１の誘導性は、主に、活性化されたＴ細胞表面に発現され、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単核細胞、ＤＣ細胞にも発現される。ＰＤ−１のリガンドは、ＰＤ−Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １）、ＰＤ−Ｌ２（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ ２）を含み、前記リガンドは、Ｂ７ファミリーに属する。そのうち、ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単核細胞、大食細胞、ＤＣ細胞、内皮細胞、表皮細胞などの多様な免疫細胞表面で誘導性発現を行うが、ＰＤ−Ｌ２は、大食細胞、ＤＣ細胞、Ｂ細胞などの一部免疫細胞でのみ誘導性発現を行う（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｒｅｖ， ２０１３， １２（１１）： １０９１−１１００． Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２０１３， ４： ４８１． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ， ２０１２， １２（４）： ２５２−２６４． Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ． ２０１５ Ｊａｎ； ２１（１）： ２４−３３）。

１９８０年代に、Ｄｅｎｉｓ Ｓｌａｍｏｎが、最初に１８９の原発性乳腺癌病例から、ＨＥＲ２（ヒト上皮細胞増殖因子受容体２型）遺伝子が、３０％の病例において、いずれも過度に増加することを発見し、ＨＥＲ２が、全体生存率及び再発時期と密接に係わっているということを明らかにした（Ｓａｌｍａｎ ＤＪ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３５： １７７−１８２， １９８５）。現在の研究によれば、およそ２５〜３０％の乳腺癌患者のうち、ＨＥＲ２がいずれも過多発現され（Ｒｅｖｉｌｌｉｏｎ Ｆ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ３４： ７９１−８０８， １９９８）、それは、いずれも腫瘍の悪性増殖の程度と係わりがある（Ｗｒｉｇｈｔ Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ４９： ２０８７−２０９０， １９８９）。

トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）は、抗ＨＥＲ２細胞外領域のヒト化単一クローン抗体（Ｃａｒｔｅｒ Ｐ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ８９（１０）： ４２８５−４２８９， １９９２）である。しかし、トラスツズマブが臨床に応用されたときの抗癌効果は、臨床前実験に比べ、低い場合が多いので、一般的に、化学治療剤などと組み合わせて使用しなければならない（Ｓｌａｍｏｎ ＤＪ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， ３４４： ７８３−７９２， ２００１）。

エフェクター細胞をリクルートすることができる二重機能抗体の設計は、抗体の効能を向上させる効果的手段である。現在まで、最も多くの研究がなされているのは、ＣＤ３分子の機能を利用するものである。ＣＤ３分子によるキラーＴ細胞の活性化を介して、標的腫瘍を効果的に除去することができる（Ｈａａｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２１４：４４１−４５３， ２００９）。そのうち、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ社で開発された組み換え二重機能Ｔ細胞刺激抗体は、ＢｉＴＥとして非常に有望であるが、最大の問題点は、血漿半減期が非常に短く、人体での半減期が１時間に過ぎないという点である（Ｌｏｆｆｌｅｒ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ， ９５： ２０９８−２１０３）。それは、ＢｉＴＥ自体の構造によるものであり、ＢｉＴＥは、２つの単一鎖型抗体断片によって形成され、分子量は、６０ｋＤａに過ぎないだけではなく、抗体分子内において、半減期延長に重要な役割を行うＦｃ断片が欠失されている。

カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）は、他の有望な多機能性抗体であり、ＣＤ３及びＥｐＣＡＭを標的にするヘテロＩｇ分子であり、現在、前記製品は、腹水癌の治療において、使用を許可された状態である（Ｊａｇｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ７２： ２４−３２， ２０１２）。臨床第ＩＩ相にある他の多機能性抗体は、エルツマキソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）であり、ＣＤ３及びＨＥＲ２を標的にする。そのようなヘテロ抗体の一本の重鎖及び軽鎖は、ラットのＩｇＧに由来したものであり、ＣＤ３を標的にし、他の一本の重鎖及び軽鎖は、マウスのＩｇＧに由来したものであり、ＨＥＲ２を標的にする。それによって伴う問題は、そのような製品生産が非常に困難であるということである。二重機能性エルツマキソマブが発現されるクローンを獲得するためには、まず、ＣＤ３抗体を発現する１つの二倍体ハイブリドーマ、及びＨＥＲ２抗体を発現する１つの二倍体ハイブリドーマを獲得した後、２つのハイブリドーマをさらにハイブリッドさせて、抗ＣＤ３及び抗ＨＥＲ２を発現することができる二重機能抗体である四倍体ハイブリドーマを獲得しなければならないからである。しかし、普通の単一標的抗体を生産するためには、二倍体ハイブリドーマ１個の獲得だけが必要であるので、それと比較すると、二重機能抗体の生産過程がはるかに複雑であり、また四倍体ハイブリドーマの獲得がさらに困難であり、前述のマウス起源により、免疫原性が非常に高い結果となる。

また、抗ＣＤ３抗体の最も明白な副作用は、体内サイトカインの短時間での増加をもたらすことであり、それは、サイトカインストームとも称する。したがって、免疫細胞を腫瘍細胞表面にリクルートする新たな二重機能抗体を開発する必要がある。

本発明の第１の態様は、ＰＤ−１と特異的結合することができる第１抗原結合機能領域、及びＨＥＲ２と特異的結合することができる第２抗原結合機能領域を含むヘテロダイマー系二重特異性抗体に関する。前記二重特異性抗体は、１または複数の二硫化結合を介して連結された第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖を含み、前記第１Ｆｃ鎖と第２Ｆｃ鎖は、それぞれＰＤ−１抗原結合機能領域及びＨＥＲ２抗原結合機能領域に連結され、前記第１Ｆｃ鎖と第２Ｆｃ鎖は、以下の位置において、５個アミノ酸の置換を含む：
１）第１Ｆｃ鎖上においては、３６６番目及び３９９番目のアミノ酸置換、第２Ｆｃ鎖上においては、３５１番目、４０７番目及び４０９番目のアミノ酸置換；または
２）第１Ｆｃ鎖上においては、３６６番目及び４０９番目のアミノ酸置換、第２Ｆｃ鎖上においては、３５１番目、３９９番目及び４０７番目のアミノ酸置換。

前記アミノ酸置換を含む第１Ｆｃ鎖と第２Ｆｃ鎖は、それぞれホモダイマーを形成する傾向なしに、互いにヘテロダイマーを形成する傾向がさらに強く、
前記アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ ＥＵ索引番号体系によって番号が付けられる。

ある実施形態において、第１Ｆｃ鎖と第２Ｆｃ鎖とのアミノ酸置換は、以下の通りである：
ａ）３５１番目において、グリシン、チロシン、バリン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシンまたはトリプトファンに置換され、
ｂ）３６６番目において、ロイシン、プロリン、トリプトファン、バリンに置換され、
ｃ）３９９番目において、システイン、アスパラギン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、トレオニンまたはアラニンに置換され、
ｄ）４０７番目において、ロイシン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニンまたはヒスチジンに置換され、
ｅ）４０９番目において、システイン、プロリン、セリン、フェニルアラニン、バリン、グルタミンまたはアルギニンに置換される。

ある実施形態において、アミノ酸置換は、
ａ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｅ，Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖ置換；
ｂ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｇ，Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｃ置換；
ｃ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｙ，Ｙ４０７Ａ及びＫ４０９Ｐ置換；
ｄ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｎ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｖ，Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓ置換；
ｅ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｗ及びＤ３９９Ｇ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｄ，Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓ置換；
ｆ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｉ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｐ，Ｙ４０７Ｆ及びＫ４０９Ｆ置換；
ｇ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｖ及びＤ３９９Ｔ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｋ，Ｙ４０７Ｔ及びＫ４０９Ｑ置換；
ｈ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ａ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｗ，Ｙ４０７Ｈ及びＫ４０９Ｒ置換を含む。

ある実施形態において、アミノ酸置換は、
ａ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｖ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｅ，Ｙ４０７Ｌ及びＤ３９９Ｒ置換；
ｂ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｃ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｇ，Ｙ４０７Ｌ及びＤ３９９Ｃ置換；
ｃ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｐ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｙ，Ｙ４０７Ａ及びＤ３９９Ｃ置換；
ｄ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｐ及びＫ４０９Ｓ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｖ，Ｙ４０７Ｐ及びＤ３９９Ｎ置換；
ｅ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｗ及びＫ４０９Ｓ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｄ，Ｙ４０７Ｐ及びＤ３９９Ｇ置換；
ｆ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｐ及びＫ４０９Ｆ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｐ，Ｙ４０７Ｆ及びＤ３９９Ｉ置換；
ｇ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｖ及びＫ４０９Ｑ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｋ，Ｙ４０７Ｔ及びＤ３９９Ｔ置換；
ｈ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｒ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｗ，Ｙ４０７Ｈ及びＤ３９９Ａ置換を含む。

