MX2009001620A - Anticuerpos para il-17a. - Google Patents

Abstract

Se proveen anticuerpos manipulados por ingeniería genética para IL-17A humano, así como también usos de éstos.

Description

ANTICUERPOS PARA IL-17A CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere en general a compuestos de adhesión específica a IL-17A, tales como anticuerpos, y a los usos de éstos. Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos quiméricos y humanizados que reconocen la IL-17A y modulan su actividad, particularmente en trastornos inflamatorios, autoinmunes y proliferativos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El sistema inmune funciona para proteger a los individuos contra agentes infecciosos, por ejemplo, bacterias, organismos multicelulares y virus así como también cánceres. Este sistema incluye varios tipos de células linfoides y mieloides tales como monocitos, macrófagos, células dendríticas (DC), eosinófilos, células T, células B y neutrófilos. Estas células linfoides y mieloides producen a menudo proteínas señalizadoras que se conocen como citocinas. La respuesta inmune incluye inflamación, es decir, la acumulación de células inmunes sistémicamente o en una localización particular del cuerpo. En respuesta a un agente infeccioso o a una sustancia extraña, las células inmunes secretan citocinas, las cuales, a su vez, modulan la proliferación, desarrollo, diferenciación o migración de células inmunes. La respuesta inmune puede producir consecuencias patológicas, por ejemplo, cuando involucra una inflamación excesiva, tal como ocurre en los trastornos autoinmunes (ver por ejemplo, Abbas et al. (eds.) (2000) Cellular y Molecular Immunology, W.B. Saunders Co., Filadelfia, PA; Oppenheim y Feldmann (eds.) (2001 ) Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, CA; von Andrian y Mackay (2000) New Engl. J. Med. 343:1020-1034; Davidson y Diamond (2001 ) New Engl. J. Med. 345:340-350). La interleucina-17A (IL-17A; conocida también como antígeno 8 asociado a Linfocitos T citotóxicos (CTLA8), IL-17) es una citocina homodimérica producida por las células T de la memoria que sigue el reconocimiento del antígeno. El desarrollo de dichas células T es promovido por la interleucina 23 (IL-23). McKenzie et al. (2006) Trends Immunol. 27(1 ):17-23; Langrish et al. (2005) J. Exp. Med. 201 (2):233-40. La IL-17A actúa a través de dos receptores, IL-17RA y IL-17RC para inducir la producción de numerosas moléculas que están involucradas en la biología de los neutrófilos, inflamación y destrucción de los órganos. Esta citocina se sinergiza con el factor de necrosis tisular (TNF) y o la interleucina 1 ß (IL-1 ß) para promover un ambiente pro-inflamatorio más grande. La antagonización de la actividad de IL-17A con anticuerpos o fragmentos de los anticuerpos de adhesión al antígeno, ha sido propuesta para el tratamiento de una variedad de trastornos inflamatorios, inmunes y proliferativos, que incluyen artritis reumatoidea (RA), osteoartritis, osteoporosis de artritis reumatoide, fibrosis inflamatoria (por ejemplo, escleroderma, fibrosis pulmonar y cirrosis), gingivitis, periodontitis u otras enfermedades periodontales inflamatorias, trastornos inflamatorios del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa y enfermedad inflamatoria del intestino), asma (incluyendo asma alérgico), alergias, enfermedades pulmonares obstructivas crónicas (COPD), esclerosis múltiple, psoriasis y cáncer. (Ver, por ejemplo, Patente Norteamericana 2003/0166862, WO 2005/108616, WO 2005/051422, y WO 2006/013107). La limitación más significativa en el uso de anticuerpos como agentes terapéuticos in vivo es la inmunogenicidad de los anticuerpos. Debido a que la mayoría de los anticuerpos monoclonales se deriva de roedores, el uso repetido en seres humanos da como resultado la generación de una respuesta inmune contra el anticuerpo terapéutico, por ejemplo, anticuerpos de ratón contra humanos o HA A. Dicha respuesta inmune da como resultado una pérdida de eficacia terapéutica como mínimo y una potencial respuesta anafiláctica fatal como máximo. Los esfuerzos iniciales para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos roedores, involucraron la producción de anticuerpos quiméricos, en los cuales las regiones variables de ratón (Fv) se fusionaron con regiones constantes humanas. Liu et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3439-43. Sin embargo, los ratones inyectados con híbridos de regiones variables humanas y regiones constantes de ratón desarrollaron una fuerte respuesta anti-anticuerpo dirigida contra la región variable humana, lo cual sugiere que la retención de la región Fv entera del roedor en dichos anticuerpos quiméricos puede dar todavía como resultado una inmunogenicidad indeseable en los pacientes. Generalmente se cree que los bucles de la región determinante de complementariedad (CDR) de los dominios variables comprenden el sitio de adhesión de las moléculas de anticuerpos. Por lo tanto, el injerto de bucles de CDR de roedores, sobre estructuras humanas (es decir, humanización) ha sido intentada para minimizar más las secuencias de roedores. Jones et al. (1986) Nature 321 :522; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534. Sin embargo, los intercambios de bucle CDR no dan aún como resultado uniforme, un anticuerpo con las mismas propiedades de adhesión que el anticuerpo de origen. A menudo se requieren cambios en los residuos estructurales (FR), residuos que están involucrados en el soporte del bucle CDR, en anticuerpos humanizados para preservar la afinidad de adhesión al antígeno. Kabat et al. (1991 ) J. Immunol. 147: 709. Aunque se ha informado sobre el uso de injertos de CDR y preservación del residuo estructural en una variedad de construcciones de anticuerpos humanizados, es difícil pronosticar si una secuencia particular proveerá como resultado en el anticuerpo con las propiedades de adhesión deseadas, y algunas veces biológicas. Ver por ejemplo, Queen et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:10029, Gorman et al. (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:4181 , y Hodgson (1991 ) Biotechnology (NY) 9:421 -5. Además, la mayor parte de los estudios anteriores usaron diferentes secuencias humanas para las secuencias variables livianas y pesadas de animales, lo cual convierte en cuestionable la naturaleza predictiva de dichos estudios. Se han usado secuencias de anticuerpos conocidas o más típicamente de aquellos anticuerpos que tienen estructuras cristalinas conocidas por rayos X, tales como los anticuerpos NEW y KOL. Ver por ejemplo, Jones et al., supra; Verhoeyen et al., supra; y Gorman et al., supra. La información exacta de la secuencia ha sido informada para unas pocas construcciones humanizadas. Existe la necesidad de antagonistas de IL-17A, tales como anticuerpos monoclonales anti-IL-17A, para usarlos en el tratamiento de trastornos humanos tales como trastornos inflamatorios, autoinmunes y proliferativos. Dichos antagonistas exhibirán preferiblemente baja inmunogenicidad en sujetos humanos, lo cual permitirá la administración repetida sin respuestas inmunes adversas.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a anticuerpos anti-humanos IL- 17A que tienen una o más propiedades deseables que incluyen afinidades de adhesión alta, actividades neutralizadoras, buena farmacocinética y baja antigenicidad en sujetos humanos. La invención se refiere también al uso de los anticuerpos de la presente invención en el tratamiento de una enfermedad. Por consiguiente, en una modalidad, la presente invención provee un compuesto de adhesión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo o fragmento de adhesión de ésta, que se adhiere a IL-17A e inhibe su actividad. En algunas modalidades, el compuesto de adhesión comprende por lo menos un dominio variable de cadena liviana de anticuerpo (VL) y por lo menos un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) o fragmentos de adhesión de éstos dominios, donde el dominio VL comprende por lo menos una cantidad especificada de regiones determinantes de complementariedad (CDR) que tienen una secuencia seleccionada de las SEQ ID NOS: 11 -13, y el dominio VH comprende por lo menos una cantidad especificada de CDR que tienen una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NOS:14-20, donde la cantidad especificada es una, dos o tres. La cantidad especificada de CDR puede ser igual o diferente para los dominios variables de cadena liviana y pesada, en cualquier compuesto de adhesión determinado. En otra modalidad, las CDR del dominio VH están seleccionadas entre las SEQ ID NOS: 14, 17 y 20. En una modalidad más, las CDR del dominio VH están seleccionadas entre las SEQ ID NOS: 14, 16 y 19. En una modalidad más, las secuencias del dominio VL y VH son las secuencias de las SEQ ID NOS: 5 y 6, respectivamente. En algunas modalidades, el compuesto de adhesión IL-17A inhibe la actividad del IL-17A. En otras modalidades, el compuesto de adhesión comprende por lo menos un dominio VL y por lo menos un dominio VH o fragmentos de adhesión de éstos dominios, donde el dominio VL comprende uno, dos o tres CDR que tienen una secuencia seleccionada de las SEQ ID NOS: 26-28, y el dominio VH comprende uno, dos o tres CDR que tienen una secuencia seleccionada entre SEQ ID NOS: 29-31. En otra modalidad, las secuencias de los dominios VL y VH son las secuencias de SEQ ID NOS: 22 y 23, respectivamente. En otra modalidad, el compuesto de adhesión tiene las mismas CDR que el anticuerpo producido a partir del hibridoma que tiene el No. de Acceso ATCC PTA-7739 (30C10 de rata, depositado como cepa JL7-30C10.C3 el 20 de Julio del 2006). En una modalidad más, el compuesto de adhesión comprende por lo menos un dominio VL y por lo menos un dominio VH o fragmentos de adhesión de estos dominios, donde el dominio VL comprende una, dos o tres CDR que tienen una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NOS: 48-50, y el dominio VH comprende una, dos o tres CDR que tienen una secuencia seleccionada entre SEQ ID NOS: 51 -53. En otras modalidades más, el compuesto de adhesión comprende por lo menos un dominio VL y por lo menos un dominio VH o fragmentos de adhesión de estos dominios donde el dominio VL comprende una, dos o tres CDR que tienen una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NOS: 34-36, y el dominio VH comprende una, dos o tres CDR que tienen una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NOS: 37-39, o el dominio VL comprende una, dos o tres CDR que tienen una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NOS: 56-58, y el dominio VH comprende una, dos o tres CDR que tienen una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NOS: 59-61. En varias otras modalidades, la presente invención provee un compuesto de adhesión que se adhiere a IL-17A humana que tiene los dominios VL y VH con por lo menos 95%, 90%. 85%, 80%, 75% o 50% de homología de secuencia con las secuencias de las SEQ ID NOS: 5 y 6, respectivamente. En otras modalidades el compuesto de adhesión de la presente invención comprende dominios VL y VH que tienen hasta 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones de aminoácido conservadoras con referencia a las secuencias de las SEQ ID NOS: 5 y 6, respectivamente. En otra modalidad el compuesto de adhesión de la presente invención es un anticuerpo que tiene una cadena liviana y una cadena pesada con hasta 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones aminoácido conservadoras con referencia a las formas maduras de las SEQ ID NOS: 2 y 4, respectivamente. En una modalidad, el compuesto de adhesión es un anticuerpo o un fragmento de adhesión de éste, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, y un diacuerpo. En una modalidad el compuesto de adhesión de la presente invención es el anticuerpo hu16C10 que comprende una cadena liviana que tiene la secuencia de la forma madura de la SEQ ID NO: 2 (residuos 1-220) y una cadena pesada que tiene la secuencia de la forma madura de SEQ ID NO: 4 (residuos 1 -454). En otra modalidad, el compuesto de adhesión es el anticuerpo producido a partir del vector de expresión que tiene el número de acceso ATCC PTA-7675 (hu16C10 en el plásmido pAIL17AV1 , depositado el 28 de Junio del 2006). En una modalidad, el compuesto de adhesión de la presente invención comprende una región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante humana tal como una región constante de cadena pesada humana ?1 , ?2, ?3, o ?4 o una variante de ésta. En otra modalidad el compuesto de adhesión comprende una región constante de cadena liviana, por ejemplo, una región constante de cadena liviana humana tal como una región de cadena liviana humana lambda o kappa o una variante de ésta. En otra modalidad, la invención se refiere a un ácido nucleico aislado, por ejemplo, ADN, que codifica un compuesto de adhesión de la presente invención por ejemplo, un anticuerpo (o el fragmento de adhesión de éste) que se adhiere a IL-17A. En una modalidad, el ácido nucleico aislado codifica un compuesto de adhesión que comprende por lo menos un dominio variable de cadena liviana del anticuerpo (VL) y por lo menos un dominio variable de cadena pesada del anticuerpo (VH) o fragmentos de adhesión de estos dominios donde el domino VL comprende por lo menos una cantidad especificada de regiones determinantes de complementariedad (CDR) que tienen una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NOS: 1 1 -13, y el dominio VH comprende por lo menos un número especificado de CDR que tienen una secuencia seleccionada entre SEQ ID NOS: 14-20, donde la cantidad especificada es una, dos o tres. En otra modalidad, el ácido nucleico aislado codifica una o ambas secuencias de región variable de cadena liviana y pesada de las SEQ ID NOS: 5 y 6, respectivamente. En otra modalidad el ácido nucleico aislado codifica el anticuerpo 16C10 que consiste en una cadena liviana que tiene la secuencia de la forma madura de la SEQ ID NO: 2 y una cadena pesada que tiene la secuencia de la forma madura de SEQ ID NO:4. En algunas modalidades, el ácido nucleico aislado comprende los nucleótidos 58-717 de la SEQ ID NO:1 o de la SEQ ID NO:62 y en otras modalidades, el ácido nucleico aislado comprende los nucleótidos 58-1419 de la SEQ ID NO:3 o de la SEQ ID NO:63. En una modalidad más, el ácido nucleico aislado comprende la secuencia de la SEQ ID NO:1 y la secuencia de la SEQ ID NO:3. Todavía en una modalidad más, el ácido nucleico aislado comprende la secuencia de la SEQ ID NO:62 y la secuencia de la SEQ ID NO:63. En algunas modalidades el ácido nucleico aislado codifica tanto a la cadena liviana como a la cadena pesada en una sola molécula de ácido nucleico, y en otras modalidades, las cadenas pesada y liviana están codificadas en dos o más moléculas de ácido nucleico separadas. En otras modalidades la presente invención se refiere a vectores de expresión que comprenden los ácidos nucleicos aislados de la invención, donde el ácido nucleico está ligado operativamente para controlar secuencias que son reconocidas por una célula huésped, donde la célula huésped es transfectada con el vector. En una modalidad, el vector de expresión tiene un número de acceso ATCC. PTA-7576 (hu16C10 en el plásmido pAIL17AV1 , depositado el 28 de Junio del 2006). En otra modalidad, la invención se refiere a una célula huésped que comprende un vector de expresión de la presente invención. La invención se refiere además a métodos para producir un compuesto de adhesión de la presente invención, que comprende cultivar una célula huésped que comprende un vector de expresión que codifica el compuesto de adhesión en el medio de cultivo, e aislar el compuesto de adhesión de la célula huésped o medio de cultivo. La invención se refiere también a compuestos de adhesión tales como anticuerpos o fragmentos de adhesión a éstos, que se adhieren al mismo epítope en IL-17A humana como anticuerpos 16C 10, 4C3, 30C10, 1 2E6, 23E12 o D10; por ejemplo, anticuerpos que son capaces de adhesión por bloqueo cruzado de cualquiera de estos anticuerpos de la presente invención o anticuerpos que se adhieren dentro del epítope definido por los residuos aminoácidos 74-85 de IL-17A humana (SEQ ID NO: 40). La invención se refiere también a compuestos de adhesión IL-1 7A humana de alta afinidad tal como anticuerpos o fragmentos de adhesión de éstos, tales como compuestos de adhesión que se adhieren con constantes de disociación de equilibrio (Kd) de 1000, 500, 100, 50, 20, 10, 5, 2 pM o menos (es decir, afinidad más elevada). La invención se refiere también a los compuestos de adhesión que tienen una actividad biológica potente tal como una Cl50 de 5000, 2000, 1000, 500 pM cuando se miden en un ensayo de actividad biológica, donde la estimulación de IL-17A se efectúa en una concentración de 1000 pM (1 nM), tal como producción de IL-6 estimulada por IL-17, de fibroblastos dérmicos humanos normales, fibroblastos de prepucio o sinoviocitos. La invención se refiere también a compuestos de adhesión que tienen una CI5o de 1000, 500, 200, 100, 50 pM o menos cuando se miden en un ensayo de actividad biológica donde se efectúa la estimulación de IL-17A en una concentración de 100 pM, tal como en un ensayo de proliferación Ba/F3-hlL-17Rc-mGCSFR. En general la invención se refiere a compuestos de adhesión que son capaces de inhibir la actividad de la IL-17A humana en ensayos biológicos en una concentración que está en un intervalo desde 10X, 5X, 2X, 1 X y tan bajo como 0.5X de la concentración de IL-17A, cuando la concentración de IL-17A es, por ejemplo de, 5, 10, 50, 100, 500 o 1000 pM o superior. La invención se refiere también a compuestos de adhesión que son capaces de reducir el reclutamiento en el pulmón de neutrofilos inducidos por IL-17A en un 50% o más cuando se administran a ratones para obtener una concentración del compuesto de adhesión en el suero de 50, 40, 30, 20 pg/ml o menos. En una modalidad, el compuesto de adhesión se adhiere a IL-17A de macaco con una afinidad (Kd) que no es de más de 5, 10, o 20 veces menor que su afinidad para IL-17A. En otra modalidad, el compuesto de adhesión se adhiere a IL-17A humana con una afinidad (Kd) que es 100, 500, 1000 o 2000 veces más elevada que su afinidad para IL-17A de ratón o rata. La invención se refiere también a métodos para tratar sujetos, incluyendo sujetos humanos que necesitan el tratamiento con los compuestos de adhesión IL-17A humana de la presente invención. Dichos sujetos pueden tener un trastorno inflamatorio o autoinmune tal como artritis reumatoidea, enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis, esclerosis múltiple, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística, escleroderma sistémica, rechazo a los aloinjertos, miocarditis autoinmune o adhesiones peritoneales. Dichos métodos de tratamiento pueden comprender además la administración de uno o más agentes terapéuticos adicionales tales como agentes inmunosupresores o antiinflamatorios. En una modalidad, se ha diagnosticado que el sujeto tiene una enfermedad intermediada por IL-17A. En otra modalidad, se ha diagnosticado que el sujeto tiene artritis reumatoidea. En una modalidad más, se ha diagnosticado que el sujeto tiene esclerosis múltiple. En una modalidad más, la invención provee métodos de tratamiento que comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo IL-17A anti-humano o un fragmento de adhesión en combinación con uno o más de otros atentes terapéuticos. En una modalidad, el otro agente terapéutico es un anticuerpo IL-23 antihumano o un fragmento de éste. En varias modalidades el anticuerpo o fragmento IL-23 anti-humano es administrado antes, concurrentemente con o después del anticuerpo o fragmento anti IL-17A anti-humano. En una modalidad, los anticuerpos anti-IL-17A y anti- IL-23 se administran conjuntamente por un período de tiempo limitado durante la fase aguda de un evento inmunológico adverso después de lo cual se interrumpe el tratamiento con un anticuepro anti-IL-17A pero se prosigue con el tratamiento con el anticuerpo IL-23. En otras modalidades el uno o más agentes comprenden un antagonista de IL-? ß, IL-6 o TGF-ß, por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-6 o anti-TGF-ß o una combinación de dichos antagonistas. La invención se refiere también a composiciones y formulaciones de los compuestos de adhesión de la presente invención, que comprenden el compuesto de adhesión y un portador o diluyente farmacéuticamente estable y opcionalmente uno o más agentes inmunosupresores o anti-inflamatorios.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1A muestra alineaciones de los dominios variables de cadena liviana de varios anticuerpos IL-17A anti-humanos de acuerdo con la presente invención. 16C10 VL de rata = SEQ ID NO: 7; 16C10 VL humano = SEQ ID NO: 5; 4C3 VL de rata = SEQ ID NO: 21 ; 4C3 VL humano = SEQ ID NO: 5; 23E12 VL de rata = SEQ ID NO: 45; 30C10 VL de rata = SEQ ID NO: 24; 30C10 VL humano = SEQ ID NO: 22; 12E6 VL de rata = SEQ ID NO: 32; 1 D10 VL de rata = SEQ ID NO: 54. Las CDR se indican (y se proveen en el cuadro 3). La numeración está de acuerdo con Kabat et al. (1991 ) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Department of Health y Human Services, NIH Pub. 91 -3242, 5th Ed., denominada aquí "Kabat et al. (1991)". La figura 1 B muestra alineaciones de los dominios variables de cadena pesada de varios anticuerpos IL-17A anti-humanos de acuerdo con la presente invención. 16C10 VH de rata = SEQ ID NO: 8; 16C10 VH humano = SEQ ID NO: 6; 4C3 VH de rata = SEQ ID NO: 8; 4C3 VH humano = SEQ ID NO: 6; 23E12 VH de rata = SEQ ID NO: 47; 30C10 VH de rata = SEQ ID NO: 25; 30C10 VH humano = SEQ ID NO: 23; 12E6 VH de rata = SEQ ID NO: 33; 1 D10 VH de rata = SEQ ID NO: 55. Las CDR están indicadas (y se proveen en el cuadro 4). La numeración está de acuerdo con Kabat et al. (1991 ). La figura 2A muestra la secuencia de aminoácido de la cadena liviana del anticuerpo 16C10 de anti-IL-17A de acuerdo con la presente invención (la forma madura de la SEQ ID NO: 2, es decir, residuos 1 -220). Se indican las CDR. La figura 2B muestra la secuencia de aminoácido de la cadena pesada del anticuerpo 16C10 de anti-IL-17A de acuerdo con la presente invención (la forma madura de la SEQ ID NO: 4, es decir, residuos 1 -454). Se indican las CDR. Las figuras 3A-3D muestran los efectos de los tratamientos de anticuerpos anti- anti-IL-17A en la patología del modelo de artritis reumatoidea en ratón CIA. Los tratamientos incluyen la administración del anticuerpo 1 D10 de anti-IL-17A (a 28, 7, y 2 mg/kg) y la administración de un isotipo de control (7 mg/kg). La figura 3A presenta el resultado de la gravedad de la enfermedad visual (DSS), una medición visual de la inflamación y enrojecimiento de la pata, como función del tratamiento con anticuerpos. El resultado es: 0 = la pata aparece igual que la pata de control (no tratada); 1 = la inflamación de un dedo en una pata determinada; 2 = inflamación de dos dedos o la palma de una pata determinada; 3 = inflamación de la palma y dedos de una pata determinada. La figura 3B presenta daños en el cartílago (por histopatología) como función del tratamiento con anticuerpos. El resultado es: 0 = normal; 1 = mínimo, 2 = leve; 3 = moderado; 4 = grave. La figura 3C presenta erosión ósea (por histopatología) como función del tratamiento con anticuerpos. El resultado es: 0 = normal; 1 = mínimo, 2 = leve; 3 = moderado; 4 = grave. La figura 3D presenta erosión ósea (por histopatología) para patas de ratones CIA que tienen u resultado de 2 o 3 DSS visual, es decir, patas muy inflamadas. El rlgG1 es un anticuerpo de control de isotipo. El resutlado es: 0 = normal; 1 = mínimo, 2 = leve; 3 = moderado; 4 = grave. La figura 4 presenta un % de neutrófilos BAL (una medición del reclutamiento de neutrófilos en el pulmón) en ratones que habían sido tratados intranasalmente con IL-17A humana, como una función de la concentración en el suero de varios anticuerpos IL-17A anti-humanos de la presente invención (1 D10, 16C10, 4C3) y un control de isotipo. Los triángulos sólidos representan experimentos de control sin ningún anticuerpo anti-IL-17A agregado, y los puntos de datos más a la izquierda (ángulos abiertos) son controles no estimulados. La figura 5A muestra la secuencia nucleotídica (SEQ ID NO:62) que codifica la cadena liviana del anticuerpo 16c10 anti-IL-17A humanizado. La figura 5B muestra una secuencia nucleotídica que codifica la cadena pesada del anticuerpo 16C10 anti-IL-17A humanizado (SEQ ID NO:63).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION I. Definiciones De manera de comprender más fácilmente la invención, se definirán específicamente a continuación ciertos térmicos técnicos y científicos. A menos que se definan específicamente en otra parte en este documento, todos los términos técnicos y científicos que se usan aquí tienen el significado que les aplica comúnmente un experto en la técnica a la cual pertenece esta invención. Tal como se usan aquí, incluyendo las reivindicaciones anexas las formas singulares de las palabras tales como "un" "una" "el/la" incluyen sus correspondientes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. "Activación," "estimulación," y "tratamiento," tal como se aplica a células o receptores puede tener el mismo significado, es decir, activación, estimulación o tratamiento de una célula o receptor con un ligando, a menos que se indique lo contrario en el contexto o explícitamente. "Ligando" abarca ligandos naturales y sintéticos, por ejemplo, citocinas, variantes de citocinas, análogos, muteinas y compuestos de adhesión derivados de anticuerpos. "Ligando" abarca también moléculas pequeñas, por ejemplo, miméticos peptídicos de citocina y miméticos peptídicos de anticuerpos. "Activación" puede referirse a la activación de células reguladas por mecanismos internos, así como también por factores ambientales y externos. "Respuesta", por ejemplo, de una célula, tejido, órgano u organismo abarca un cambio en el comportamiento bioquímico o fisiológico, por ejemplo, en la concentración, adhesión o migración dentro de un compartimiento biológico, un régimen de expresión génica o un estado de diferenciación, donde el cambio está correlacionado con la activación, estimulación o tratamiento o con mecanismos internos tales como programación genética. "Actividad" de una molécula puede describirse o hacer referencia a la adhesión de la molécula a un ligando o a un receptor, a la actividad catalítica; la capacidad para estimular la expresión génica o la señalización, diferenciación o maduración de células; la actividad antigénica, la modulación de las actividades de otras moléculas y similares. "Actividad" de una molécula puede referirse también a la actividad para modular o mantener las interacciones de célula a célula, por ejemplo, la adhesión o actividad en el mantenimiento de una estructura de una célula, por ejemplo, membranas de células o citoesqueleto. "Actividad" puede significar también actividad específica, por ejemplo, [actividad catalítica]/[mg de proteína], o [actividad inmunológica]/[mg de proteína], concentración en un compartimiento biológico o similares. "Actividad" puede referirse a la modulación de los componentes de los sistemas inmunes innatos o adaptivos. "Actividad proliferativa" abarca una actividad que promueve, que es necesaria para o que está asociada específicamente con por ejemplo, división normal de células así como también cáncer, tumores displasias, transformación de células, metástasis y angiogénesis.

