CN112930358B - 抗TNFα/抗IL-17A天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备 - Google Patents

Abstract

提供一种抗TNFα/抗IL‑17A天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备，所述抗体能同时结合两种靶分子，可治疗复杂疾病。

Description

抗TNFα/抗IL-17A天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗 体及其制备

技术领域

本发明涉及抗TNFα/抗IL-17A天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备。具体而言，本发明提供了一种具有天然IgG特点、并且没有重轻链错配的高度稳定的异源二聚体形式的抗TNFα/抗IL-17A双特异抗体及其制备方法。

背景技术

TNFα是一种细胞炎症因子，通过与其受体TNFR1和TNFR2结合诱导其它炎症因子的分泌。TNFα的拮抗剂能够阻止这种结合，降低TNFα信号通路的活性，达到抑制炎症反应的目的。目前已上市的TNFα的拮抗剂主要有可溶性的TNFα受体和TNFα单克隆抗体两类。可溶性的TNFα受体是将TNFR2的胞外区与IgG的恒定区进行融合，如辉瑞(Pfizer)公司于1998年上市的依那西普(Etanercept)。TNFα单克隆抗体类是特异识别TNFα的基因工程抗体，能够中和TNFα，目前已上市的有J&J的英利昔单抗(Infliximab)和戈利木单抗(Golimumab)，UCB公司的赛妥珠单抗(Certolizumab)以及雅培(Abbott)公司的阿达木单抗(Adalimumab)(Clinical Immunology，2008，126：13-30)。临床应用显示，TNFα的拮抗剂可以有效地减轻RA炎症、缓解关节的放射学进展，患者ACR20指数的改善率达50％-70％。但是，同时也发现有20-30％的患者对TNFα的拮抗剂的应答不理想，或者在接受长期的TNFα的拮抗剂治疗后，效果逐渐下降(Biodrugs，2009，23(2)：111-124)。

近期研究发现，这部分应答不理想或者治疗之后逐渐失效的RA患者，体内的Th17细胞水平和IL-17A细胞因子的表达水平是上升的。这种现象在动物模型上也有发现，对TNFα的拮抗剂应答不理想的动物体内的Th17细胞水平和IL-17A细胞因子的表达水平也是上升的。大量文献报道，IL-17A能与TNFα协同作用诱发或加重炎症反应，体内升高的Th17和IL-17A是TNFα拮抗剂应答效果不理想可能的重要机制(Trends Pharmacol Sci.2015 Apr；36(4)：189-95.Ann Rheum Dis.2012 Oct；71(10)：1741-8.PLoS ONE 2014，9(5)：e95346.)。因此有理由相信，共同抑制TNFα和IL-17A可能给RA患者以及其它TNFα、IL-17A相关的自身免疫性疾病患者比如银屑病患者，银屑病性关节炎患者带来更好的治疗效果，改善生活质量。

鉴于此，有必要研究一种同时能阻断TNFα和IL-17A信号通路的新型治疗药物。

发明内容

本发明提供了一种新的具有天然IgG结构特点、并且没有重轻链错配的高度稳定的异源二聚体形式的能同时阻断TNFα和IL-17A的双功能抗体及其制备方法，该双功能抗体倾向于选择性结合同时高表达TNFα和IL-17A的肿瘤细胞，从而发挥高效、特异的杀伤效果，同时具有较低的毒副作用。

本发明的第一方面涉及一种异源二聚体形式的双特异抗体，其包含第一Fc链和第二Fc链，以及能与TNFα特异性结合的第一个抗原结合功能区和能与IL-17A特异性结合的第二个抗原结合功能区；

其中所述第一Fc链和第二Fc链均为包含氨基酸替换的免疫球蛋白GFc片段，并且所述第一Fc链及第二Fc链共同构成可以与Fc受体结合的异源二聚体；

其中所述第一Fc链和第二Fc链通过共价键或连接体分别连接到所述第一抗原结合功能区和第二抗原结合功能区；

并且其中所述第一Fc链和第二Fc链中的任意一条在366位及399位上包含氨基酸替换，另一条在351位、407位及409位上包含氨基酸替换，其中氨基酸位置根据Kabat EU指数编号系统编号。

本文中第一Fc链及第二Fc仅出于区分存在的两条Fc链的目的而定义，并不意味着其重要性不同或次序存在差异。同时，第一Fc链和第二Fc链与第一抗原结合功能区和第二抗原结合功能区的连接也是任意的，即第一Fc链既可以与第一抗原结合功能区连接，也可以与第二抗原结合功能区连接，第二Fc链也是如此。

在一些实施方案中，第一Fc链及第二Fc链的氨基酸替换如下，

a)L351G、L351Y、L351V、L351P、L351D、L351E、L351K或L351W；

b)T366L、T366P、T366W或T366V；

c)D399C、D399N、D399I、D399G、D399R、D399T或D399A；

d)Y407L、Y407A、Y407P、Y407F、Y407T或Y407H；和

e)K409C、K409P、K409S、K409F、K409V、K409Q或K409R。

在一些实施方案中，氨基酸替换包括：

a)第一Fc链和第二Fc链中的任意一条为T366L及D399R替换，另一条为L351E、Y407L及K409V替换；

b)第一Fc链和第二Fc链中的任意一条为T366L及D399C替换，另一条为L351G、Y407L及K409C替换；

c)第一Fc链和第二Fc链中的任意一条为T366L及D399C替换，另一条为L351Y、Y407A及K409P替换；

d)第一Fc链和第二Fc链中的任意一条为T366P及D399N替换，另一条为L351V、Y407P及K409S替换；

e)第一Fc链和第二Fc链中的任意一条为T366W及D399G替换，另一条为L351D、Y407P及K409S替换；

f)第一Fc链和第二Fc链中的任意一条为T366P及D399I替换，另一条为L351P、Y407F及K409F替换；

g)第一Fc链和第二Fc链中的任意一条为T366V及D399T替换，另一条为L351K、Y407T及K409Q替换；

h)第一Fc链和第二Fc链中的任意一条为T366L及D399A替换，另一条为L351W、Y407H及K409R替换。

在一些实施方案中，第一Fc链和第二Fc链中的任意一条的氨基酸替换为T366L和D399R，另一条的氨基酸替换为L351E、Y407L和K409V。

在一些实施方案中，第一个抗原结合功能区和第二个抗原结合功能区选自Fab片段、scFv片段、可变结构域片段Fv和重链抗体的重链可变区片段VHH。

在一些实施方案中，第一个抗原结合功能区和第二个抗原结合功能区都是Fab片段。

在一些实施方案中，第一个抗原结合功能区和第二个抗原结合功能区中一个是Fab片段，另一个是scFv。

在一些实施方案中，Fab片段包含不同的第一重链可变区及第二重链可变区，以及不同的第一轻链可变区及第二轻链可变区。

在一些实施方案中，第一Fc链及与其共价相连的第一抗原结合功能区，和第二Fc链及与其共价相连的第二抗原抗原结合功能区，在存在还原剂的溶液中且所述溶液中除所述第一Fc链及与其共价相连的第一抗原结合功能区和第二Fc链及与其共价相连的第二抗原抗原结合功能区以外不含其它多肽时，其形成同源二聚体的基于所有多肽链的重量比例均低于50％。

在一些实施方案中，第一抗原结合功能区包含SEQ ID NO：2和6的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第二抗原结合功能区包含SEQ ID NO：10和12的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一抗原结合功能区进一步包含SEQ ID NO：4和8的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第二抗原结合功能区进一步包含SEQ ID NO：4和14的氨基酸序列。

在一些实施方案中，双特异抗体的氨基酸序列是SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12和14的相应组合。如SEQ ID No：2、4、6和8相互组合，SEQ ID No：10、4、12和14相互组合，然后，组合后的二者再组合，以形成本发明的双特异性抗体。

本发明的第二方面涉及一种分离的多核苷酸，其编码如第一方面所述的异源二聚体形式的双特异抗体。

在一些实施方案中，编码第一抗原结合功能区氨基酸的核苷酸序列选自：SEQ IDNO：1和5。

在一些实施方案中，编码第二抗原结合功能区氨基酸的核苷酸序列选自：SEQ IDNO：9和11。

在一些实施方案中，编码第一抗原结合功能区氨基酸的核苷酸序列进一步选自：SEQ ID NO：3和7。

在一些实施方案中，编码第二抗原结合功能区氨基酸的核苷酸序列进一步选自：SEQ ID NO：3和13。

在一些实施方案中，多核苷酸的序列是SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11和13的相应组合。如SEQ ID No：1、3、5和7相互组合，SEQ ID No：9、3、11和13相互组合。

本发明的第三方面涉及一种重组表达载体，其包含第二方面所述的分离的多核苷酸。

在一些实施方案中，表达载体为基于pCDNA改造得到的质粒载体XOGC。

本发明的第四方面涉及一种宿主细胞，其包含第二方面所述的分离的多核苷酸，或第三方面所述的重组表达载体。

在一些实施方案中，宿主细胞选自人胚肾细胞HEK293或以HEK293细胞为基础改造而得到的HEK293T、HEK293F、HEK293E；仓鼠卵巢细胞CHO或以CHO细胞为基础改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr-、CHO/DG44、ExpiCHO；大肠杆菌或以大肠杆菌为基础改造得到的大肠杆菌BL21、BL21(DE3)、Rosetta、Origami；酵母菌或以酵母为基础改造得到的毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸克鲁维亚酵母、多形汉逊酵母；昆虫细胞或以昆虫细胞为基础改造得到的细胞High5、SF9；植物细胞；哺乳动物乳腺细胞、体细胞。