ある実施形態において、第１Ｆｃ鎖のアミノ酸は、Ｔ３６６ＬとＤ３９９Ｒとに置換され、第２Ｆｃ鎖のアミノ酸は、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖに置換される。

ある実施形態において、Ｆｃ鎖は、ＩｇＧに由来する。

ある実施形態において、ＰＤ−１抗原結合機能領域及びＨＥＲ２抗原結合機能領域は、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ断片である。

ある実施形態において、ＰＤ−１抗原結合機能領域及びＨＥＲ２抗原結合機能領域は、いずれもＦａｂ断片である。

ある実施形態において、ＰＤ−１抗原結合機能領域及びＨＥＲ２抗原結合機能領域のうち一つは、Ｆａｂ断片であり、他の一つは、ｓｃＦｖ断片である。

ある実施形態において、Ｆａｂ断片は、異なる第１重鎖可変部位及び第２重鎖可変部位、並びに異なる第１軽鎖可変部位及び第２軽鎖可変部位を含む。

ある実施形態において、二重特異性抗体のアミノ酸配列は、配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６及び１８から選択される。

本発明の第２の態様は、第１の態様に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体をコードする分離されたポリヌクレオチドに関する。

ある実施形態において、該ポリヌクレオチドの配列は、配列番号１，３，６，７，９，１３，１５及び１７から選択される。

本発明の第３の態様は、第２の態様に記載の分離されたポリヌクレオチドを含む組み換えプラスミドに関する。

ある実施形態において、発現ベクターは、ｐＣＤＮＡを改変して得られたプラスミドベクターＸ０ＧＣである。

本発明の第４の態様は、第２の態様に記載の分離されたポリヌクレオチド、または第３の態様に記載の組み換え発現ベクターを含む宿主細胞に関する。

ある実施形態において、該宿主細胞は、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３、またはＨＥＫ２９３細胞を基に改変して得たＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｅ、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ、またはＣＨＯ細胞を基に改変して得たＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯから選択される。

本発明の第５の態様は、第１の態様に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、第２の態様に記載の分離されたポリヌクレオチド、第３の態様に記載の組み換え発現ベクター、または第４の態様に記載の宿主細胞、及び薬理学的に許容可能な担体（ｃａｒｒｉｅｒ）を含む組成物に関する。

本発明の第６の態様は、第１の態様に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体を生産する方法に関し、次のような段階を含む：
１）第２の態様に記載の分離されたポリヌクレオチド、または第３の態様に記載の組み換え発現ベクターをそれぞれ宿主細胞内で発現させる段階；
２）宿主細胞内でそれぞれ発現されるタンパク質を還元させる段階；及び
３）還元されたタンパク質を混合した後、混合物を酸化させる段階。

ある実施形態において、前記宿主細胞は、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３、またはＨＥＫ２９３を基に改変して得たＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｆ、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ、またはＣＨＯ細胞を基に改変して得たＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯから選択される。

ある実施形態において、前記還元段階は、１）還元剤を添加し、前記還元剤が、２−メルカプトエチルアミン、ジチオトレイトール、トリ（２−カルボキシエチル）ホスファイン、その他の化学誘導体、またはその組み合わせを含む段階、２）０．１ｍＭ以上の濃度のジチオトレイトールの存在下で、４℃条件下で、少なくとも３時間還元反応を行う段階、３）脱塩などを介して、還元剤を除去する段階を含む。

ある実施形態において、前記酸化段階は、１）空気中で酸化させるか、あるいは酸化剤を添加することを含み、前記酸化剤は、Ｌ−デヒドロアスコルビン酸、またはその他の化学的誘導体から選択される段階、２）０．５ｍＭ以上の濃度のＬ−デヒドロアスコルビン酸の存在下で、４℃条件下で、少なくとも５時間酸化反応を行う段階を含む。

ある実施形態において、分離精製段階をさらに含む。

本発明の第７の態様は、第１の態様に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、および／または第２の態様に記載の分離されたポリヌクレオチド、および／または第３の態様に記載の組み換え発現ベクター、および／または第４の態様に記載の宿主細胞、および／または第５の態様に記載の組成物の、個体の疾患を予防および／または治療する薬物の製造での用途に関する。

本発明の第８の態様は、個体の疾患予防および／または疾患治療に利用される、第１の態様に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、および／または第２の態様に記載の分離されたポリヌクレオチド、および／または第３の態様に記載の組み換え発現ベクター、および／または第４の態様に記載の宿主細胞、および／または第５の態様に記載の組成物に関する。

本発明の第９の態様は、疾病を予防および／または治療する方法に関し、第１の態様に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、および／または第２の態様に記載の分離されたポリヌクレオチド、および／または第３の態様に記載の組み換え発現ベクター、および／または第４の態様に記載の宿主細胞、および／または第５の態様に記載の組成物をそれを必要とする個体に投与することを含む。

ある実施形態において、前記個体は、哺乳動物、望ましくは、ヒト個体である。

ある実施形態において、前記疾病は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平細胞癌、非小細胞性肺癌、鼻咽頭癌腫、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、メラノーマなどの腫瘍から選択される。

本発明は、ＰＤ−１を免疫細胞をリクルートする分子とし、ＨＥＲ２を腫瘍細胞の標的分子として、完全に新たな抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２天然抗体構造形態のヘテロダイマー系二重特異性抗体を設計した。前記二重特異性抗体は、天然ＩｇＧの特性を有する上に、重鎖と軽鎖とのミスマッチングがなく、高度に安定したヘテロダイマー系の抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２二重特異性抗体である。前記二重特異性抗体は、同時に２種の標的分子ＰＤ−１及びＨＥＲ−２に結合することができ、複合病治療分野でさらに効果的である。

ヘテロダイマー抗体分子のモノマーの溶出ピークを示す図である。 抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子の構造を示す図である。 重鎖と軽鎖とのハーフ抗体分子を図示した構造図である。 重鎖と軽鎖とのハーフ抗体分子のＳＥＣ分析結果を図示したものである。ＡとＢは、それぞれ抗ＨＥＲ２ハーフ抗体分子と、抗ＰＤ−１ハーフ抗体分子との分析結果を示す図である。 抗ＰＤ−１抗体と抗ＨＥＲ２抗体とのハーフ抗体分子酸化物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。 抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子の溶出ピークを示す図である。 抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。 抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子のＳＥＣ分析結果を示す図である。 抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子の安定性実験を示す図である。 抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子の安定性実験を示す図である。 抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子のＨＥＲ２結合活性とＰＤ−１結合活性とを示す図である。ＡとＢは、それぞれＨＥＲ２結合活性及びＰＤ−１結合活性を示す。 抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子が、ＰＤ−１高発現のＣＨＯ／ＰＤ−１細胞、及びＨＥＲ２高発現のＳＫ−ＢＲ−３細胞と同時に結合することを示す図である。Ａ〜Ｄは、それぞれＨＥＲ２単一クローン抗体、ＰＤ−１単一クローン抗体、ＨＥＲ２単一クローン抗体＋ＰＤ−１単一クローン抗体、及び抗ＰＤ−１ＢＪＨＭ／抗ＨＥＲ２の同時結合を示す。 抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合と、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２結合との活性を遮断することを示す図である。Ａ及びＢは、それぞれＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２の結合遮断活性を示す。 抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子がサイトカインＩＬ−２の分泌を促進することを示す図である。 抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子の曲線下面積（ＡＵＣ：ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）を示す図である。

定義：
共有原子の連結とは、ヘテロダイマー系二重特異性抗体において、２つのＦｃ鎖の間；並びにいずれか１つのＦｃ鎖、及びそれと連結された抗原結合機能領域の間；が共有結合によって１つの分子に連結されていることである。そのうちＦｃ鎖は、１または複数の共有原子が、連結（または、二硫化結合鎖）を介して連結された第１抗原結合機能領域及び第２抗原結合機能領域を含み、前記第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖は、それぞれ共有原子が、連結（イミン結合またはペプチド結合などの結合）を介して、１つの抗原結合機能領域に連結され、
該抗原結合機能領域は、抗原などの標的分子との特異性相互作用が発生する区域であり、その作用は、高度の選択性を有しており、１つの標的分子を識別する配列は、一般的に、他の分子配列を識別することができない。代表的な抗原結合機能領域は、抗体の可変部、抗体可変部の構造変異体、受容体の結合領域、リガンド結合領域、または酵素結合領域を含む。

１または複数の二硫化結合鎖間の連結は、第１Ｆｃ鎖と第２Ｆｃ鎖とが、１または複数の二硫化結合鎖間の連結を介して、ヘテロダイマー断片を形成することを示す。本発明において、１または複数の二硫化結合の形成は、第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖、あるいは第１Ｆｃ鎖、第２Ｆｃ鎖、及びそれと連結された抗原結合機能領域が同一細胞内で合成される場合に形成されるものでもあり、また第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖、あるいは第１Ｆｃ鎖、第２Ｆｃ鎖、及びそれと連結された抗原結合機能領域が異なる細胞内でそれぞれ形成された後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ還元方法によって形成されるものでもある。