"Administración" y "tratamiento," aplicado a un animal, un ser humano, un sujeto experimental, células, tejidos, órganos o fluido biológico se refiere al contacto de un agente exógeno, farmacéutico, terapéutico, o de diagnóstico, o una composición con un animal, un ser humano, un sujeto, una célula, un tejido, o un órgano o un fluido biológico. "Administración" y "tratamiento" puede referirse por ejemplo, a métodos terapéuticos, farmacocinéticos, de diagnóstico, investigación y experimentales. El tratamiento de una célula abarca el contacto de un reactivo con las células, así como también el contacto de un reactivo con un fluido, donde el fluido está en contacto con la célula. "Administración" y "tratamiento" se refiere también a los tratamientos ¡n vitro y ex vivo, por ejemplo, de una célula, con un reactivo, un compuesto de diagnóstico, de adhesión, o con otra célula. "Tratamiento" tal como se aplica a un sujeto humano, veterinario o de investigación, se refiere al tratamiento terapéutico profiláctico o a medidas preventivas, para investigar y diagnosticar aplicaciones. "Tratamiento" aplicado a un sujeto humano, veterinario o de investigación o una célula, tejido u órgano abarca el contacto de un agonista de IL-17A o un antagonista de IL-17A con un sujeto humano o animal, una célula, tejido, compartimiento fisiológico o fluido fisiológico. "Tratamiento de una célula" abarca también situaciones en las cuales el agonista de IL-17A o el antagonista de IL-17A contacta el receptor IL-17A por ejemplo, en la fase fluida o fase coloidal, pero también situaciones en las cuales el agonista o antagonista no entran en contacto con la célula o el receptor.

"Tratar" o "tratando" significa administrar un agente terapéutico, tal como una composición que contiene cualquiera de los compuestos de adhesión de la presente invención, internamente o externamente a un paciente que tiene uno o más síntomas de enfermedad, en los cuales se sabe que el agente tiene actividad terapéutica conocida. Típicamente el agente se administra en una cantidad eficaz para aliviar uno o más síntomas de la enfermedad en el paciente o población tratada, tanto si induce la regresión o inhibe el avance de dicho síntoma o síntomas en cualquier grado clínicamente medible. La cantidad de un agente terapéutico que es eficaz para aliviar cualquier síntoma de enfermedad particular (denominado también "cantidad terapéuticamente eficaz") puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad y el peso del paciente, y la capacidad del fármaco para provocar una respuesta deseada en el paciente. Si un síntoma de la enfermedad ha sido aliviado puede verificarse mediante cualquier medición clínica de las que usan típicamente los médicos u otros cuidadores de la salud expertos, para verificar la gravedad o el progreso de ese síntoma. Aunque una modalidad de la presente invención (por ejemplo, un método de tratamiento o un artículo de manufactura) puedan no resultar eficaces para aliviar el o los síntomas de la enfermedad a la cual están dirigidos en cada paciente, deberían aliviar el o los síntomas de la enfermedad a la que están dirigidos en una cantidad de pacientes estadísticamente significativa, de acuerdo a lo que se determina en cualquier prueba, estadística conocida en la técnica tal como la prueba t de Student, la prueba chi2, la prueba U de acuerdo con Mann y Whitney, la prueba Kruskal-Wailis (H-prueba), prueba Jonckheere-Terpstra y la prueba Wilcoxon. Hay cuatro variantes de la proteína IL-17A humana que se mencionan aquí, i) Tal como se usan aquí, los términos "IL-17A humana" e "IL-17A humana nativa" ("hulL-17A" y "humlL-17A") se refieren a las formas maduras (es decir, residuos 24-155) de la proteína IL-17A humana números de acceso NP_002181 y AAT22064, y las variantes naturales y los polimorfismos de éstas, ii) Tal como se usa aquí, el término "rhlL-17A" se refiere a un derivado recombinante de IL-17A humano nativo, en el cual dos aminoácidos adicionales, (LE) están unidos al N-terminal de la forma madura de IL-17A humana nativa. Esta nomenclatura se adoptó por razones de conveniencia para referirse a varias formas de IL-17A, y puede no tener un uso parejo en la literatura, iii) Tal como se usa aquí, el término "FLAG-hulL-17A" se refiere a una variante de IL-17A humana que tienen una marca del péptido N-terminal FLAG® anexado. En algunos experimentos, el FLAG-hulL-17A está biotinilado. iv) IL-17A humano R&D Systems se refiere aquí a los residuos 20-155 de la proteína IL-17A humana, números de acceso NP_002181 y AAT22064, con una metionina N-terminal adicional. El cuadro 1 es un resumen de las N-terminales variantes de las moléculas de IL-17A a las cuales se hace referencia aquí.

CUADRO 1 Formas variantes de IL-17A humana A menos que se indique lo contrario, cualquier IL-17A usada en los experimentos que se describen aquí, que se produce usando vectores adenovirales es rhlL-17A. El término "IL-17A" se refiere generalmente a IL-17A, nativo o recombinante, y a homólogos no humanos de IL-17A humano. A menos que se indique lo contrario, las concentraciones molares de IL-17A se calculan usando el peso molecular de un homodímero de IL-17A (por ejemplo 30 kDa para IL- 17 A). Tal como se usa aquí, el término "anticuerpo" se refiere a cualquier forma de anticuerpo que exhibe la actividad biológica deseada. Por lo tanto, se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente pero no está limitado a anticuerpos monoclonales (que incluyen anticuerpos monoclonales de longitud total), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos bi-específicos). Tal como se usan aquí, los términos "fragmento de adhesión IL-17A" o "fragmento de adhesión" de un anticuerpo (el "anticuerpo parental") abarca un fragmento o un derivado de un anticuerpo, que incluye típicamente por lo menos una porción del antígeno de adhesión o regiones variables (por ejemplo, una o más CDR) de un anticuerpo parental, que retiene por lo menos parte de la especificidad de adhesión del anticuerpo parental. Ejemplos de fragmentos de adhesión al anticuerpo incluyen pero no están limitadas a los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena única, por ejemplo, sc-Fv; y anticuerpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticuerpos. Típicamente, un fragmento de adhesión o un derivado retiene por lo menos 10% de su actividad de adhesión a IL-17A cuando esa actividad se expresa en una base molar. Preferiblemente, un fragmento de adhesión o un derivado retiene por lo menos 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% o 100% o más de la afinidad de adhesión a IL-17A como anticuerpo parental. También se contempla que un fragmento de adhesión IL-17A pueda incluir sustituciones de aminoácido conservadoras (denominadas aquí "variantes conservadoras" del anticuerpo) que no alternan sustancialmente su actividad biológica. El término "compuesto de adhesión" se refiere a ambos anticuerpos y fragmentos de adhesión de éstos. Un "fragmento Fab" está constituido por una cadena liviana y el CH1 y regiones variables de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un enlace disulfúro con otra molécula de cadena pesada. Una región "Fe" contiene dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios CH1 y CH2 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de cadena pesada se mantienen juntos mediante dos o más enlaces disulfúro y mediante interacciones hidrofóbicas de los dominios CH3.

Un "fragmento "Fab"' contiene una cadena liviana y una porción de una cadena pesada que contiene el dominio VH y el dominio C H1 y también la región entre los dominios CH1 y CH2, de manera que puede formarse un enlace disulfúro de intercadena entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab' para formar una molécula F(ab') 2. Un "fragmento F(ab')2" contiene dos cadenas livianas y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región constante entre los dominios CH1 y CH2, de modo que el enlace disulfúro de intercadena se forma entre las dos cadena pesadas. Un fragmento F(ab')2 está compuesto por lo tanto de dos fragmentos Fab' que se mantienen juntos mediante un enlace disulfúro entre las dos cadenas pesadas. La "región Fv" comprende las regiones variables de ambas cadenas, la pesada y la liviana, pero carece de las regiones constantes. El término anticuerpos de "Fv" de cadena única o "scFv" se refiere a fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una cadena oligopeptídica única. En general, el polipéptido Fv comprende además un ligador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la adhesión al antígeno. Para una revisión de scFv, ver Pluckthun ( 1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 1 3, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-31 5. Ver también, la Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 88/01 649 y las Patentes Norteamericanas Nos. 4,946,778 y 5,260,203.

Un "anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene únicamente la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena liviana. En algunos casos, dos o más regiones VH están unidas covalentemente con un ligador peptídico para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones VH de un antcuerpo de dominio bivalente pueden apuntar a los mismos antígenos o antígenos diferentes. Un "anticuerpo bivalente" comprende dos sitios de adhesión al antígeno. En algunos casos, los dos sitios de adhesión tienen las mismas especificidades de antígeno. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes pueden ser bioespecíficos (ver a continuación). Tal como se usa aquí, a menos que se indique lo contrario, un anticuerpo "anti-IL-17A" se refiere a un anticuerpo que se crea contra IL-17A humano o una variante de éste, tal como hulL-17A, rhlL-17A, FLAG-hulL-17A y R&D IL-17A, o un fragmento antigénico de éstos. El término "anticuerpo monoclonal" tal como se usa aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones que ocurren en forma natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, y están dirigidos contra un epítope antigénico único. En contraste, las preparaciones convencionales de anticuerpos (policlonales) incluyen típicamente una multitud de anticuerpos dirigidos contra (o específicos para) epítopes diferentes. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no puede considerarse que requiera la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que deben usarse de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante un método de hibridoma descrito primero por Kohler et al. (1975) Nature 256: 495, o pueden prepararse por métodos de ADN recombinante (Ver por ejemplo, la Patente Norteramericana No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" pueden aislarse también a partir de colecciones de anticuerpos fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al. (1991 ) Nature 352: 624-628 y Marks et al. (1991 ) J. Mol. Biol. 222: 581 -597, por ejemplo. Ver también, Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 1 16:731. Los anticuerpos monoclonales que se indican específicamente aquí, incluyen anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los cuales una porción de la cadena pesada y/o liviana es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o sub-clase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la o las cadenas es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como también fragmentos de dichos anticuerpos, con la condición de que exhiban la actividad biológica deseada (Patente Norteamericana No. 4,816,567; y Morrison et al., (1984) Proc. Nati. Acad. Sci.USA 81 : 6851 -6855). Tal como se usa aquí, un "anticuerpo quimérico" es un anticuerpo que tiene el dominio variable de un primer anticuerpo y el dominio constante de un segundo anticuerpo, donde el primer y segundo anticuerpos son de especies diferentes. Típicamente, los dominios variables se obtienen a partir de un anticuerpo de un animal experimental (el "anticuerpo parental"), tal como un roedor y las secuencias de dominio constante se obtienen a partir de anticuerpos humanos, de modo que es menos probable que el anticuerpo quimérico resultante produzca una respuesta inmune adversa en un sujeto humano que en un anticuerpo parental de roedor. Los anticuerpos monoclonales presentes incluyen también anticuerpos de dominios únicos camelizados. Ver, por ejemplo, Muyldermans et al. (2001 ) Trends Biochem. Sci. 26:230; Reichmann et al. (1999) J. Immunol. Methods 231 :25; WO 94/04678; WO 94/25591 ; Patente Norteamericana. No. 6,005,079, que se incorporan aquí como referencia en su totalidad). En una modalidad, la presente invención provee anticuerpos de un solo dominio que comprenden dos dominios (VH) con modificaciones de modo de formar los anticuerpos de dominio único. Tal como se usa aquí, el término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de adhesión al antígeno donde dichos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena liviana (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL o VL-VH). Mediante el uso de un ligador demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de adhesión al antígeno. Los diacuerpos se describen en forma más completa en por ejemplo, EP 404,097; WO 93/1 1 161 ; y Holliger et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. Para una revisión de las variantes de anticuerpo manipuladas por ingeniería genética ver en forma general Holliger y Hudson (2005) Nal Biotechnol. 23:1 126-1 136. Tal como se usa aquí, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a formas de anticuerpo que contienen secuencias de anticuerpos tanto de humanos como de no humanos (por ejemplo, murinos, de ratas). En general el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno y típicamente dos dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables correspoden a aquellos de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones del marco estructural (FR) son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina humana (Fe). Los anticuerpos de la presente invención incluyen también anticuerpos con regiones Fe modificadas (o bloqueadas) para proveer funciones efectoras alteradas. Ver por ejemplo, la Patente Norteamericana.