本发明的第五方面涉及一种组合物，其包含第一方面所述的异源二聚体形式的双特异抗体或第二方面所述的分离的多核苷酸或第三方面所述的重组表达载体或第四方面所述的宿主细胞，及药学上可接受的载体。

本发明的第六方面涉及一种生产如第一方面所述的异源二聚体形式的双特异抗体的方法，其包括步骤：

1)将第二方面所述的分离的多核苷酸或第三方面所述的重组表达载体分别在宿主细胞中进行表达；

2)将在宿主细胞中分别表达的蛋白进行还原；以及

3)将还原的蛋白混合，然后将混合物进行氧化。

在一些实施方案中，宿主细胞选自人胚肾细胞HEK293或以HEK293细胞为基础改造而得到的HEK293T、HEK293F、HEK293F；仓鼠卵巢细胞CHO或以CHO细胞为基础改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr-、CHO/DG44、ExpiCHO；大肠杆菌或以大肠杆菌为基础改造得到的大肠杆菌BL21、BL21(DE3)、Rosetta、Origami；酵母菌或以酵母为基础改造得到的毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸克鲁维亚酵母、多形汉逊酵母；昆虫细胞或以昆虫细胞为基础改造得到的细胞High5、SF9；植物细胞；哺乳动物乳腺细胞、体细胞。

在一些实施方案中，还原步骤包括1)在还原剂存在下进行还原反应，所述还原剂选自：2-巯基乙胺、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦或其他化学衍生物；2)去除还原剂，例如在0.1mM或更高浓度二硫苏糖醇存在下在4℃条件下进行还原反应最少3小时。所述还原剂及还原反应条件的限定也适用于本文涉及还原剂及还原反应使用的其它情况。

在一些实施方案中，氧化步骤为在空气中氧化，也包括在氧化剂存在下进行氧化反应，所述氧化剂选自：L-脱氢抗坏血酸或其化学衍生物，例如在0.5mM或更高浓度L-脱氢抗坏血酸存在下在4℃条件下进行氧化反应最少5小时。

在一些实施方案中，所述的方法还包括分离纯化的步骤。

本发明的第七方面涉及第一方面所述的异源二聚体形式的双特异抗体和/或第二方面所述的分离的多核苷酸和/或第三方面所述的重组表达载体和/或第四方面所述的宿主细胞和/或第五方面所述的组合物在制备用于预防和/或治疗受试者疾病的药物中的用途。

本发明的第八方面涉及第一方面所述的异源二聚体形式的双特异抗体和/或第二方面所述的分离的多核苷酸和/或第三方面所述的重组表达载体和/或第四方面所述的宿主细胞和/或第五方面所述的组合物，其用做用于预防和/或治疗受试者疾病的药物。

本发明的第九方面涉及一种预防和/或治疗疾病的方法，包括将第一方面所述的异源二聚体形式的双特异抗体和/或第二方面所述的分离的多核苷酸和/或第三方面所述的重组表达载体和/或第四方面所述的宿主细胞和/或第五方面所述的组合物施予有需求的受试者。

在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，优选地，人类受试者。

在一些实施方案中，所述疾病选自如下疾病：类风湿性关节炎、骨性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、痛风性关节炎、幼年类风湿性关节炎、化脓性关节炎、牛皮癣、I型糖尿病、多发性硬化症、自身免疫性脑脊髓炎、克罗恩氏病、系统性脉管炎、皮肌炎、混合结缔组织病、红斑性狼疮、特发性血小板减少性紫癜、原发性干燥综合征、肾小球肾炎、痛风、器官移植的排斥反应、哮喘或动脉粥样硬化。

本发明设计了一种全新的抗TNFα/抗IL-17A天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体，其具有天然IgG特点，并且没有重轻链错配，是高度稳定的异源二聚体形式的抗TNFα/抗IL-17A双特异抗体。本发明制备的双特异抗体能同时阻断TNFα信号通路和IL-17A信号通路，将其应用于复杂疾病治疗时可发挥比单一治疗剂更好的效果。同时，相对于多个药物的组合治疗，该双特异抗体作为单一治疗分子不仅方便了患者和医疗工作者的使用，也简化了复杂的新药开发流程。另外，本发明发现在有IL-17A存在时，该双特异抗体中抗TNFα部分的TNFα中和活性较无IL-17A存在时明显增强，提示该双特异抗体在IL-17A高水平的病灶部位具有更强的TNFα中和活性，而在IL-17A低水平的循环系统中表现较弱的TNFα中和活性，从而表明该双特异抗体在有效治疗疾病的同时保持较低的毒副作用。

附图说明

图1.示出了抗TNFα表达产物和抗IL-17A表达产物的洗脱峰色谱图。其中A图为抗TNFα表达产物的洗脱峰色谱图，B图为抗IL-17A表达产物的洗脱峰色谱图。。

图2.示出了抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体分子的结构。

图3.示出了包含一条重链和一条轻链的半抗体分子结构。

图4.示出了包含一条重链和一条轻链的半抗体分子的SEC分析结果。其中A图为抗TNFα半抗体分子，纯度为98％，B图为抗IL-17A半抗体分子，纯度为90.2％。

图5.示出了抗TNFα/IL-17A异源二聚体抗体分子的非还原毛细管电泳结果，其中峰1为单条轻链，峰2为一条重链加一条轻链，峰3为两条重链，峰4为两条重链加一条轻链，峰5为两条重链加两条轻链。

图6.示出了抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体分子的洗脱峰。

图7.示出了最终纯化得到的抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体分子的非还原毛细管电泳结果，其中峰1为单条轻链，峰2为两条重链，峰3为两条重链加一条轻链，峰4为两条重链加两条轻链。

图8.示出了抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体分子的SEC分析结果，纯度为99.9％。

图9.示出了抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体BH1657的靶抗原体外中和活性。其中A图表示BH1657的TNFα中和活性，B图表示BH1657的IL-17A中和活性，C图表示BH1657在TNFα和IL-17同时存在时的中和活性。

图10.示出了抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体BH1657的抗TNFα活性受IL-17A存在与否影响。其中A图表示IL-17A对BH1657的TNFα/TNFR2封闭活性的影响，B图表示IL-17A对BH1657的TNFα中和活性的影响。

图11.示出了抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体BH1657的靶抗原体内中和活性。##p＜0.01vs抗TNFα；**p＜0.01vs抗IL-17A。

图12.示出了抗小鼠TNFα/抗小鼠IL-17A异源二聚体抗体BH1654在II型胶原诱导的小鼠关节炎(mCIA)模型中的药效。*p＜0.5，**p＜0.01，***p＜0.001vs溶媒；#p＜0.05，###p＜0.001，vs BH1654140nmol/kg。

图13.示出了抗小鼠TNFα/抗小鼠IL-17A异源二聚体抗体BH1654在葡萄糖-6-磷酸异构酶诱导的小鼠关节炎(mGPI)模型中的药效。#p＜0.5，##p＜0.01，###p＜0.001vs溶媒；*p＜0.05，**p＜0.01，vs BH165470nmol/kg。

图14.示出了抗小鼠TNFα/抗小鼠IL-17A异源二聚体抗体BH1654在酵母聚糖诱导的SKG小鼠银屑病性关节炎模型中的药效。#p＜0.5vs溶媒。

具体实施方式

定义：

共价连接是指异源二聚体形式的双特异抗体中，两条Fc链之间，任一条Fc链及与其相连接的抗原结合功能区之间，是通过共价键而连接成为一个分子。其中Fc链包含通过一个或多个共价键(如二硫键)连接的第一抗原结合功能区及第二抗原结合功能区；该第一Fc链及第二Fc链分别通过共价连接(如亚胺键或酰胺键)而连接到一个抗原结合功能区上；

抗原结合功能区是指可以与目标分子如抗原发生特异性相互作用的区域，其作用具有高度选择性，识别一种目标分子的序列通常不能识别其他分子序列。代表性的抗原结合功能区包括：抗体的可变区、抗体可变区的结构变构体、受体的结合域、配体结合域或酶结合域。

一个或多个二硫键链间连接是指第一Fc链及第二Fc链通过一个或多个二硫键相互连接，形成异源二聚体片段。在本发明中，一个或多个二硫键的形成可以是第一Fc链及第二Fc链或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区在同一个细胞内合成时形成，也可以是第一Fc链及第二Fc链或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区在不同细胞内分别合成，之后通过体外还原氧化的方法形成。

第一Fc链及第二Fc链是指通过共价连接而组成结合片段，共价连接包括二硫键，每条链至少包含免疫球蛋白重链恒定区的一部分；并且该第一Fc链及第二Fc链在氨基酸序列上是不同的，至少包括了一位氨基酸的不同。在此发明中的第一Fc链及第二Fc链，相同链之间存在强烈的相互排斥作用，而不同链之间存在吸引作用，因此当在细胞内共同表达时，第一Fc链及第二Fc链，或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区，更倾向于形成异源二聚体。将第一Fc链及第二Fc链，或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区分别在两个宿主细胞内表达时，第一Fc链或者第一Fc链及其相连接的抗原结合功能区不倾向于形成同源二聚体，第二Fc链或者第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区不倾向于形成同源二聚体。在本发明中，当第一Fc链及第二Fc链，或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区分别在两个宿主细胞内表达时，并且在存在还原剂时，同源二聚体的比例低于50％，即单体(一条Fc链或者一条Fc链及其相连接的抗原结合功能区)比例大于50％。