第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖は、共有原子が、連結を介して結合断片を構成し、共有原子の連結は、二硫化結合を含み、各鎖は、少なくとも、免疫グロブリン重鎖不変部の一部分を含み、前述の第１鎖及び第２鎖は、アミノ酸配列上で異なり、少なくとも１桁のアミノ酸が同一ではないものを含む。本発明における第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖において、同一鎖間には、強力な相互排斥作用が存在し、異なる鎖間には、吸引作用が存在する。したがって、細胞内で共同発現されるとき、第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖、あるいは第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖、並びにそれらと連結される抗原結合機能領域は、ヘテロダイマーを形成する傾向性がさらに強い。第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖、あるいは第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖、並びにそれらと互いに連結された抗原結合機能領域が、それぞれ２つの宿主細胞内で発現されるとき、第１Ｆｃ鎖、あるいは第１Ｆｃ鎖、及びそれと連結された抗原結合機能領域は、ホモダイマーを形成する傾向性を有さず、第２Ｆｃ鎖、あるいは第２Ｆｃ鎖、及びそれと連結された抗原結合機能領域も、ホモダイマーを形成する傾向性を有さない。本発明において、第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖、あるいは第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖、並びにそれらと連結された抗原結合機能構造が、それぞれ２つの宿主細胞内で発現されるだけではなく、還元剤が存在する場合、ホモダイマーの比率は、５０％未満であり、すなわち、モノマー（一本Ｆｃ鎖、あるいは一本Ｆｃ鎖、及びそれと連結された抗原結合機能領域）の比率は、５０％より高い。

免疫グロブリンは、４本のポリペプチド鎖を有する対称構造であり、そのうち２本は、比較的長い長さであり、相対分子量も、比較的大きい同一の重鎖であり、４５０〜５５０個のアミノ酸残基を含み、相対分子量は、５５，０００〜７０，０００Ｄａである。他の２本は、比較短く、相対分子量が比較的小さい互いに同一の軽鎖（Ｌ鎖）であり、２１０個のアミノ酸残基を含み、相対分子質量は、約２４，０００Ｄａである。異なる免疫グロブリンの重鎖と軽鎖とのうち、Ｎ末端に近接した約１１０個のアミノ酸配列は、変化が非常に大きく、それを可変部（Ｖ区域：ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）と称し、Ｃ末端に近接したその残余アミノ酸の配列は、相対的に安定しており、それを不変部（Ｃ区域：ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）と称する。重鎖において可変部は、およそ重鎖長の１／４を占め、不変部は、およそ重鎖長の３／４を占める。すでに知られた５種のＩｇの種類は、ＩｇＧ（γ）、ＩｇＡ（α）、ＩｇＤ（δ）、ＩｇＭ（μ）及びＩｇＥ（ε）であり、このうち、前の３種ＩｇのＨ鎖内には、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣ３によって構成された３個の不変部がある。後ろの２つ（ＩｇＭ及びＩｇＥ）のＨ鎖には、１つのＶＨ部位と、４つの不変部、すなわち、ＣＨ１〜ＣＨ４がある。該不変部は、免疫グロブリン分子の骨格でもあり、免疫反応を活性化させる部位の一つでもある。

本発明における不変部一部分は、少なくとも、第１Ｆｃ鎖と第２Ｆｃ鎖との相互作用領域を含み、前記領域は、ＩｇＧの場合、ＣＨ３領域の一部分アミノ酸に位置するものであり、少なくとも、ＧＬＮ３４７、ＴＹＲ３４９、ＴＨＲ３５０、ＬＥＵ３５１、ＳＥＲ３５４、ＡＲＧ３５５、ＡＳＰ３５６、ＧＬＵ３５７、ＬＹＳ３６０、ＳＥＲ３６４、ＴＨＲ３６６、ＬＥＵ３６８、ＬＹＳ３７０、ＡＳＮ３９０、ＬＹＳ３９２、ＴＨＲ３９４、ＰＲＯ３９５、ＶＡＬ３９７、ＡＳＰ３９９、ＳＥＲ４００、ＰＨＥ４０５、ＴＹＲ４０７、ＬＹＳ４０９、ＬＹＳ４３９を含む。

第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖が、それぞれ共有結合またはリンカーを介して、１つの抗原結合機能領域に連結されるということは、第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖が、それぞれ共有結合またはリンカーを介して、１つの抗体の抗原結合断片、または抗原を識別することができる一本鎖抗体、または抗原を識別することができるその他の抗体断片変異体、またはリガンドを識別することができる受容体、または受容体を識別することができるリガンドに連結されることを示す。そのうち、前記共有結合は、化学的結合の一種であり、２またはそれ以上の原子が共同して外層電子を使用し、理想的な状況において、電子飽和状態に逹し、比較的安定した化学的構造を構成することを示すか、あるいは原子間に電子対を共有することによって形成される相互作用である。同一元素の原子、または異なる元素の原子は、いずれも共有結合を介しても結合される。本発明の第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖の共有結合の場合、１分子アミノ酸のアミノ基が、他分子アミノ酸のカルボン酸基と脱水反応を起こして形成されたアミド結合、またはエチレングリコールまたはポリエチレングリコール、あるいはその他の化合物またはその重合基のアルデヒド基が１分子アミノ酸のアミノ基と、アミド結合またはイミン結合を形成することを含むが、それに制限されるものではない。そのうちリンカーは、二本鎖ポリペプチドを、共有結合を介して連結することができる１つのアミノ酸配列、１種の化合物、または１種の化合物の重合体であり、そのうち１つのアミノ酸配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳなどの小さいペプチドを含むが、それに制限されるものではなく、アミド結合を介して、第１Ｆｃ鎖または第２Ｆｃ鎖、及び抗原を識別することができる一本鎖抗体、または抗原を識別することができるその他の抗体の断片構造変異体を連結する。

第１Ｆｃ鎖と第２Ｆｃ鎖は、ヘテロダイマーを形成する傾向性がさらに強く、それぞれホモダイマーを形成する傾向性を有さないことは、第１Ｆｃ鎖と第２Ｆｃ鎖とのうち、互いに同じポリペプチド鎖間では、相互排斥作用が存在し、異なるポリペプチド鎖間では、吸引作用が存在するので、細胞内で共同発現されるとき、第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖、あるいは第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖、並びにそれらと連結される抗原結合機能領域は、ヘテロダイマーを形成する傾向性がさらに強いということを意味する。第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖、あるいは第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖、並びにそれらと互いに連結された抗原結合機能領域が、それぞれ２つの宿主細胞内で発現されるとき、第１Ｆｃ鎖、あるいは第１Ｆｃ鎖、及びそれと連結された抗原結合機能領域は、ホモダイマーを形成する傾向性を有さず、第２Ｆｃ鎖、あるいは第２Ｆｃ鎖、及びそれと連結された抗原結合機能領域も、ホモダイマーを形成する傾向性を有さない。

Ｋａｂａｔ ＥＵ索引番号体系は、Ｋａｂａｔが、１つの番号を、抗体配列の全てのアミノ酸に指定したことを意味し、そのように各残基の番号を指定する方法は、本分野においては、すでに標準的な方法である。Ｋａｂａｔ方法は、その研究がなされていないその他の抗体にも適用され、保存的なアミノ酸に基づいて、標的抗体と、Ｋａｂａｔ鑑定されたコンセンサス配列（共有配列）とのうち一つに対して比較を行う。

Ｆｃ断片区域は、結晶可能断片（Ｆｃ：ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）を示し、それは、ＩｇのＣＨ２構造区域とＣＨ３構造区域とに該当し、Ｉｇと、エフェクター分子または細胞とが相互作用を行う部位である。

ＩｇＧは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ：ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ）の略語であり、血清の主な抗体成分であり、ＩｇＧ分子中のｒ鎖の抗原性の差により、ヒトＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の４種の亜型を有する。

ハーフ抗体分子は、抗体の一本重鎖と一本軽鎖とが形成した構造である。前述の重鎖と軽鎖とは、共有結合を介して連結され、また共有結合なしでも連結される、抗原を識別する単一価抗体構造である。