No. 5,624,821 ; WO2003/086310; WO2005/120571 ; WO2006/0057702. Dicha modificación puede usarse para mejorar o suprimir varias reacciones del sistema inmune con posibles efectos beneficiosos en el diagnóstico y terapia. Las alteraciones de las regiones Fe incluyen cambios de aminoácidos (sustituciones, supresiones e inserciones) glicosilación o desglicosilación y agregado Fe múltiple. Los cambios de Fe pueden alterar también la vida media de los anticuerpos, en anticuerpos terapéuticos, permitiendo una dosis menos frecuente y aumentando de este modo la conveniencia y disminuyendo el uso de material. Ver Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 1 16:731 at 734-35. El término "anticuerpo completamente humano" se refiere a un anticuerpo que comprende secuencias de proteínas de inmunoglobulina humana únicamente. Un anticuerpo completamente humano puede contener cadenas carbohidrato murinas si se produce en un ratón, en una célula de ratón o en un hibridoma derivado de una célula de ratón. De manera similar, "anticuerpo de ratón" se refiere a un anticuerpo que comprende secuencias de inmunoglobulina de ratón únicamente. Alterativamente, un anticuerpo completamente humano puede contener cadenas carbohidrato de rata si se ha producido en una rata, en una célula de rata o en un hibridoma derivado de una célula de rata. De manera similar "anticuerpo de rata" se refiere a un anticuerpo que comprende secuencias de inmunoglobulina de rata únicamente. Tal como se usa aquí, el término "región hipervariable" se refiere a los residuos aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la adhesión al antígeno. La región hipervariable comprende los residuos aminoácido de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (es decir, los residuos 24-34 (CDRL1 ), 50-56 (CDRL2) y 89-97 (CDRL3) en el dominio variable de cadena liviana y los residuos 31 -35 (CDRH1 ), 50-65 (CDRH2) y 95-102 (CDRH3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al. (1991 ) Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico, 5a Edición. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (es decir, residuos 26-32 (CDRL1 ), 50-52 (CDRL2) y 91 -96 (CDRL3) en el dominio variable de cadena liviana y 26-32 (CDRH1 ), 53-55 (CDRH2) y 96-101 (CDRH3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901 -917). Tal como se usa aquí, el término residuos "estructurales" o "Fr" se refiere a aquellos residuos de dominio variable distintos de los residuos de región hipervariable definidos aquí como residuos CDR. "Sustancia de adhesión" se refiere a una molécula, a una molécula pequeña, a una macromolécula, un anticuerpo, un fragmento o un análogo de éstos, o un receptor soluble, capaz de adherirse a un objetivo. "Sustancia de adhesión" puede referirse tambén a un complejo de moléculas, por ejemplo, un complejo no covalente, a una molécula ionizada, y a una molécula modificada covalentemente o no modificada covalentemente por ejemplo, modificada con fosforilación, acilación, entrecruzamiento, ciclización o disociación limitada, que es capaz de unirse a un objetivo. "Sustancia de adhesión" puede referirse también a una molécula capaz de adherirse a un objetivo en combinación con un estabilizador, un excipiente, una sal, un regulador de pH, un solvente o un aditivo. "Adhesión" puede definirse como una asociación de la sustancia de adhesión con un objetivo donde la asociación da como resultado reducción en el movimiento browniano normal de la sustancia de adhesión, en casos en los cuales la sustancia de adhesión puede estar disuelta o suspendida en solución. "Variantes modificadas conservadoramente" o "sustitución conservadora" se refiere a sustituciones de aminoácidos en una proteína con otros aminoácidos que tienen características similares (por ejemplo, carga, tamaño de cadena secundaria, hidrofobicidad/hidrofilicidad, conformación esqueletal y rigidez, etc.), de modo que los cambios pueden efectuarse frecuentemente sin alterar la actividad biológica de la proteína. Los expertos en la técnica reconocen que en general, las sustituciones de aminoácido únicas en regiones no esenciales de un polipéptido no alternan sustancialmente la actividad biológica (ver por ejemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4a Ed.)). Además, las sustituciones de aminoácidos estructuralmente o funcionalmente similares, distorsionarán menos probablemente la actividad biológica. Varias modalidades de los compuestos de adhesión de la presente invención comprenden cadenas polipeptídicas con secuencias que incluyen hasta 0 (ningún cambio), 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20 o más sustituciones de aminoácido conservadoras cuando se comparan con las secuencias de aminoácidos específicas que se describen aquí, por ejemplo, SEQ ID NOS: 2, 4, 5, o 6. Tal como se usa aquí, la frase "hasta X" sustituciones de aminoácido conservadora incluye 0 sustituciones y cualquier cantidad de sustituciones hasta e incluyendo sustituciones X. Dichas sustituciones ejemplares se efectúan preferiblemente de acuerdo con las que se indican en el cuadro 2 siguiente: CUADRO 2 Ejemplos de sustituciones de aminoácido conservadoras Los términos "que consiste esencialmente en" o variaciones tales como "que consiste esencialmente de" o "consistiendo esencialmente en" tal como se usan a través de toda la especificación y reivindicaciones, indican la inclusión de cualquier elemento o grupo de elementos mencionados, y la inclusión opcional de otros elementos, de naturaleza similar o diferente a la de los elementos mencionados, que no cambian materialmente las propiedades básicas o novedosas del régimen, método o composición de dosis especificado. Como ejemplo no limitativo, un compuesto de adhesión que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácido mencionada puede incluir uno o más aminoácidos que no afectan materialmente las propiedades del compuesto de adhesión. "Cantidad eficaz" abarca una cantidad suficiente para mejorar o prevenir un síntoma o un signo de la enfermedad. Una cantidad eficaz significa también una cantidad suficiente para permitir o facilitar el diagnóstico. Una cantidad eficaz para un paciente o un sujeto veterinario particular puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad que se está tratando, la salud global del paciente, el método, la vía y dosis de adminsitracion y la gravedad de los efectos secundarios (ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,888,530 concedida a Netti, et al.). Una cantidad eficaz puede ser una dosis máxima o un protocolo de dosificación que evita efectos secundarios o efectos tóxicos significativos. El efecto dará como resultado un mejoramiento de una medida o parámetro de diagnóstico de por lo menos 5%, usualmente de por lo menos 10%, más usualmente de por lo menos 20%, más usualmente por lo menos 30%, preferiblemente de por lo menos 40%, más preferiblemente, por lo menos 50%, más preferiblemente por lo menos 60%, idealmente por lo menos 70%, más idealmente por lo menos 80% y aún más idealmente por lo menos 90%, donde el 100% se define como el parámetro de diagnóstico mostrado por un sujeto normal (ver, por ejemplo, Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Ratón, FL; Dent (2001 ) Good Laboratory y Good Clinical Practice, Urch Publ., Londres, RU). "Exógeno" se refiere a sustancias que se producen fuera de un organismo, célula o cuerpo humano dependiendo del contexto. "Endógeno" se refiere a sustancias que se producen dentro de una célula, organismo o cuerpo humano dependiendo del contexto. "Homología" se refiere a similaridad de secuencia entre dos secuencias polinucleotídicas o entre dos secuencias polipeptídicas. Cuando una posición en ambas de dos secuencias comparadas es ocupada por la misma base o subunidad monomérica de aminoácido, por ejemplo, si una posición en cada una de dos molécuals de ADN es ocupada por adenina, entonces las moléculas son homologas en esa posición. El porcentaje de homología entre las dos secuencias es una función de la cantidad de emparejamiento o posiciones homologas compartidas por las dos secuencias divididas por la cantidad de posiciones comparadas por x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias están emparejadas o son homologas cuando las secuencias están alineadas óptimamente, entonces las dos secuencias son 60% homologas. En general, la comparación se efectúa cuando dos secuencias están alineadas para proporcionar una homología porcentual máxima. "Enfermedad inmune" o "trastorno inmune" abarca pro ejemplo, inflamación patológica, un trastorno inflamatorio, y un trastorno o enfermedad autoinmune. "Trastorno inmune" se refiere también a infecciones, infecciones persistentes y trastornos proliferativos, tales como cáncer, tumores y angiogénesis, que incluyen infecciones, tumores y cánceres que resisten la erradiación por el sistema inmune, "trastorno canceroso" incluye por ejemplo, cáncer, células de cáncer, tumores, angiogénesis y trastornos pre-cancerosos tales como displasia. "Trastorno inflamatorio" significa un trastorno o enfermedad patológica donde la patología es el resultado, en su totalidad o en parte, de por ejemplo, un cambio del número, cambio del régimen de migración, o cambio de la activación de células del sistema inmune. Las células del sistema inmune incluyen, por ejemplo, células T, células B, monocitos o macrófagos, células que presentan antígeno (APC), células dendríticas, microglia, células NK, células NKT, neutrófilos, eosinófilos, mastocitos o cualquier otra célula específicamente asociada con la inmunología, por ejemplo, células endoteliales o epiteliales productoras de citocinas "Compuesto de adhesión aislado" se refiere al estado de purificación de un compuesto de adhesión y en dicho contexto significa que la molécula está sustancialmente libre de otras moléculas biológicas tales como ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, carbohidratos, u otro material tal como restos celulares y medios de crecimiento. En general, el término "aislado" no se refiere a la ausencia completa de dicho material o a una ausencia de agua, reguladores de pH, o sales, a menos que estén presentes en cantidades que interfieren sustancialmente con el uso experimental o terapéutico del compuesto de adhesión que se describe aquí. "Molécula de ácido nucleico aislada" significa ADN o ARN genómico, ARNm, ADNc, o de origen sintético o alguna combinación de éstos que no está asociada con la totalidad o una porción de un polinucleótido en el cual el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza o está ligado a un polinucleótido al cual no está ligado en la naturaleza. Para el propósito de esta descripción, debe entenderse que "una molécula de ácido nucleico comprende" una secuencia nucleotídica particular no abarca cromosomas intactos. Las moléculas de ácido nucleico asiladas "que comprende" secuencias de ácido nucleico específicas pueden incluir, además de las secuencias específicas, secuencias codificadoras para hasta diez o incluso veinte o más de otras proteínas o porciones de éstas, o pueden incluir secuencias reguladoras ligadas operativamente que controlan la expresión de la región codificadora de la secuencia de ácido nucleico citada y/o pueden incluir secuencias vectoras. La frase "secuencias de control" se refiere secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificadora ligada operativamente en organismos huéspedes particulares. Las secuencias de control que son apropiadas para procariotos, incluyen por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de adhesión al ribosoma. Se sabe que las células eucarióticas usan promotores, señales de poliadenilación e intensificadores. Un ácido nucleico está "ligado operativamente" cuando está colocado dentro de una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una pre-secuencia o una guía secretora, está ligada operativamente al ADN para un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador está ligado operativamente a una secuencia codificadora si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de adhesión al ribosoma está ligado operativamente a una secuencia codificadora si está posicionado de manera de facilitar la traducción. En general, "ligado operativamente" significa que las secuencias de ADN que están ligadas son contiguas y que en el caso de una guía secretora, contigua y en fase de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen que ser contiguos. La ligadura se lleva a cabo por ligación en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se usan adaptadores o ligadores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional. Tal como se usa aquí, las expresiones "célula", "línea de célula" y "cultivo de célula" se usan intercambiablemente y todas dichas designaciones incluyen progenie. Por lot anto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos derivados de ésta sin tener en cuenta la cantidad de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en cuanto al contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. La progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la rastreada en la célula originalmente transformada está incluida. Cuando se pretenden designaciones distintas, resultará claro del contexto. Tal como se usa aquí, "reacción en cadena de polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimento o técnica en la cual pequeñas cantidades de un trozo específico de ácido nucleico, ARN y/o ADN son ampificadas tal como se describió en, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,683,195. En general, la información de secuencia de los extremos de la región de interés o más allá las necesidades que pueden ser disponibles, tales como iniciadores oligonucleotídicos, pueden ser diseñados; estos iniciadores serán idénticos o similares en la secuencia a los filamentos opuestos del molde que debe ser amplificado. Los oligonucleótidos 5' terminales de los dos iniciadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR puede usarse para amplificar las secuencias de ARN específicas, las secuencias de ADN específicas del ADN genómico total, y el ADNc transcrito a partir del ARN celular total, bacteriófagos o secuencias de plásmidos, etc. Ver, en términos generales, Mullís et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51 :263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.). Tal como se usa aquí, PCR se considera que es uno, pero no el único ejemplo, del método de reacción de polimerasa de ácido nucleico para amplificar una muestra de ensayo de ácido nucleico que comprende el uso de un ácido nucleico conocido como iniciador y una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar una pieza específica de ácido nucleico. Tal como se usa aquí, el término "secuencia de línea germinal" se refiere a una secuencia de secuencias de ADN de inmunoglobulina no reordenadas. Puede usarse cualquier fuente apropiada de inmunoglobulina no reordenada. "Inhibidores" y "antagonistas," o "activadores" y "agonistas," se refiere a moléculas inhibidoras o activadoras respectivamente, por ejemplo para la activación de por ejemplo, un ligando, un receptor, un co-factor, un gen, una célula, un tejido o un órgano. Un modulador de, por ejemplo, un gen, un receptor, un ligando o una célula, es una molécula que altera una actividad del gen, el receptor, el ligando o la célula, donde la actividad puede ser activada, inhibida o alterada en sus propiedades reguladoras. El modulador puede actuar solo o puede usar un co-factor, por ejemplo, una proteína, un ion metálico o una molécula pequeña. Los inhibidores son compuestos que disminuyen, bloquean, previenen, demoran la activación, inactivan, desensibilizan o regulan en sentido descendente, por ejemplo, un gen, una proteína, un ligando, un receptor o una célula. Los activadores son compuestos que aumentan, activan, facilitan, mejoran la activación, sensibilizan o regulan en sentido ascendente, por ejemplo, un gen, una proteína, un ligando, un receptor o una célula. Un inhibidor puede definirse también como un compuesto que reduce, bloquea o inactiva una actividad constitutiva. Un "agonista" es un compuesto que interactúa con un objetivo para causar o promover un aumento en la activación del objetivo. Un "antagonista" es un compuesto que se opone a las acciones de un agonista. Un antagonista previene, reduce, inhibe o neutraliza la actividad de un agonista. Un antagonista puede prevenir, inhibir o reducir también una actividad constitutiva de un objetivo, por ejemplo, un receptor objetrivo incluso cuando no hay ningún agonista identificado. Para examinar el grado de inhibición, por ejemplo, las muestras o ensayos que comprenden una proteína, por ejemplo, gen, célula u organismo determinado, son tratadas con un activador o inhibidor potencial y se comparan con muestras de control sin el inhibidor. A las muestras de control, es decir, las muetras no tratadas con antagonistas, se les asigna un valor de actividad relativa de 100%. La inhibición se logra cuando el valor de actividad relativo al control es de aproximadamente 90% o menos, típicamente 85% o menos, más típicamente 80% o menos, más típicamente 75% o menos, generalmente 70% o menos, más generalmente 65% o menos, más generalmente 60% o menos, típicamente 55% o menos, usualmente 50% o menos, más usualmente 45% o menos, más usualmente 40% o menos, preferiblemente 35% o menos, más preferiblemente 30% o menos, y aún más preferiblemente 25% o menos, y más preferiblemente menos de 25%. La activación se logra cuando el valor de actividad relativo al control es de aproximadamente 1 10%, generalmente de por lo menos 120%, más generalmente de por lo menos 140%, más generalmente de por lo menos 160%, a menudo de por lo menos 180%, más a menudo por lo menos 2 veces, más a menudo por lo menos 2.5 veces, usualmente por lo menos 5 veces, más usualmente por lo menos 10 veces, preferiblemente por lo menos 20 veces, más preferiblemente por lo menos 40 veces y aún más preferiblemente más de 40 veces superior. Los puntos finales de activación o inhibición pueden monitorearse de la manera siguiente. La activación, inhibición y respuesta al tratamiento por ejemplo, de una célula, fluido fisiológico, tejido, órgano y animal o sujeto animal pueden monitorearse mediante un punto final. El punto final puede comprender una cantidad predeterminada o porcentaje de, por ejemplo, indicios de inflamación, oncogenicidad o desgranualción de células o secreción, tal como la liberación de una citocina, oxígeno tóxico o una proteasa. El punto final puede comprender por ejemplo, una cantidad predeterminada de un flujo iónico o un transporte; migración de células, adhesión de células; proliferación de células; potencial para metástasis, diferenciación de células y cambios de fenotipo, por ejemplo, cambio en la expresión del gen en relación a la inflamación, apoptósis, transformación, ciclo celular o metástasis (ver por ejemplo, Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sci. 30:145-158; Hood y Cheresh (2002) Nature Rev. Cáncer 2:91 -100; Timme, et al. (2003) Curr. Drug Targets 4:251 -261 ; Robbins y Itzkowitz (2002) Med. Clin. North Am. 86:1467-1495; Grady y Markowitz (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:101 -128; Bauer, et al. (2001 ) Glia 36:235-243; Stanimirovic y Satoh (2000) Brain Pathol. 10:1 13-126). Un punto final de inhibición es generalmente de 75% del control o menos, preferiblemente 50% del control o menos, más preferiblemente 25% del control o menos, y más preferiblemente 10% del control o menos. En general, un punto final de activación es de por lo menos 150% del control, preferiblemente por lo menos dos veces el control, más preferiblemente por lo menos cuatro veces el control, y aún más preferiblemente por lo menos diez veces el control. "Ligando" se refiere por ejemplo, a una molécula pequeña, péptido, polipéptido, y membrana asociada o molécula adherida a la membrana o un complejo de éstos, que puede actuar como agonista o antagonista de un receptor. "Ligando" abarca también un agente que no es un agonista o un antagonsita pero que puede adherirse al receptor. Además, "ligando" incluye un ligando adherido a una membrana que ha sido cambiada, por ejemplo, por métodos químicos o recombinantes, a una versión soluble del ligando adherido a la membrana. Convencionalmente, cuando un ligando está ligado a una membrana en una primera célula, el receptor ocurre usualmente en una segunda célula. La segunda célula puede tener la identidad igual o diferente a la de la primera célula. Un ligando o receptor puede ser enteramente intracelular, es decir, puede residir en el citosol, el núcleo, o cualquier otro compartimiento intracelular. El ligando o receptor puede cambiar su localización, por ejemplo, desde un compartimiento intracelular a la cara externa de la membrana de plasma. El complejo de un ligando y receptor se denomina un "complejo receptor ligando". Cuando un ligando y receptor están involucrados en una vía de señalización, el ligando ocurre en una posición cadena arriba y el receptor ocurre en una posición cadena abajo de la vía de señalización. "Molécula pequeña" se define como una molécula con un peso molecular que es inferior a 10 kDa, típicamente inferior a 2 kDa, preferiblemente menos de 1 kDa, y más preferiblemente menos de aproximadamente 500 Da. Las moléculas pequeñas incluyen, pero no están limitadas a moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas, moléculas orgánicas que contienen un componente inorgánico, moléculas que comprenden un átomo radioactivo, moléculas sintéticas, miméticos de péptidos y miméticos de anticuerpos. Como terapéutico, una molécula pequeña puede ser más permeable a las células, menos susceptible a la degradación, y menos apta para provocar una respuesta inmune que las moléculas grandes. Las moléculas pequeñas tales como miméticos de péptidos de anticuerpos y citocinas, así como también toxinas de moléculas pequeñas, han sido descritas (ver por ejemplo, Casset, et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 307:198-205; Muyldermans (2001 ) J. Biotechnol. 74:277-302; Li (2000) Nat. Biotechnol. 18:1251 -1256; Apostolopoulos, et al. (2002) Curr. Med. Chem. 9:41 1 -420; Monfardini, et al. (2002) Curr. Pharm. Des. 8:2185-2199; Domingues, et al. (1999) Nat. Struct. Biol. 6:652-656; Sato y Soné (2003) Biochem. J. 371 :603-608; Patente Norteramericana No. 6,326,482 concendida a Stewart, et al). Se adhiere "específicamente" o "selectivamente", cuando se refiere a un ligando/receptor, anticuerpo/antígeno, u otro par de adhesión indica una reacción de adhesión que es determinante de la presencia de la proteína en una población hetereogénea de proteínas y otros biológicos. Por lo tanto, bajo las condiciones designadas, un ligando específico se adhiere a un receptor particular y no se adhiere en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. El anticuerpo o compuesto de adhesión derivado del sitio de adhesión al antígeno de un anticuerpo, del método contemplado se adhiere al antígeno, o a una variante o muteina de éste, con una afinidad que es por lo menos dos veces superior, preferiblemente por lo menos 10 veces superior, más preferiblemente por lo menos 20 veces superior, y aún más preferiblemente por lo menos 100 veces superior a la afinidad con cualquier otro antígeno. En una modalidad preferida el anticuerpo tendrá una afinidad que es superior a aproximadamente 109 M"1 , determinada por ejemplo, por análisis Scatchard (Munsen et al. (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239). Tal como se usa aquí, el término "agente inmunomodulador" se refiere a agentes naturales o sintéticos que suprimen o modulan una respuesta inmune. La respuesta inmune puede ser una respuesta humoral o celular. Los agentes inmunomoduladores abarcan agentes inmunosupresores o anti-inflamatorios. "Agentes inmunosupresores", "fármacos inmunosupresores", o "inmunosupresores" tal como se usan aquí, son terapéuticos que se usan en terapia inmunosupresora para inhibir o prevenir la actividad del sistema inmune. Clínicamente se usan para prevenir el rechazo de los órganos y tejidos transplantados (por ejemplo, médula ósea, corazón, riñon, hígado) y/o en el tratamiento de enfermedades autoinmunes o enfermedades que son muy probablemente de origen autoinmune (por ejemplo, artritis reumatoidea, miastenia gravis, lupus eritematoso sistémico, colitis ulcerativa, esclerosis múltiple). Los fármacos inmunosupresores pueden clasificarse como: glucocorticoides; citostáticos, anticuerpos (modificadores de respuesta biológica); fármacos que actúan en inmunofilinas; otros fármacos que incluyen agentes quimioterapéuticos conocidos usados en el tratamiento de trastornos proliferativos. Para esclerosis múltiple, en particular, los anticuerpos de la presente invenicón pueden administrarse conjuntamente con una nueva clase de terapeúticos de tipo proteína que se adhieren a mielina, que se conocen como copaxones. "Agentes anti-inflamatorios" o "fármacos antiinflamatorios" se refieren tanto a los terapéuticos esteroidales como a los no esteroidales. Los esteroides, conocidos también como corticosteroides, son fármacos que se parecen estrechamente al cortisol, una hormona producida en forma natural por las glándulas adrenales. Los esteroides se usan como tratamiento principal para ciertos trastornos inflamatorios tales como: vasculitis sistémica (inflamación de los vasos sanguíneos); y miositis (inflamación muscular). Los esteroides podrían usarse también selectivamente para tratar trastornos inflamatorios tales como: artritis reumatoide (artritis inflamatoria crónica que ocurre en las articulaciones de ambos lados del cuerpo); lupus eritematoso sistémico (una enfermedad generalizada causada por una función anormal del sistema inmune); síndrome de Sjogren (trastorno crónico que causa sequedad ocular y boca seca). Los fármacos anti-inflamatorios no esteroidales abreviados usualmente como NSAID son fármacos con efectos analgésicos, antipiréticos y anti-inflamatorios reducen el dolor, la fiebre y la inflamación. El término "no esferoidal" se usa para distinguir estos fármacos de los esteroides que (entre un amplio intervalo de otros efectos) tienen una acción depresora de eicosanoides, anti-inflamatoria similar. Los NSAID están generalmente indicados para el alivio sintomático de los trastornos siguientes: artritis reumatoidea, osteoartritis, artropatías inflamatorias (por ejemplo, espondilitis anquilosante, artritis psoriática, síndrome de Reiter); gota aguda, dismenorrea; dolor óseo metastásico; dolor de cabeza y migraña; dolor post-operativo; dolor que va desde leve a moderado debido a inflamación y a lesiones de los tejidos; pirexia; y cólico renal. Los NSAID incluyen salicilatos, ácidos arilalcanoicos, ácidos 2-arilpropiónicos (profenos), ácidos N-arilantranílicos (ácidos fenámicos), oxicams, coxibs, y sulfonanilidas. Pueden administrarse fármacos anti-reumatoicos modificadores de la enfermedad (DMARD), a menudo en combinación con NSAIDs. Los DMARD comúnmente prescritos incluyen hidroxicloroquina/cloroquina, metotrexato, terapia con oro, sulfasalazina y azatioprina.

II. Anticuerpos específicos para IL-17A Humano La presente invención provee anticuerpos anti-IL-17A manipulados por ingeniería genética y uso de éstos para tratar varios trastornos inflamatorios inmunes y proliferativos que incluyen artritis reumatoide (RA), osteoartritis, osteoporosis de artritis reumatoidea, fibrosis inflmatoria (por ejemplo, escleroderma, fibrosis pulmonar y cirrosis), trastornos inflamatorios del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa y enfermedad de intestino inflamatorio), asma (que incluye asma alérgico), alergias, COPD, esclerosis múltiple, psoriasis y cáncer. Cualquier método apropiado para generar anticuerpos monoclonales, puede emplerarse para generar los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención. Por ejemplo, un animal receptor puede ser inmunizado con una forma ligada o no ligada (por ejemplo, natural) de homodímero IL-17A, o un fragmento de éste. Puede usarse cualquier método de inmunización apropiado. Dichos métodos pueden incluir coadyuvantes, otros inmunoestimulantes, inmunizaciones de refuerzo repetidas y el uso de una o más vías de inmunización. Cualquier forma apropiada de IL-17A puede usarse como inmunógeno (antígeno) para la generación del anticuerpo no humano específico para IL-17A, donde dicho anticuerpo puede ser clasificado para la actividad biológica. El inmunógeno producido puede ser IL-17A humano maduro de longitud total, incluyendo, homodímeros ligados y naturales o péptidos de éstos que abarcan epítopes únicos o epítopes múltiples. El inmunógeno puede usarse solo o en combinación con uno o más agentes mejoradores de inmunogenicidad conocidos en la técnica. El inmunógeno puede purificarse a partir de una fuente natural o puede producirse en una célula genéticamente modificada. El ADN que codifica el inmunogeno puede ser de origen genómico o no genómico (por ejemplo, ADNc). El ADN que codifica el inmunogeno puede expresarse usando vectores genéticos apropiados que incluyen pero que no están limitados a vectores adenovirales, vectores virales adenoasociados, vectores vaculovirales, plásmidos y vectores no virales tales como lípidos catiónicos. Cualquier método apropiado puede usarse para obtener una respuesta de anticuerpo con las propieadades biológicas deseadas, por ejemplo, para inhibir la adhesión de IL-17A a su receptor. En algunas modalidades, los anticuerpos se crean en huéspedes mamíferos tales como ratones, roedores, primates, humanos, etc. Las técnicas para preparar anticuerpos monoclonales pueden encontrarse en, por ejemplo, Stites et al. (eds.) BASIC Y CLINICAL IMMUNOLOGY (4a ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y referencias citadas aquí; Harlow y Lañe (1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL CSH Press; Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES Y PRACTICE (2d ed.) Academic Press, New York, NY. Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse mediante una variedad de técnicas con las cuales están familiarizados los expertos en la técnica. Típicamente, células de bazo de un animal inmunizado con un antígeno deseado, son inmortalizadas, comúnmente por fusión con una célula de mieloma. Ver Kohler y Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:51 1 -519. Métodos alternativos para la inmortalización incluyen transformación con virus de Epstein Barr, oncogénes o retrovirus u otros métodos conocidos en la técnica.

Ver por ejemplo, Doyle et al. (eds.) ( 1 994 y suplementos periódicos) CELL Y TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley y Sons, New York, NY. Las colonias que surgen de las células inmortalizadas únicas son clasificadas para determinar la producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad deseada para el antígeno. El rendimiento de anticuerpos monoclonales producidos por dichas células puede incrementarse mediante varias técnicas que incluyen inyección dentro de la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado. Otras técnicas apropiadas incluyen la selección de colecciones de anticuerpos en fagos o vectores similares. Ver por ejemplo, Huse et al., Science 246: 1275-1 281 ( 1 989); y Ward et al., Nature 341 :544-546 ( 1989). Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse sin modificación, por ejemplo, como anticuerpo parental de roedor, o con modificaciones para facilitar su uso como agentes terapéuticos en sujetos humanos, tales como anticuerpos quiméricos o humanizados. En algunas modalidades los anticuerpos estarán rotulados, en forma covalente o no covalente, con una sustancia que provee una señal detectable. Se provee una variedad de rótulos y técnicas de conjugación y se mencionan extensamente tanto en literatura científica como en la de patentes. Los rótulos apropiados incluyen radionuclidos, enzimas, sustratos, co-factores, inhibidores, porciones fluorescentes, porciones quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que enseñan el uso de dicho rótulos incluyen las Paentes Norteamericanas Nos. 3,81 7,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; y 4,366,241 . También, pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes, ver, Cabilly Patente Norteamericana No. 4,816,567; y Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; o efectuadas en ratones transgénicos, ver, Méndez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; ver también tecnologías Abgenix y Medarex. Los anticuerpos contra fragmentos pre-determinados de IL-17A pueden crearse por inmunización de animales con conjugados del fragmento pre-determinado de IL-17A con proteínas portadoras. Se preparan anticuerpos monoclonales a partir de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos pueden ser clasificados para la adhesión a IL-17A normal o defectuoso. Estos anticuerpos monoclonales se adherirán usualmente con por lo menos un de aproximadamente 1 µ?, más usualmente por lo menos aproximadamente 300, 30, 10, o 3 nM, preferiblemente por lo menos aproximadamente 300, 100, 30, 10, 3, o 1 pM. Debido a la relación inversa de los valores y la afinidad, las referencias a la adhesión con un K¿ determinado "o menos" se refiere a la adhesión con una afinidad que es por lo menos tan elevada que el valor numérico mencionado, es decir, con un que es por lo menos tan bajo como el valor citado. Las afinidades de adhesión pueden determinarse mediante ELISA (ver Ejemplos 5-6, infra), o por espectroscopia de resonancia plasmónica de superficie Biacore®, métodos KinExA o ECL (ver Ejemplo, 7, infra). Los anticuerpos no humanos apropiados pueden identificarse también usando los ensayos biológicos descritos en los ejemplos 8-1 1 y 16-17, infra.

Un método que se da como ejemplo para la producción de anticuerpos IL-17A anti-humanos se describe en el Ejemplo 2.

III. Humanización de Anticuerpos Específicos de IL-17A Puede usarse cualquier anticuerpo no humano apropiado como fuente para la región hipervariable de un anticuerpo anti-IL-17A de la presente invención. Las fuentes para anticuerpos no humanos incluyen pero no están limitadas a roedores (por ejemplo, de ratón, rata), lagomorfos (incluyendo conejos), vacas y primates no humanos. En su mayor parte los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de región hipervariable del receptor son reemplazados con residuos de región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo dador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad y afinidad deseadas. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador, tal como modificaciones efectuadas para retinar adicionalmente el rendimiento de los anticuerpos de la actividad biológica deseada. Para otros detalles ver, Jones et al. (1986) Nature 321 : 522-525; Reichmann et al. (1988) Nature 332: 323-329; y Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596. Los métodos para la manipulación por ingeniería genética recombinante y la producción de anticuerpos han sido descritos por ejemplo, por Boss et al. (Patente Norteamericana No. 4,816,397), Cabilly et al. (Patente Norteamericana No. 4,816,567), Law et al. (Publicación de Solicitud de Patente Europea No. 438 310) y Winter (Publicación de Solicitud de Patente Europea No. 239 400). Las variantes de secuencias de aminoácidos de anticuerpos anti-IL-17A humanizados de la presente invención pueden prepararse por introducción de cambios nucleotídicos apropiados dentro del ADN de anticuerpo IL-17A humanizado o por síntesis de péptidos. Cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución puede efectuarse para llegar a la construcción final con la condición de que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácido pueden alterar también el proceso post-translacional del anticuerpo anti-IL-17A humanizado tal como mediante el cambio del número o posición de los sitios de glicosilación. Un método útil para identificar residuos o regiones de un anticuerpo anti-IL-17A humanizado que son las localizaciones preferidas para mutagenesis se denomina "mutagenesis de escaneo de alanina" Cunningham y Wells (1989) Science 244: 1081 -1085. Se identificó un grupo de residuos objetivo (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys, y Glu) y se reemplazó con aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferiblemente alanina o polialanina) para alterar la interacción de los aminoácidos con IL-17A. Los residuos que muestran sensibilidad funcional a las sustituciones alanina, son luego refinados por introducción de otras sustituciones de aminoácidos. En una modalidad, el efecto de las mutaciones en un codón objetivo dado se determina por escaneo de alanina o por mutagenesis al azar seguido de actividad y análisis de adhesión de las variantes de anticuerpo anti-IL-17A humanizada resultantes. Las inserciones de secuencia de aminoácido incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que están comprendidas en una longitud de un reiduo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como también inserciones de intrasecuencia de residuos aminoácidos simples o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen anticuerpos anti-IL-17A humanizados con un residuo N-terminal metionilo o el anticuerpo fusionado con un marbete epítope. Otras variantes incluyen la fusión de una enzima o un polipéptido que aumenta la vida media en el suero de un anticuerpo para el N-o C-terminal. Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen por lo menos un residuo aminoácido en la molécula de anticuerpo anti-IL-17A, removido y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagenesis sustitucional incluyen los bucles hipervariables, pero se contemplan también las alteraciones de FR. Los residuos de región hipervariable o los residuos FR involucrados en la región de antígeno están generalmente sustituidos en una manera relativamente conservadora. Otras variantes de aminoácidos del anticuerpo alteran el patrón de glicosilación original del anticuerpo, por ejemplo, mediante la eliminación de una o más porciones carbohidrato y/o adición de uno o más sistios de glicosilación. La glicosilación de los anticuerpos es típicamente N-ligada u O- ligada. N-ligada se refiere a la adhesión de la porción carbohidrato a la cadena secundaria de un residuo asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina, y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la adhesión enzimática de la porción carbohidrato a la cadena secundaria asparagina. La presencia de cualqueira de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio potencial de glicosilación. La glicosilación O-ligada involucra la adhesión de N-acetilgalactosamina, lactosa oxilosa, a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque puede usarse también 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. Los sitios de glicosilación pueden agregarse a los anticuerpos de la presente invenicón mediante la inserción de una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilación N-ligado), o la adición de uno o más residuos serina o treonina (para sitios de glicosilación O-ligada). Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes de secuencia de aminoácido de anticuerpo IL-17A específico humanizado se preparan mediante una varieda de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen pero no están limitados a aislación de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos naturales) o mediante mutagenesis intermediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagenesis de PCR o mutagenesis de cartucho. Comúnmente, las variantes de secuencia de aminoácido del anticuerpo anti- IL-17A humanizado tendrán una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 50% de identidad de secuencia de aminoácido con las secuencias de aminoácido de anticuerpo humanizado originales de la cadena pesada o la cadena liviana, preferiblemente por lo menos 70%, 80%, 85%, 90%, y más preferiblemente por lo menos 95%. La identidad u homología con respecto a esta secuencia se define aquí como el porcentaje de residuos aminoácido en la secuencia experimental que son idénticos a los residuos anti-IL-17A humanizados cuando las secuencias están alineadas óptimamente (es decir, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr la identidad de secuencia porcentual máxima), y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Ningúna de las extensiones, supresiones o inserciones N-terminales, C-terminales o internas dentro de la secuencia de anticuerpo se considera que afecta la identidad u homología de secuencia. El anticuerpo humanizado puede seleccionarse entre cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo, IgM, IgG, IgD, IgA, y IgE. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. Puede usarse cualquier isotipo de IgG incluyendo IgGi, lgG2, lgG3) y lgG4. Las variantes de los isotipos IgG también están contempladas. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo. La optimización de las secuencias de dominio constante necesarias para generar la actividad biológica deseada se logra fácilmente clasificando los anticuerpos en los ensayos biológicos descritos a continuación en los ejemplos. Asimismo, cualquier clase de cadena liviana puede usarse en los compuestos y métodos presentes. Específicamente, kappa, lambda, o variantes de éstas son útiles en los presentes compuestos y métodos. Cualquier porción apropiada de la secuencia CDR del anticuerpo no humano pueden usarse para crear los anticuerpos humanizados de la presente invención. Las secuencias CDR pueden mutagenizarse por sustitución, inserción o supresión, aunque dichas mutaciones sean mínimas debido a la necesidad de mantener la especificidad y afinidad de adhesión a IL-17A. Típicamente, por lo menos el 75% de los residuos CDR de anticuerpos humanizados corresponderá con aquellos de los residuos CDR no humanos, más a menudo 90%, y aún más preferiblemente más del 95%, y frecuentemente 100%. Puede usarse cualquier porción apropiada de las secuencias FR del anticuerpo humano. Las secuencias FR pueden mutagenizarse por sustitución, inserción o supresión de por lo menos un residuo de modo que la secuencia FR es distinta de la secuencia de anticuerpo humano y no humano que se emplea. Se ha contemplado que dichas mutaciones serían mínimas. Típicamente, por lo menos el 75% de los residuos de anticuerpo humanizados corresponderán a la de los residuos FR humanos, más a menudo 90%, y más preferiblemente más del 95%. También se han contemplado los anticuerpos quiméricos o fragmentos de éstos, con la condición de que exhiban la actividad biológica deseada (Patente Norteamericana No. 4,816,567; y Morrison et al. (1984) Proc. Nati. Acad Sci. USA 81 : 6851 -6855). Tal como se observó anteriormente, los anticuerpos quiméricos típicos comprenden secuencias de dominio constante de anticuerpos de una especie ligados al dominio variable de un anticuerpo específico de antígeno obtenido de una especie diferente. Los compuestos de adhesión de la invención pueden comprender anticuerpos bioespecíficos. Tal como se usa aquí, el término "anticuerpo bioespecífico" se refiere a un anticuerpo típicamente un anticuerpo monoclonal que tiene especificidades de adhesión para por lo menos dos epítopes antigénicos diferentes. En una modalidad los epítopes son del mismo antígeno. En otra modalidad, los epítopes son de dos antígenos diferentes. Los métodos para preparar anticuerpos bioespecíficos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos bioespecíficos pueden producirse recombinantemente usando la co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena liviana de inmunoglobulina. Ver por ejemplo, Milstein et al. (1983) Nature 305: 537-39. Alternativamente, pueden prepararse anticuerpos bioespecíficos usando enlaces químicos. Ver por ejemplo, Brennan, et al. (1985) Science 229: 81. Los anticuerpos bioespecíficos incluyen fragmentos de anticuerpos bioespecíficos. Ver por ejemplo, Hollinger, et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6444-48, Gruber, et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994). Un método que es un ejemplo de la humanización de anticuerpos anti-humanos IL-17A de la presente invención se describió en el Ejemplo 3.