免疫球蛋白是具有四条多肽链的对称结构，其中两条较长、相对分子量较大的相同的重链，含450～550个氨基酸残基，相对分子质量在55000～70000Da之间；两条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)，含约210个氨基酸残基，相对分子质量约24000Da。不同的免疫球蛋白重链和轻链在靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，称为可变区(variable region，V区)，而靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，称为恒定区(constantregion，C区)。重链中可变区约占重链长度的1/4，恒定区约占重链长度的3/4。对于已知五种Ig来说，IgG(γ)、IgA(α)、IgD(δ)、IgM(μ)和IgE(ε)，其中前三类Ig的H链内有三个恒定区，即CH1、CH2和CH3组成。后两类(IgM和IgE)的H链中有一个VH区和四个恒定区，即CH1至CH4。恒定区既是免疫球蛋白分子的骨架，又是激活免疫反应的部位之一。虽然本发明实施例涉及IgG，但本领域技术人员知晓，如果希望的话，可以通过已知方法转换本发明的抗体的类别。例如，最初是IgM的本发明抗体可以类别转换为本发明的IgG抗体。此外，类别转换技术可以用来将一个IgG亚类转化成另一亚类，例如从IgGl转换到IgG2。因此，本发明的抗体的效应子功能可以通过同种型切换变为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体，用于各种治疗用途。在一个实施例中，本发明的抗体是IgG1抗体，例如IgG1，κ。

本发明中的恒定区一部分至少包括了第一Fc链和第二Fc链相互作用的区域，该区域对于IgG来说，是位于CH3区域的一部分氨基酸，至少包括GLN347、TYR349、THR 350、LEU351、SER 354、ARG 355、ASP 356、GLU 357、LYS 360、SER 364、THR 366、LEU 368、LYS 370、ASN390、LYS392、THR394、PRO395、VAL 397、ASP399、SER400、PHE405、TYR407、LYS409、LYS439。

第一Fc链及第二Fc链分别通过共价键或连接体连接到一个抗原结合功能区上是指第一Fc链及第二Fc链分别通过共价键或连接体连接到一个抗体的抗原结合片段，或可以识别抗原的单链抗体，或可以识别抗原的其他抗体片段变构体，或可以识别配体的受体，或可以识别受体的配体，其中所述共价键是指是化学键的一种，两个或多个原子共同使用它们的外层电子，在理想情况下达到电子饱和的状态，由此组成比较稳定的化学结构叫做共价键，或者说共价键是原子间通过共用电子对所形成的相互作用。同一种的元素的原子或不同元素的都可以通过共价键结合，对于本发明的第一Fc链及第二Fc链间的共价键，包括但不限于一分子氨基酸的氨基与另一分子氨基酸的羧基脱水反应形成的酰胺键，或者乙二醇或聚乙二醇或其他化合物或其多聚物的醛基与一分子氨基酸的氨基形成酰胺键或亚胺键，其中连接体是可以将两条多肽链通过共价键连接起来的一段氨基酸序列或者一种化合物或者一种化合物的多聚体，其中一段氨基酸序列包括但不限于一段小肽，如GGGGSGGGGSGGGGS，通过酰胺键将第一Fc链或第二Fc链，以及可以识别抗原的单链抗体，或可以识别抗原的其他抗体片段结构变构体连接起来

第一Fc链与第二Fc链更倾向于形成异源二聚体而不倾向于各自形成同源二聚体是指，由于在第一Fc链与第二Fc链中，相同的多肽链间存在互相排斥的作用，而不同的多肽链间存在吸引作用，因此当在细胞内共同表达时，第一Fc链及第二Fc链，或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区，更倾向于形成异源二聚体。将第一Fc链及第二Fc链，或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区分别在两个宿主细胞内表达时，第一Fc链或者第一Fc链及其相连接的抗原结合功能区不倾向于形成同源二聚体，第二Fc链或者第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区不倾向于形成同源二聚体。

Kabat EU指数编号系统是指，Kabat利用一种方法将一个编号指定给抗体序列的每个氨基酸并且这种指定每个残基的编号的方法已经成为本领域的标准方法。Kabat方案可以延伸到不存在于他的研究中的其它抗体，基于保守的氨基酸，将目标抗体与Kabat鉴定的共有序列之一进行比对。

Fc结构域是指可结晶段(fragment crystallizable，Fc)，相当于Ig的CH2和CH3结构域，是Ig与效应分子或者细胞相互作用的部位。

IgG是免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)的缩写，是血清主要的抗体成分，根据IgG分子中的r链抗原性差异，人IgG有四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。

半抗体分子是指抗体的一条重链与一条轻链形成的结构，其中重链与轻链间可以通过共价键连接，也可以不通过共价键连接，是一种识别抗原的单价抗体结构。

Fab片段是一种分子识别序列，是抗原结合片段(fragment of antigen binding，Fab)，相当于抗体分子的两个臂，由一个完整的轻链和重链的VH和CH1结构域组成。scFv是一种分子识别序列，是一种由抗体的轻链可变区与重链可变区通过基因工程改造而得到的抗体片段的结构异构体。膜受体的细胞外区是一种分子识别序列，膜受体通常包括位于细胞外部的可以识别并结合相应抗原或者配体的细胞外区域，将受体锚定在细胞表面的跨膜区，以及在胞内的具有激酶活性或者可以传递信号通路的胞内区。细胞膜受体的配体是指能被膜受体胞外区识别并结合的蛋白质，小肽或化合物。细胞因子是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、APSC多能细胞以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。蛋白表达标签指在目标蛋白的N端或C端加入的一段氨基酸序列，可以是小肽也可以是长的氨基酸，标签的加入可以有利于蛋白质的正确折叠，可以有利于蛋白质的分离纯化，可以有利于降低蛋白质在胞内的降解，常用的标签包括但不限于HA、SUMO、His、GST、GFP、Flag。

可应用于本发明的异源二聚体形式的双特性抗体中的抗体并无任何限制。优选地，现有技术中已知可以用于治疗和/或预防疾病的抗体均可以用于本发明。

本发明的异源二聚体形式的双特性抗体可具有一个或多个替换、缺失、添加和/或插入。例如，某些氨基酸可以替换在蛋白质结构中的其它氨基酸而没有明显损失与其它多肽(如抗原)或细胞结合的能力。由于结合能力和蛋白性质决定了蛋白的生物功能活性，可以在蛋白序列上进行某些氨基酸序列的替换而不会明显损失它们的生物效用或活性。

在许多情况中，多肽变体含有一个或多个保守替换。“保守替换”是指其中氨基酸被其它具有类似性质的氨基酸所替换，使得肽化学领域中技术人员可预期多肽的二级结构和亲水性质基本上不发生变化。

氨基酸替换通常是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑了各种前述特征的示例性替换是本领域技术人员公知的并包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

本发明使用的术语“同一性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同一性的规则、标准，是指在序列比对和引入缺口(如果必要的话，以获得最大百分比同源性)后，多核苷酸或多肽序列变体的残基与非变体序列的相同的百分比。。在本发明中，在满足同一性限定的情况下，还需要所获得的变体序列具有母体序列所具有的生物活性。本领域技术人员公知如何利用上述活性筛选变体序列的方法和手段。本领域技术人员可以在本申请公开内容的教导下容易地获得这样的变体序列。在具体实施方式中，多核苷酸和多肽变体与本文所述的多核苷酸或多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或至少约99％，或至少约99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的多核苷酸或多肽同一性。由于遗传密码的冗余性，将存在编码相同氨基酸序列的这些序列的变体。

本发明的另一个实施方式中，提供了能够在中度至高度严格条件下与本发明提供的多核苷酸序列或其片段或其互补序列相杂交的多核苷酸组合物。杂交技术是分子生物学领域公知的。为了说明的目的，用于测试本发明的多核苷酸与其他多核苷酸杂交的合适中等严格条件包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预洗；在50-60℃、5×SSC、过夜的条件下杂交；再于65℃下20分钟用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×的SSC各洗涤两次。本领域技术人员理解，可容易地操纵杂交的严格性，例如通过改变杂交溶液的盐含量和/或进行杂交的温度。例如，在另一个实施方式中，合适的高严格杂交条件包括上述的条件，所不同的是杂交温度升高了，例如达到60-65℃或65-70℃。

本发明的宿主细胞可以是用于外源基因表达的所有细胞，包括但不限于大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，植物细胞，哺乳动物细胞。

本发明的载体包括可以在任何类型的细胞或生物体中进行复制的载体，包括如质粒、噬菌体、粘粒和迷你染色体。在一些实施方式中，包括本发明多核苷酸的载体是适合于多核苷酸繁殖或复制的载体，或者是适合于表达本发明多肽的载体。这样的载体是本领域已知并可以购买的。

“载体”包括穿梭载体和表达载体。通常，质粒构建体也包括分别用于细菌中质粒复制和选择的复制起点(如复制的ColE1起点)和选择标记(如氨苄青霉素或四环素抗性)。“表达载体”是指包含用于在细菌或真核细胞中表达本发明的抗体包括抗体片段所需要的控制序列或调控元件的载体。

本发明的载体可以是用于外源基因表达的所有载体，包括但不限于质粒载体，其中质粒载体至少包含复制起始位点、启动子、目的基因、多克隆位点、筛选标记基因，优选地，本发明所述载体包括但不限于基于pCDNA改造得到的质粒载体，比如X0GC载体。