Ｆａｂ断片は、分子識別配列であり、抗原結合断片（Ｆａｂ：ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）であり、抗体分子の両アームに該当し、完全な軽鎖と重鎖とのＶＨ構造領域及びＣＨ１構造領域によって構成される。ｓｃＦｖは、分子識別配列であり、抗体の軽鎖可変部と重鎖可変部との遺伝子組み換えを介して得られた抗体断片の構造異性体である。細胞膜受容体の細胞外部位は、分子識別配列であり、細胞膜受容体は、一般的に、細胞外部に位置し、対応する抗原またはリガンドを識別及び結合することができる細胞外部位、受容体を細胞表面に固定させることができる膜貫通領域、及び細胞内のキナーゼ活性を有するか、あるいは信号を伝達することができる経路を有する細胞内領域を含む。細胞膜受容体のリガンドは、細胞膜受容体細胞外領域により、識別及び結合されるタンパク質、小さいペプチドまたは化合物を意味する。サイトカインは、免疫源、マイトジェン、またはその他の刺激剤が誘導した多様な細胞によって生産される低分子量の可溶性タンパク質であり、自然免疫、適応免疫、造血発生、細胞増殖、ＡＰＳＣ多機能細胞及び損傷組織回復などの多様な機能を有する。該サイトカインは、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍懐死因子スーパーファミリー、コロニー刺激因子、走化性因子（ケモカイン）、成長因子などにも区分される。タンパク質発現タグとは、標的タンパク質のＮ末端またはＣ末端に添加される１つのアミノ酸配列を意味し、小さいペプチドまたは長いアミノ酸でもある。該タグの添加は、タンパク質の正確なフォールディングに有利であり、タンパク質の分離及び精製に有利であり、細胞内タンパク質の分解の低減にも有利である。頻繁に使用されるタグとしては、ＨＡ、ＳＵＭＯ、Ｈｉｓ、ＧＳＴ、ＧＦＰ、Ｆｌａｇを含むが、それらに制限されるものはない。

本発明のヘテロダイマー系二重特異性抗体に応用される抗体には、いかなる制限もない。望ましくは、従来技術において、すでに疾病の治療および／または予防に使用される抗体は、いずれも本発明に応用されるのである。

本発明のヘテロダイマー系二重特異性抗体は、１または複数の置換、欠失、添加および／または挿入を有することができる。例えば、一部アミノ酸が、タンパク質構造中のその他のアミノ酸を置換するにしても、その他のポリペプチド（例えば、抗原）または細胞と結合する能力は明らかに損失されない。結合能とタンパク質の性質とが、タンパク質の生物機能的活性を決定するので、タンパク質配列上において、一部アミノ酸配列の置換を行っても、それらに対する生物学的な効用または活性を明らかに損失させない。

さまざまな場合において、ポリペプチド変異体は、１または複数の保存的置換を含む。「保存的置換」とは、そのうちのアミノ酸が、類似性質を有した他のアミノ酸に置換されることを意味するので、ペプチド化学分野の当業者であるならば、ペプチドの二次構造及び親水性に基本的な変化が生じないということを予測することができるであろう。

アミノ酸置換は、一般的に、疎水性、親水性、電荷、大きさなどの、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性に基づく。前述の多様な特徴を考慮した例示的置換は、本分野の当業者に周知であり、アルギニン及びリシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸、セリン及びトレオニン、グルタミン及びアスパラギン、並びにバリン、ロイシン及びイソロイシンを含む。

本発明で使用された用語である「同一性」は、本分野の公知の含意を有し、本分野の当業者も、異なる配列間の同一性を測定する規則と標準とが、配列を比較してギャップを導入（必要な場合、最大％の相同性を獲得するため）した後、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列変異体の残基と、非変異体配列との相同性百分率を意味するということを熟知している。本発明において、同一性限定を満足する状況において獲得された変異体配列は、母体配列が有する生物的活性を有さなければならない。本分野の当業者であるならば、前記活性を利用し、変異体配列を選別する方法及び手段を知っているであろう。本分野の当業者であるならば、本出願で公開された内容の教示下で、そのような変異体配列を容易に獲得することができるであろう。具体的な実施形態において、ポリヌクレオチドとポリペプチドの変異体は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの同一性を有する。遺伝暗号の重複性のために、互いに同一アミノ酸配列をコードするそのような配列の変異体が存在することになる。

本発明の他の実施形態においては、中程度あるいは高度にストリンジェントな条件下において、本発明が提供するポリヌクレオチドの配列またはその断片、あるいはその相補的配列とハイブリダイゼーションされるポリヌクレオチド組成物を提供する。該ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学分野においては、公知の技術である。前述の目的のために、本発明のポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを試験するために使用される適切な中間ストリンジェント条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液で前洗浄すること；５０〜６５℃、５×ＳＳＣに一晩置く条件下でハイブリダイゼーションすること；次に、６５℃で２０分間、０．１％のＳＤＳを含む２×、０．５×及び０．２×のＳＳＣで、それぞれ２回ずつ洗浄することを含む。本分野の当業者であるならば、例えば、ハイブリダイゼーション溶液の塩含量、および／またはハイブリダイゼーションを行う温度を変更することにより、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを容易に操作することができるということを理解するであろう。例えば、他の実施形態において、適する高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、前述の条件を含むが、ハイブリダイゼーション温度を、例えば、６０〜６５℃または６５〜７０℃まで上昇させる点において異なっている。

本発明の宿主細胞は、外来遺伝子発現に使用される全ての細胞でもあってもよく、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞を含むが、それらに制限されるものではない。

本発明のベクターは、いかなる類型の細胞または生物体においても、複製を行うことができるベクターであり、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド及びミニ染色体（ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）を含む。ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、ポリヌクレオチドの伝播または複製に適するベクターであるか、あるいは本発明のポリペプチド発現に適するベクターである。そのようなベクターは、本分野で公知であり、購入も可能である。

「ベクター」は、シャトルベクターと発現ベクターとを含む。一般的に、プラスミド構造体は、それぞれ細菌において、プラスミドの複製と選択とに使用される複製原点（例えば、複製のＣｏｌＥ１原点）及び選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性またはテトラサイクリン耐性）も含む。「発現ベクター」とは、細菌内または真核細胞内において、抗体断片を含む本発明の抗体発現に必要な制御配列または調節エレメントを含むベクターを意味する。

本発明のベクターは、外来遺伝子発現に使用される全てのベクターであり、プラスミドベクターを含むが、それらに制限されるものではない。このとき、該プラスミドベクターは、少なくとも、複製開始サイト、プロモーター、標的遺伝子、マルチクローニングサイト、選抜マーカー遺伝子を含み、望ましくは、本発明の前記ベクターは、Ｘ０ＧＣベクターのように、ｐＣＤＮＡを基に改変して得たプラスミドベクターを含むが、それに制限されるものではない。

本発明の個体は、鳥類、爬虫類動物、哺乳類動物などを含む。望ましくは、哺乳類動物は、齧歯類動物、霊長類動物を含み、望ましくは、該霊長類動物は、ヒトを含む。

本発明に係る疾病の範囲は、腫瘍を含むが、それに制限されるものではない。適する例としては、前記腫瘍は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平細胞癌、非小細胞性肺癌、鼻咽頭癌腫、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、腎細胞癌、メラノーマなどの疾病を含む。

薬理学的に許容可能な担体とは、薬理学分野の一般的な薬物担体を意味し、例えば、希釈剤、賦形剤及び水など、デンプンなどの充填剤、ショ糖、乳糖、微結晶性セルロースなど；セルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン及びポリビニルピロリドンなどの接着剤；グリセリンなどの湿潤剤；カボキシメチル澱粉ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロース、寒天、炭酸カルシウム及び炭酸水素ナトリウムなどの崩壊剤、四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；セタノール、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤；熟成土壌及びベントナイトなどの吸着担体；滑石粉、ステアリン酸カルシウム、マグネシウム、微粉末シリカゲル及びポリエチレングリコールなどの潤滑剤などである。それ以外にも、組成物に、香味剤、甘味料などの他の補助剤を添加することができる。

以下では、後述される非制限的な実施例を介して、本発明についてさらに詳細に説明する。本分野の当業者であるならば、本発明の趣旨を外れずに、本発明に対して多様な改変を実施することができ、そのような改変も、本発明の範囲に該当するということを熟知しているであろう。

後述される実験方法は、別段の説明がない限り、いずれも一般的な方法であり、使用された実験材料も、別段の説明がない限り、商社やメーカーから容易に購入することができるものである。本発明の後述の実施例で使用される各種抗体は、いずれも商業的ルートから求めた標準抗体である。