IV. Caracterización de los anticuerpos específicos IL-17A Los métodos descritos aquí, se usaron para generar anticuerpos monoclonales inmunorreactivos con IL-17A humano, tal como se describió con mayor detalle en los Ejemplos 2 y 3. Las figuras 1 A y 1 B muestran alineaciones de secuencia de las regiones variables de las cadenas liviana y pesada respectivamente de varios anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención. Las regiones CDR están indicadas y la numeración es de acuerdo con Kabat et al. (1991 ). Un plásmido que contiene las secuencias de ácido nucleico que codifican las cadenas liviana y pesada 16C10 humanizadas se depositaron de acuerdo con el Tratado de Budapest el 28 de Julio del 2006, en American Type Culture Collection (ATCC - Manassas, Virginia, USA) bajo el Número de Acceso PTA-7675. Los hibridomas que expresan los anticuerpos 30C10 y 23E12 se depositaron como JL7-30C10.C3 y JL7-23E12.B10, respectivamente, de acuerdo con el Tratado de Budapest del 20 de Julio del 2006, con la Colección de cultivo tipo americano (ATCC - Manassas, Virginia, USA) bajo los Números de Acceso PTA-7739 y PTA-7740. Las CDR de cadena liviana y cadena pesada de varios anticuerpos humanizados de la presente invención se proveen en los cuadros 3 y 4 respectivamente. Además, el cuadro 4 provee CDR adicionales para VH de hu 16C10 con posiciones variables en las cuales puede usarse más de un aminoácido.

CUADRO 3 Secuencias de CDR Variable de Cadena Liviana CUADRO 4 Secuencias de CDR Variable de Cadena Pesada En general las CDR para los anticuerpos humanizados son idénticas a las CDR de los anticuerpos parentales de rata, con excepción de que son CDRH2 y CDRH3 de 16C10 hum y 4C3 hum, que tienen cada uno, un cambio único de aminoácido de las respectivas CDR de rata. Aunque se obtuvieron clones independientes, los anticuerpos parentales de rata 16C10 y 4C3 son idénticos en la secuencia de la región VH y difieren en la región VL únicamente por una sustitución estructural (isoleucina en posición 15 en 16C10 es valina en 4C3). Como resultado, las CDR son idénticas para estos dos anticuerpos parentales de rata y por lo tanto para sus formas humanizadas. Se proveen secuencias para regiones VL humanizadas de los anticuerpos 16C10/4C3 y 30C10 en las SEQ ID NOS: 5 y 22, respectivamente. Se proveen secuencias para regiones VH humanizadas de anticuerpos 16C10/4C3 y 30C10 en las SEQ ID NOS: 6 y 23, respectivamente. Estos dominios variables humanizados pueden usarse para crear anticuerpos quiméricos o humanizados de longitud total agregando las secuencias de dominio constante apropiadas. Otras modalidades incluyen varias otras alteraciones en los residuos de aminoácido CDR en la cadena pesada 16C10, por ejemplo, tal como se ilustró en el cuadro 4. Con referencia a la numeración del residuo de la figura 1 B, las alteraciones descritas en el cuadro 4 (y en las SEQ ID NOS: 17 y 20) son N54A, N54Q, N60A, N60Q, M96L, M96A, M96K, M96F, M100hF, MIOOhL En una modalidad de la presente invención, se crean cadenas livianas y pesadas quiméricas del anticuerpo 16C10 anexando los dominios constantes humanos (dominio constante de cadena liviana kappa humana y dominio constante de lgG1 humana, respectivamente) a C-terminal de las regiones VL humanizadas (SEQ ID: NO: 5) y de las regiones VH (SEQ ID NO: 6). Las secuencias de cadena liviana y pesada 16C10 quiméricas se proveen en las SEQ ID NOS: 9 y 10. En otras modalidades las formas quiméricas de los anticuerpos 30C10 y 4C3 se crean fusionando los mismos dominios constantes de 16C10 quimérico a sus respectivas regiones VL y VH humanizadas (SEQ ID NOS: 22 y 23 para 30C10; SEQ ID NOS: 5 y 6 para 4C3). La forma quimérica de 4C3 humanizado sería naturalmente idéntica a la forma quimérica de 16C10 humanizado. En otra modalidad, los anticuerpos humanizados de longitud total se crean sustituyendo los residuos estructurales (es decir, aquellos residuos aminoácido en el dominio variable que no forman parte de una CDR) de los anticuerpos de formas quiméricas con secuencias estructurales de línea germinal humana, tal como se describió en forma más detallada en el Ejemplo 3. Los anticuerpos resultantes retienen únicamente las secuencias CDR de los anticuerpos de rata, con dominios constantes y secuencias estructurales reemplazadas con secuencias derivadas humanas. Las cadenas liviana y pesada de longitud total para el anticuerpo humanizado 16C10, incluyendo las secuencias de señal se proveen en las SEQ ID NOS: 2 y 4, respectivamente. En otras modalidades, se crean formas humanizadas de los anticuerpos 4C3 y 23E12 por analogía con el método descrito para 16C10, es decir, sustituyendo las secuencias estructurales humanas apropiadas en la secuencia de las versiones quiméricas de estos anticuerpos (descrito supra). Ver Ejemplo 3. En una modalidad más, las cadenas liviana y pesada de longitud total de los anticuerpos humanizados de la presente invención se clonan para obtener un péptido de señal en su N-terminal para facilitar la secreción de las células cuando se produce el anticuerpo. En una modalidad, se agrega una secuencia de señal de 19 aminoácidos a ambas cadenas, la liviana y la pesada del anticuerpo 16C10 humanizado (residuos -19 a -1 de las SEQ ID NOS: 2 y 4). Las secuencias de ADN de las cadenas liviana y pesada de longitud total 16C 0, con la secuencia de señal agregada se proveen en las SEQ ID NOS: 1 y 3. Dichas secuencias de ADN pueden clonarse y expresarse en cualquier vector de expresión apropiado para la producción de los anticuerpos humanizados de la presente invención. En otras modalidades, las secuencias de señal pueden agregarse a las cadenas liviana y pesada de los anticuerpos humanizados 30C10 y 4C3, tal como se describió para el anticuerpo 16C10. En otras modalidades, se agregan péptidos de secuencia de señal que son diferentes de la secuencia de señal específica provistas en las SEQ ID NOS: 1 -4, dependiendo del método de producción de anticuerpos propuestos. Dichas secuencias de señal pueden obtenerse de la literatura científica, por ejemplo, Choo et al. (2005) "SPdb - a signal peptide datábase," BMC Bioinformatics 6:249. En otras modalidades, diferentes dominios constantes pueden anexarse a las regiones VL y VH humanizadas provistas aquí. Por ejemplo, si un uso particular propuesto para un anticuerpo (o fragmento) de la presente invención fuera destinado a funciones efectoras alteradas, puede usarse un dominio constante de cadena pesada distinto de lgG1 . Aunque los anticuerpos de lgG1 proveen una vida media prolongada y funciones efectoras tales como activación de complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, dichas actividades pueden no ser deseables para todos los usos del anticuerpo. En tales casos, puede usarse por ejemplo, un dominio constante de lgG4.

V. Afinidad y actividad biológica de anti-IL-17A humanizado Los anticuerpos que tienen las características identificadas aquí, como deseables en un anticuerpo anti-IL-17A humanizado, pueden ser clasificadas para determinar la actividad biológica inhibidora in vitro, in vivo, o midiendo la afinidad de adhesión. Para clasificar anticuerpo que se adhieren al mismo epítope en IL-17A humana adherida por un anticuerpo de interés, (por ejemplo, aquellos que bloquean la adhesión de la citocina a su receptor), puede llevarse a cabo un ensayo de rutina de bloqueo cruzado tal como el que se describió en ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988). Alternativamente, puede llevarse a cabo un mapeo de epítopes para determinar si el anticuerpo se adhiere a un epítope de interés, por ejemplo, tal como se describió en Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394. Las afinidades de anticuerpos (por ejemplo, para IL-17A humana) pueden determinarse usando métodos convencionales, que incluyen los que se describen en el Ejemplo 7. Los anticuerpos humanizados preferidos son aquellos que se adhieren a IL-17A humana con un valor K<j de no más de aproximadamente 100 nM (1 x10'7 M); preferiblemente no más de aproximadamente 10nM; más preferiblemente no más de aproximadamente 1 n M. Se prefieren aún más las modalidades en las cuales los anticuerpos tienen valores Kd de no más de aproximadamente 200 pM (2x10"10 M), 100 pM, 50 pM, 20 pM, 10 pM, 5pM o incluso 2 pM. Los anticuerpos y fragmentos de los mismos, útiles en los presentes compuestos y métodos incluyen pero no están limitados a anticuerpos y fragmentos biológicamente activos. Tal como se usa aquí, el término "biológicamente activo" se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es capaz de adherir el epítope antigénico deseado y ejercer directa o indirectamente un efecto biológico. Típicamente, estos efectos son el resultado del fracaso de IL-17A para adherirse a su receptor. Tal como se usa aquí, el término "específico" se refiere a la adhesión selectiva del anticuerpo, al epítope antigénico objetivo. Los anticuerpos pueden ensayarse para la especificidad de adhesión, comparando la adhesión a IL-17A para adherirse a un antígeno o mezcla antigénica y relevante bajo un conjunto de condiciones determinadas. Un anticuerpo se considera específico si se adhiere a IL-17A con una afinidad de por lo menos 10 veces, y preferiblemente 50 veces más que su afinidad para un antígeno o mezcla de antígeno irrelevante. Un anticuerpo que se "adhiere específicamente" a una proteína que comprende IL-17A (o un fragmento de ésta), no se adhiere a proteínas que no comprenden las secuencias derivadas de IL-17A, es decir, "especificidad" tal como se usa aquí, se refiere a especificidad de IL-17A, y no a cualquiera otras secuencias que pueden estar presentes en la proteína en cuestión. Por ejemplo, tal como se usa aquí, un anticuerpo que se "adhiere específicamente" a FLAG-hlL-17A, que es una proteína de fusión que comprende IL-17A y un marbete de péptido FLAG , no se adhiere al marbete de péptido FLAG® solo o cuando está fusionado a una proteína distinta de IL-17A. Los datos que se presentan en los Ejemplos siguientes muestran (por ejemplo el Ejemplo 7) que el anticuerpo humanizado 16C10 (incluyendo las sustituciones N54Q y M96A relativas a las CDR de cadena pesada parental de rata) tienen una afinidad elevada para la adhesión a IL-17A humano, con un K<j en el intervalo de 1 -10 pM tal como se determina por análisis KinExA. Los ensayos de actividad in vitro tales como el ensayo de proliferación de células Ba/F3 hlL-17Rc-GCSFR (Ejemplo 1 ), el ensayo de fibroblasto dérmico humano normal (NHDF) (Ejemplo 9), y el ensayo de sinoviocito de artritis reumatoidea humana (RA) (Ejemplo 8) confirman que el hu16C10 es un anticuerpo de alta afinidad debido a que los valores CI50 observados fueron típicamente inferiores a o iguales al 50% de la concentración de hlL-17A que está presente en el ensayo (100 pM, 1000 pM, y 1000 pM en los tres ensayos, respectivamente). El carácter bivalente de los anticuerpos usados en los experimentos y el potencial para la formación de dímero IL-17A, hacen posible lograr el 50% de inhibición de una concentración determinada de IL- 7A con menos de 0.5 equivalentes molares de anticuerpo. Los ensayos de actividad in vivo tales como la administración a ratones que exhiben artritis inducida por colágeno (Ejemplo 16) y el ensayo de reclutamiento de neutrófilos BAL (Ejemplo 17) confirman la actividad de varios de los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención en animales. Los ensayos de actividad in vitro e in vivo confirman también que el anticuerpo 16C10 humanizado es un anticuerpo neutralizador, que no era conocido en los experimentos de adhesión solamente. La capacidad de varios de los anticuerpos de la presente invención para adherirse a cyno IL-17A así como también a IL-17 A humana es ventajosa debido a que dicho potencial anticuerpo terapéutico puede usarse directamente en monos cynomolgus (macacos) para estudios de toxicología en vez de tener que desarrollar un anticuerpo específico cyno para dichos estudios. La alta afinidad de varios de los anticuerpos de la presente invención es también ventajosa porque puede reducir la dosis requerida en humanos (y otros) sujetos, lo cual reduce la probabilidad de ciertas reacciones adversas. Además, la afinidad elevada puede reducir el volumen que debe ser administrado a un sujeto y reducir el costo del tratamiento. La vida media en el suero de hu16C10 se midió en ratones y en monos cynomolgus. En cyno, la vida media después de administración intravenosa (iv) se evaluó en un estudio de gamas de dosis de 0.4, 4.0 y 40 mg/kg de dosis. Las concentraciones de fármaco en el suero se midieron periódicamente durante 42 días. La vida media para la administración subcutánea (se) en cyno se determinó en dosis de 4 mg/kg, lo cual fue también seguido de 42 días. La vida media en monos cynomolgus fue de 10-19 días iv y 28 días se medida por la pendiente terminal de la concentración de fármaco versus perfil de tiempo. Algunos puntos de datos anómalos en dosis superiores fueron excluidos del análisis. Experimentos similares en ratones mostraron que el anticuerpo hu16C10 tenía una vida media de 13-25 días iv y 12-22 días se. El Ejemplo 19 describe métodos usados para determinar el epítope adherido con un anticuerpo anti-IL-17A ejemplar de la presente invención (16C10), es decir, residuos en la región de L74-Y85 de IL-17A humana (SEQ ID NO: 40). Debido a que los datos de ensayos biológicos presentados aquí, demuestran que el anticuerpo 16C10 es un anticuerpo neutralizador de alta afinidad, puede esperarse que otros anticuerpos que se adhieren al mismo epítope serán anticuerpos neutralizadores y quizás tendrán también la afinidad de adhesión elevada. El epítope tal como se determina aquí, se obtiene por mediciones funcionales en vez de determinaciones de estructura, y los epítopes mencionados aquí pueden diferir en detalle del epítope determinado por métodos estructurales. El epítope que se informa aquí, incluye por lo menos algunos, pero no necesariamente todos los residuos aminoácidos que son importantes para adhesión 16C10 al anticuerpo. El epítope adherido por los anticuerpos de la presente invención puede determinarse también por otros métodos tales como experimentos de bloqueo cruzado (ver ejemplo 12) o por métodos estructurales tales como determinación de la estructura cristalina por rayos X. Anticuerpos adicionales que se adhieren al mismo epítope tales como el anticuerpo 16C10 pueden obtenerse por ejemplo, clasificando los anticuerpos creados contra hlL-17A, o por inmunización de una animal con un péptido que comprende la secuencia de epítopes.

V. Producción de anticuerpos Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico que codifica es aislado e insertado dentro de un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal es rápidamente aislado y secuenciado usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de adherirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y liviana del anticuerpo). Muchos vectores se encuentran disponibles. Los componentes del vector incluyen generalmente pero no están limitados a uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento realzador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. En una modalidad, tanto las cadenas liviana como la pesada del anticuerpo anti-IL-17A humanizado de la presente invención se expresaron a partir del mismo vector, por ejemplo un plásmido o un vector adenoviral. Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse mediante cualquier método conocido en la técnica. En una modalidad, los anticuerpos se expresan en células de mamíferos o insectos, en cultivos tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñon embriónico humano (HEK) 293, células NSO de mieloma de ratón, células de riñon de hámster bebé (BHK), células de ovario Spodoptera frugiperda (Sf9). En una modalidad, los anticuerpos secretados a partir de células CHO se recuperaron y purificaron por métodos cromatográficos convencionales tales como proteína A, intercambio catiónico, intercambio aniónico, interacción hidrofóbica y cromatografía de hidroxiapatita. Los anticuerpos resultantes se concentraron y almacenaron en 20 mM de acetato de sodio, a pH 5.5. En otra modalidad, los anticuerpos de la presente invención se produjeron en levadura de acuerdo con los métodos descritos en WO2005/040395. Brevemente, los vectores que codifican las cadenas liviana o pesada individuales de un anticuerpo de interés se introducen en diferentes células de levadura haploide, por ejemplo, tipos de apareamiento diferentes de la levadura Pichia pastons, cuyas células de levadura aploides son opcionalmente auxotrofos complementarios. Las células de levadura haploides transformadas pueden ser luego apareadas o fusionadas para proporcionar una célula de levadura diploide capaz de producir a ambas, las cadenas pesadas y las livianas. La cepa diploide es luego apta para secretar el anticuerpo completamente ensamblado y biológicamente activo. Los niveles de expresión relativos de las dos cadenas pueden optimizarse, por ejemplo, mediante el uso de vectores con números de copia diferentes usando promotores transcripcionales de resistencia diferente o induciendo expresión de promotores inducibles que guian la transcripción de los genes que codifican una o ambas cadenas. En una modalidad, las respectivas cadenas pesada y liviana de una pluralidad de anticuerpos antilL-17A diferentes (los anticuerpos "originales") se introducen dentro de las células haploides de levadura para crear una colección de cepas de levadura haploides de un tipo de apareamiento que expresa una pluralidad de cadenas livianas, y una colección de cepas de levadura haploides de un tipo de apareamiento diferente que expresa una pluralidad de cadenas pesadas. Estas colecciones de cepas haploides pueden ser apareadas (o fusionadas como esferoplastos) para producir una serie de células de levadura diploides que expresan una colección combinatoria de anticuerpos constituida por varias permutaciones posibles de cadenas livianas y pesadas. La colección combinatoria de anticuerpos puede ser luego rastreada para determinar si cualquiera de los anticuerpos tiene propiedades que son superiores (por ejemplo, de afinidad superior para IL-17A) que aquellas de los anticuerpos originales. Ver por ejemplo, WO2005/040395. En otra modalidad, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos de dominio humano en los cuales porciones de un dominio variable de anticuerpo están ligadas en un polipéptido de un peso molecular de aproximadamente 13 kDa. Ver por ejemplo, la Publicación de Patente Norteamericana No. 2004/01 10941. Dichos agentes de dominio único, de bajo peso molecular proveen numerosas ventajas en términos de facilidad de síntesis, estabilidad y vía de administración.