本发明的受试者包括禽类、爬行动物、哺乳动物等。优选地，哺乳动物包括啮齿类动物、灵长类动物，优选地，灵长类动物包括人。

本发明所涉及的疾病的范围包括但不限于炎症、自身免疫性疾病，优选的，所述疾病选自：类风湿性关节炎、骨性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、痛风性关节炎、幼年类风湿性关节炎、化脓性关节炎、牛皮癣、I型糖尿病、多发性硬化症、自身免疫性脑脊髓炎、克罗恩氏病、系统性脉管炎、皮肌炎、混合结缔组织病、红斑性狼疮、特发性血小板减少性紫癜、原发性干燥综合征、肾小球肾炎、痛风、器官移植的排斥反应、哮喘或动脉粥样硬化，更优选的，所述疾病选自类风湿性关节炎、骨性关节炎、银屑病关节炎、痛风性关节炎、幼年类风湿性关节炎、化脓性关节炎。

药学上可接受的载体是指是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂和水等，填充剂如淀粉、蔗糖，乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠，羟丙纤维素，交联羧甲基纤维素，琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇，十二烷基硫酸钠；吸附载体如高龄土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、微粉硅胶和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本发明下述实施例中使用的各种抗体均来源于商业途径的标准抗体。

实施例1抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体分子的载体构建

构建分别含抗人TNFα抗体(Adalimumab)的重链和轻链的XOGC表达载体，其中抗体可变区序列来源于https：//www.drugbank.ca/drugs/DB00051。轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；轻链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；重链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，氨基酸序列如SEQID NO：8所示。通过PCR的方法分别扩增轻链可变区以及轻链恒定区，重链可变区以及重链恒定区。本申请中所有PCR反应均使用NEB公司的Phusion超保真DNA聚合酶(F-530L)。PCR引物根据碱基互补原则以及酶切位点的需要进行常规设计。反应体系均为：H₂O 8.9μl，5×Phusion超保真DNA聚合酶缓冲液4μl，1mM dNTP 4μl，上游引物1μl，下游引物1μl，Phusion超保真DNA聚合酶0.1μl，模板1μl。将可变区及恒定区PCR产物，经1.5％琼脂糖凝胶电泳后用DNA回收试剂盒(Promega，A9282，下同)回收相应片段。以回收的可变区片段与恒定区片段作为模板，使用可变区上游引物及恒定区下游引物，再进行一轮PCR反应，然后再回收相应片段，得到重链和轻链的全长片段。将X0GC载体及全长片段，用EcoRI(NEB，货号R3101L)及HindIII(NEB，货号R3104L)酶切，酶切反应体系为：10×缓冲液32μl，EcoRI及HindIII各0.5μl，胶回收获得的全长片段3μl，H₂O 14.5μl。酶切体系于37℃条件下反应3小时。将酶切产物用T4DNA连接酶(NEB，货号M0202V)连接(下同)，反应体系为：10×连接酶缓冲液2μl，连接酶0.5μl，胶回收获得的全长片段3μl，胶回收获得的X0GC载体3μl，H₂O 11.5μl。连接于室温反应12小时。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(天根，CB104，下同)。获得含抗体重链和轻链的X0GC表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗体的重链和轻链。

分别构建含抗人IL-17A抗体(BJHM)的重链和轻链的X0GC表达载体，其中抗体可变区序列来源于专利申请：WO2018050028。轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；轻链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；重链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。获得含抗体重链和轻链的XOGC表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗体的重链和轻链。

实施例2抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体分子的表达

分别将含抗人或小鼠TNFα抗体的重链和轻链的表达载体转染ExpiCHO细胞(ExpiCHO^TM Cells，货号A29127，invitrogen)，另外分别将含抗人或小鼠IL-17A抗体的重链和轻链的表达载体也转染ExpiCHO细胞。转染前一天接种细胞，接种密度为3.5×10⁶细胞/mL。转染当天用新鲜的ExpiCHO表达培养基(ExpiCHO^TM Expression Medium，货号A29100-01，invitrogen)将细胞稀释，稀释密度为6×10⁶细胞/mL。按照转染体积取出质粒，质粒的终浓度为0.5ug/ml，用OptiPRO^TMSFM培养基(OptiPRO^TMSFM，货号12309-019，invitrogen)将质粒稀释至转染体积的4％，颠倒混匀。取出6.4倍质粒量的ExpiFectamine^TM转染试剂(ExpiFectamine^TMCHO Transfection Kit，货号A29129，invitrogen)，用OptiPRO^TMSFM培养基将转染试剂稀释至转染体积的4％，颠倒混匀。将稀释后的转染试剂加入到稀释的质粒中，轻轻混匀，室温静置1～5min，慢慢滴加到细胞中。之后放入细胞培养箱(CO₂浓度为8％)，120rpm摇床37℃培养20小时。向细胞中慢慢滴加0.006倍转染体积的ExpiCHO^TMEnhancer(ExpiFectamine^TMCHO Transfection Kit，货号A29129，invitrogen)和0.24倍转染体积的ExpiCHO^TMFeed(ExpiCHO^TMFeed，货号A29101-02，invitrogen)。放入120rpm摇床32℃培养。离心收集转染10天的细胞培养上清。

通过ELISA的方法测定表达量。在应用层析柱纯化之前，以0.2μm滤膜过滤以去除沉淀物。此步骤在4℃下进行。

实施例3.抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体分子表达产物的纯化

采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(GE Healthcare)以及亲和色谱柱Mabselect SuRe(16mm I.D.，27ml，GE Healthcare)于室温下进行纯化。首先以流动相A(20mM磷酸钠缓冲液，pH 7.4)平衡色谱柱，在基线稳定后将经过上述处理的细胞上清液进行上样，流速为5ml/min，并在上样后以流动相A进行平衡。样品分别为实施例2中表达的抗TNFα表达产物和抗IL-17A表达产物。之后，首先以流动相B1(含有1M氯化钠的流动相A)冲洗3个柱体积，然后以平衡液A(20mM磷酸钠缓冲液，pH 7.4)冲洗1个柱体积；最后以流动相B2(100mM甘氨酸，10mM氯化钠pH 3.3)洗脱5个柱体积，收集洗脱峰即为目的蛋白峰；以上洗脱步骤流速都为5ml/min。抗TNFα的洗脱峰色谱图如图1的A图所示，抗IL-17A的洗脱峰色谱图如图1的B图所示。收集标示的洗脱峰(图示灰色区域)，并通过滴加1M Tris溶液将pH调至7.0。

实施例4.抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体分子的纯化

抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体分子的结构如图2所示。

将上述实施例3中通过Mabselect SuRe(16mm I.D.，27ml，GE Healthcare)柱纯化获得的抗TNFα和抗IL-17A表达产物，进行体外重组以获得异源二聚体。首先将上述纯化收集的蛋白溶液通过超滤浓缩管超滤浓缩(标称截留分子量10kDa)，将溶液置换为磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)PBS(pH＝7.4)。将获得的抗TNFα和抗IL-17A表达产物分别加所述PBS调整到1mg/ml，加入1/200倍终体积的1M DTT，DTT终浓度分别为5mM，在4℃条件下进行还原(3-8小时)，通过还原的过程，二硫键被打开，抗TNFα和抗IL-17A表达产物中含有的少量的抗体同源二聚体分子的铰链区二硫键也打开，形成了含有一条重链和一条轻链的半抗体分子，结构如图3所示。还原的样品经流动相缓冲液中包含1mM DTT还原剂的SEC-HPLC分析，结果如图4的A图和图4的B图所示，抗TNFα和抗IL-17A同源二聚体分子重量比例均小于10％，相应地半抗体分子重量比例均大于90％。

然后将还原的抗TNFα和抗IL-17A半抗体分子等摩尔比例混合，在4℃条件下进行重组反应24小时，在重组的过程中，抗TNFα和抗IL-17A半抗体分子通过CH2/CH3的非共价作用力形成了同时含有抗TNFα和抗IL-17A半抗体分子的异源二聚体形式的双特异抗体，之后将蛋白溶液通过超滤浓缩管超滤浓缩(标称截留分子量10kDa)，将溶液置换为磷酸盐溶液(PBS，pH＝7.4)终止还原，通过空气或者氧化剂进行氧化反应，使异源二聚体的双特异抗体的二硫键重新形成。氧化反应的条件为加入氧化剂100mM L-脱氢抗坏血酸，蛋白终浓度1mg/ml，氧化剂终浓度1mM，在4℃条件下进行氧化，反应进行24小时。将上述氧化反应获得的样品进行毛细管电泳分析，结果如图5所示。

上述抗TNFα和抗IL-17A半抗体分子经还原氧化得到的异源二聚体分子通过超滤浓缩管超滤浓缩(标称截留分子量10kDa)，将溶液置换为10mM磷酸钠缓冲液，pH 5.8。采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(GE Healthcare)以及离子色谱柱Source 15S(10mmI.D.，2ml，GE Healthcare)于4℃下进行纯化。首先以流动相A(10mM磷酸钠，pH 7.0)平衡色谱柱，在基线稳定后将经过上述处理的蛋白溶液进行上样，流速为1ml/min，并在上样后以流动相A进行平衡，之后以A(10mM磷酸钠，pH 5.8)到B(10mM磷酸钠，pH 5.8)梯度冲洗20个柱体积(0％B-100％B，80min，流速0.5ml/min)，收集洗脱主峰(如图6)，收集的蛋白溶液通过超滤浓缩管超滤浓缩(标称截留分子量10kDa)，将溶液置换为磷酸盐溶液(PBS，pH＝7.4)，过滤除菌4℃保存。将该抗人TNFα/抗人IL-17A异源二聚体抗体命名为BH1657。将纯化产物通过毛细管电泳方法分析，结果如图7所示。经SEC-HPLC纯度分析，结果如图8所示，纯度为99.9％。