実施例１：抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子のベクター構造構築
それぞれヒト抗ＰＤ−１（Ｐｅｍ）抗体の重鎖と軽鎖とを含むＸ０ＧＣ発現ベクターを構築する。前記抗体可変部の配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ／ｃｇｉ／ｄｅｔａｉｌｓ．ｃｇｉ？ｐｄｂｃｏｄｅ＝９７９８に由来する。軽鎖可変部のヌクレオチド配列は、配列番号９に示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号１０に示されている通りである。軽鎖不変部のヌクレオチド配列は、配列番号３に示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号４に示されている通りである。重鎖可変部のヌクレオチド配列は、配列番号１１に示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号１２に示されている通りである。重鎖不変部のヌクレオチド配列は、配列番号１３に示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号１４に示されている通りである。ＰＣＲ方法により、軽鎖可変部及び軽鎖不変部、重鎖可変部及び重鎖不変部をそれぞれ増幅させる。本発明の全てのＰＣＲ反応において、ＮＥＢ社のＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティーＤＮＡポリメラーゼ（Ｆ−５３０Ｌ）を使用した。ＰＣＲプライマーは、相補的塩基配列の原則及び制限酵素サイトの必要に基づいて、一般的な設計を行う。反応系は、いずれもＨ_２Ｏ ８．９μｌ、５×ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティーＤＮＡポリメラーゼ緩衝液４μｌ、１ｍＭのｄＮＴＰ ４μｌ、フォワードプライマー１μｌ、リバースプライマー１μｌ、ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティーＤＮＡポリメラーゼ０．１μｌ、テンプレート１μｌで構成される。可変部と不変部とのＰＣＲ産物を、１．５％のアガロースゲルを介して、電気移動させた後、ＤＮＡ回収キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ９２８２、以下同一）を使用し、対応する断片を回収した。回収された可変部断片及び不変部断片をテンプレートにし、可変部のフォワードプライマー及び不変部のリバースプライマーを使用し、ＰＣＲ反応をさらに一回行った後、対応する断片をさらに回収し、重鎖と軽鎖との全体長断片を得た。Ｘ０ＧＣベクター及び全体長断片を、ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ、製品コードＲ３１０１Ｌ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ、製品コードＲ３１０４Ｌ）を使用して酵素切断し、酵素制限反応系は、１０×緩衝液３２μｌ、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩそれぞれ０．５μｌ、ゲル回収で得た全体長断片３μｌ、Ｈ_２Ｏ １４．５μｌである。該制限酵素系を、３７℃条件下で、３時間反応させた。制限酵素産物を、Ｔ４ＤＮＡ連結酵素（ＮＥＢ、製品コードＭ０２０２Ｖ）を利用して連結し（以下、同一）、反応系は、１０×連結酵素緩衝液２μｌ、連結酵素０．５μｌ、ゲル回収で得た全体長断片３μｌ、ゲル回収で得たＸ０ＧＣベクター３μｌ、Ｈ_２Ｏ １１．５μｌであった。それを室温で連結し、１２時間反応させた。連結産物を、大腸菌コンピテント細胞ＤＨ５α（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＣＢ１０４、以下同一）に形質転換した。真核細胞において、抗体の重鎖と軽鎖とをそれぞれ発現させるための抗体重鎖と抗体軽鎖とのＸ０ＧＣ発現ベクターを獲得した。

本発明は、同時に、他の抗ヒトＰＤ−１（ＢＪＨＭ）の抗体重鎖と抗体軽鎖とのＸ０ＧＣ発現ベクターをそれぞれ構築した。そのうち、軽鎖可変部のヌクレオチド配列は、配列番号１５に示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号１６に示されている通りであり、る。軽鎖不変部のヌクレオチド配列は、配列番号３に示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号４に示されている通りである。重鎖可変部のヌクレオチド配列は、配列番号１７に示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号１８に示されている通りである。重鎖不変部のヌクレオチド配列は、配列番号１３に示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号１４に示されている通りである。真核細胞において、抗体の重鎖と軽鎖とをそれぞれ発現させるための抗体重鎖と抗体軽鎖とのＸ０ＧＣ発現ベクターを獲得した。

抗ヒトＨＥＲ２抗体の重鎖と軽鎖とのＸ０ＧＣ発現ベクターをそれぞれ構築し、そのうち抗体可変部の配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ０００７２に由来にし、重鎖不変部は、ヒトＩｇＧ１（Ｆｃ２）である。軽鎖可変部のヌクレオチド配列は、配列番号１に示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号２に示されている通りである。軽鎖不変部のヌクレオチド配列は、配列番号３に示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号４に示されている通りである。重鎖可変部のヌクレオチド配列は、配列番号５に示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号６に示されている通りである。重鎖不変部のヌクレオチド配列は、配列番号７に示されている通りであり、アミノ酸配列は、配列番号８に示されている通りである。真核細胞において、抗体の重鎖と軽鎖とをそれぞれ発現させるための抗体重鎖と抗体軽鎖とのＸ０ＧＣ発現ベクターを獲得した。

実施例２：抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子の発現
抗ヒトＰＤ−１抗体の重鎖と軽鎖とを含む発現ベクターそれぞれを、２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（登録商標）２９３−Ｆ Ｃｅｌｌｓ、製品コードＲ７９００７、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、また抗ヒトＨＥＲ２抗体の重鎖と軽鎖とを含む発現ベクターもそれぞれ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの１日前に細胞を播種し、トランスフェクションの当日には、細胞を、遠心分離によって収集し、細胞を新鮮なＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（登録商標）２９３発現培地（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（登録商標）２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、製品コード１２３３８００１、Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁させ、細胞密度は、２００＊１０^５細胞／ｍＬであった。トランスフェクション体積によってプラスミドを添加し、最終濃度が３６．６７μｇ／ｍＬになれば、軽く均一混合し、次に、線形ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、線形、Ｍ．Ｗ．２５０００、製品コード４３８９６、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）を添加し、最終濃度が５５μｇ／ｍＬになれば、軽く均一混合した。その後、細胞培養器に添加し、１２０ｒｐｍ速度の振盪器で３７℃で１時間培養した。その後、トランスフェクション体積の１９倍の新鮮な培地を添加した。続けて、１２０ｒｐｍ速度の振盪器で、３７℃で培養した。５〜６日間トランスフェクションした細胞培養上澄み液を、遠心分離によって収集した。

ＥＬＩＳＡ方法で、発現量を測定した。クロマトグラフィーカラムを応用して精製する前に、０．２μｍの濾過膜で濾過して沈殿物を除去した。この段階は、４℃の温度で行われた。

実施例３：抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子発現物の精製
ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００型タンパク質精製システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び親和性クロマトグラフィーｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（１６ｍｍ Ｉ．Ｄ．、２２ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、４℃で精製を行った。まず、移動相Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で、クロマトグラフィーカラムの平衡化を行い、基線が安定化された後、前述の処理過程を経た細胞上澄み液をローディングした。流速は、５ｍＬ／ｍｉｎであった。サンプルをローディングした後には、移動相Ａで平衡化を行った。該サンプルは、それぞれ抗ＰＤ−１発現物及び抗ＨＥＲ２発現物である。その後、まず、移動相Ｂ１で（０．５Ｍアルギニンを含む移動相Ａ）、カラム体積の５倍を溶出させ、移動相Ｂ２で（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０）、カラム体積の５倍で洗浄し、溶出ピーク、すなわち、目的タンパク質のピークを収集した。前記洗浄段階の流速は、いずれも５ｍＬ／ｍｉｎであった。抗ＰＤ−１−Ｆｃ１の溶出ピーククロマトグラムは、図１に示されている通りであり、抗ＨＥＲ２−Ｆｃ２の溶出ピークも、それと類似している（結果は含まず）。表示された溶出ピーク（灰色領域で表示）を収集し、１Ｍの酢酸ナトリウム溶液を滴下し、５．０に調節した。

実施例４．抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子の精製
抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子の構造は、図２に示されている通りである。

前述のｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（１６ｍｍ Ｉ．Ｄ．、２２ｍｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）方法で獲得した抗ＰＤ−１及び抗ＨＥＲ２発現物に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換えを行い、ヘテロダイマーを獲得した。まず、精製して収集した前述のタンパク質溶液を、限外濾過濃縮チューブを介して限外濾過濃縮し（標準カットオフ分子量１０ｋＤａ）、溶液をリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ＝７．４）に置き換えた。獲得した抗ＰＤ−１及び抗ＨＥＲ２の発現物に、それぞれ前記ＰＢＳを添加し、１ｍｇ／ｍｌに調節し、１／２００倍の最終体積の１Ｍ ＤＴＴを添加し、ＤＴＴ最終濃度が、各５ｍＭになるようにした。４℃条件下において還元を行い（３〜８時間）、還元過程を介して、二硫化結合が開放され、抗ＰＤ−１及び抗ＨＥＲ２の発現物に含有された少量の抗体ホモダイマー分子ヒンジ領域の二硫化結合も開放され、一本重鎖と一本軽鎖とを含んだハーフ抗体分子を形成し、その構造は、図３に図示されている通りである。還元された試料は、移動相緩衝液において、１ｍＭのＤＴＴ還元剤を含むＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析され、該分析結果は、図４に図示されている通りである。抗ＰＤ−１及び抗ＨＥＲ２のホモダイマー重量比は、いずれも１０％未満であり、それに対応し、ハーフ抗体分子の重量比は、いずれも９０％を超えた。

その後、還元された抗ＰＤ−１及び抗ＨＥＲ２のハーフ抗体分子などを、モル比率によって混合し、４℃の条件下において、２４時間組み換え反応を行った。該組み換え過程において、抗ＰＤ−１及び抗ＨＥＲ２のハーフ抗体分子は、ＣＨ２及びＣＨ３の非共有相互作用を介して、同時に、抗ＰＤ−１及び抗ＨＥＲ２のハーフ抗体分子を含むヘテロダイマー系二重特異性抗体を形成した。その後、タンパク質溶液を、限外濾過濃縮チューブで限外濾過濃縮（標準カットオフ分子量１０ｋＤａ）し、溶液をリン酸塩溶液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）に置き換えて還元を終了し、空気または酸化剤で酸化反応を行い、ヘテロダイマー系二重特異性抗体の二硫化結合がさらに形成されるようにした。該酸化反応の条件は、酸化剤である１００ｍＭ Ｌ−デヒドロアスコルビン酸を添加し、タンパク質最終濃度が１ｍｇ／ｍｌになり、酸化剤最終濃度が１ｍＭになれば、４℃条件下で酸化を進め、２４時間反応を行う。前述の酸化反応において獲得したサンプルに対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、結果は、図５に図示されている通りであった。