VI. Composiciones Farmacéuticas y Administración Para preparar composiciones farmacéuticas o estériles de los anticuerpos anti-hulL-17A de la presente invención, el anticuerpo se mezcla con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Ver por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences y U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984). Las formulaciones de agentes terapéuticos y de diagnóstico pueden prepararse mezclando con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables en forma de, por ejemplo, polvos liofilizados, suspensiones, soluciones o suspensiones acuosas (ver por ejemplo, Hardman, et al. (2001 ) Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science y Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, y Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity y Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY). En una modalidad, los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención se diluyeron hasta una concentración apropiada en una solución de acetato de sodio a pH 5-6, y se agregó NaCI o sucrosa para tonicidad. Pueden agregarse para mejorar la estabilidad agentes adicionales tales como polisorbato 20 o polisorbato 80. La toxicidad y eficacia terapéutica de las composiciones de anticuerpo, administradas solas o en combinación con otro agente, puede ser determinada mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos de células o en animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal hasta 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico (DL5o/DE50). Se prefieren anticuerpos que exhiben índices terapéuticos elevados. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo de células y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosis para ser usadas en seres humanos. La dosis de dichos compuestos está preferiblemente comprendida entre un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. Las dosis pueden variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosis empleada y de la vía de administración. El modo de administración no es particularmente importante. Las vías apropiadas de administración incluyen administración oral, rectal, transmucosal o intestinal; liberación parenteral que incluye inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como también, inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares. La administración puede llevarse a cabo en una variedad de formas convencionales tales como ingestión oral, inhalación, insuflación, aplicación tópica o cutánea, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, parenteral, intraarterial o intravenosa. Se prefiere la administración intranvenosa para el paciente. Alternativamente, puede administrarse el anticuerpo en una manera local en vez de sistémica, por ejemplo, a través de inyección del anticuerpo directamente en una articulación artrítica o en una lesión inducida por patógenos, caracterizada por inmunopatología, a menudo en una formulación de depósito o de liberación sostenida. Además, puede administrarse el anticuerpo en un sistema de liberación del fármaco dirigido por ejemplo en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico de tejido, que apunta por ejemplo, a una articulación artrítica o a una lesión inducida por patógeno, caracterizada por inmunopatología. Los liposomas serán dirigidos a, y recogidos selectivamente por el tejido dañado. El régimen de administración depende de varios factores, que incluyen la tasa de cambio en el suero o tejido del anticuerpo terapéutico, el nivel de síntomas, la inmunogenicidad del anticuerpo terapéutico, y la accesibilidad de las células objetivo en la matriz biológica. Preferiblemente, el régimen de administración libera suficiente anticuerpo terapéutico para efectuar la mejoría del estado de enfermedad objetivo al mismo tiempo que minimiza simultáneamente los efectos secundarios indeseables. Por consiguiente, la cantidad de biológico liberado depende en parte del anticuerpo terapéutico particular y la severidad de la condición a ser tratada. Una guía para seleccionar las dosis apropiadas de anticuerpos terapéuticos se encuentra disponible (ver, por ejemplo, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, RU; Kresina (ed.) (1991 ) Monoclonal Antibodies, Cytokines y Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies y Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601 -608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med. 341 :1966-1973; Slamon et al. (2001 ) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Meó. 342:613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602). La determinación de la dosis apropiada es determinada por el clínico, por ejemplo, usando parámetros o factores conocidos o que se sospecha en la técnica que afectan el tratamiento. En general la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis óptima y se aumenta en pequeños incrementos a continuación hasta que se logra el efecto deseado u óptimo con relación a cualquier efecto secundario negativo. Las mediciones de diagnóstico importantes incluyen aquellos de los síntomas de, por ejemplo inflamación o nivel de citocinas inflamatorias producidas. Preferiblemente, un biológico que se usará se deriva de la misma especie que el animal designado como objetivo para el tratamiento, minimizando de esta manera una respuesta inflamatoria, autoinmune o proliferativa para el reactivo. En el caso de sujetos humanos, por ejemplo, se prefieren anticuerpos quiméricos, humanizados y completamente humanos. Los anticuerpos, los fragmentos de anticuerpos y las citocinas pueden proveerse por infusión continua, o por dosis administradas por ejemplo diariamente, 1 -7 veces por semana, semanalmente, bisemanalmente, mensualmente, bimensualmente, etc. Las dosis puede proveerse intravenosamente, subcutáneamente, tópicamente, oralmente, nasalmente, rectalmente, intramuscularmente, intracerebralmente, intraespinalmente o por inhalación. Una dosis semanal total es generalmente de por lo menos 0.05 pg/kg de peso corporal, más generalmente de por lo menos 0.2 pg/kg, 0.5 pg/kg, 1 pg/kg, 10 pg/kg, 100 pg/kg, 0.25 mg/kg, 1 .0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/ml, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg o más (ver por ejemplo, Yang, et al. (2003) New Engl. J. Meó. 349:427-434; Herold, et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu, et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451 -456; Portielji, et al. (20003) Cáncer Immunol. Immunother. 52:133-144). Pueden proveerse también dosis para lograr una concentración objetivo predeterminada del anticuerpo anti- IL-17A en el suero del sujeto, tal como de 0.1 , 0.3, 1 , 3, 10, 30, 100, 300 pg/ml o más. En otras modalidades, se administra un anticuerpo anti-IL-17A humanizado de la presente invención por vía subcutánea o intravenosa, en una base semanal, bisemanal o "cada cuatro semanas" de 10, 20, 50, 80, 00, 200, 500, 000 o 2500 mg/sujeto. Tal como se usa aquí, "inhibir" o "tratar" o "tratamiento" incluye posponer el desarrollo de los síntomas asociados con un trastorno y/o una reducción en la gravedad de los síntomas de dicho trastorno. Los términos incluyen además, mejorar los síntomas descontrolados existentes o indeseables, previniendo síntomas adicionales y mejorando o previniendo las causas subyacentes de dichos síntomas. Por lo tanto, los términos denotan que se ha conferido un resultado beneficioso en un sujeto vertebrado con un trastorno, enfermedad o síntoma o con potencial para desarrollar dicho trastorno, enfermedad o síntoma. Tal como se usan aquí, los términos "cantidad terapéuticamente eficaz", "dosis terapéuticamente eficaz" y "cantidad eficaz" se refieren a una cantidad de compuestos de adhesión a IL-17A de la invención que cuando es administrado solo o en combinación con un agente terapéutico adicional a una célula, tejido o sujeto, es eficaz para prevenir o mejorar uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno o el avance de dicha enfermedad o trastorno. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere además, a esa cantidad de compuestos de adhesión que es suficiente para dar como resultado un mejoramiento de los síntomas, por ejemplo, el tratamiento, curación, prevención o mejoramiento del trastorno médico relevante o un aumento de la velocidad del tratamiento, la curación, prevención o mejoramiento de dichos trastornos. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual administrado solo, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a ese ingrediente solamente. Cuando se aplica a una combinación, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan como resultado un efecto terapéutico, tanto si se administran en combinación, en serie o simultáneamente. Una cantidad eficaz de un terapéutico dará como resultado una mejoría de una medida o parámetro de diagnóstico de por lo menos 10%, usualmente de por lo menos 20%; preferiblemente de por lo menos aproximadamente 30%; más preferiblemente de por lo menos 40%, y aún más preferiblemente de por lo menos 50%. Los métodos de co-administración con un segundo agente terapéutico, por ejemplo, citocina, otro anticuerpo terapéutico, esteroide, agente quimioterapéutico o antibiótico son bien conocidos en la técnica, ver por ejemplo, Hardman, et al. (eds.) (2001 ) Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole y Peterson (eds.) (2001 ) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner y Longo (eds.) (2001 ) Cáncer Chemotherapy y Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA. La composición farmacéutica de la invención puede contener también agentes inmunosupresores o inmunomoduladores. Puede emplearse cualquier agente inmunosupresor apropiado, incluyendo pero sin limitarlo a agentes antiinflamatorios, corticosteroides, ciclosporina, tacrolimos (es decir, FK-506), sirolimus, interferones, receptores citocina solubles (por ejemplo, sTNRF y slL-1 R), agentes que neutralizan la actividad de las citocinas (por ejemplo, inflixmab, etanercept), micofenolato mofetil, 15-desoxispergualina, talidomida, glatiramero, azatioprina, leflunomida, ciclofosfamida, metotrexato, y similares. La composición farmacéutica puede emplerarse también con otras modalidades terapéuticas tales como fototerapia y radiación. Los compuestos que se adhieren a IL-17A de la presente invención pueden usarse también en combinación con el uno o más antagonistas de otras citocinas (por ejemplo, anticuerpos), incluyendo pero sin limitarlo a IL-23, IL-1 ß, IL-6 y TGF-ß. Ver por ejemplo, Veldhoen (2006) Immunity 24:179-189; Dong (2006) Nal Rev. Immunol. 6(4):329-333. En varias modalidades, un compuesto de adhesión IL-17A de la invención se administran antes, concurrentemente con o después de la administración del otro u otros antagonistas. En una modalidad, un compuesto de adhesión a IL- 17A de la presente invención se usa en tratamientos de la fase inicial aguda de una respuesta inmune adversa (por ejemplo, MS, Enfermedad de Crohn) sola o en combinación con un antagonista IL-23. En este último caso, el compuesto de adhesión IL-17A puede ser disminuido gradualmente, y se puede continuar el tratamiento con el antagonista de IL-23 para mantener la supresión de la respuesta adversa. Alternativamente, los antagonistas para IL-1 ß, IL-6 y/o TGF-ß pueden administrarse concurrentemente, antes o después de un compuesto de adhesión IL-17A de la presente invención. Ver Cua y Kastelein (2006) Nat. Immunol. 7:557-559; Tato y O'Shea (2006) Nature 441 :166-168; Iwakura y Ishigame (2006) J. Clin. Invest. 1 16:1218-1222. Los sujetos veterinarios experimentales o de investigación típicos incluyen monos, perros, gatos, ratas, ratones, conejos, conejillas de india, caballos y seres humanos.

VII. Usos La presente invención provee métodos para usar anticuerpos anti-IL-17A de ingeniería genética para el tratamiento y diagnóstico de trastornos y condiciones inflamatorias así como también, trastornos autoinmunes y proliferativos. Se proveen métodos para el diagnóstico, prevención o tratamiento de la enfermedad de inflamación intestinal (IBD), esclerosis múltiple (MS), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), fibrosis quística (CF), psoriasis, escleroderma sistémico, rechazo a los aloinjertos, miocarditis autoinmune y adhesiones perifonéales (ver por ejemplo, Chung et al. (2002) J. Exp. Meó. 195:1471 -78).

Psoriasis La piel sirve como una importante frontera entre el medio interno y el medio ambiente, previendo el contacto con antígenos potencialmente dañinos. En el caso de penetración de antígeno/patógeno se induce una respuesta inflamatoria para eliminar el antígeno. Esta respuesta conduce a una infiltración dérmica que consiste predominantemente en células T, células polimorfonucleares y macrófagos (ver, por ejemplo, Williams y Kupper (1996) Life Sci., 58:1485-1507). Normalmente, esta respuesta inflamatoria, desencadenada por el patógeno, está bajo un estrecho control y será detenida mediante la eliminación del patógeno. En ciertos casos esta respuesta inflamatoria ocurre sin estímulos externos y sin controles apropiados, lo cual conduce a inflamación cutánea. La presente invención provee métodos para tratar y diagnosticar inflamaciones cuténeas. La inflamación cutánea, el resultado de la infiltración celular comentada anteriormente así como también las citocinas secretadas de estas células, abarca varios trastornos inflamatorios tales como penfigoides cicatricial, escleroderma, hidradenitis supurativa, necrolisis epidérmica tóxica, acné, osteítis, enfermedad de injerto versus huésped (GvHD), piroderma gangrenoso y Síndrome de Behcet (ver por ejemplo, Willams y Griffiths (2002) Clin. Exp. Dermatol., 27:585-590). La forma más común de inflamación cutánea es la psoriasis.

La psoriasis se caracteriza por hiperproliferacion de queratinocitos intermediados por células T, acoplados con una infiltración inflamatoria. La enfermedad tiene ciertos fenotipos clínicos superpuestos distintos que incluyen lesiones crónicas de placa, erupciones en la piel y lesiones pusturales (ver, por ejemplo, Gudjonsson et al. (2004) Clin Exp. Immunol. 135:1 -8). Aproximadamente el 10% de los pacientes con psoriasis desarrollan artritis. La enfermedad tiene una predisposición genética fuerte pero compleja, con 60% de concordancia en gemelos monocigóticos. La lesión psoriática típica es una placa eritematosa bien definida cubierta por escamas gruesas, plateadas. La inflamación e hiperproliferacion de tejido psoriático está asociado con un perfil histológico, antigénico y de citocinas diferente al de la piel normal. Entre las citocinas asociadas con psoriasis están: TNFa, IL-19, IL-18, IL-15, IL-12, IL-7, IFNy, IL-17A y IL-23 (ver Gudjonsson et al., supra). Se ha detectado IL-17A en piel psoriática. Los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención, solos o en combinación con otros agentes, pueden usarse en la prevención, tratamiento, diagnóstico y predicción de brotes agudos de psoriasis. El uso de anticuerpos anti- IL-17A en la predicción y tratamiento de erupciones psoriáticas, se describe en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana comúnmente asignada 2005/0287593 y la Publicación de Patente PCT WO 2005/108616, cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

Artritis Reumatoide (RA) La RA es una enfermedad sistémica, progresiva que se caracteriza por inflamación de las articulaciones sinoviales que afectan aproximadamente 0.5% de la población mundial. Emery (2006) £ 7 332: 152-155. La inflamación de las articulaciones puede conducir a deformidad, dolor, rigidez e hinchazón, y finalmente a deterioro irreversible de las articulaciones. Las articulaciones afectadas incluyen rodillas, codos, cuello y articulaciones de las manos y pies. El tratamiento convencional involucra el uso de NSAID para aliviar los síntomas, seguido de administración de fármacos antireumáticos modificadores de la enfermedad (DMARD) tales como, oro, penicilamina, sulfasalazina y metotrexato. Avances recientes incluyen tratamiento con inhibidores de TNF-oc que incluyen anticuerpos monoclonales, tales como infliximab, adalumimab y golimumab, y proteínas de fusión tales como etanercept. El tratamiento con estos inhibidores de TNF-a reduce drásticamente el daño estructural de la enfermedad. Los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención pueden usarse para tratar RA en sujetos que necesitan dicho tratamiento. El ejemplo 16 describe experimentos que involucran el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) modelo de RA, para la cual se presentan datos en las figuras 3A-3D, y cuadro 15. Los resultados muestran una reducción en la fracción de patas con marcas elevadas de gravedad de la enfermedad en animales tratados con un anticuerpos anti -IL-17A de la presente invención en comparación con controles diluyentes y de isotipo.

Los anticuerpos anti-IL-17A de la prsente invención pueden combinarse también con otros tratamientos de RA, por ejemplo, metotrexato, azatioprina, ciclofosfamida, esferoides, micofenolato mofetil, NSAID, o inhibidores de TNF-a (anticuerpos o fragmentos receptores). En una modalidad, los anticuerpos anti-tL-17A de la presente invención se usan para tratar sujetos humanos que no han respondido previamente en forma adecuada a los tratamientos con DMARD solo. En otras modalidades, el tratamiento con anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención se inicia tempranamente en el curso de la enfermedad, sin requerir un fracaso previo de terapia con DMARD. Dicha intervención inicial puede ser apropiada por ejemplo, una vez que se ha establecido firmemente la seguridad de la terapia con anticuerpos. Las mejoras clínicas se miden determinando el resultado de ACR tal como se describe en forma más detallada en el Ejemplo 18. En varias modalidades los resultados de ACR de 20, 50, y 70 son el punto final deseado, y estos puntos finales pueden ser verificados en cualquier punto apropiado en el curso del tratamiento tal como 5, 10, 15, 24, 40, 50 o más semanas.

Esclerosis Múltiple (MS) La MS se considera que es una enfermedad autoinmune del sistema nervioso central (SNC) que involucra la pérdida de mielina de las fibras nerviosas, lo cual da como resultado placas o lesiones. La forma más común es la recaída/remición de la MS donde ocurren brotes sintomáticos bien definidos, seguido de períodos de remisión parcial o completa. Las opciones de tratamiento convencionales incluyen interferon- -1a y -1 b, mitoxantrona, el tetrapéptido acetato de glatimero, los anticuerpos terapéuticos específicos de alfa-4-integrina (natalizumab), o antagonistas de moléculas pequeñas de alfa-4-integrina (por ejemplo, aquellas descritas en WO2003/084984). Los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención pueden usarse para tratar MS en sujetos que necesitan dicho tratamiento. Los anticuerpos antilL-17A pueden combinarse también con otros tratamientos para MS, por ejemplo, interferón-ß, interíerón-a, esferoides o anticuerpos alfa-4-integrina-específicos.

Enfermedad Inflamatoria del Intestino (IBP) La IBD es el nombre para un grupo de trastornos (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa) en las cuales los intestinos se inflaman, lo cual da como resultado calambres y dolor abdominal, diarrea, pérdida de peso y sangrado intestinal. La IBD afecta más de 600,000 americanos. Las opciones para tratamiento convencional incluyen sulfasalacina, corticoestoerides (por ejemplo, prednisona), supresores del sistema inmune tales como azatioprina y mercaptopurina, o un antibiótico (por ejemplo, metronidazol) para la enfermedad de Crohn. Los tratamientos terapéuticos con anticuerpos monoclonales incluyen etanercept, natalizumab e infliximab. Los anticuerpos anti-IL-17A pueden usarse para tratar IBD en sujetos que necesitan dicho tratamiento. Yen et al. (2006,) J. Clin. Invest. 1 16:1310-1316; Fujimo et al. (2003) Gut 52:65-70. Los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención pueden combinarse también con otros tratamientos para IBD, por ejemplo, IL-10 (ver Patentes Norteamericanas Nos. 5,368,854, 7,052,686), esteroides y sulfasalazina. En otras modalidades, los anticuerpos de la presente invención no bloquean la adhesión de IL-17A a su receptor (por ejemplo, el anticuerpo no neutralizador 12E6) que se usan terapéuticamente para estabilizar IL-17A in sujetos que lo necesitan para una actividad IL-17A. Dichos sujetos incluyen pacientes que sufren de infecicones o cánceres. Pueden efectuarse muchas modificaciones y variaciones de esta invención sin apartarse de su espíritu y alcance, como resultará aparente para los expertos en la técnica. La invención se define en términos de las reivindicaciones anexas junto con el alcance total de equivalentes a los cuales pueden aspirar dichas reivindicaciones. Las modalidades específicas que se describen aquí, incluyen los ejemplos siguientes, que se ofrecen a modo de ejemplo únicamente, y no limitan, por sus detalles, el alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Métodos Generales Los métodos convencionales en biología molecular han sido descritos por (Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY; Sambrook y Russell (2001 ) Molecular Cloning, 3a ed., Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). Los métodos convencionales aparecen también en Ausbel, et al. (2001 ) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley y Sons, Inc. New York, NY, que describen clonación en células bacterianas y mutagénesis de ADN (Vol. 1 ), clonación en células de mamífero y levaduras (Vol. 2), glicoconjugados y expresión de proteínas (Vol. 3), y bioinformática (Vol. 4). Se describen métodos para purificación de proteína que incluyen inmunoprecipitación, cromatografía, electrofóresis, centrifugación y cristalización (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley y Sons, Inc., New York). El análisis químico, las modificaciones químicas, la modificación post-translacional, la producción de proteínas de fusión, la glicosilación de proteínas se describen en (ver, por ejemplo, Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley y Sons, Inc., New York; Ausubel, et al. (2001 ) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley y Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001 ) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001 ) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391 ). La producción, purificación y fragmentación de anticuerpos policlonales y monoclonales se describen (Coligan, et al. (2001 ) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley y Sons, Inc., New York; Harlow y Lañe (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow y Lañe, supra). Se encuentran disponibles técnicas convencionales para caracterizar las interacciones de ligando/receptor (ver por ejemplo, Coligan, et al. (2001 ) Current Protcols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York). Pueden prepararse anticuerpos monoclonales, policlonales y humanizados (ver, por ejemplo, Sheperd y Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY; Kontermann y Dubel (eds.) (2001 ) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York; Harlow y Lañe (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 139-243; Carpenter, et al. (2000) J. Immunol. 165:6205; He, et al. (1998) J. Immunol. 160:1029; Tang et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371 -27378; Baca et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883; Foote y Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499; Patente Norteramericana No. 6,329,51 1 ). Una alternativa para la humanización consiste en usar colecciones de anticuerpos humanos exhibidos en colecciones de fagos o anticuerpos humanos en ratones transgénicos (Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1 :837-839; Méndez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Hoogenboom y Chames (2000) Immunol. Today 21 :371 -377; Barbas et al. (2001 ) Phage DisplayA Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Kay et al. (1996) Phage Display of Peptides y Proteins:A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruin et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:397-399). Los anticuerpos y diacuerpos de cadena única se han descrito (ver por ejemplo, Malecki et al. (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99:213-218; Conrath et al. (2001 ) J. Biol. Chem. 276:7346-7350; Desmyter et al. (2001 ) J. Biol. Chem. 276:26285-26290; Hudson y Kortt (1999) J. Immunol. Methods 231 :177-189; y Patente Norteamericana No. 4,946,778). Se proveen anticuerpos bifuncionales (ver por ejemplo, Mack, et al. (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:7021 -7025; Cárter (2001 ) J. Immunol. Methods 248:7-15; Volkel, et al. (2001 ) Protein Engineering 14:815-823; Segal, et al. (2001 ) J. Immunol. Methods 248: 1 -6; Brennan, et al. (1985) Science 229:81 -83; Raso, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:27623; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Traunecker, et al. (1991 ) EMBO J. 10:3655-3659; y Patentes Norteamericanas. Nos. 5,932,448, 5,532,210, y 6,129,914). Se proveen también anticuerpos bioespecíficos (ver por ejemplo, Azzoni et al. (1998) J. Immunol. 161 :3493; Kita et al. (1999) J. Immunol. 162:6901 ; Merchant et al. (2000) J. Biol. Chem. 74:91 15; Pandey et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:38633; Zheng et al. (2001 ) J. Biol Chem. 276:12999; Propst et al. (2000) J. Immunol. 165:2214; Long (1999) Ann. Rev. Immunol. 17:875). La purificación de antígeno no es necesaria para la generación de anticuerpos. Los animales pueden ser inmunizados con células portadoras del antígeno de interés. Los esplenocitos pueden ser luego aislados de animales inmunizados, y dichos esplenocitos pueden fusionarse con una línea de célula de mieloma para producir un hibridoma (ver, por ejemplo, Meyaard et al. (1997) Immunity 7:283-290; Wright et al. (2000) Immunity 13:233-242; Preston et al., supra; Kaithamana et al. (1999) J. Immunol. 163:5157-5164). Los anticuerpos usualmente se adherirán con por lo menos un K, de aproximadamente 10"6 M, típicamente por lo menos 10'7 M, más típicamente por lo menos 10"8 M, preferiblemente por lo menos aproximadamente 10'9 M, y más preferiblemente por lo menos 10"10 M, y más preferiblemente por lo menos 10"11 M (ver por ejemplo, Presta et al. (2001 ) Thromb. Haemost. 85:379-389; Yang et al. (2001 ) Crít. Rev. Oncol. Hematol. 38: 17-23; Carnahan et al. (2003) Clin. Cáncer Res. (Suppl.) 9:3982s-3990s). Los anticuerpos pueden conjugarse, por ejemplo, con moléculas pequeñas de fármacos, enzimas, liposomas, polietilenglicol (PEG). Los anticuerpos son útiles para propósitos terapéuticos, de diagnóstico, para equipos u otros propósitos, e incluyen anticuerpos acoplados, por ejemplo a tintes, radioisótopos, enzimas o metales, por ejemplo, oro coloidal (ver por ejemplo, Le Doussal et al. (1991 ) J. Immunol. 146:169-175; Gibellini et al. (1998) J. Immunol. 160:3891 -3898; Hsing y Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-281 1 ; Everts et al. (2002) J. Immunol. 168:883-889).

Los métodos para citometría de flujo, incluyendo la distribución de células activadas por fluorescencia (FACS), se encuentran disponibles (ver, por ejemplo Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principies for Clinical Laboratory Practice, John Wiley y Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001 ) Flow Cytometry, 2a ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practica! Flow Cytometry, John Wiley y Sons, Hoboken, NJ). Los reactivos fluorescentes apropiados para modificar ácidos nucleicos incluyendo iniciadores y sondas de ácido nucleico, polipéptidos y anticuerpos para ser usados por ejemplo como reactivos de diagnóstico se encuentran disponibles (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, O; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO). Se han descrito métodos convencionales de histología del sistema inmune (ver, por ejemplo, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology y Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, y Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text y Atlas, McGraw-Hill, New York, NY). Se encuentran disponibles paquetes y bases de datos de software para determinar por ejemplo, fragmentos antigénicos, secuencias guiadoras, plegamiento de proteínas, dominios funcionales, sitios de glicosilación y alineaciones de secuencia (ver por ejemplo, GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16: 741 -742; Menne, et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741 -742; Wren, et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181 ; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21 ; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690).

EJEMPLO 2 Anticuerpos monoclonales IL-17A Anti-humanos rata Los anticuerpos monoclonales para IL-17A humana se obtuvieron de la manera siguiente. Ratas Lewis hembra de 8 semanas de vida (Harían Sprague Dawley, Indianapolis, Indiana, USA) recibieron una serie de inyecciones de IL-17A humano recombinante (rhlL-17A) que había sido expresado de vectores adenovirales en células HEK 293. Las inyecciones se administraron en los días 0, 14, 32, 46, y 83. La inyección del día 0 fue una inyección subcutánea (se) de 50 pg rhlL-17A, acompañada de inyección intraperitoneal (ip) de adyuvante Completo de Freund. El día 14, 32 y 46 inyecciones se de 25 pg rhlL-17A fueron acompañadas de una inyección ip de adyuvante Incompleto de Freund. El día 83 la inyección fue una combinación de una inyección ip de 20 g rhlL-17A en adyuvante Incompleto de Freund y una inyección en la vena intravenosa de la cola (iv) de rhlL-17A en solución salina. Se efectuó un sangrado de ensayo en el día 53. La fusión de esplenocitos de rata se efectuó en el día 87, usando 1 .6 X 108 esplenocitos y 1 .8 X 108 células de mieloma divididas en 30 placas de 96 pozos, lo cual proporcionó un total de 1 .13 X 105 de células totales por pozo. Se llevó a cabo una clasificación primaria de los anticuerpos monoclonales resultantes (miles) mediante un ELISA indirecto rhlL-17A (ver Ejemplo 5). Las clasificaciones secundarias en los anticuerpos resultantes incluyeron neutralización de la expresión inducida por rhlL-17A de IL-6 murino con células ST2 (estromales de ratón) y neutralización de la proliferación inducida por rhlL-17A de células de Ba/F3 hlL-17Rc:mGCSFR (ver Ejemplo 1 1 ). Se estudiaron además aproximadamente 1 1 de los monoclonales, después de la primera y segunda clasificación. Se llevaron a cabo experimentos subsiguientes para confirmar que los anticuerpos experimentales eran capaces de adherirse a hulL-17A nativo para tener la seguridad de que serían útiles para varios propósitos, terapéuticos, de diagnóstico y/o investigación. Dicha clasificación puede efectuarse usando ensayos de adhesión (tales como ELISA indirecta o ELISA sandwich), mediante ensayo de actividad in vitro o mediante ensayo de actividad \n vivo, ejemplos de los cuales se proveen aquí.

EJEMPLO 3 Humanización de anticuerpos IL-17A Anti-humanos rata La humanización del anticuerpo monoclonal 16C10 para IL-17A anti-humano de rata se llevó a cabo esencialmente tal como se describió en WO 2005/047324 y WO 2005/047326, cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Resumiendo, se usaron dominios constantes humanos para reemplazar los dominios constantes parentales (rata), y se seleccionaron secuencias de línea germinal humana homologas a las secuencias del dominio variable de rata, y se usaron para proveer una estructura humana para las CDR de rata, tal como se describió en forma más detallada a continuación.

Procedimiento para la Selección de Secuencias Estructurales de Línea Germinal Humana Las etapas siguientes se usaron para seleccionar las secuencias estructurales de línea germinal apropiadas para humannizar los anticuerpos IL-17A antihumanos de la presente invención. 1 ) Se clonan y secuencian dominios VL y VH no humanos y se determina la secuencia de aminoácido.