实施例5.抗小鼠TNFα/抗小鼠IL-17A异源二聚体抗体分子的制备

按照实施例1-4所述的方法，本发明同时分别构建了含抗小鼠TNFα的抗体重链和轻链(其重链和轻链可变区序列从分泌大鼠抗小鼠TNFα抗体的V1q杂交瘤细胞中克隆而获得(Echtenacher等人，J.Immunol.145：3762-3766(1990))的X0GC表达载体，以及含抗小鼠IL-17A的抗体重链和轻链(其重链和轻链可变区序列来源于专利US7846443，1D10)的X0GC表达载体。抗小鼠TNFα抗体的轻链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；重链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。抗小鼠IL-17A抗体的轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，氨基酸序列如SEQID NO：16所示；轻链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示；重链恒定区核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。然后获得含这些抗体重链和轻链的X0GC表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗体的重链和轻链。然后经表达纯化获得抗小鼠TNFα/抗小鼠IL-17A异源二聚体抗体，命名为BH1654，其纯度与BH1657类似(数据未显示)。

实施例6.抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体分子的稳定性

将通过实施例4获得的充分密封的1mg/mL抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体(BH1657)样品放置于40℃恒温箱(博讯生化培养箱BSP-400)，在相应时间点(基线(第0周)、第1周、第4周、第6周、第8周)取10μg样品进行高效排阻液相色谱(SEC-HPLC)分离。上述SEC-HPLC条件如下：(1)排阻色谱柱：waters xbridge BHE200 3.5um，7.8mm×30cm；(2)流动相：0.1M PB pH6.7+0.1M Na₂SO₄，pH 6.7；(3)流速：0.6mL/min；(4)紫外检测波长：280nm；(5)采集时间：40min。所用仪器是Agilent 1200 Infinity色谱仪，利用Agilent ChemStation记录图谱并计算剩余单体的比例。如表1所示，在40℃实验条件下，主峰比例变化较小，故认为所述抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体具备较好的热稳定性。

表1.抗TNFα/抗IL-17异源二聚体的稳定性

实施例7.抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体的靶点结合活性

用Biacore X100仪器来测定抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体(BH1657)与其抗原TNFα和IL-17A结合的动力学常数。该仪器利用光学的表面等离子体共振技术来检测偶联包被在生物芯片上的分子与待测分子之间的结合和解离。所用的主要试剂为ProteinA芯片(GE Healthcare，29-1275-57)。实验过程简介如下：将BH1657样品以及对照品(抗TNFα单抗和抗IL-17A单抗)、人TNFα和人IL-17A分别稀释于1x HBS-EP+溶液(10mM HEPES，150mMNaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20，pH7.4)。在捕获结合阶段，将浓度为1μg/mL的BH1657样品或者对照品以10μL/min的速度注入60秒；在结合阶段，将不同浓度的人TNFα和溶剂对照(1x HBS-EP+溶液)分别以30μL/min的速度注入120秒，或者将不同浓度的人IL-17A和溶剂对照分别以30μL/min的速度注入60秒；在解离阶段，用1x HBS-EP+溶液以10μL/min的速度注入1800秒。再生条件为10mM甘氨酸盐溶液，pH 1.5。结合动力学常数和解离动力学常数通过Biacore X100 control software来进行分析计算

BH1657和人TNFα以及人IL-17A的结合动力学常数、解离动力学常数和平衡解离常数分别见表2和表3。结果显示抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体保持了跟母本单抗一致的抗原结合活性。

表2.BH1657与人TNFα结合的动力学常数

表3.BH1657与人IL-17A结合的动力学常数

用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体BH1657与不同种属单个抗原的结合能力。

具体实施过程如下：用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被重组人TNFα，猴子TNFα，人IL-17A，猴子IL-17A(均购自北京义翘神州)，包被浓度为1μg/mL，每孔100μL，包被在4℃过夜进行。PBST洗涤5次。用含1％BSA的PBST按300μL/孔封闭，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入序列稀释在含1％BSA的PBST里的BH1657样品以及对照，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。然后加入1∶10000稀释在含1％BSA的PBST里的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(Chemicon，货号AP309P)，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10分钟。加入1M H₂SO₄，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。

BH1657和不同种属TNFα、不同种属IL-17A的结合能力见表4。抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体具有良好的人TNFα，猴子TNFα，人IL-17A，猴子IL-17A的结合力，跟母本单抗活性相似。

表4.BH1657与人和猴TNFα和IL-17A的结合

实施例8.抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体的体外中和活性

人包皮成纤维细胞HFF-1在TNFα或者IL-17A的刺激下能分泌一系列细胞因子和趋化因子，用此细胞来测定抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体BH1657对其靶点的中和活性。

TNFα中和活性：将BH1657样品以及对照样品序列稀释于含15％FBS(Hyclone，货号SH30084.03)的DMEM(GIBCO，货号11995-073)完全培养基中，每孔50μL，加入细胞培养板中。再向细胞培养板中加入稀释于相同完全培养基的浓度为2ng/mL(终浓度0.5ng/mL)的人TNFα，每孔50μL。在37℃，5％CO₂培养箱中孵育1小时。然后将HFF-1细胞(ATCC，货号SCRC-1041)重悬在完全培养基中，接种到96孔细胞培养板内，100μL每孔，每孔5000个细胞。细胞在37℃，5％CO₂培养箱中孵育培养24小时。孵育结束后，将细胞培养板250g离心5分钟，取出培养上清，用人IL-6ELISA试剂盒(R&D systems，货号S6050)，按说明书测定人IL-6的水平。结果如图9的A图所示，BH1657显著抑制TNFα诱导的IL-6分泌，显示了良好的TNFα中和活性，略微弱于其双价抗TNFα母本单抗。

IL-17A中和活性：将BH1657样品以及对照样品序列稀释于含15％FBS(Hyclone，货号SH30084.03)的DMEM(GIBCO，货号11995-073)完全培养基中，每孔50μL，加入细胞培养板中。再向细胞培养板中加入稀释于相同完全培养基的浓度为20ng/mL(终浓度5ng/mL)的人IL-17A，每孔50μL。在37℃，5％CO₂培养箱中孵育1小时。然后将HFF-1细胞重悬在完全培养基中，接种到96孔细胞培养板内，100μL每孔，每孔5000个细胞。细胞在37℃，5％CO₂培养箱中孵育培养24小时。孵育结束后，将细胞培养板250g离心5分钟，取出培养上清，用人IL-6ELISA试剂盒(R&D systems，货号S6050)，按说明书测定人IL-6的水平。结果如图9的B图所示，BH1657显著抑制IL-17A诱导的IL-6分泌，显示了良好的IL-17A中和活性，略微弱于其双价抗IL-17A母本单抗。

TNFα和IL-17A在HFF-1上具有协同作用。测定TNFα、IL-17A共同存在时的中和活性：将BH1657样品以及对照样品序列稀释于含15％FBS(Hyclone，货号SH30084.03)的DMEM(GIBCO，货号11995-073)完全培养基中，每孔50μL，加入细胞培养板中。再向细胞培养板中加入稀释于相同完全培养基的浓度为2ng/mL(终浓度0.5ng/mL)的人TNFα和10ng/mL(终浓度2.5ng/mL)的人IL-17A，每孔50μL。在37℃，5％CO₂培养箱中孵育1小时。然后将HFF-1细胞重悬在完全培养基中，接种到96孔细胞培养板内，100μL每孔，每孔5000个细胞。细胞在37℃，5％CO₂培养箱中孵育培养24小时。孵育结束后，将细胞培养板250g离心5分钟，取出培养上清，用人IL-6ELISA试剂盒(R&D systems，货号S6050)，按说明书测定人IL-6的水平。结果如图9的C图所示，BH1657显著抑制TNFα和IL-17A协同刺激HFF-1的IL-6分泌，在高浓度能完全抑制IL-6的水平，强于其双价母本单抗。

实施例9.抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体的抗TNFα活性受IL-17A存在与否的影响

用ELISA测定IL-17A对抗TNFα/IL-17A异源二聚体抗体BH1657的TNFα/TNFR2封闭活性的影响。具体实施过程如下：用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被重组人TNFα(购自北京义翘神州)，包被浓度为1μg/mL，每孔100μL，包被在4℃过夜进行。PBST洗涤5次。用含1％BSA的PBST按300μL/孔封闭，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入序列稀释在含1％BSA的PBST里的BH1657样品以及对照25μL，人IL-17A(购自北京义翘神州)25μL(16μg/mL，终浓度4μg/mL)，生物素标记的TNFR2-Fc(购自北京义翘神州)50μL(0.3μg/mL，终浓度0.15μg/mL)，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。然后加入1∶1000稀释在含1％BSA的PBST里的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(BD，货号554066)，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10分钟。加入1M H₂SO₄，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。结果如图10的A图所示，在没有IL-17A存在时，TNFα/TNFR2封闭活性较母本单抗有所下降；在有IL-17A存在时，活性增强，与母本单抗相当。抗TNFα母本单抗的TNFα/TNFR2封闭活性不受IL-17A的影响。