前述の抗ＰＤ−１及び抗ＨＥＲ２のハーフ抗体分子の還元酸化を経て得たヘテロダイマー分子を、限外濾過濃縮チューブを介して限外超濾過濃縮し（標準カットオフ分子量１０ｋＤａ）、溶液を、ｐＨ５．８のリン酸ナトリウム緩衝液１０ｍＭに置き換えた。ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００型タンパク質精製システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びイオンクロマトグラフィーカラムＳｏｕｒｃｅ １５Ｓ（１６ｍｍ Ｉ．Ｄ．、１７ｍｌ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、４℃下で精製を行った。まず、移動相Ａ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を使用し、クロマトグラフィーカラムを平衡化し、基線が安定化された後、前述の処理を経たタンパク質溶液をローディングした。流速は、３ｍｌ／ｍｉｎであった。サンプルのローディング後、移動相Ａを使用して平衡化を行い、その後、Ａ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．８）を使用し、Ｂ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．８）まで、段階的にカラム体積の２０倍（０％ Ｂ〜１００％ Ｂ、１７０ｍｉｎ、流速２ｍｌ／ｍｉｎ）で洗浄し、表示された溶出メインピークを収集した（図６参照）。収集したタンパク質溶液は、限外濾過濃縮チューブを介して限外濾過濃縮し（標準カットオフ分子量１０ｋＤａ）、溶液をリン酸塩溶液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）に置き換えて濾過殺菌し、４℃の温度で保存した。精製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法によって分析した。結果は、図７に図示されている通りである。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ純度分析の結果、図８に図示されているように、純度は９７．３％である。

実施例５：抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子の安定性
十分に密封した１０ｍｇ／ｍＬのＰＤ−１／ＨＥＲ２ヘテロダイマーサンプルを、４０℃の恒温器（ＢＩＮＤＥＲ ＫＢＦ２４０）に放置し、対応する時間ポイントに（基線（第０日）、１日後、３日後、５日後、７日後、１４日後）、２０μｇのサンプルを取り、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を行って分離させた。前記ＳＥＣ−ＨＰＬＣの条件は、次の通りである：（１）排除クロマトグラフィーカラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、５μｍ、７．８ｍｍ×３０ｃｍ；（２）移動相：５ｍＭ ＰＢＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．７；（３）流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ；（４）紫外線探知波長：２８０ｎｍ；（５）収集時間：３０ｍｉｎ。使用した測定器は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ Ｉｎｆｉｎｉｔｙクロマトグラフィー装置であり、Ａｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎを利用し、クロマトグラフ記録を行い、余剰モノマーの比率を計算した。図９（１０ｍｇ／ｍＬ）及び図１０（１ｍｇ／ｍＬ）に示されているように、４０℃の実験条件下で、前記ダイマーは、明らかな凝集が起こらないので、前記ＰＤ−１／ＨＥＲ２ヘテロダイマーは、比較的優秀な熱安定性を有すると見られる。

実施例６：抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子の体外結合活性
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用し、ＰＤ−１／ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体と、１つの抗原との結合能を測定した。

その具体的な実施過程は、次の通りである：ｐＨ９．６の炭酸塩緩衝溶液において、９６ウェル高吸着ＥＬＩＳＡプレート上で組み換えられたヒトＰＤ−１（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｑｉａｏ Ｓｈｅｎｚｈｏｕ、製品コード１０３７７−Ｈ０８Ｈ）またはヒトＨＥＲ２（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｑｉａｏ Ｓｈｅｎｚｈｏｕ、製品コード１０００４−Ｈ０８Ｈ）でコーティングを行った。コーティング濃度は、１μｇ／ｍＬであり、コーティング量は、ウェル当たり１００μＬであった。該コーティングは、４℃で一晩行われた。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴを利用し、ウェル当たり３００μＬになった時点で密封し、２５℃で１時間培養させた。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴにおいて、連続希釈したヘテロダイマー抗体サンプル、及び対照群を、ウェル当たり１００μＬずつ添加し、２５℃で１時間培養させた。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。その後、１％のＢＳＡを含んだＰＢＳＴにおいて、１：２，０００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、製品コードＡＰ３０９Ｐ）を添加し、ウェル当たり１００μＬ添加し、２５℃で１時間培養した。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。表色基質ＴＭＢを、ウェル当たり１００μＬずつ添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ_２ＳＯ_４を、ウェル当たり１００μＬずつ添加し、発色を終了させた。マイクロプレート読取り機で、４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

その結果、図１１に図示されているように、抗ＰＤ−１ｐｅｍ／抗ＨＥＲ２及び抗ＰＤ−１ＢＪＨＭ／抗ＨＥＲ２は、いずれもＰＤ−１及びＨＥＲ２に対する高い親和力を有し、二価単一クローン抗体の抗原親和的活性を比較的良好に保存した。そのうち、抗ＰＤ−１_ＢＪＨＭ／抗ＨＥＲ２は、ＰＤ−１_ｐｅｍ／抗ＨＥＲ２に比べ、さらに強いＰＤ−１親和力を有する。

実施例７：抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子の二重標的抗原との同時結合活性
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を使用し、ＰＤ−１高発現のＣＨＯ／ＰＤ−１（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、製品コードＭ００５２９）細胞上と、ＨＥＲ２高発現のＳＫ−ＢＲ−３細胞上とにおいて、ＰＤ−１／ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体と二重標的抗原との同時結合能を測定した。

ＰＫＨ２６試薬キット（Ｓｉｇｍａ、製品コードＳＬＢＨ４５６８Ｖ）の使用マニュアルを参照し、ＣＨＯ／ＰＤ−１細胞を染色した。要約すると、ＣＨＯ／ＰＤ−１細胞を収集し、無血清培地において１回洗浄した後、ＰＫＨ２６試薬キットのＤｉｌｕｅｎｔ Ｃを利用し、ＣＨＯ／ＰＤ−１をそれぞれ２×１０^７／ｍＬの細胞懸濁液に製造し、ＰＫＨ２６染料を４μＭまで希釈した後、１：１で混合する。本混合懸濁液の細胞密度は、１×１０^７／ｍＬであり、ＰＫＨ２６の濃度は、２μＭであった。室温において１時間培養させた後、同等な体積を有するＦＢＳを利用し、１分間培養させた後、染色を終了させる。４００ｇで１０分間遠心分離させた後、完全培地を利用して２回洗浄し、完全培地にさらに懸濁させて準備する。ＣＦＳＥ試薬キット（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、製品コードＣ３４５５４）の使用マニュアルを参照し、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を染色した。要約すれると、ＰＢＳでＣＦＳＥを、作業濃度０．５まで希釈し、３７℃で予熱し、１，０００ｒｐｍの速度で５分間遠心分離し、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を収集し、予熱されたＣＦＳＥ作業溶液を、ＳＫ−ＢＲ−３に再懸濁させ、３７℃で１５分間培養し、１，０００ｒｐｍ速度で５分間細胞を収集した後、さらに完全培地に再懸濁させて３０分間培養し、完全培地を利用して１回洗浄した後、完全培地に懸濁させて準備する。

前記染色された細胞を、遠心分離によって収集し、２％のＦＢＳを含む冷ＰＢＳで１回洗浄した。２％のＦＢＳを含む冷ＰＢＳに、細胞を再懸濁させれば、細胞密度は、５×１０^６／ｍＬになる。ＳＫ−ＢＲ−３及びＣＨＯ／ＰＤ−１を、１：１で混合した後、各フローパイプから１００μＬずつ取り（すなわち、２．５×１０^５のＳＫ−ＢＲ−３、及び２．５×１０^５のＣＨＯ／ＰＤ−１）、さらに２％のＦＢＳを含んだ冷ＰＢＳに希釈させたヘテロダイマー抗体サンプル１００μＬ、対照群及び同型対照群（ヒト免疫グロブリン、Ｊｉａｎｇｘｉ Ｂｏｙａ Ｂｉｏ−ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、国家医薬品許可番号Ｓ１９９９３０１２）を添加した。最終濃度は、５ｎＭである。フローパイプは、氷上で３０分間培養させた。２％のＦＢＳを含むＰＢＳで２回洗浄した。細胞を５００μＬの冷ＰＢＳに再懸濁させ、該細胞懸濁液をフローサイトメトリーで解析した。