Cadena Pesada 2) Se compara la secuencia VH ho humana con un grupo de cinco secuencias de aminoácido de línea germinal VH humana; una representativa de los sub-grupos IGHV1 y IGHV4 y las tres representantes del sub-grupo IGHV3. Los subgrupos VH están enumerados en M.-P. Lefranc (2001 ) "Nomenclature of the Human Immunoglobulin Heavy (IGH) Genes", Experimental y Clinical Immunogenetics, 18:100-1 16. La comparación de las cinco secuencias de línea germinal se lleva a cabo de la manera siguiente: A) Se asignan los números de residuos de secuencia VH no humanos de acuerdo con Kabat et al. (1991 ). B) Se alinean las secuencias VH no humana con cada uan de las cinco secuencias de línea germinal humana. Debido a que los genes V comprenden únicamente los residuos VH 1 -94, solo se consideran en la alineación estos residuos. C) Delinear las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y estructurales (FR) en la secuencia. Las CDR y FR se definen como una combinación de las definiciones provistas en Kabat et al. (1991 ) (Id.) y Chothia y Lesk (1987) "Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 196:901 -917. La definición es por lo tanto: VH CDR1 = 26-35, CDR2 = 50-65, CDR3 = 95-102. D) A cada posición de residuo siguiente enumerada (cuadro 1 ) se asigna una clasificación numérica en cada posición del residuo para la cual las secuencias no humanas y humanas son IDENTICAS: CUADRO 1 * Se indica que afecta la conformación de la CDR en C. Chothia et al. (1989) "Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions", Nature 342:877-883. E) Agregar todas las clasificaciones de posición de residuo. La secuencia de línea germinal aceptora es aquella que tiene la clasificación total más elevada. En caso de que dos o más secuencias de línea germinal tengan clasificaciones idénticas, entonces: 1 ) Entre las posiciones de residuo siguiente se agrega 1 al total para cada posición donde las secuencias no humanas y humanas son IDENTICAS: 1 , 3, 5-23, 25, 36, 38, 40-43, 46, 66, 68, 70, 72, 74, 75, 77, 79-90, 92 (máx 49). 2) La secuencia de línea germinal aceptora es aquella que tiene la clasificación total más alta. Si dos o más secuencias de línea germinal tienen aún clasificaciones idénticas, cualquiera de ellas es aceptable como aceptora.

Cadena Liviana III) Si la secuencia VL es un miembro de la subclase kappa de VL, comparar la secuencia VL no humana con un grupo de cuatro secuencias de aminoácido de línea germinal VL kappa humana. El grupo de cuatro está constituido por un representante de cada una de los subgrupos VL humanos establecidos enumerados en Barbie y Lefranc (1998) "The Human Immunoglobulin Kappa Variable (IGKV) Genes y Joining (IGKJ) Segments", Experimental y Clinical Immunogenetics, 15:171 -183, y M.-P. Lefranc (2001 ) "Nomenclature of the Human Immunoglobulin Kappa (IGK) Genes", Experimental y Clinical Immunogenetics, 18:161 -174. Los cuatro subgrupos corresponden también a los cuatro subgrupos enumerados en Kabat et al. (1991 ) at pp. 103-130. La comparación con las cuatro secuencias de línea germinal se efectúa de la manera siguiente: A) Asignar los números de residuo de secuencia VL no humana de acuerdo con Kabat et al. (1991 ). B) Alinear las secuencias VL no humana con cada una de las cuatro secuencias de línea germinal humana. Debido a que los genes V comprenden únicamente los residuos VL 1 -95, únicamente estos residuos se consideran en la alineación. C) Delinear las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y estructurales (FR) en la secuencia. CDR y FR se definen como una combinación de las definiciones provistas en Kabat et al. (1991 ) y Chothia y Lesk (1987) "Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 196:901 -917. La definición es por lo tanto: VL CDR1 = 24-34, CDR2 = 50-56, CDR3 = 89-97. D) A cada posición de residuo siguiente enumerada (cuadro 2) se asigna una clasificaicón numérica en cada posición del residuo para la cual las secuencias no humanas y humanas son IDENTICAS: CUADRO 2 * Se indica que afecta la conformación de la CDR en C. Chothia et al. "Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions", Nature 342:877-883, 1989. E) Agregar todas las clasificaciones de posición de residuo. La secuencia de línea germinal aceptora es aquella que tiene la clasificación total más elevada. En caso de que dos o más secuencias de línea germinal tengan clasificaciones idénticas, entonces: 1 ) Entre las posiciones de residuo siguiente se agrega 1 al total para cada posición donde las secuencias no humanas y humanas son IDENTICAS: 1 , 3, 5-23, 35, 37, 39-42, 57, 59-61 , 63, 65-70, 72-86, 88. 2) La secuencia de línea germinal aceptora es aquella que tiene la clasificación total más alta. Si dos o más secuencias de línea germinal tienen aún clasificaciones idénticas, cualquiera de ellas es aceptable como aceptora. Si la secuencia VL es un miembro de la subclase lambda de VL, se lleva a cabo un procedimiento análogo usando secuencias de aminoácido línea germinal lambda VL humana de las fuentes de la literatura citadas anteriormente.

Humanización de Anticuerpos IL-17A Anti-Humanos Con respecto a la modificación de los dominios constantes, los dominios livianos y pesados variables del anticuerpo 16C10 (lgG1 IL-17A antihumano de rata), se clonaron y fusionaron con una cadena liviana kappa humana (dominio CL) y cadena pesada de lgG1 humana (CH1 -bisagra-CH2-CH3), respectivamente. Esta combinación de dominios variables de ratas y dominios constantes humanos comprenden una versión quimérica del anticuerpo 16C10. Las secuencias de las cadenas pesada y liviana de esta 16C10 quimérica se proveen en las SEQ ID NOS: 9 y 10, respectivamente. Con respecto a la modificación de las regiones estructurales de los dominios variables, la secuencia de dominio VH del anticuerpo 16C10 se comparó con un grupo de cinco secuencias de aminoácido de línea germinal VH; una representante de los subgrupos IGHV1 y IGHV4 y tres representativas del subgrupo IGHV3. Los subgrupos VH se enumeran en M.-P. Lefranc, "Nomenclature of the Human Immunoglobulin Heavy (IGH) Genes," Experimental y Clinical Immunogenetics, 18:100-1 16, 2001 . La clasificación del anticuerpo 16C10 fue más alta contra la línea germinal de cadena pesada humana DP-71 en el subgrupo IV. La secuencia VL de 16C10 fue de la subclase kappa. Esta secuencia se comparó con un grupo de cuatro secuencias de aminoácido de línea germinal kappa VL humana. El grupo de cuatro está constituido por un representante de cada uno de cuatro subgrupos VL humanos enumerados en V. Barbie & M.-P. Lefranc, "The Human Immunoglobulin Kappa Variable (IGKV) Genes y Joining (IGKJ) Segments", Experimental y Clinical Immunogenetics, 15:171 -183, 1998 y M.-P. Lefranc, "Nomenclature of the Human Immunoglobulin Kappa (IGK) Genes", Experimental y Clinical Immunogenetics, 18:161 -174, 2001 . Los cuatro subgrupos corresponden también a los cuatro subgrupos enumerados en Kabat et al. (1991 ) en pp. 103-130. El anticuerpo 16C10 tuvo una clasificación más elevada contra la línea germinal de cadena liviana humana Z-A19 en el subgrupo II. Una vez determinadas las secuencias estructurales de la línea germinal deseada, se generó un plásmido que codifica las cadenas pesada y liviana variables humanizadas de longitud total. Las sustituciones de los residuos estructurales humanos en lugar de los residuos estructurales del anticuerpo 16C10 anticuerpo de rata parental puede ser considerada equivalentemente al injerto de las 16C10 CDR de rata en las secuencias estructurales humanas. El anticuerpo resultante se denomina aquí "16C10wt", donde "wf designa ia presencia de las mismas CDR que 16C10 parental de rata, a diferencia de las CDR optimizadas (que tienen dos alteraciones únicas de aminoácidos) que se discutirán a continuación. Tanto los dominios variables de cadena liviana como de cadena pesada fueron optimizados con codones, sintetizados e insertados sobre dominios constantes para proporcionar una expresión potencialmente óptima. La optimización de codones que puede mejorar la expresión de los anticuerpos clonados es puramente opcional. Además de la sustitución de dominio constante humano y las secuencias estructurales, el anticuepro 16C10 wt humanizado fue también modificado en dos residuos CDR para proporcionar mayor estabilidad química del anticuerpo humanizado final. Los dos cambios están representados por residuos aminoácidos en negrilla en la secuencia VH "hu16C10" que se muestra en la figura 1 B. Con referencia a la numeración Kabat que se usó en la figura 1 B, el residuo 54 de CDR2 se cambió de N (asparagina) en el anticuerpo de rata a Q (glutamina) en el anticuerpo humanizado para reducir el potencial para la formación de isoaspartato en la secuencia NG en los residuos 54-55. La formación de isoaspartato puede debilitar o puede anular completamente la adhesión de un anticuerpo a su antígeno objetivo. Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 1 16:731 at 734. Además, el residuo 96 de CDR3 cambió de M (metionina) en el anticuerpo de rata a A (alanina) en el anticuerpo humanizado para reducir la posibilidad de que se oxidara el azufre de metionina, el cual podría reducir la afinidad de adhesión al antígeno y contribuir tamibén a una heterogeneidad molecular en la preparación de anticuerpo final. Id. Estas modificaciones de residuo único pueden representarse como N54Q y M96A. El anticuerpo 16C10 humanizado final descrito aquí, comprende estas dos sustituciones relativas a las CDR 16C10 de rata parental. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo 16C10 quimérico (no humanizado) se altera para incorporar las dos modificaciones de residuo único descritas anteriormente para la forma humanizada, es decir N54Q y M96A. Las secuencias de aminoácido de la cadena liviana y pesada del anticuerpo 16C10 humanizado (hu 16C10) se proveen en las figuras 2A y 2B respectivamente, y en las SEQ ID NOS: 2 y 4 (que incluyen secuencias de señal). Una modalidad de las secuencias nucleotídicas que codifican las cadenas pesada y liviana de hu 16C10 se muestra en las SEQ ID NOS:1 y 3. Otra modalidad de las secuencias nucleotídicas que codifican las cadenas liviana y pesada de hu 16C10 se muestran en la figura 5A (SEQ ID NO:62) y figura 5B (SEQ ID NO:63). Para que quede claro con respecto a la nomenclatura, es importante reconocer que el sistema de numeración Kabat incluye designaciones de residuos aminoácido no numéricos (por ejemplo, los residuos de VH 83a, 83b, 83c) para acomodar las variaciones de longitud de las CDR y las regiones estructurales entre varios anticuerpos. Aunque este sistema de numeración es ventajoso para permitir una fácil referencia a los residuos aminoácidos correspondientes entre varios antcuerpos con CDR de longitudes diferentes, puede dar como resultado designaciones conflictivas para resdiuos aminoácido específicos cuando se comparan con numeraciones de secuencias numérico-secuenciales estrictas (por ejemplo, listados de secuencia). Las designaciones de residuos aminoácidos que se dan aquí se preparan con referencia al listado de secuencia relevante a menos que se indique lo contrario, por ejemplo, con referencia a "numeración Kabat". Como un punto de clarificación adicional con respecto a la nomenclatura, las SEQ ID NOS: 2 y 4 (16C10 humanizada) incluyen las secuencias de péptidos de señalización N-terminales (los primeros 19 residuos de cada uno), donde los aminoácidos son removidos en la forma madura del anticuerpo. Las SEQ ID NOS: 1 , 3, 62 y 63 incluyen 57 nucleótidos que codifican las secuencias de señal. Tal como se usa aquí, una forma "madura" de proteína se refiere a la proteína sin la secuencia de señalización. El anticuerpo 4C3 humanizado se creó por métodos análogos a los descritos anteriormente para el anticuerpo 16C10. Debido a que el anticuerpo 4C3 de rata parental difiere únicamente en el residuo aminoácido único en la región estructural de la cadena liviana, y debido a que dichas regiones estructurales son reemplazadas con secuencias estructurales de línea germinal humana durante la humanización, la secuencia de anticuerpo 4C3 humanizada final es idéntica a la secuencia del anticuerpo 16C10 humanizado.

El anticuerpo 30C10 humanizado se ha creado también por métodos análogos a los descritos anteriormente para el anticuerpo 16C10. Para determinar las secuencias estructurales humanas adecuadas que deben usarse, el anticuerpo 30C10 parental de rata tiene las clasificaciones más altas contra DP-46 de línea germinal de cadena pesada humana en el subgrupo III y en Z-A19 de línea germinal de cadena liviana humana en el subgrupo II, de manera que esas secuencias estructurales están sustituidas con las secuencias estructurales de rata. Las secuencias 30C10 VL y VH humanizadas se proveen en las SEQ ID NOS: 22 y 23, respectivamente. En otras modalidades, uno o más residuos metionina en las CDR 30C10 de rata, están mutadas para evitar el potencial de oxidación del azúfre de metionina en el anticuerpo 30C10 humanizado. Específicamente, el residuo 34 de cadena pesada (en CDRH1 ) y/o el residuo 30f de cadena liviana (numeración Kabat, ver figura 1 A) cambian de la metionina a otro aminoácido, por ejemplo alanina. Dichos anticuerpos son clasificados subsiguientemente para tener la seguridad de que la sustitución metionina no disminuye la afinidad de adhesión IL-17A a niveles inaceptables. Las versiones quiméricas, humanizadas, y que contienen secuencias de señalización del anticuerpo 12E6 han sido creadas usando los métodos descritos aquí, por analogía con la preparación de dichos anticuerpos basados en el anticuerpo 16C10 parental de rata. Las CDR de cadena liviana y pesada para 12E6 de anticuerpo parental de rata se proveen en las SEQ ID NOS: 34-36 y 37-39. Las secuencias estructurales de dominio constante humano y dominio variable se introducen tal como se describió anterioremente. En una modalidad, el residuo 34 de cadena pesada (en CDRH1 ) cambia de una metionina a otro aminoácido, por ejemplo, alanina para evitar el potencial de oxidación del azúfre de metionina en el antcuerpo 12E6 humanizado. Los anticuerpos resultantes son clasificados subsiguientemente para tener la seguridad de que la sustitución de metionina no disminuirá la afinidad de adhesión de IL-17A a niveles inaceptables. Se han creado versiones que contienen secuencia quimérica, humanizada y de señal de anticuerpo 23E12 usando los métodos descritos aquí, por analogía con la preparación de dichos anticuerpos en base al anticuerpo 16C10 parental de rata. Las secuencias de dominio variable de cadena liviana y pesada para el anticuerpo 23E 2 parental de rata se proveen en las SEQ ID NOS: 44 y 46 (ADN), y 45 y 47 (aminoácido). Las CDR para el anticuerpo 23E12 parental de rata se proveen en las SEQ ID NOS: 48-50 (cadena liviana) y 51 -53 (cadena pesada). Las secuencias estructurales de dominio constante y dominio variable humano se introducen dentro de los anticuerpos parentales de rata tal como se describió anteriormente EJEMPLO 4 Anticuerpos anti-IL-17A Completamente Humanos Los anticuerpos monoclonales anti-IL-17A completamente humanos se generaron usando ratones transgénicos portadores de partes del sistema inmune humano en vez del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos, denominados aquí, ratones "HuMAb", contienen minilugares génicos de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (µ y ?) y de cadena liviana ? humana no reordenada, conjuntamente con mutaciones objetivo que inactivan los lugares de cadena µ y ? endógenos (Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474):856-859). Por consiguiente, los ratones exhiben expresión de IgM o de ratón reducida, y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena pesada y cadena liviana humanos introducidos, sufren un cambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgG ? humanos de alta afinidad (Lonberg et al. (1994), supra; revisado en Lonberg (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 1 13:49-101 ; Lonberg et al. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, y Harding et al. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación de ratones HuMab es comúnmente conocida en la técnica y ha sido descrito por ejemplo, en Taylor et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:1 17-123; Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 821 - 830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 1 13:49-101 ; Taylor et al. (1994) International Immunology 6: 579-591 ; Lonberg et al. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93; y Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 ; el contenido de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Ver también las Patentes Norteamericanas Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661 ,016; 5,814,318; 5,874,299; 5,770,429 y 5,545,807; y Publicación de Solicitud de Patente Internacional Nos. WO 98/24884; WO 94/25585; WO 93/1227; WO 92/22645 y WO 92/03918, cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos para IL-17A, ratones HuMab fueron inmunizados con un polipéptido IL-17A antigénico tal como fue descrito por Lonberg et al. (1994); Fishwild et al. (1996) y WO 98/24884. Preferiblemente, los ratones son de 6-16 semanas de vida después de la primera inmunización. Por ejemplo, puede usarse una preparación purificada de IL-17A para inmunizar ratones HuMab intraperitonealmente. Los ratones pueden inmunizarse con células HEK293 enteras que están establemente transformadas o transfectadas con un gen IL-17A. Un "polipéptido IL-17A antigénico" puede referirse a un polipépitdo IL-17A de cualquier fragmento de éste, que produce una respuesta inmune anti-IL-17A en respuesta a ratones HuMab. En general, los ratones transgénicos HuMAb responden mejor cuando es inmunizado inicialmente intraperitonealmente (IP) con antígeno en adyuvante completo de Freund, seguido de inmunizaciones con IP una semana sí y la otra no (usualmente hasta un total de 6) con antígeno en adyuvante de Freund incompleto. Los ratones son inmunizados primero con células que expresan IL-17A (por ejemplo, células HEK293 establemente transformadas), y luego con un fragmento soluble de IL-17A, seguido de inmunizaciones alternativas con los dos antígenos. La respuesta inmune es monitoreada en el curso del protocolo de inmunización con muestras de plasma obtenidas por sangrado retro-orbital. El plasma es clasificado para determinar la presencia de anticuerpos anti-IL-17A, por ejemplo, con ELISA y para las fusiones se usan ratones con valoraciones de inmunoglobulina suficientes. Los ratones son reforzados intravenosamente con antígeno 3 días antes de sacrificarlos y remoción del bazo. Pueden ser necesarias dos a tres fusiones para cada antígeno. Para cada antígeno se inmunizan varios ratones. Por ejemplo, pueden inmunizarse un total de 12 ratones HuMAb de las cepas HCO7 y HC012. Se producen células de hibridoma productoras de anticuerpos anti-IL-17A monclonales, completamente humanos mediante métodos comúnmente conocidos en la técnica, tales como la técnica de hibridoma originalmente desarrollada por Kohier et al. (1975) (Nature 256:495-497); la técnica de trioma (Hering et al. (1988) Biomed. Biochim. Acta. 47:21 1 -216 y Hagiwara et al. (1993) Hum. Antibod. Hybridomas 4:15); la técnica de células de hibridoma B humanas (Kozbor et al. (1983) Immunology Today 4:72 y Cote et al. (1983) Proc. Nati Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030); y la técnica EBV-hibridoma (Colé et al. (1985) en Monoclonal Antibodies y Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Preferiblemente, se aislan esplenocitos de ratón y se fusionan con PEG para una línea de células de mieloma de ratón basada en protocolos convencionales. Luego pueden clasificarse los hibridomas resultantes para determinar la producción de anticuerpos específicos de antígeno. En una modalidad, suspensiones de célula únicas de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados, se fusionan hasta una sexta parte de la cantidad de células de mieloma de ratón no secretadores P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con 50% de PEG. Se depositan células a aproximadamente 2 x 105 células/ml en una placa microevauladora de fondo plano, seguido de una incubación de dos semanas en un medio selectivo que contenía 20% de Suero de Clon Fetal, 18% "653" de medios acondicionados, 5% de origen, 4 mM L-de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 5mM de HEPES, 0.055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y 1 X HAT (Sigma; el HAT se agrega 24 horas después de la fusión). Después de dos semanas se cultivan en un medio en el cual el HAT es reemplazado con HT. Luego se clasifican pozos individuales mediante ELISA para los anticuerpos IgG monocionaíes anti-IL-17A humanos. Una vez que ocurre el crecimiento extensivo de hibridoma, se observa el medio usualmente después de 10-14 días. Se re-depositan los hibridomas secretores de anticurepos, se clasifican nuevamente, y si son aún positivos para IgG humana, los anticuerpos monocionaíes anti-IL-17A se subclonan por lo menos dos veces limitando la dilución. Los subclones estables son luego cultivados in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpos en un medio de cultivo de tejidos para la caracterización. En otra modalidad, las moléculas de anticuerpo anti-IL-17A de la presente invención se producen recombinantemente (por ejemplo, en un sistema de expresión de E.coli/T7). En esta modalidad, los ácidos nucleicos que codifican las molécuals de anticuerpo de la invención (por ejemplo, VH o VL) son insertadas dentro del plásmido a base de pET y se expresan en el sistema de E.coli/T7. Existen varios métodos para producir anticuerpos recombinantes conocidos en la técnica, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4,816,567 que se incorpora aquí como referencia. Las moléculas de anticuerpo pueden producirse también recombinantemente en células de CHO o NSO.

EJEMPLO 5 ELISA Indirecto de Anticuerpos Monoclonales anti-IL-17A La adhesión de anticuerpos monoclonales anti-humanos-IL-17A a rhlL-17A se verificó usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) indirecto. Resumiendo, una concentración fija de rhlL-17A es adherida directamente a los pozos de una placa microtituladora. El anti-IL-17A monoclonal que debe ser ensayado se agrega luego a la placa recubierta con rhlL-17A, donde el anticuerpo es capturado y cuantificado. A continuación sigue un protocolo más detallado. Una placa MaxiSorp de fondo en forma de U de 96 pozos se recubrió con 50 µ?/???? de rhlL-17A (0.5 pg/ml) en regulador de pH de recubrimiento de carbonato ("placa de ensayo"). El regulador de pH de recubrimiento de carbonato es 2.9 g/L NaHC03, 1 .6 g/L Na2C03, pH 9.4. Las placas son incubadas, cubriéndolas a 4°C durante la noche. Los anticuerpos monoclonales que deben ser clasificados se diluyen en forma sucesiva por duplicado a través de las hileras de una placa con fondo en forma de V de manera que el volumen final sea de 60 µ?/???? ("la placa de dilución sucesiva "). La placa de ensayo se lava tres veces con PBS-Tween en un lavador de placas (SkanWasher, Molecular Devices, Sunnyvale, California, USA) y se absorbe hasta sequedad. El PBS-Tween se obtiene agregando 0.5 ml/l de Tween 20 a 1X PBS. Cincuenta µ? de cada pozo de la placa de dilución sucesiva es transferida a la placa de ensayo y se incuba a 25°C durante una hora. Los anticuerpos secundarios se diluyen a 1/2000 en diluyente (PBS-BSA-Tween, la cual es PBS-Tween con 1 g/l de BSA). El anticuerpo secundario para los anticuerpos monoclonales de rata es IgG (H+L) de anticabra- HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA). El anticuerpo secundario para los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados es IgG Fcy - HRP anti-humano de cabra F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). La placa de ensayo se lavó tal como anteriormente. Los anticuerpos secundarios diluidos (100 µ?/????) se agregaron a los pozos apropiados en la placa de ensayo y la placa se incubó a 25°C durante 45 minutos. La placa de ensayo se lavó tal como anteriormente. Se agregó ABTS (100 µ?/????) (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, USA) y la placa se incubó a 25°C durante 5-10 minutos, después de lo cual la absorbancia se leyó a 405 nm en un lector de placas (Versamax, Molecular Devices, Sunnyvale, California, USA) con una agitación de 5 segundos antes de la lectura.

Los resultados ELISA indirectos para varias formas de anticuerpo 16C10 se muestran en el cuadro 5. La adhesión se informa como CE50 (la concentración de anticurerpo necesaria para obtener la señal media-máxima). Los resultados demuestran que la adhesión se detecta con todas las formas de 16C10. Aunque dichos ensayos ELISA indirectos son útiles para determinar rápidamente la presencia o ausencia de anticuerpos anti-IL-17A, los números CE50 obtenidos pueden depender del ensayo y no se usan típicamente para verificar la afinidad de adhesión absoluta para cualquier anticuerpo determinado.