用L-929细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心)测定IL-17A对抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体BH1657的TNFα中和活性的影响。具体实施过程如下：L-929细胞的完全培养基为含10％FBS(Hyclone，货号SH30084.03)的MEM(GIBCO，货号10370-021)培养基。将L-929细胞重悬于完全培养基中，接种于96孔细胞培养板，100μL每孔，每孔15000个细胞。细胞在37℃，5％CO₂培养箱中孵育培养过夜。弃去培养上清，将BH1657样品以及对照样品序列稀释于含2ng/mL人TNFα和1μg/mL放线菌素D的完全培养基中，每孔100μL，加入细胞培养板中。细胞在37℃，5％CO₂培养箱中继续孵育培养24小时。在孵育终点，向细胞培养板每孔中加入20μL的MTS(CellTiter96 Aqueous One Solution，Promega，货号：G358B)来检测细胞活力。结果如图10的B图所示，在有IL-17A存在时，抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体形式双特异抗体中抗TNFα部分的TNFα中和活性较无IL-17A存在时明显增强。抗TNFα/抗IL-17A双特异抗体的这种活性差异，提示了其在IL-17A高水平的病灶部位具有更强的TNFα中和活性，而在IL-17A低水平的循环系统中表现较弱的TNFα中和活性，从而表明该双特异抗体在有效治疗疾病的同时保持较低的毒副作用。

实施例10.抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体的体内中和活性

实验材料选用雌性BALB/c小鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。小鼠适应环境一周后，随机分组，每组6只。各组分别给予抗TNFα/IL-17A异源二聚体抗体BH1657，抗TNFα单抗，抗IL-17A单抗，以及抗TNFα单抗和抗IL-17A单抗的组合，三个剂量水平(单抗为0.1mg/kg，1mg/kg，10mg/kg，双特异抗体为0.2mg/kg，2mg/kg，20mg/kg)，静脉注射，单次给药。在给药1小时后，皮下注射人TNFα和IL-17A，每只小鼠0.2μg TNFα和20μgIL-17A。在2小时之后，眼眶采血，不予抗凝，室温放置血样30分钟至1个小时，待凝血后，3000rpm离心10分钟，得到血清样品。采用小鼠CXCL1ELISA试剂盒(RayBiotech，货号ELM-KC)，按说明书测定血清中小鼠CXCL1的浓度。

结果如图11所示，BH1657显著抑制TNFα和IL-17A协同刺激小鼠的CXCL1分泌，在高浓度能完全抑制CXCL1的水平，强于其双价母本单抗。

实施例11.抗小鼠TNFα/抗小鼠IL-17A异源二聚体抗体的靶点结合活性

用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗小鼠TNFα/抗小鼠IL-17A异源二聚体抗体(即BH1654)与不同种属单个抗原的结合能力。具体实施过程如下：用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被重组小鼠TNFα，大鼠TNFα，小鼠IL-17A，大鼠IL-17A(均购自北京义翘神州)，包被浓度为1μg/mL，每孔100μL，包被在4℃过夜进行。PBST洗涤5次。用含1％BSA的PBST按300μL/孔封闭，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入序列稀释在含1％BSA的PBST里的BH1654样品以及对照品(抗小鼠TNFα单抗和抗小鼠IL-17A单抗)，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。然后加入1∶10000稀释在含1％BSA的PBST里的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(Chemicon，货号AP309P)，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10分钟。加入1M H₂SO₄，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。

BH1654和不同种属TNFα以及不同种属IL-17A的结合能力见表5。抗小鼠TNFα/抗小鼠IL-17A异源二聚体具有良好的小鼠TNFα及小鼠IL-17A结合力，跟母本单抗活性相似。与大鼠TNFα不结合，与大鼠IL-17A结合弱。

表5.BH1654与小鼠及大鼠TNFα和IL-17A的结合

实施例12.抗小鼠TNFα/抗小鼠IL-17A异源二聚体抗体在II型胶原诱导的小鼠关节炎(mCIA)模型中的药效研究

小鼠CIA模型能较好的模拟人类类风湿性疾病和预测药物在人类此种疾病上的疗效，广泛应用于类风湿性关节炎发病机制研究和治疗药物筛选。实验动物选用8周龄雄性DBA1/J小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，适用环境一周后，随机选取5只小鼠作为正常对照小鼠，其余小鼠用于建立小鼠CIA模型。小鼠经初次免疫和加强免疫得到CIA模型。初次免疫使用70μg II型牛胶原(Chondrex，货号20022)与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich，货号F5881)混合形成乳液，于小鼠尾根部皮内注射。三周以后，进行加强免疫。加强免疫使用70μg II型牛胶原与弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich，货号F5506)混合形成乳液，于小鼠背部皮内注射。在加强免疫后观察到小鼠四肢足爪红肿等临床性关节炎症状之后，进行分组，每组8只。

对CIA模型小鼠各组分别给药。分别给予药物溶媒(PBS)、抗小鼠TNFα单抗(70nmol/kg)、抗小鼠IL-17A单抗(70nmol/kg)、抗小鼠TNFα单抗和抗小鼠IL-17A单抗的组合(70nmol/kg+70nmol/kg)、抗小鼠TNFα/小鼠IL-17A异源二聚体抗体BH1654(70nmol/kg，140nmol/kg)，每两天给药一次，腹腔注射，共给药7次。给药后，每两天称量一次体重，观察前后四肢足爪病变情况，并进行关节炎指数评分：0＝无红肿，1＝踝关节或者跗骨关节有红斑、轻微肿胀，2＝从踝关节到跗骨关节均有红斑、轻微肿胀，3＝从踝关节到跖骨关节均有红斑、中等程度肿胀，4＝踝关节、足爪包括趾骨关节均有红斑、严重程度肿胀或者四肢关节僵硬，小鼠四肢都给予炎症评分，每只鼠的最大评分为16分。

实验结果如图12所示，正常对照组小鼠没有产生炎症反应，溶媒组的CIA模型小鼠产生明显炎症反应、关节炎指数增长迅速，抗小鼠TNFα/抗小鼠IL-17A异源二聚体抗体BH1654给药组的CIA模型小鼠关节炎指数得到了明显的抑制，显示出了比抗小鼠TNFα单抗、抗小鼠IL-17A单抗更好的炎症缓解效果。

实施例13.抗小鼠TNFα/抗小鼠IL-17A异源二聚体抗体在葡萄糖-6-磷酸异构酶诱导的小鼠关节炎(mGPI)模型中的药效研究

小鼠GPI模型是用葡萄糖-6-磷酸异构酶(Glucose-6-phosphate isomerase，GPI)或者其325-339肽段(GPI_325-339)来免疫小鼠而建立。此模型是近年来发展起来的动物模型，被认为能较好的模拟人类类风湿性疾病，适合应用于类风湿性关节炎发病机制研究和治疗药物筛选。实验动物选用8周龄雄性DBA1/J小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，适用环境一周后，随机选取5只小鼠作为正常对照小鼠，其余小鼠用于建立小鼠GPI模型。小鼠经一次免疫得到GPI模型。免疫使用100μg GPI_325-339(韩美药品化学组合成，氨基酸序列为IWYINCFGCETHAML(SEQ ID No：19))与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich，货号F5881)混合形成乳液，于小鼠尾根部皮内注射。免疫第1天(当天)以及第3天腹腔注射百日咳毒素(Merck，货号516560)。免疫之后第5天，随机进行分组，每组8只。

对GPI模型小鼠各组分别预防性给药。分别给予药物溶媒(PBS)、抗小鼠TNFα单抗(35nmol/kg)、抗小鼠IL-17A单抗(35nmol/kg)、抗小鼠TNFα单抗和抗小鼠IL-17A单抗的组合(35nmol/kg+35nmol/kg)、抗小鼠TNFα/小鼠IL-17A异源二聚体抗体BH1654(35nmol/kg，70nmol/kg)，每两天腹腔注射给药一次，共给药7次。给药后，每天称量一次体重，观察前后四肢足爪病变情况，并进行关节炎指数评分：0＝无红肿，1＝踝关节或者跗骨关节有红斑、轻微肿胀，2＝从踝关节到跗骨关节均有红斑、轻微肿胀，3＝从踝关节到跖骨关节均有红斑、中等程度肿胀，4＝踝关节、足爪包括趾骨关节均有红斑、严重程度肿胀或者四肢关节僵硬，小鼠四肢都给予炎症评分，每只鼠的最大评分为16分。

实验结果如图13所示，正常对照组小鼠没有产生炎症反应，溶媒组的GPI模型小鼠产生明显炎症反应，抗小鼠TNFα/小鼠IL-17A异源二聚体抗体BH1654在35nmol/kg、70nmol/kg均显示出了良好的抗炎效果，且具有剂量依赖性。BH1654的炎症缓解效果强于抗小鼠TNFα单抗、抗小鼠IL-17A单抗。

实施例14.抗小鼠TNFα/抗小鼠IL-17A异源二聚体抗体在酵母聚糖诱导的SKG小鼠银屑病性关节炎(PsA)模型中的药效研究

小鼠银屑病性关节炎模型用酵母聚糖(zymosan，一种葡聚糖)免疫SKG小鼠而建立。此模型是近年来发展起来的模拟人类脊柱关节炎(spondyloarthritis，一类免疫疾病，包含强直性脊柱炎、银屑病性关节炎等)的动物模型，本实施例将其用于银屑病性关节炎治疗药物的评价。实验动物选用9至10周龄雌性SKG/Jcl小鼠(购自CLEA Japan)，适应环境一周后，随机选取4只小鼠作为正常对照小鼠，其余小鼠用于建立小鼠PsA模型。小鼠经一次免疫得到PsA模型，免疫使用溶于PBS缓冲溶液的3mg酵母聚糖(购自Sigma-Alrich公司，货号Z4250)，腹腔注射。免疫之后第12天，随机进行分组，每组8只。