その結果、表１及び図１２に示されているように、ヘテロダイマー抗体が、同時にＰＤ−１高発現ＣＨＯ／ＰＤ−１細胞及びＨＥＲ２高発現ＳＫ−ＢＲ−３細胞と結合することにより、ＰＤ−１／ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体が、ＳＫ−ＢＲ−３細胞及びＣＨＯ／ＰＤ−１細胞の密接な関連を誘発し、それは、腫瘍細胞に対するＴ細胞の殺傷を媒介する基になる。

実施例８．抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子のＰＤ−１と、リガンドＰＤ−Ｌ１，ＰＤ−Ｌ２との結合に対する遮断活性
ｐＨ９．６のリン酸塩緩衝溶液を利用し、９６ウェル高吸着ＥＬＩＳＡプレート上において、組み換えヒトＰＤ−１−Ｆｃコーティングを行った。コーティング濃度は、１μｇ／ｍＬ、コーティング量は、ウェル当たり１００μＬであり、該コーティングは、４℃で一晩行われた。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴを利用し、ウェル当たり３００μＬになった時点で密封し、２５℃で１時間培養させた。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。１％のＢＳＡを含んだＰＢＳＴで配列希釈したヘテロダイマーサンプル及び対照群を添加し、同時に、最終濃度１μｇ／ｍＬであるビオチン標識のＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ、または最終濃度４μｇ／ｍＬであるビオチン標識のＰＤ−Ｌ２をウェル当たり１００μＬずつ添加し、２５℃で１時間培養した。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。その後、１％のＢＳＡを含んだＰＢＳＴにおいて、１：１，０００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識のストレプトアビジン（ＢＤ、製品コード５５４０６６）を、ウェル当たり１００μＬ添加し、２５℃で１時間培養した。ＰＢＳＴ洗浄を５回行った。表色基質ＴＭＢを、ウェル当たり１００μＬずつ添加し、室温で１０分間発色させた。１ＭのＨ_２ＳＯ_４を、ウェル当たり１００μＬずつ添加し、発色を終了させた。マイクロプレート読取り機で、４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

その結果、図１３に示されているように、抗ＰＤ−１_ｐｅｍ／抗ＨＥＲ２及び抗ＰＤ−１Ｂ_ＪＨＭ／抗ＨＥＲ２は、いずれもＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２結合を遮断し、二価単一クローン抗体の遮断活性を比較的良好に保存した。そのうち、抗ＰＤ−１_ＢＪＨＭ／抗ＨＥＲ２は、ＰＤ−１_ｐｅｍ／抗ＨＥＲ２に比べ、さらに強いＰＤ−１遮断活性を有する。

実施例９．抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子のＴ細胞サイトカイン分泌増強活性
ヒトＰＢＭＣ細胞（Ｌｏｎｚａ、製品コードＣＣ−２７０２）を収集した。ヒトＰＢＭＣ細胞を、細胞密度２×１０^６／ｍＬで、完全培地（１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）に再懸濁させた。ウェル当たり１００μＬ（ウェル当たり２×１０^５個の細胞）で９６ウェルプレートに接種した後、完全培地を使用して希釈したＰＤ−１／ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体サンプル及び対照群を、ウェル当たり５０μＬずつ添加した。完全培地で希釈した、最終濃度１μｇ／ｍＬのＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ、製品コードＬ−２７６９）を、ウェル当たり５０μＬずつ添加した。培養プレートを、３７℃の二酸化炭素恒温器に配置して培養した。３日間培養させた後、５０μＬの上澄み液を抽出し、サイトカインＩＬ−２（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ、製品コードＥＬＨ−ＩＬ２）の検出に利用した。

図１４に示されているように、ヒトＴ細胞がＰＨＡの刺激を受けると、ＩＬ−２の分泌が活性化される。ＰＤ−１抗体を添加すると、Ｔ細胞の活性化が増大され、サイトカインの分泌が促進される。ＰＤ−１／ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体は、ＰＤ−１単一クローン抗体に対応する効果を有し、濃度依存的に、サイトカインＩＬ−２の分泌を促進させる。

実施例１０．ラット体内での抗ＰＤ−１／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体分子に対する薬物動態学的研究
実験材料としては、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｈｕａｆｕｋａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した、６〜８週齢メスＳＤラットを使用した。ラットを環境に１週間適応させた後、任意にグループに分け、グループごとに３匹のラットが含まれる。全てのグループに、それぞれＰＤ−１単一クローン抗体、ＨＥＲ２単一クローン抗体、ＰＤ−１／ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体を投与した。用量は、いずれも２０ｎｍｏｌ／ｋｇであり、静脈注射で１回投与した。投与直後、投与後５分、３０分、１時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１６８時間、２１６時間、２６４時間、３１２時間、３６０時間、４０８時間、４８０時間ごとに、眼瞼から、０．２ｍＬ〜０．３ｍＬの血液を採取した。抗凝固剤を使用せず、血液サンプルを、室温で３０分〜１時間放置し、血液凝固後には、３０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離た。得られた血清サンプルを−８０℃で冷凍し、テストのために保管した。

ＥＬＩＳＡ方法で、血清中のＰＤ−１単一クローン抗体、ＨＥＲ２単一クローン抗体、ＰＤ−１／ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体の濃度を測定した。簡略に述べれば、ｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液を使用し、４℃でヒト組み換えＨＥＲ２タンパク質（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｑｉａｏ Ｓｈｅｎｚｈｏｕ、製品コード１０００４−Ｈ０８Ｈ）または組み換えＰＤ−１タンパク質（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｑｉａｏ Ｓｈｅｎｚｈｏｕ、製品コード１０３７７−Ｈ０８Ｈ）を、高吸着ＥＬＩＳＡプレートで一晩コーティングした。ＰＢＳＴで洗浄した。非特異的結合を防止するために、５％の脱脂粉乳を含むＰＢＳＴで、前記プレートを密閉し、ＰＢＳＴ洗浄を行った。その後、１０％の混合ラット血清と、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴに希釈したテスト用保管血清サンプルとを投入し、２５℃で１時間培養した後、ＰＢＳＴで前記プレートを洗浄した。５％の脱脂粉乳を含むＰＢＳＴで希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識の抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、製品コードＡＰ３０９Ｐ）を添加し、２５℃で１時間培養した後、ＰＢＳＴで前記プレートを洗浄した。最後に、表色基質ＴＭＢを使用し、室温で１０分間発色を行った。１ＭのＨ_２ＳＯ_４を添加し、発色を終了させた。マイクロプレート読取り機で、４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

その結果、図１５に示されているように、１回静脈注射に利用された２０ｎｍｏｌ／ｋｇのＰＤ−１／ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体は、ラットの体内で、良好な薬物動態学的特徴を示した。抗ＰＤ−１_ＢＪＨＭ／抗ＨＥＲ２ヘテロダイマー抗体の薬物動態学的媒介変数は、以下の通りである：半減期（ｔ_１／２）は、２０７時間であり、血中濃度曲線下面積（ＡＵＣｌａｓｔ）は、３３，４４８ｎＭ．ｈｒであり、Ｃ_０は、５３４ｎＭであり、見かけ体積（Ｖ_ｄ）は、１４８ｍＬ／Ｋｇであり、除去率（ＣＬ）は、０．５０ｍＬ／ｈｒ／ｋｇであり、平均残留時間（ＭＲＴ_ｌａｓｔ）は、１５９時間である。

Claims (29)