CUADRO 5 ELISA de anticuerpo anti-IL-17A indirecto EJEMPLO 6 ELISA de anticuerpos monoclonales anti-IL-17A La adhesión de anticuerpos monoclonales anti-human-IL-17A a rhlL-17A se verificó usando un ELISA de la manera siguiente. Resumiento, un anticuerpo de captura se adhirió a los pozos de una placa microtituladora, después de lo cual se agregó una concentración fija de rhlL-17A. El anti-IL- 17A monoclonal que debe ensayarse es titulado luego versus el rhlL-17A adherido sobre la placa para determinar la concentración de anticuerpo necesaria para lograr una adhesión media-máxima. Sigue a continuación un protocolo más detallado. Una placa microtituladora de 96 pozos se recubrió con 100 µ?/???? de anticuerpo de captura (hlL-17A 12E6 de rata 0.5 pg/ml) recubrimiento de carbonato de regulador de pH a pH 9.5 (la "placa de ensayo"). Las placas se incubaron cubiertas a 4°C durante 24 a 48 horas. La placa de ensayo se lavó tres veces en un lavador de placas (SkanWasher, Molecular Devices, Sunnyvale, California, USA) y se secó por absorción. La placa se bloqueó luego con 200 µ?/pozo de regulador de pH de ensayo ELISA (20 mM Tris-HCI, 0.15 M NaCI, pH7.4, 0.5% BSA, 0.05% Tween-20, 2mM EDTA) durante una hora a 25°C en un agitador orbital. La placa se lavó y se agregaron 100 µ?/???? de rhlL-17A derivado de adenovirus o IL-17 (IL-17A) humano derivado de E. coli (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA)(0.1 g/ml), en un regulador de pH de ensayo ELISA y se incubó durante 2 horas a 25°C en un agitador orbital. La placa se lavó y los anticuerpos monoclonales que era necesario clasificar se diluyeron en forma sucesiva a través de una hilera de 7 pozos usando diluciones sucesivas en un intervalo de 1000 ng/ml a 0.0813 ng/ml en cuatro veces. Las placas se incubaron durante 1.5 horas a 25°C en un agitador orbtial. Las placas se lavaron y se agregaron 100 µ?/???? de anticuerpo secundario de cadena liviana kappa anti-humana de cabra (F(ab') - HRP, con dilución 1 :20,000, BioSource, Carlsbad, California, USA) excepto por los pozos de ensayo en blanco. Las placas se lavaron dos veces (es decir, dos ciclos de 3 lavados por ciclo) con rotación de placas entre ciclos. Se agregó sustrato de TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, USA) a 100 µ?/???? y se incubó durante 3-5 minutos en un agitador orbital. Se agregó solución de interrupción (100 µ?/????) y la placa se leyó para la absorbancia a 450-570 nm en un lector de placas (Versamax, Molecular Devices, Sunnyvale, California, USA). Los resultados de ELISA para varias formas del anticuerpo 16C10 de la presente invención se muestran en el cuadro 6. La adhesión se informó como una CE50 (la concentración de anticuerpo necesaria para obtener una señal media-máxima). Los resultados muestran que la adhesión se detectó con todas las formas de 16C10. Los valores que se presentan con intervalos de error representan la media de determinaciones múltiples con la desviación estándar.

CUADRO 6 Anticuerpo ELISA anti-IL-17A EJEMPLO 7 Afinidad de adhesión para anticuerpos IL-17A antihumanos Medición de la adhesión de anticuerpos IL-17A anti-humanos de rata y quiméricos usando un ensayo electroquimioluminiscente (ECL) Se empleó tecnología de electroluminiscencia de origen desarrollada por IGEN, Inc. (Gaithersburg, Maryland, USA), para medir la adhesión de anticuerpos IL-17A antihumanos de rata (y un anticuerpo quimérico) para FLAG-hulL-17A. Ver el sistema de Inmunoensayo Elecsys®, Roche Diagnostics (Indianapolis, Indiana, USA). La tecnología de electroquimioluminiscencia usa un quelato de metal de rutenio estable (Ori- TAG) que, en presencia de tripropilamina (TPA), genera electroquimioluminiscencia por aplicación de voltaje. Los granos paramagnéticos, de micrones de diámetro, actúan como fase sólida y facilitan una rápida cinética de ensayo. El grano/complejo es canalizado a través de una célula fluida y es capturado como electrodo por aplicación magnética. Se aplica voltaje y se mide la electroquimioluminiscencia resultante. Se llevaron a cabo ensayos de ECL de la manera siguiente. Tres diluciones sucesivas de IL-17A mAbs anti-humano en 50 µ? de regulador de pH de ensayo se prepararon en una placa microtituladora de 96 pozos para proporcionar 1 -3 g/ml de concentración final en el primer pozo. Cincuenta µ? del regulador de pH de ensayo y 50 µ? de FLAG-hulL-17A biotinilado a 50 ng/ml se agregaron a cada pozo, seguido de adición de cualquiera de IgG (H+L) pAb anti-rata de cabra rotulado con Ori-Tag, (50 µ? a 450 ng/ml) o bien un anti-hlgG mAb (50 µ? a 500 ng/ml). Finalmente se agregaron a cada pozo 50 µ? de Origen Streptavidin-Dynabeads a 0.1 mg/ml. Después de 1 hr de incubación a 25°C la placa se procesó con un analizador Origen M-series M8/384. Se usó software Grap Pad Prism (GraphPad Software, San Diego, California, USA) para graficar los datos, y se calculó el área bajo la curva, que es una medición aproximadamente de la adhesión. Los resultados se presentan en el cuadro 7 (que incluye algunas determinaciones por duplicado). Las dos hileras que muestran la adhesión de 16C10 de rata a FLAG-hulL-17A representan determinaciones por duplicado. Todos los anticuerpos IL-17A anti-humanos de rata en el cuadro (1 D10, 16C10, 30C10, 23E12) se adhirieron a FLAG-hulL-17A, tal como lo hizo el 16C10 quimérico. Todos los cuatro anticuerpos se adhirieron también a cyno IL-17A. Los anticuerpos 16C10 y 30C10 no se adhirieron a IL-17A bajo las condiciones de este ensayo, mientras que los anticuerpos 1 D10 y 23É12 sí lo hicieron.

CUADRO 7 Adhesión del anticuerpo determinado por ECL Determinación de la constante de disociación en equilibrio (Kd) para anticuerpos IL-17A anti-humanos humanizados y de rata usando tecnología KinExA Las constantes de disociación en equilibrio (Kd) para anticuerpos IL-17A humanos se determinaron usando el instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Instruments Inc., Boise, Idaho, USA). KinExA usa el principio del método de Ensayo por Exclusión Cinética, basado en la medición de la concentración del anticuerpo no complejado en una mezcla de anticuerpo, antígeno y complejo de anticuerpo-antígeno. Ver por ejemplo, Darling y Brault (2004) Assay Drug Dev. Technol. 2(6):647-57. La concentración de los anticuerpos libres se mide exponiéndo la mezcla a un antígeno inmovilizado de fase sólida por un breve período de tiempo. En la práctica, esto se logró haciendo fluir la mezcla de fase de antígeno-anticuerpo en solución, pasando las partículas recubiertas con antígeno atrapadas en una célula fluida. Los datos generados por el instrumento fueron analizados usando sofware a medida. Las constantes de equilibrio se calcularon suando una teoría matemática que se basa en las siguientes presunciones: 1 . La adhesión sigue la ecuación de adhesión reversible para el equilibrio: kon [Ab] [Ag] = >« [AbAg], donde Kd = ,? / 2. El anticuerpo (Ab) y el antígeno (Ag) se adhieren 1 :1 y el anticuerpo total iguala el complejo antígeno-anticuerpo (AbAg) más anticuerpo libre. 3. La señal del instrumento está linealmente relacionada con la concentración de anticuerpo libre. Se llevó a cabo un análisis KinExA en varios anticuerpos IL-17A anti-humano de rata, variantes humanizadas de éstos, y variantes de secuencia de estos anticuerpos humanizados. IL-17A derivó de humanos ("hu"), macacos ("cyno"), o ratones ("mu"). Se usó IL-17A de la misma especie para ambas fases, la inmovilizada y la de solución para cada determinación de KinExA. Partículas de poli(metacrilato de metilo) (PMMA) (98 micrones) para el recubrimiento con IL-17A humano, de macaco o ratón de acuerdo con Sapidyne "Protocol for coating PMMA particles with biotinylated ligands having short o nonexistent linker arms." Todos los procedimientos experimentales se efectuaron de acuerdo con el Manual de KinExA 3000. Todos los ensayos se efectuaron por duplicado. Se proveen condiciones para KinExA en el cuadro 8.

CUADRO 8 Condiciones de KinExA Se prepararon diluciones sucesivas dobles del antígeno y se mezclaron con el anticuerpo a una concentración constante. La mezcla se incubó durante dos horas a 25°C para equilibrar. El cuadro 9 muestra los resultados del análisis KinExA. Las concentraciones molares para el análisis KinexA se calcularon en la base de un peso molecular de 75 kDa para los anticuerpos y 15 kDa para IL-17A para tener en cuenta la presencia de los dos sitios de adhesión en los anticuerpos y la naturaleza dimérica de IL-17A. Para algunos anticuerpos se efectuaron experimentos replicados con diferentes lotes de anticuerpo y/o antígeno, en cuyos casos se proporcionaron valores promedio en el cuadro 9, junto con errores estándar. Las constantes de adhesión para el anticuerpo 16C10 wt humanizado y el anticuerpo 16C10 de rata parental fueron similares a aproximadamente 5-10 pM, lo cual demuestra que la humanización no redujo significativamente la afinidad elevada del 16C10 de rata parental para IL-17A humano. También se ensayaron 16C10 humanizados que incorporan varias sustituciones de aminoácido (N54Q, M96A, MIOOhF), incluyendo el anticuerpo 16C10 humanizado final (que tiene sustituciones N54Q y M96A comparadas con 16C10 de rata) y se halló que tenían constantes de adhesión elevada similares en el intervalo de 1-10 pM. El fragmento Fab de hu 16C10 adherido, retuvo una afinidad alta (16 pM) en comparación con el anticuerpo completo. Otros anticuerpos de la presente invención (1 D10 de rata, 23E12 de rata, 30C10 de rata) se adhirieron también con alta afinidad a FLAG-hulL-17A, y a cyno IL-17A. Aunque 1 D10 de rata se adhirió a la de ratón con una afinidad de 10 pM similar a su afinidad para IL-17A humano y de cyno, 23E12 de rata tuvo una afinidad 200-2000 veces inferior a la de IL-17A de ratón (7000 pM). Los anticuerpos 16C10 y 30C10 no se adhirieron a IL-17A de ratón (no se muestran datos).

CUADRO 9 Valores Kg determinados por KinExA Otros métodos conocidos en la técnica tales como espectroscopia de resonancia plasmónica superficial Biacore® pueden usarse para medir la afinidad de los anticuerpos de la presente invención. Aunque el análisis Biacore® se llevó a cabo en varios de los anticuerpos de la presente invención, la afinidad de adhesión generalmente fue demasiado alta para medirla en forma exacta, específicamente, el régimen de disociación fue demasiado lento para medirlo mediante este método. Dicho análisis puede ser útil sin embargo en el análisis de anticuerpos anti-IL-17A de menor afinidad o anticuerpos anti-IL-17A que tienen constantes de régimen de disociación más rápida.

EJEMPLO 8 Ensayo de sinoviocitos para anticuerpos Anti-IL-17A La capacidad de los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención para bloquear la actividad biológica de IL-17A (ya sea rhlL-17A o hulL-17A nativo) se midió monitoreando la expresión inducida por IL-17A de IL-6 y IL-8 en cultivos primarios de sinoviocitos humanos de la manera siguiente. Se aislaron sinoviocitos por digestión de colagenasa de un sinovio de artritis reumatoide obtenido de un paciente con reemplazo de rodilla. Los sinoviocitos fueron enriquecidos por pasaje continuo en Medio de Crecimiento (DMEM, 10%BCS, 1 X Pen-Strep (50 lU/ml de penicilina, 55 pg/ml de estreptomicina), 1 X beta-mercaptoetanol (50 µ?), 1 X de glutamina (20 mM), 25 mM HEPES), bajando la congelación en el número de pasaje tres, y almacenado en nitrógeno líquido. Cuando estuvo listo para ser usado en un ensayo, se descongeló un frasco de células, se depositó en placas, y se dejaron crecer las células hasta casi confluencia. Luego las células se pasaron a 1 :2 en frascos más grandes usando tripsina/EDTA. Una vez expandidas suficientes células, se inició un experimento mediante tripsinización de las células, depositándolas en placas de 96 pozos o 48 pozos, y dejándolas desarrollar hasta confluencia total.

Se diluyó IL-17A hasta 120 ng/ml, es decir, 4X la concentración final de 30 ng/ml (1 nM). IL-17A es o bien (rhlL-17A y hulL-17A nativa) humana o de un primate no humano, en este caso macacos (cyno). Se agregaron alícuotas de 100 y 300 µ? de cargas de 4X IL-17A para vaciar placas de 96 pozos y 48 pozos, respectivamente. Los anticuerpos anti-IL-17A que debían ser ensayados se diluyeron en Medio de Crecimiento a 4X la concentración máxima para ser ensayada en un experimento. La carga 4X anti-IL-17A se diluyó en forma sucesiva a 1 :2 para cubrir el intervalo de inhibición dinámica del ensayo. Cada una de las muestras de anticuerpos diluida en forma sucesiva (todas son 4X su concentración final) se mezclaron a 1 :1 con las soluciones 4X IL-17A en placas vacías para generar mezclas con concentraciones 2X de ambas IL- 7A y anticuerpos anti-IL-17A. Estas mezclas se dejaron equilibrar a 37°C en incubador de cultivo de tejidos durante más de cuatro horas. Se extrajo el medio de los sinoviocitos confluentes adherentes y se reemplazó con 100 µ? (placa de 96 pozos) o 200 µ? (placa de 48 pozos) de Medio de Cultivo. Se agregó un volumen igual de la solución de 2X ligando/2X anticuerpo a los sinoviocitos para obtener 1 X IL-17A (30 ng/ml final) y 1 X anticuerpo. Cada pozo (datos puntuales) se trabaja por duplicado. Los sinoviocitos son activados (es decir, son expuestas a la mezcla de IL-17A/anticuerpo) durante tres días, punto en el cual los sobrenadantes son transferidos a placas de 96 pozos, y son opcionalmente congelados y almacenados a -80°C hasta el momento de ser analizados. Las placas microtituladoras que contienen los sobrenadantes se descongelan y cada solución se diluye a 1 :10 usando Medio de Crecimiento. Los sobrenadantes son analizados para la IL-6 y IL-8 usando pares de granos Luminex (Upstate, Charlottesville, Virginia, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se proveen en los cuadros 10 (IL-6) y 1 1 (IL-8).

Los valores que se presentan con intervalos de error, representan la media de las determinaciones múltiples con la desviación estándar. Se muestran los rseultados para varias formas del anticuerpo 16C10 incluyendo la forma humanizada de 16C10 que tiene las CDR de rata originales ("hu16C10 (wt)") así como también variantes varios que tienen uno, dos o tres cambios en las CDR de cadena pesada (generalmente "hu16C10 X##Z", donde X es el aminoácido en el residuo ## en la cadena pesada de hu16C10 (wt) y Z es el aminoácido nuevo). "NHP IL-17A" es IL-17A derivado de primate no humano, en este caso IL-17A macaco. "hulL-17A nativo" se refiere a hulL-17A maduro producido cuando la proteína precursora es producida usando la secuencia de señal natural, y difiere de rhlL-17A por la ausencia de dos aminoácidos N-terminales. Las concentraciones y valores CI50 se expresan en ng/ml, pero pueden expresarse también en unidades pM. Por ejemplo, 30 ng/ml rhlL-17A corresponde a 1000 pM (PM = 30 kDa) y 70 ng/ml de anticuerpo anti-IL-17A corresponde a aproximadamente 470 pM (PM = 150 kDa).

CUADRO 10 CI50 (ng/ml) de anti-IL-17A medido por producción por IL-6 de sinoviocitos CUADRO 11 CI50 (ng/ml) de anti-IL-17A medido por producción de IL-8 de sinoviocitos EJEMPLO 9 Ensayo de NHDF para anticuerpos anti-IL-17A La capacidad de los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención para bloquear la actividad biológica de IL-17A se mide por monitoreo de la expresión inducida por rhlL-17A de IL-6 en una línea de célula primaria de fibroblasto dérmico humano normal (adultos) (NHDF). Resumiendo, varias concentraciones de un anticuerpo anti-IL-17A para ser ensayado se incubaron con rhlL-17A, y la mezcla resultante se agregó luego a cultivos de células de NHDF. La producción IL-6 se determina a continuación como una medida de la capacidad del anticuerpo en cuestión para inhibir la actividad IL-17A. A continuación sigue un protocolo más detallado. Se preparó una serie de diluciones dobles de anticuerpos anti-IL-17A de interés (por duplicado) a partir de una solución de carga a 40 pg/ml. Se preparó una solución de carga de rhlL-17A a 120 ng/ml. Se mezclaron setenta µ? de solución de carga rhlL-17A con 70 µ? de las diluciones de anticuerpo anti -IL-17A en pozos de una placa microtituladora y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Cien µ? de cada una de estas mezclas se agregó luego a los pozos de una placa microtituladora que había sido sembrada con 1 X 104 NHDF células/pozo (100 µ?) la noche previa y se dejaron incubar a 37°C. Se obtuvieron células de NHDF (pasaje 4) de Cambrex Bio Science (Baltimore, Maryland, USA). La concentración final resultante de rhlL-17A es 30 ng/ml (1 nM), y el intervalo de anticuerpos descendente en intervalos de dos veces desde 10 pg/ml. Las placas se incubaron a 37°C durante 24 horas, seguido de cosecha del sobrenadante y remoción de 50 µ? para ser usados en un ELISA para IL-6. El ELISA para la detección de IL-6 humano se llevó a cabo de la manera siguiente. Los reactivos son generalmente de R&D Systems (Minneapolis, Minnesota, USA). Un anticuerpo de captura hlL-6 (50 µ?/???? de una solución de 4 Mg/ml) se transfirió a pozos de una placa microtituiadora, la cual se selló e incubó durante la noche a 4°C. La placa se lavó tres veces y luego se bloqueó con 100 µ?/???? de regulador de pH bloqueador durante 1 hora o más. Luego la placa se lavó nuevamente tres veces. Se agregaron muestras experimentales (50 µ? del sobrenadante de cultivo) y controles (diluciones sucesivas de proteína IL-6) a los pozos en 50 µ? y se incubaron durante dos horas. Las placas se lavaron tres veces y se agregaron 50 µ?/???? de anticuerpo de detección de anti-IL-6 biotinilado (300 ng/ml). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante dos horas, se lavaron tres veces, y se agregaron 100 µ?/???? de HRP de estreptavidina y se incubaron durante 20 minutos. La placa se lavó nuevamente, se agregó ABTS (BioSource, Carlsbad, California, USA) (100 µ?/????) y se incubaron durante 20 minutos. Se agregó solución de detección (100 µ?/????) y se midió la absorbancia a 405 nm. La CI50 para un anticuerpo anti-IL-17A de interés es la concentración de anticuerpo requerida para reducir el nivel de la producción de IL-6 inducida por rhlL-17A hasta un 50% del nivel observado en ausencia de cualquier anticuerpo anti-IL-17A agregado. Los resultados se proveen en el cuadro 12.

CUADRO 12 Inhibición del anticuerpo anti-IL-17A de la producción de IL-6 en células NHDF EJEMPLO 10 Ensayo de anticuerpos anti-IL-17A en fibroblasto de prepucio La capacidad de los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención para bloquear la actividad biológica de IL-17A se midió monitoreando la expresión de IL-6 inducida por rhlL-17A en la línea de célula de fibroblasto de prepucio HS68. Una producción reducida de IL-6 en respuesta a rhlL-17A se usa como medida de la actividad bloqueadora de los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención. El análisis de la expresión de IL-17RC (un receptor IL-17A) en un panel de líneas de células de fibroblastos identificaron la línea de célula de fibroblasto de prepucio humano HS68 (ATCC CRL1635) como una potencial línea de célula responsable de IL-17A. Esto fue confirmado por tinción de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpo policlonal IL-17R anti-humano de cabra (R&D Systems, Gaithersburg, Maryland, USA) seguido de IgG anticabra de asno de ficoeritrina (PE)-F(ab')2 (Jackson Immunoresearch, Inc., West Grove, Pennsylvania, USA), y se analizó la señal de inmunofluorescencia PE en un citómetro de flujo (FACScan, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, USA). Como validación adicional del modelo, IL-17A (tanto rhlL-17A derivado de adenovirus como el IL-17A derivado de E. coli comercialmente obtenible, R&D Systems) fueron inducidos a la inducción de respuesta a la dosis de IL-6 en las células HS68 con una CE50 de 5-10 ng/ml, cuya inducción fue bloqueada por pre-incubación con anticuerpos anti- IL-17A policlonales y monoclonales comerciales (R&D Systems). El ensayo de inhbición de IL-17A se llevó a cabo de la manera siguiente. Un frasco T-75 confluente de células HS68 (aproximadamente 2 X 106 células) se lavó con PBS de Dulbecco sin Ca++ y Mg++ y luego se incubó con 5 mi de un medio de disociación de células (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) durante 2-5 minutos a 37°C en una incubadora a 5% de CO2. Luego las células se cosecharon con 5 mi de un medio de cultivo de células (TC) y se centrifugaron durante 5 minutos a 1000 rpm. El medio TC es un Medio Eagle Modificado con Dulbecco (con glutamina), suero bovino fetal inactivado con calor a 10%, (Hyclone), 10 mM de Hepes, 1mM de piruvato de sodio, penicilina, y estreptomicina. Las células se resuspendieron en 2 mi de Medio de TC, se diluyeron con 1 :1 de azul de tripano y se contaron. La concentración de células se ajustó a 1 X 105 células/ml en un medio TC y 0.1 ml/pozo se añade en alícuotas en los pozos de una placa de fondo plano que contiene 0.1 mi de medio TC. Se desarrollaron las células durante la noche y el sobrenadante fue aspirado, y las células lavadas con 0.2 mi de medio de TC fresco. Los anticuerpos anti-IL-17A que debían ensayarse fueron diluidos en forma sucesiva en dos o tres etapas para proporcionar una serie de soluciones de carga que se usaron para crear concentraciones finales de anticuerpo de 1 a 0.001 pg/ml en el ensayo de inhibición de IL-17A. Se usó un control de IgG de rata en cada ensayo, así como también muestras de medio solamente, como controles para medir la producción espontánea de IL-6 en células de HS68. El medio TC se aspiró de los pozos de la placa que contenían células HS68. Alícuotas de las varias concentraciones de anticuerpo anti-IL-17A (0.1 mi de cada uno) fueron pre-incubadas en los pozos con células HS68 a 37°C durante 5 minutos antes de la adición de 0.1 mi de 20 ng/ml rhlL-17A, para proporcionar una concentración final de rhlL-17A de 10 ng/ml (aproximadamente 330 pM de dímero IL-17A). Las células se incubaron durante 24 horas a 37oC, y los sobrenadantes (50 - 100 µ?) se consecharon y ensayaron para la IL-6 usando por ejemplo, un equipo ELISA de IL-6 de Pharmingen (OptEIA - BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey, USA). Los resultados para varios anticuerpos IL-17A anti-humanos de rata de la presente invención en el ensayo de inhibición de IL-17A de fibroblasto de prepucio se proveen en el cuadro 13.