对各组PsA模型小鼠分别预防性给药。分别给予药物溶媒(PBS)、抗小鼠TNFα单抗(35nmol/kg)、抗小鼠IL-17A单抗(35nmol/kg)、抗小鼠TNFα/小鼠IL-17A异源二聚体抗体BH1654(70nmol/kg)，每周腹腔注射给药两次，共给药8次。给药后，每周两次称量体重，观察前后四肢足爪病变情况，并进行关节炎指数评分：0分：无关节脚趾肿胀等异常现象。0.1分：脚趾有红肿现象，一趾记为0.1分。0.5分：踝关节有轻微肿胀，踝关节外侧最先开始发病。1分：踝关节有明显的肿胀产生。1.5分：为程度分，踝关节有明显的肿胀产生，并有向脚趾蔓延的趋势，且肿胀程度明显大于1分小于2分。2分：踝关节产生中等程度的肿胀，肿胀继续向脚趾蔓延，但未肿至趾关节。2.5：为程度分，肿胀程度明显大于2分，但未肿至趾关节。3分：从踝关节至趾关节产生严重的肿胀。关节肿胀严重最高记为3分，此时一般伴随着严重的脚趾肿胀。此评分系统将关节肿胀和脚趾肿胀分开评价，关节肿胀以0.5分的肿胀程度叠加，脚趾以每脚趾0.1分标记。按关节评分+脚趾评分标记。

实验结果如图14所示，正常对照组小鼠没有产生炎症反应，溶媒组的PsA模型小鼠产生明显炎症反应，有银屑病和银屑病性关节炎症状，抗小鼠TNFα/小鼠IL-17A异源二聚体抗体BH1654在70nmol/kg显示出了良好的抗炎效果，而抗小鼠TNFα单抗、抗小鼠IL-17A单抗在此模型中基本没有抗炎效果。

实施例15.抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体对表达跨膜TNFα细胞的凋亡诱导作用

TNFα拮抗剂与跨膜TNFα结合后，可以通过跨膜TNFα介导的由外向内信号(outside-to-inside signaling)诱发表达跨膜TNFα的免疫细胞凋亡，且这种凋亡与TNFα拮抗剂引起的宿主防御下降相关。修美乐的凋亡诱导作用强于恩利，修美乐用药后的感染风险也高于恩利。本实施例涉及检测抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体BH1657的凋亡诱导作用。具体实施过程如下：参照文献(Arthritis&Rheumatism，2008，58(5)：1248-1257.)，在Jurkat细胞(细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)上构建表达跨膜TNFα的细胞系，命名为Jurkat/tmTNFα，并在含10％FBS(购自Hyclone，货号SH30084.03)的RPMI1640培养基(购自GIBCO，货号22400-089)中培养。实验当天，收集处于对数生长期的Jurkat/tmTNFα，重悬于含2％FBS的RPMI 1640培养基中，接种于12孔细胞培养板的孔中，每孔400000个细胞，1mL每孔。将待测样品序列稀释于含2％FBS的RPMI 1640培养基中，并加入12孔细胞培养板的孔中，1mL每孔。共同孵育24小时，然后收集细胞，用凋亡检测试剂盒(购自Sigma-Alrich，货号APOAF-50TST)染色细胞，染色方法参加试剂盒说明书。然后用流式细胞仪分析细胞的凋亡情况。

实验结果如表6所示。数据表明，修美乐诱导Jurkat/tmTNFα凋亡作用比较强，这可能是因为修美乐的抗TNFα为二价，可以交联不同的跨膜TNFα，诱发更强的由外向内的凋亡信号。而抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体BH1657的抗TNFα为单价，其凋亡诱导作用较弱，与恩利相当。由此推测，相较于修美乐，抗TNFα/抗IL-17A异源二聚体抗体可能具有较低的宿主抵抗抑制作用，从而可能具有更低的感染风险。

表6.BH1657在Jurkat/tmTNFα细胞上的凋亡诱导作用

序列表

<110> 北京韩美药品有限公司

<120> 抗TNFα/抗IL-17A天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备

<130> LZ1805868CN01

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial）

<220>

<223> 抗人TNFα抗体轻链可变区

<400> 1

gacatccaga tgacccaatc cccttcctcc ctcagcgcga gcgtcggaga cagggtgaca 60

atcacctgca gggcctccca gggaatccgg aactatctcg cctggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgct gccagcacac tccaatccgg cgtgccttcc 180

aggttctccg gaagcggatc cggcaccgac ttcaccctca ccatttccag cctgcagccc 240

gaagacgtcg ccacctacta ctgccagcgg tacaacaggg ccccctacac cttcggccaa 300

ggcaccaagg tcgagatcaa g 321

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial）

<220>

<223> 抗人TNFα抗体轻链可变区

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial）

<220>

<223> 抗人TNFα抗体轻链恒定区

<400> 3

aggaccgtgg ccgcccccag cgtgttcatc ttccctccct ccgacgagca gctgaagagc 60

ggcacagcca gcgtcgtgtg cctgctcaac aacttctacc ccagggaagc caaggtgcag 120

tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc aacagccagg agagcgtgac cgaacaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctgagctcc accctcaccc tgtccaaggc cgactacgag 240

aagcataagg tgtacgcctg cgaagtgacc catcagggcc tgtccagccc cgtgacaaag 300

tccttcaaca ggggcgaatg c 321

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial）

<220>

<223> 抗人TNFα抗体轻链恒定区

<400> 4

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 5

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial）

<220>

<223> 抗人TNFα抗体重链可变区

<400> 5

gaggtgcagc tggtggaatc cggaggagga ctggtccaac ctggcaggtc cctcaggctc 60

tcctgtgctg ccagcggctt taccttcgac gattacgcta tgcattgggt gcggcaagcc 120

cctggcaaag gactggaatg ggtgagcgcc attacctgga actccggcca catcgactac 180

gccgactccg tggagggccg gtttaccatt agccgggaca acgccaagaa ctccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgag ggctgaggac accgctgtgt actactgcgc caaggtgagc 300

tacctgtcca cagccagcag cctggattac tggggccagg gcaccctggt gacagtcagc 360

agc 363

<210> 6

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial）

<220>

<223> 抗人TNFα抗体重链可变区

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 7

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial）

<220>

<223> 抗人TNFα抗体重链恒定区

<400> 7

gctagcacaa aaggaccttc cgtgtttcca ctggcaccct ctagtaagag tacttcagga 60

ggaaccgcag cactgggatg tctggtgaag gactacttcc cagagcccgt caccgtgtct 120

tggaacagtg gagcactgac ctccggggtc catacatttc ctgccgtgct gcagtcatcc 180

ggtctgtata gcctgagctc tgtggtcaca gtcccaagtt catccctggg cacccagaca 240

tacatctgca acgtgaatca caaaccttcc aatactaagg tcgacaagaa agtggaaccc 300

aagtcctgcg ataagaccca cacatgccct ccctgtcctg ctcccgaact gctgggagga 360

ccctccgtct tcctgttccc ccccaagccc aaagacacac tgatgatcag caggacccct 420

gaagtgacct gcgtggtcgt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtcaa gtttaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt ccacaacgcc aagaccaagc ccagggagga gcagtacaac 540

agcacctaca gggtcgtgtc cgtgctgacc gtgctccacc aagattggct caacggcaag 600

gagtataagt gcaaagtcag caacaaggcc ctccccgccc ccatcgagaa aaccatcagc 660

aaggccaagg gccaaccgcg ggaacctcaa gtgtataccc tccctcccag ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaagtctc cctcttgtgc ctggtcaagg gattctaccc ttccgacatt 780

gccgtcgaat gggagagcaa tggccagccc gagaacaact acaagacaac cccccccgtc 840

ctgcgcagcg acggatcctt cttcctgtac tccaagctca ccgtggacaa gagccggtgg 900

caacagggca acgtgttctc ctgtagcgtg atgcacgaag ccctccacaa ccactatacc 960

cagaagagcc tgagcctcag ccccggcaaa 990

<210> 8

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial）

<220>

<223> 抗人TNFα抗体重链恒定区

<400> 8

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Arg Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 9

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial）

<220>

<223> 抗人IL-17抗体轻链可变区

<400> 9

atcatcgtca tgacccagtc ccccctgtcc ctgcctgtga cactgggcca gcctgcctcc 60

atctcctgca ggtcctccca gagcctggtg cacagcaacg gcaacaccta cctgcactgg 120

tatcaacaga ggcctggcca gagccctagg ctgctgatct acaaggtgta caaccggttc 180

tccggcgtgc ctgacaggtt ctccggcagc ggttctggca ccgacttcac cctgaagatc 240

tccagggtgg aggccgagga tgtgggcgtg tacttctgca gccagtccac ccacttccct 300

accttcggcc agggcaccag gctggagatc aag 333

<210> 10

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial）

<220>

<223> 抗人IL-17抗体轻链可变区

<400> 10

Ile Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Tyr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Phe Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 11

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial）

<220>

<223> 抗人IL-17抗体重链可变区

<400> 11

caggtgcagg tgcaggaatc cggccctgga ctggtgaagc cctccgagac cctgtccctg 60

acctgtaccg tgtccggcaa ctccatcacc tcctactacg cctggaactg gatcaggcag 120

cctcccggaa agggcctgga gtggatgggc tacatcacct actccggcac cacctcctac 180

aacccttccc tgaagagccg gatcaccatc agcgtggaca cctccaagaa ccagttctcc 240

ctgaaactgt cctccgtgac agccgccgat accgccgtgt actactgcgc ccgggaggag 300

tacgacgaca tctacgccgt ggactactgg ggccagggca cactggtgac cgtgtcctcc 360

<210> 12

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial）

<220>

<223> 抗人IL-17抗体重链可变区

<400> 12

Gln Val Gln Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asn Ser Ile Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Glu Tyr Asp Asp Ile Tyr Ala Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 13