1. ＰＤ−１と特異的結合することができる第１抗原結合機能領域、及びＨＥＲ２と特異的結合することができる第２抗原結合機能領域を含み、１または複数の二硫化結合を介して連結された第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖を含み、前記第１Ｆｃ鎖と前記第２Ｆｃ鎖は、共有原子が結合またはリンカーを介して、それぞれＰＤ−１抗原結合機能領域及びＨＥＲ２抗原結合機能領域に連結されるか、あるいは前記第１Ｆｃ鎖及び前記第２Ｆｃ鎖は、共有原子が結合またはリンカーを介して、それぞれＨＥＲ２抗原結合機能領域及びＰＤ−１抗原結合機能領域に連結され、前記第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖は、以下の部位において、５個アミノ酸の置換を含む：
   １）第１Ｆｃ鎖上においては、Ｔ３６６番目及びＤ３９９番目のアミノ酸置換、第２Ｆｃ鎖上においては、Ｌ３５１番目，Ｙ４０７番目及びＫ４０９番目アミノ酸の置換；または
   ２）第１Ｆｃ鎖上においては、Ｔ３６６番目及びＫ４０９番目のアミノ酸置換、第２Ｆｃ鎖上においては、Ｌ３５１番目，Ｄ３９９番目及びＹ４０７番目のアミノ酸置換；
   前記アミノ酸置換を含む第１Ｆｃ鎖と第２Ｆｃ鎖は、それぞれホモダイマーを形成する傾向なしに、互いにヘテロダイマーを形成する傾向がさらに強く、
   前記アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ ＥＵ索引番号体系によって番号が付けられる、
   ヘテロダイマー系二重特異性抗体。
2. 前記第１Ｆｃ鎖及び第２Ｆｃ鎖のアミノ酸置換は、
   ａ）Ｌ３５１Ｇ、Ｌ３５１Ｙ、Ｌ３５１Ｖ、Ｌ３５１Ｐ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｅ、Ｌ３５１ＫまたはＬ３５１Ｗ；
   ｂ）Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｐ、Ｔ３６６ＷまたはＴ３６６Ｖ；
   ｃ）Ｄ３９９Ｃ、Ｄ３９９Ｎ、Ｄ３９９Ｉ、Ｄ３９９Ｇ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９ＴまたはＤ３９９Ａ；
   ｄ）Ｙ４０７Ｌ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｐ、Ｙ４０７Ｆ、Ｙ４０７ＴまたはＹ４０７Ｈ；及び
   ｅ）Ｋ４０９Ｃ、Ｋ４０９Ｐ、Ｋ４０９Ｓ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｖ、Ｋ４０９ＱまたはＫ４０９Ｒ；
   である、請求項１に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
3. 前記アミノ酸置換は、
   第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｅ，Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖ置換；
   ｂ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｇ，Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｃ置換；
   ｃ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｙ，Ｙ４０７Ａ及びＫ４０９Ｐ置換；
   ｄ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｎ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｖ，Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓ置換；
   ｅ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｗ及びＤ３９９Ｇ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｄ，Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓ置換；
   ｆ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｉ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｐ，Ｙ４０７Ｆ及びＫ４０９Ｆ置換；
   ｇ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｖ及びＤ３９９Ｔ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｋ，Ｙ４０７Ｔ及びＫ４０９Ｑ置換；
   ｈ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ａ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｗ，Ｙ４０７Ｈ及びＫ４０９Ｒ置換
   を含む、請求項１または２に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
4. 前記アミノ酸置換は、
   ａ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｖ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｅ，Ｙ４０７Ｌ及びＤ３９９Ｒ置換；
   ｂ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｃ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｇ，Ｙ４０７Ｌ及びＤ３９９Ｃ置換；
   ｃ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｐ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｙ，Ｙ４０７Ａ及びＤ３９９Ｃ置換；
   ｄ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｐ及びＫ４０９Ｓ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｖ，Ｙ４０７Ｐ及びＤ３９９Ｎ置換；
   ｅ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｗ及びＫ４０９Ｓ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｄ，Ｙ４０７Ｐ及びＤ３９９Ｇ置換；
   ｆ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｐ及びＫ４０９Ｆ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｐ，Ｙ４０７Ｆ及びＤ３９９Ｉ置換；
   ｇ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｖ及びＫ４０９Ｑ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｋ，Ｙ４０７Ｔ及びＤ３９９Ｔ置換；
   ｈ）第１Ｆｃ鎖のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｒ置換、第２Ｆｃ鎖のＬ３５１Ｗ，Ｙ４０７Ｈ及びＤ３９９Ａ置換
   を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
5. 前記第１Ｆｃ鎖のアミノ酸置換は、Ｔ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒであり、第２Ｆｃ鎖のアミノ酸置換は、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖである、請求項１に記載のヘロダイマー系二重特異性抗体。
6. 前記Ｆｃ鎖は、ＩｇＧ由来のものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
7. 前記ＰＤ−１抗原結合機能領域及びＨＥＲ２抗原結合機能領域は、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ断片である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
8. 前記ＰＤ−１抗原結合機能領域及びＨＥＲ２抗原結合機能領域は、いずれもＦａｂ断片である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
9. 前記ＰＤ−１抗原結合機能領域及びＨＥＲ２抗原結合機能領域のうち一つは、Ｆａｂ断片であり、他の一つは、ｓｃＦｖである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
10. 前記Ｆａｂ断片は、異なる第１重鎖可変部及び第２重鎖可変部、並びに異なる第１軽鎖可変部及び第２軽鎖可変部を含むものである、請求項７〜９のいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
11. 前記第１Ｆｃ鎖、及びそれと連結されるＰＤ−１抗原結合機能領域、並びに前記第２Ｆｃ鎖、及びそれと連結されるＨＥＲ２抗原結合機能領域、または第１Ｆｃ鎖、及びそれと連結されるＨＥＲ２抗原結合機能領域、並びに第２Ｆｃ鎖、及びそれと連結されるＰＤ−１抗原結合機能領域は、単独で存在するか、あるいは還元剤と同時に存在する場合、ホモダイマーを形成する重量比率が、いずれも５０％未満である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
12. 前記二重特異性抗体のアミノ酸配列は、配列番号２，４，６，１８，１０，１２，１４，１６及び１８から選択されるものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体。
13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体をコードする、分離されたポリヌクレオチド。
14. 配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５及び１７から配列が選択される、請求項１３に記載の分離されたポリヌクレオチド。
15. 請求項１３または１４に記載の分離されたポリヌクレオチドを含む、組み換え発現ベクター。
16. 前記発現ベクターが、ｐＣＤＮＡに基づいて改変して得られたプラスミドベクターＸ０ＧＣである、請求項１５に記載の組み換え発現ベクター。
17. 請求項１３又は１４に記載のポリヌクレオチド、あるいは請求項１５または１６に記載の組み換え発現ベクターを含む宿主細胞。
18. ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３、またはＨＥＫ２９３細胞を基に改変して得たＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ｆ；チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ、またはＣＨＯ細胞を基に改変して得たＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯから選択される、請求項１７に記載の宿主細胞。
19. 請求項１〜１２のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、請求項１３または１４に記載の分離されたポリヌクレオチド、請求項１５または１６に記載の組み換え発現ベクター、あるいは請求項１７または１８に記載の宿主細胞、及び薬理学的に許容可能な担体を含む組成物。
20. 請求項１〜１２のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体を生産する方法であって、
    １）請求項１３または１４に記載の分離されたポリヌクレオチド、あるいは請求項１５または１６に記載の組み換え発現ベクターをそれぞれ宿主細胞内で発現させる段階と、
    ２）宿主細胞内でそれぞれ発現されるタンパク質を精製及び還元させる段階と、
    ３）還元されたタンパク質を混合した後、混合物を酸化させる段階と
    を含む方法。
21. 前記宿主細胞は、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３、またはＨＥＫ２９３細胞を基に改変して得たＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｆ；チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ、またはＣＨＯ細胞を基に改変して得たＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯから選択される、請求項２０に記載の方法。
22. 前記還元段階は、１）還元剤を添加する段階として、該還元剤が、２−メルカプトエチルアミン、ジチオトレイトール、トリ（２−カルボキシエチル）ホスファイン、またはその他の化学的誘導体から選択される段階と、２）０．１ｍＭ以上の濃度のジチオトレイトールの存在下で、４℃条件下で、少なくとも３時間還元反応を行う段階と、３）脱塩などを介して、還元剤を除去する段階とを含む、請求項２０または２１に記載の方法。
23. 前記酸化段階は、１）空気中で酸化させるか、あるいは酸化剤を添加することを含み、前記酸化剤は、Ｌ−デヒドロアスコルビン酸、またはその他の化学的誘導体から選択され、２）０．５ｍＭ以上の濃度のＬ−デヒドロアスコルビン酸の存在下で、４℃条件下で、少なくとも５時間酸化反応を行う段階を含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 分離精製段階をさらに含む、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 個体疾病の予防および／または治療に使用される薬物の製造における、請求項１〜１２のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、および／または請求項１３または１４に記載の分離されたポリヌクレオチド、および／または請求項１５または１６に記載の組み換え発現ベクター、および／または請求項１７または１８に記載の宿主細胞、または請求項１９に記載の組成物の用途。
26. 個体疾病の予防および／または治療に使用される薬物として使用される、請求項１〜１２のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、および／または請求項１３または１４に記載の分離されたポリヌクレオチド、および／または請求項１５または１６に記載の組み換え発現ベクター、および／または請求項１７または１８に記載の宿主細胞、および／または請求項１９に記載の組成物。
27. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、および／または請求項１３または１４に記載の分離されたポリヌクレオチド、および／または請求項１５または１６に記載の組み換え発現ベクター、および／または請求項１７または１８に記載の宿主細胞、および／または請求項１９に記載の組成物をそれを必要とする個体に投与する段階を含む、疾病を予防および／または治療する方法。
28. 前記個体が哺乳動物であり、望ましくは、ヒト個体である、請求項２５に記載の用途、請求項２６に記載のヘテロダイマー系二重特異性分子、分離されたポリヌクレオチド、組み換え発現ベクター、宿主細胞または組成物、または請求項２７に記載の方法。
29. 前記疾病が、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平細胞癌、非小細胞肺癌、鼻咽頭癌腫、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、メラノーマなどの疾病から選択される、請求項２５に記載の用途、請求項２６に記載のヘテロダイマー系二重特異性抗体、分離されたヌクレオチド、組み換え発現ベクター、宿主細胞または組成物、または請求項２７に記載の方法。