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial）

<220>

<223> 抗人IL-17抗体重链恒定区

<400> 13

gctagcacaa aaggaccttc cgtgtttcca ctggcaccct ctagtaagag tacttcagga 60

ggaaccgcag cactgggatg tctggtgaag gactacttcc cagagcccgt caccgtgtct 120

tggaacagtg gagcactgac ctccggggtc catacatttc ctgccgtgct gcagtcatcc 180

ggtctgtata gcctgagctc tgtggtcaca gtcccaagtt catccctggg cacccagaca 240

tacatctgca acgtgaatca caaaccttcc aatactaagg tcgacaagaa agtggaaccc 300

aagtcctgcg ataagaccca cacatgcccc ccttgtcctg cccctgaact gctcggaggc 360

cctagcgtgt tcctcttccc tcccaaaccc aaggacaccc tcatgatctc caggacccct 420

gaggtgacct gcgtcgtggt ggacgtcagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtcgaggt ccacaacgcc aagacaaagc ccagggagga acagtacaac 540

agcacctaca gggtggtcag cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct caacggcaag 600

gagtacaagt gcaaagtctc caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatctcc 660

aaggctaagg gacagcccag ggagccccaa gtgtacaccg agcctcccag ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaagtctc cctcacctgc ctggtcaagg gattctaccc ttccgacatt 780

gccgtcgaat gggagagcaa tggccagccc gagaacaact acaagacaac cccccccgtc 840

ctggatagcg acggatcctt cttcctgctc tccgtgctca ccgtcgacaa gagcagatgg 900

cagcagggca acgtgttcag ctgtagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 960

cagaagagcc tgtccctcag ccccggcaag 990

<210> 14

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial）

<220>

<223> 抗人IL-17抗体重链恒定区

<400> 14

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Glu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Leu Ser Val Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 15

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial）

<220>

<223> 抗小鼠IL-17A抗体轻链可变区

<400> 15

gacatccaga tgacacagtc ccccagcttc ctgagcgcta gcgtgggaga gagggtgacc 60

ctgagctgca aggccagcca gaacatcaac aagtacctgg actggttcca gcagaagctg 120

ggcgaagccc ccaagctgct gatctacaac gccgacaacc tccataccgg cattcccagc 180

aggttcagcg gctccggctc cttcagcgac ttcatcctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggatgacg ccacctactt ctgcctgcag agggaatcct ggccttacac cttcggcgcc 300

ggcaccaagc tggaactgaa g 321

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial）

<220>

<223> 抗小鼠IL-17A抗体轻链可变区

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Leu Asp Trp Phe Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Asp Asn Leu His Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Phe Ser Asp Phe Ile Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Arg Glu Ser Trp Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 17

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial）

<220>

<223> 抗小鼠IL-17A抗体重链可变区

<400> 17

caggtgcaac tgaaggagag cggccccgga ctggtgcaac cttcccaaac actcagcctc 60

acctgtaccg tctccggatt ctccctgacc aactattacg tccactgggt cagacagcct 120

cccggcaagg gactggagtg gatgggaggc gtgtggaatg acggcgacac ctcctacaac 180

agcgtcctca ggagcagact gagcattacc agagacacca gcaagagcca ggtcctcctc 240

aagatgtcct ccctccagac agaagacacc gccacctatt actgcgccag ggaaggcagg 300

gaaggcttcg tcggctacta tgtgatggat gcttggggcc ctggagctag cgtgacagtg 360

agctcc 366

<210> 18

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial）

<220>

<223> 抗小鼠IL-17A抗体重链可变区

<400> 18

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Val Trp Asn Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Arg

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Leu Leu

65 70 75 80

Lys Met Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Gly Arg Glu Gly Phe Val Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp

100 105 110

Gly Pro Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial）

<220>

<223> GPI325-339

<400> 19

Ile Trp Tyr Ile Asn Cys Phe Gly Cys Glu Thr His Ala Met Leu

1 5 10 15

Claims (27)

1.一种异源二聚体形式的双特异抗体，其包含第一Fc链和第二Fc链，以及能与TNFα特异性结合的第一个抗原结合功能区和能与IL-17A特异性结合的第二个抗原结合功能区；

其中所述第一Fc链和第二Fc链均为包含氨基酸替换的免疫球蛋白G Fc片段，并且所述第一Fc链及第二Fc链共同构成可以与Fc受体结合的异源二聚体；

其中所述第一Fc链和第二Fc链通过共价键或连接体分别连接到所述第一抗原结合功能区和第二抗原结合功能区；

并且其中第一抗原结合功能区和第一Fc链包含SEQ ID NO:2和6以及4和8的氨基酸序列，第二抗原结合功能区和第二Fc链包含SEQ ID NO:10和12以及4和14的氨基酸序列。

2.一种分离的多核苷酸，其编码如权利要求1所述的异源二聚体形式的双特异抗体。

3.如权利要求2所述的分离的多核苷酸，其中编码第一抗原结合功能区氨基酸的核苷酸序列选自：SEQ ID NO:1和5。

4.如权利要求2所述的分离的多核苷酸，其中编码第二抗原结合功能区氨基酸的核苷酸序列选自：SEQ ID NO:9和11。

5.如权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中编码第一Fc链的核苷酸序列选自：SEQ IDNO:3和7。

6.如权利要求4所述的分离的多核苷酸，其中编码第二Fc链的核苷酸序列选自：SEQ IDNO:3和13。

7.一种重组表达载体，其包含权利要求2-6任一项所述的分离的多核苷酸。

8.如权利要求7所述的重组表达载体，其中表达载体为基于pCDNA改造得到的质粒载体X0GC。

9.一种宿主细胞，其包含权利要求2-6任一项所述的分离的多核苷酸，或权利要求7或8所述的重组表达载体。

10.如权利要求9所述的宿主细胞，其选自人胚肾细胞HEK293或以HEK293细胞为基础改造而得到的HEK293T、HEK293E、HEK293F；仓鼠卵巢细胞CHO或以CHO细胞为基础改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr-、CHO/DG44、ExpiCHO；大肠杆菌；酵母菌；昆虫细胞；植物细胞；哺乳动物体细胞。

11.如权利要求9所述的宿主细胞，其选自大肠杆菌BL21、BL21(DE3)、Rosetta和Origami。

12.如权利要求9所述的宿主细胞，其选自毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸克鲁维亚酵母和多形汉逊酵母。

13.如权利要求9所述的宿主细胞，其选自细胞High5和SF9。

14.如权利要求9所述的宿主细胞，其是哺乳动物乳腺细胞。

15.一种组合物，其包含权利要求1所述的异源二聚体形式的双特异抗体或权利要求2-6任一项所述的分离的多核苷酸或权利要求7或8所述的重组表达载体或权利要求9-14任一项所述的宿主细胞，及药学上可接受的载体。

16.一种生产如权利要求1所述的异源二聚体形式的双特异抗体的方法，其包括步骤：

1)将权利要求2-6任一项所述的分离的多核苷酸或权利要求7或8所述的重组表达载体分别在宿主细胞中进行表达；

2)将在宿主细胞中分别表达的蛋白进行还原；以及

3)将还原的蛋白混合，然后将混合物进行氧化。

17.如权利要求16所述的方法，其中宿主细胞选自人胚肾细胞HEK293或以HEK293细胞为基础改造而得到的HEK293T、HEK293F、HEK293F；仓鼠卵巢细胞CHO或以CHO细胞为基础改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr-、CHO/DG44、ExpiCHO；大肠杆菌；酵母菌；昆虫细胞；植物细胞；哺乳动物体细胞。

18.如权利要求16所述的方法，其中宿主细胞选自大肠杆菌BL21、BL21(DE3)、Rosetta和Origami。

19.如权利要求16所述的方法，其中宿主细胞选自毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸克鲁维亚酵母和多形汉逊酵母。

20.如权利要求16所述的方法，其中宿主细胞选自细胞High5和SF9。

21.如权利要求16所述的方法，其中宿主细胞是哺乳动物乳腺细胞。

22.如权利要求16-21任一项所述的方法，其中还原步骤包括：1)在还原剂存在下进行还原反应，所述还原剂选自：2-巯基乙胺、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦；2)去除还原剂。

23.如权利要求16-21任一项所述的方法，其中氧化步骤为在空气中氧化，也包括在氧化剂存在下进行氧化反应，所述氧化剂是L-脱氢抗坏血酸。

24.如权利要求16-21任一项所述的方法，其还包括分离纯化的步骤。

25.权利要求1所述的异源二聚体形式的双特异抗体和/或权利要求2-6任一项所述的分离的多核苷酸和/或权利要求7或8所述的重组表达载体和/或权利要求9-14任一项所述的宿主细胞和/或权利要求15所述的组合物在制备用于预防和/或治疗受试者疾病的药物中的用途，其中所述疾病选自：类风湿性关节炎、骨性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、痛风性关节炎、幼年类风湿性关节炎和化脓性关节炎。

26.如权利要求25所述的用途，其中受试者是哺乳动物。

27.如权利要求25所述的用途，其中受试者是人类受试者。

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