CUADRO 13 Ensayo de fibroblasto de prepucio EJEMPLO 11 Ensayo de proliferación de Ba/F3-hlL-17Rc-mGCSFR La capacidad de los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención para bloquear la actividad biológica de IL-17A se midió monitoreando la proliferación inducida por rhlL-17A de una línea de células manipulada por ingeniería genética para proliferar en respuesta a la estimulación de IL-17A. Específicamente, la línea de célula Ba/F3 (células pro-B murinas dependientes de IL-3) fue modificada para expresar una proteína de fusión que comprende dominio extracelular de un receptor IL-17A humano (hlL-17RC) fusionado con el dominio de transmembrana y una región citoplásmica de un receptor del factor estimulador de colonia de granulocitos de ratón (GCSFR). La línea de célula resultante se denomina aquí Ba/F3 hlL-17Rc-mGCSFR. La adhesión de IL-17A homodimérico a los dominios IL-17RC extracelulares causan la dimerización del receptor de proteína de fusión hlL-17Rc-mGCFR que señala la proliferación de células Ba/F3 a través de sus dominios citoplásmicos mGCSFR. Dichas células proliferan en respuesta a IL-17A, proporcionando un ensayo conveniente para los inhibidores de IL-17A tales como anticuerpos anti-IL-17A. La sensibilidad del ensayo de proliferación Ba/F3-hlL-17Rc-mGCSFR para la estimulación de IL-17A hace posible llevar a cabo los experimentos en concentraciones de rhlL-17A relativamente bajas (por ejemplo, 3 ng/ml, 100 pM) en comparación con otros ensayos, manteniendo al mismo tiempo una respuesta proliferativa sólida y fácilmente mensurable. Esto significa que se requieren concentraciones menores de anticuerpos anti-IL-17A para lograr un exceso molar por arriba del rhlL-17A en el ensayo. Los experimentos que se llevaron a cabo en concentraciones menores de anticuerpo hacen posible discriminar entre anticuerpos de alta afinidad que por otra parte podrían ser indistinguibles (es decir, pueden llevarse a cabo experimentos más próximos al intervalo lineal en la curva de adhesión del anticuerpo IL-17A en vez de en la meseta) Los anticuerpos IL-17A se filtraron a través de filtros de 0.22 pm después de dilución para trabajar la concentración de carga pero antes de la adición a las muestras experimentales. Se prepararon cuatro grupos de muestras por duplicado, a través de hileras de placas de cultivo de tejido de fondo plano, de 96 pozos. Tal como se usó en este ejemplo, el Medio de Crecimient es RPMI 1640 w/Glutamax (Invitrogen, Carlsbad, California, USA), 55 µ? de 2-mercaptoetanol, de suero de ternero bovino alimentado con la fórmula 10% (Irvine Scientific, Santa Ana, California, USA), 50 pg/ml de gentamicina, 2 pg/ml de puromicina, y 10 ng/ml mlL-3, el Medio de Bioensayo es el mismo que el Medio de Crecimiento pero sin puromicina y mll_-3. Todas las diluciones sucesivas en este ejemplo se prepararon en el medio de Bioensayo. Se prepararon las siguientes muestras experimentales (75 µ?): 1 ) una dilución sucesiva de Medio de Crecimient (incluyendo 10 ng/ml de mlL-3); 2) una dilución sucesiva de rhlL-17A; 3) una dilución sucesiva de anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención mezclados con 3 ng/ml de IL-17A (concentración final después de agregar las células), incluyendo un control "sin anticuerpos"; y 4) un control de "células solamente" sin ningún anticuerpo agregado, IL-17A o mlL-3. Luego se agregaron células Ba/F3 hlL-17Rc-mGCSFR (7500 células/pozo) para llevarlas hasta un volumen total de 100 µ?/????, y las placas se incubaron a 37°C/5% de C02 durante aproximadamente 40 horas. Se agregó tinte indicador AlamarBIue® (1 1 µ l/pozo) y las placas se incubaron a 37°C/5% de C02 durante 6-8 horas. Luego se leyeron las placas para determinar la diferencia de absorbancia a 570 nm y 600 nm. Se determinaron los valores de CI50 usando ajuste no lineal/respuesta a la dosis sigmoidal/pendiente variable. Los resultados del ensayo de proliferación Ba/F3 hlL-17Rc-mGCSFR se proveen en el cuadro 14.

CUADRO 14 Ensayo de proliferación Ba/F3 hlL-17Rc-mGCSFR EJEMPLO 12 Bloqueo cruzado de anticuerpos anti-IL-17A Diferentes anticuerpos anti-IL-17A de la invención pueden adherirse al mismo epítope, a epítopes que se superponen, o epítopes que no se superponen, incluyendo epítopes que son suficientemente distintos para que dos o más anticuerpos puedan adherirse a un monómero IL-17A simultáneamente. Los anticuerpos que se adhieren a porciones de IL-17A críticos para la adhesión al receptor bloquearan la actividad de IL-17A biológica mediada por el receptor. Dichos anticuerpos se denominan aquí "anticuerpos neutralizadores". Los anticuerpos que se adhieren pero que no bloquean la adhesión al receptor se denominarán anticuerpos no neutralizadores. Cuando se llevan a cabo experimentos en anticuerpos IL-17A y anti-IL-17A es útil poder determinar el nivel de IL-17A (o anti-IL-17A) en una muestra, tal como en una ELISA sandwich. Ver por ejemplo, el ejemplo 6. En un formato, un ELISA IL-17A involucra recubrir los pozos de una placa microtituladora con anticuerpos de captura, con adición de una muestra experimental que contiene posiblemente IL-17A, y adhesión de un anticuerpo de detección. El anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección deben ser capaces de adherirse a IL-17A al mismo tiempo. Puede usarse un ensayo similar para determinar el nivel de un anticuerpo anti-IL-17A, donde una solución estándar de IL-17A se adhiere a los pozos recubiertos con el anticuerpo de captura, seguido de adición de una muestra experimental que contiene posiblemente un anticuerpo anti-IL-17A, y que se adhiere a un anticuerpo de detección secundaria (por ejemplo, un anticuerpo IgG anti-humano en el caso de anticuerpos humanizados IgG de la presente invención). Tal como en el ELISA sandwich IL-17A, el anticuerpo de captura no puede interferir con la adhesión del anticuerpo que debe ensayarse. Los pares de anticuerpos preferidos para ser usados en los experimentos ELISA señalados en este Ejemplo pueden determinarse llevando a cabo experimentos de bloqueo cruzado. En experimentos de bloqueo cruzado, un primer anticuerpo se recubre sobre los pozos de una placa microtituladora. Luego se mezcla un segundo anticuerpo biotinilado con IL-17A y se deja adherir después de lo cual se agrega la mezcla al pozo recubierto y se incuba. El segundo anticuerpo biotinilado puede agregarse en varias concentraciones (es decir, tituladas) para asegurar que por lo menos en algunas muestras está presente el anticuerpo en un exceso molar doble (o superior) sobre el IL-17A homodimérico. La placa se lava luego y se determina la presencia o ausencia del segundo anticuerpo biotinilado adherido al pozo mediante métodos convencionales. Si los dos anticuerpos se bloquean entrecruzadamente habrá una reducción de señal (adhesión de IL-17A) para la placa en presencia del segundo anticuerpo anti-IL-17A en comparación con muestras de control que no contienen un segundo anticuerpo anti-IL-17A (o que contienen un control ¡sotípico). Los pares de anticuerpo que no tienen un bloqueo cruzado pueden usarse conjuntamente en ensayos tales como en ELISA sandwich. Aunque la naturaleza dimérica de IL-17A hace posible usar pares de anticuerpos de bloqueo cruzado en ELISA en ciertos formatos (por ejemplo, cuando IL-17A está adherido al anticuerpo de captura en la placa antes de la adición del anticuerpo de detección), generalmente son preferibles pares de anticuerpos bloqueadores no cruzados. Se ensayaron varios anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención (clones 4C3, 6C3, 8G9, 12E6, 16C10, 18H6, 23E12, 29H1 , 30C10, 1 D10, 21 B12, 29G3) en forma emparejada para el bloqueo cruzado. Todos los pares se bloquearon en forma cruzada con excepción de 29G3 / 1 D10 y 29G3 / 21 B12, lo cual indica que por lo tanto estos pares de anticuerpos pueden ser usados en ELISA. Además de la identificación de los pares de anticuerpos anti- IL-17A que pueden usarse en un ELISA, estos resultados muestran que el epítope adherido por el anticuerpo 29G3 es funcional o físicamente distinto del epítope o epítopes adheridos por los anticuerpos 1 D10 y 21 B12. Estos datos demuestran también que los epítopes para 1 D10 y 21 B12 se superponen pero no son idénticos al epítope para 16C10. Dichos pares de anticuerpos anti-IL-17A que se adhieren a epítopes funcionalmente distintos son útiles por ejemplo, para validar la inmunohistoquímica anti -IL-17A (IHC). Por ejemplo, si una muestra de tejido exhibe el mismo patrón de expresión de IL-17A en IHC llevado a cabo con dos anticuerpos anti-IL-17A diferentes que se adhieren a epítopes funcionalmente distintos, entonces es aún más probable que el ensayo detecte IL-17A, en vez de cualquier otra proteína de reacción cruzada espuria en la muestra de tejido. Dichos pares de anticuerpos que no son de bloqueo cruzado, son también útiles para diseñar ELISA para la detección de IL-17A en presencia de anticuerpos anti-IL-17A terapéuticos, por ejemplo, en muestras de pacientes sometidos a terapia de anticuerpos antilL-17A, en los cuales la presencia de un exceso del anticuerpo anti-IL-17A terapéutico bloquearía la detección con ELISA anti-IL-17A, a menos que los anticuerpos ELISA no fueran de bloqueo cruzado con el anticuerpo terapéutico.

EJEMPLO 13 Terapia génica con anticuerpos anti-IL-17A Los anticuerpos anti-IL-17A de la invención pueden administrarse también a un sujeto por terapia génica En una modalidad de terapia génica, las células de un sujeto se transforman con ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención. Los sujetos que comprenden los ácidos nucleicos producirán luego las moléculas de anticuerpo (intracuerpos) endógenamente. Por ejemplo, Alvarez et al. introdujeron anticuerpos anti-ErbB2 de cadena única a sujetos usando una modalidad de terapia génica. Alvarez et al. (2000) Clinical Cáncer Research 6:3081 -3087. Los métodos descritos por Alvarez et al. pueden adaptarse fácilmente para la introducción de ácidos nucleicos que codifican una molécula de anticuerpo anti-IL-17A de la presente invención en un sujeto. En una modalidad, la molécula de anticuerpo introducida por terapia génica es un anticuerpo de cadena única completamente humana. El método de terapia génica descrita aquí tiene la ventaja potencial de que el tratamiento necesita ser llevado a cabo únicamente una vez, o a lo sumo una cantidad limitada de veces, con la condición de lograr la expresión génica a largo término. Esto contrasta con la administración de anticuerpos, que debe ser repetida periódicamente para mantener los niveles terapéuticos apropiados en el sujeto. Los ácidos nucleicos pueden ser introducidos en las células de un sujeto por cualquier medio conocido en la técnica. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos son introducidos como parte de un vector viral. Ejemplos de virus a partir de los cuales pueden derivar los vectores incluyen lentivirus, virus herpes, adenovirus, virus adeno-asociados (AAV), virus vacunal, baculovirus, alfavirus, virus de la gripe y otros virus recombinantes con tropismo celular deseable. Varias compañías producen vectores virales en forma comercial, por ejemplo, Avigen, Inc. (Alameda, CA; vectores AAV); Cell Genesys (Foster City, CA; vectores AAV retrovirales, adenovirales, y vectores lentivirales); Clontech (vectores retrovirales y baculovirales); Genovo, Inc. (Sharon Hill, PA; vectores adenoviral y AAV); Genvec (vectores adenovirales); IntroGene (Leiden, Países Bajos; vectores adenovirales); Molecular Medicine (vectores retrovirales, adenovirales, AAV, y herpes virales); Norgen (vectores adenovirales); Oxford BioMedica (Oxford, Reino Unido; vectores lentivirales); y Transgene (Strasbourg, Francia; vectores adenovirales, vacunales, retrovirales, y lentivirales). Los métodos de construcción y uso de vectores virales son conocidos en la técnica (ver por ejemplo, Miller et al. (1992) BioTechniques 7:980-990). Preferiblemente, los vectores virales son réplicas defectuosas (incapaces de replicarse autonómicamente) y por lo tanto, no son infecciosos en la célula objetivo. Preferiblemente, el virus de replicación defectuosa es un virus mínimo que retiene únicamente las secuencias de su genoma que son necesarias para encapsidar el genoma para producir partículas virales. Los virus defectuosos que carecen enteramente o casi enteramente de genes virales son los preferidos. El uso de vectores virales defectuosos, permite la administración a las células en un área localizada específica sin preocupaciones de que el vector pueda infectar otras células, permitiendo direccionamiento específico en los tejidos. Ver por ejemplo, Kanno et al. (1999) Cáncer Gen. Ther. 6: 147-154; Kaplitt et al. (1997) J. Neurosci. Meth. 71 : 125-132; y Kaplitt et al. (1994) J. Neuro-Onc. 19:137-142. Los adenovirus son virus de ADN eucarióticos que pueden ser modificados para liberar eficientemente un ácido nucleico de la invención a una variedad de tipos de células. Los vectores de adenovirus atenuados, tales como el vector descrito por Stratford-Perricaudet et al. (1992) (J. Clin. Invest. 90:626-630) son deseables en algunos casos. Varios adenovirus de replicación defectuosa y vectores mínimos de adenovirus han sido descritos (PCT Publicación Nos. W094/26914, WO94/28938, W094/28152, W094/12649, WO95/02697 y W096/22378). Los adenovirus recombinantes de replicación defectuosa de la presente invención pueden prepararse mediante cualqueir técnica conocida por un experto en la técnica (ver Levrero et al. (1991 ) Gene 101 :195; EP 185573; Graham (1984) EMBO J. 3:2917; Graham er a/. (1977) J. Gen. Virol. 36:59). Los virus adeno-asociados (AAV) son virus de ADN de un tamaño relativamente pequeño que pueden integrarse, en una manera estable y específica de sitio, en el genoma de las células a las cuales infecta. Son capaces de infectar un amplio espectro de células sin inducir ningún efecto sobre el crecimiento celular, la morfología o la diferenciación, y no parecen estar involucrados en patologías humanas. El uso de vectores derivados de AAV para transferir genes in vitro e in vivo ha sido descrito (ver, Donsante et al. (2001 ) Gene Ther. 8:1343-1346; Larson et al. (2001 ) Adv. Exp. Med. Bio. 489:45-57; PCT Publicación Nos. WO91/18088 y WO93/09239; Patentes Norteamericanas Nos. 4,797,368 y 5,139,941 ; y EP 488528B1 ). En otra modalidad, el gen puede ser introducido en un vector retrovira, tal como se describió en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,399,346, 4,650,764, 4,980,289, y 5,124,263; Mann et al. (1983) Ce// 33: 153; Markowitz et al. (1988) J. Virol. 62:1 120; EP 453242 y EP178220. Los retrovirus son virus integradores que infectan células divisoras. Los vectores lentivirales pueden usarse como agentes para la liberación directa y expresión sostenida de ácidos nucleicos que codifican una molécula de anticuerpo de la invención en varios tipos de tejidos que incluyen cerebro, retina, músculo, hígado y sangre. Los vectores pueden transducirse eficientemente dividiendo y no dividiendo células en estos tejidos, y pueden mantener la expresión de la molécula de anticuerpo a largo término. Para una revisión, ver Zufferey et al. (1998) J. Virol. 72:9873-80 y Kafri et al. (2001 ) Curr. Opin. Mol. Ther. 3:316-326. Las líneas de células de empaquetamiento lentiviral se encuentran disponibles y son en general conocidas en la técnica, lo cual facilita la producción de vectores de lentivirus de título elevado para terapia génica. Un ejemplo, es una línea de células de empaquetamiento de lentivirus de pseudotipo VSV-G inducibles por tetraciclina que pueden generar partículas de virus a títulos superiores a 106 lU/ml durante por lo menos 3 a 4 días, ver Kafri et al. (1999) J. Virol. 73: 576-584. El vector producido por la línea de célula inducible puede concentrarse como se necesite para transducir eficientemente células no divisorias in vitro e in vivo. El virus Sindbis es un miembro del género de los alfavirus que ha sido estudiado extensamente desde su descubrimiento en varias partes del mundo a partir de 1953. La transducción génica basada en alfavirus, particularmente, el virus Sindbis, ha sido bien estudiada in vitro (ver Straus et al. (1994) Microbiol. Rev. 58:491 -562; Bredenbeek et al. (1993) J. Virol. 67; 6439-6446; lijima et al. (1999) Int. J. Cáncer 80:1 10-1 18; y Sawai er a/. (1998) Biochim. Biophys. Res. Comm. 248:315-323). Muchas propiedades de los vectores alfavirus los convierten en una alternativa deseable para otros sistemas vectores derivados de virus que se están desarrollando incluyendo manipulación genética rápida de las construcciones de expresión, producción de cargas de partículas infecciosas de títulos altos, infección de células no divisoras, y altos niveles de expresión (Strauss et al. (1994) Microbiol. Rev. 58:491 -562). Se ha descrito el uso de virus Sindbis para terapia génica. (Wahlfors et al. (2000) Gene. Ther. 7:472-480 y Lundstrom (1999) J. Recep. Sig. Transduct. Res. 19(1 -4):673-686). En otra modalidad, puede introducirse un vector en células mediante lipofección o con otros agentes facilitadores de transfección (péptidos, polímeros, etc,). Los lipidos catiónicos sintéticos pueden usarse para preparar liposomas para la transfección in vivo e in vitro de un gen que codifica un marcador (Felgner et al. (1987) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 84:7413-7417 y Wang et al. (1987) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 84:7851 -7855). Los compuestos y composiciones lípidas útiles para la transferencia de ácidos nucleicos han sido descritos en la PCT Publicación Nos. WO 95/18863 y WO96/17823, y en la Patente Nortearme ricana No. 5,459,127. También es posible introducir el vector in vivo en forma de un plásmido de ADN desnudo. Los vectores de ADN desnudos para terapia génica pueden ser introducidos dentro de las células huésped deseadas mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, electroporación, microinyección, fusión célular, DEAE dextrano, precipitación con fosfato de calcio, uso de una pistola génica, o uso de un transportador vector de ADN (ver por ejemplo, Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:963-967; Williams et al. (1991 ) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88:2726-2730). Pueden usarse también métodos de liberación de ADN mediados por receptor (Wu et al. (1988) J. Biol.

Chem. 263:14621 -14624). Las Patentes Norteamericanas Nos. 5,580,859 y 5,589,466 describen la liberación de secuencias de ADN exógenas, libres de agentes facilitadores de transfeccion en un mamífero. También ha sido descrita una técnica de transferencia de ADN de voltaje relativamente bajo de alta eficiencia in vivo, denominada electrotransferencia (Vilquin et al. (2001 ) Gene Ther. 8:1097; Payen et al. (2001 ) Exp. Hematol. 29:295-300; Mir (2001 ) Bioelectrochemistry 53:1 -10; PCT Publicaciones Nos. WO99/01 157, WO99/01 158 y WO99/01 175). Los métodos de terapia génica señalados aquí, pueden llevarse a cabo in vivo, o bien pueden llevarse a cabo ex vivo, en cuyo caso las células se obtienen de un sujeto, transformadas con un método de terapia génica in vitro, y subsiguientemente son re-introducidas dentro de un sujeto. Ver por ejemplo, Worgall (2005) Pediatr. Nephrol. 20(2): 1 18-24.

EJEMPL0 14 Mutaqenesis por inserción de cartucho de la CDR de anticuerpos parentales La optimización de las secuencias de CDR de anticuerpos IL-17A anti-humanos de la presente invención (por ejemplo, 16C10) se lleva a cabo usando mutagenesis exploratoria dirigida. La mutagenesis exploratoria de alanina se usa para determinar cuales residuos dentro de las CDR son los más críticos para la adhesión de IL-17A (ver ejemplo 19). El codón para uno o más residuos dentro de una o más CDR es reemplazado con un codón alanina, o un codón alanina se reemplaza con un codón glicina, y el anticuerpo resultante se ensaya para determinar la actividad relevante (por ejemplo, afinidad de adhesión a IL-17A, CI50 para el bloqueo del receptor en un ensayo de competición, bioensayo, tal como se provee en varios otros ejemplos que se dan aquí). La sustitución de codones puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo pero sin limitarlo a mutagenesis dirigida al sitio (por ejemplo, Kunkel, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA (1985) 82:488) y mutagenesis por PCR. Los residuos cruciales para la adhesión de IL-17A pueden determinarse también mediante inspección de la estructura de un complejo de IL-17A-anticuerpo, por ejemplo, una estructura cristalina por rayos X. Los residuos de las CDR de anticuerpos dentro de la distancia de contacto de IL-17A, o que están sustancialmente enterrados en la formación del complejo IL-17A-anticuerpo, son candidatos para una optimización adicional. Aquellos residuos con la sensibilidad más elevada para la mutación son estudiados luego adicionalmente, por ejemplo, mediante mutagenesis exploratoria homologa. En esta modalidad, las sustituciones de aminoácido conservadoras con aminoácidos homólogos se efectúan en los residuos objetivo para buscar anticuerpos con cualidades superiores. También son posibles mutaciones no conservadoras, aunque se corre el riesgo de destruir completamente la adhesión de IL-17A. Alternativamente, pueden generarse secuencias de anticuerpos mejoradas usando maduración de afinidad, en la cual se mutan los residuos seleccionados en una CDR para generar todas las sustituciones de aminoácido posibles en esa posición. En otra modalidad, se usan menos de todos los posibles 20 aminoácidos naturales como sustituciones para reducir la cantidad de secuencias potenciales a niveles más manejables, proporcionando sin embargo todavía una diversidad química en cada posición mediante el uso de una cantidad limitada de aminoácidos seleccionados para que sean óptimamente diversos (por ejemplo, aminoácidos hidrofóbicos representativos, polares-no cargados, básicos y ácidos) tales como en WO2005/044853. Dicha maduración por afinidad puede llevarse a cabo mediante la sustitución con cualquier cantidad de aminoácido en una posición de interés, incluyendo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o incluso más si se incluyen aminoácidos no convencionales o modificados.

EJEMPLO 15 Reactividad cruzada con tejidos humanos La propensión del anticuerpo IL-17A anti-humano humanizado hu16C10 a la reactividad cruzada con tejidos no objetivo en sujetos humanos, fue verificada de la manera siguiente. Se pre-incubó hu16C10 con un anticuerpo secundario biotinilado para formar un pre-complejo antes de exposición de muestras de tejidos. Luego se mezclaron los complejos de anticuerpo (con 20 pg/ml de anticuerpo) con un tejido o con otra muestra y se incubaron para permitir la adhesión. Los anticuerpos secundarios adheridos se detectaron luego usando detección con inmunoperoxidasa ABC (Vector Labs, Burlingame, California, USA). Tusón et al. (1990) J. Histochem Cytocr?em.38(7):923-6. Una muestra con un anticuerpo lgG1 humano no relacionado se incluyo como control negativo. La tinción inmunohistoquímica (IHC) se llevó a cabo con hu16C10 contra varios tejidos objetivo de control positivo incluyendo manchas de proteína rhlL-17A en platinas de UV-resina (Adhesive Coated Slides, Instrumedics, Inc., St. Louis, Missouri, USA), células de hígado de ratón infectadas con una IL-17A que codifica adenovirus, y tejido de artritis reumatoide humana. IHC reveló la adhesión (+++) en todos los tres controles positivos. La IHC se efectuó luego contra un panel de tejidos humanos (32 en total) para verificar la reactividad cruzada. Todas estas muestras de tejido humano se montaron sobre platinas de UV-resina. Las muestras se obtuvieron de tres donadores para cada tejido. Los tejidos humanos clasificados fueron glándulas adrenal, vesícula, cerebelo, corteza cerebral, colon, trompas de falopio, músculo cardíaco, riñon, hígado, pulmón, nodulo linfático, glándula mamaria, ovario, páncreas, paratiroides, glándula pituitaria, placenta, próstata, retina, músculo esqueletal, piel, intestino delgado, columna vertebral, bazo, estómago, testículos, timo, glándula tiroides, uretra, útero y cerviz (útero). La IHC fue negativa en todos los 32 tejidos.

Esta falta de reactividad cruzada tiene varios beneficios potenciales en los usos terapéuticos de los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención, tales como la reducción de la pérdida de anticuerpo debida a la adhesión no específica a otros tejidos (con la reducción consiguiente del efecto terapéutico), y la reducción de la probabilidad de enfrentarse a efectos adversos asociados con la adhesión a tejidos no deseados.

EJEMPLO 16 Tratamiento de artritis inducida por coláogeno usando anticuerpos anti- IL-17A La artritis inducida por colágeno (CIA) es un modelo en ratones ampliamente aceptado para artritis reumatoide en seres humanos. El anticuerpo anti-IL-17A 1 D10 de la presente invención (el anticurepo de rata parental, en vez de las formas humanizadas de éste) se administra a ratones que expresan CIA para verificar la capacidad de la terapia anti-IL-17A para tratar artritis reumatoide. El procedimiento fue el siguiente. En el día 0, ratones macho B10.RIII fueron inmunizados intra-dérmicamente en la base de la cola con colágeno bovino de tipo II emulsionado en Adyuvante Completo de Freund. En el día 21 los ratones fueron sometidos a un experimento intra-dérmico con colágeno bovino de tipo II emulsionado en Adyuvante Incompleto de Freund liberado en la base de la cola. Cuando ocurrió el primer signo de artritis severa en el grupo inmunizado (post-día 21 ), todos los ratones inmunizados restantes fueron distribuidos al azar en varios grupos de tratamiento. Los animales se trataron con 800 g, 200 g, o bien 50 pg del anticuerpo anti-IL-17A 1 D10; 200 pg de anticuerpo de control de isotipo; o diluyente. Los tratamientos se administraron subcutáneamente en el primer día de inicio de la enfermedad en los ratones inmunizados, y luego semanalmente cuatro veces más. Los ratones fueron sacrificados en el día 35 y las patas se fijaron en 10% de formalina de un pH regulado neutro para procesar y seccionar el tejido. Las patas fueron analizadas por un patólogo para medir los siguientes parámetros de histopatología: sinovio reactivo, inflamación, formación de paño, destrucción de cartílago, erosión ósea y formación ósea. Cada parámetro se graduó usando la siguiente escala de enfermedad: 0 = ninguna enfermedad; 1 = mínima, 2 = leve, 3 = moderada, 4 = severa. Además, se valoraron las patas usando una evaluación visual de la gravedad de la enfermedad (DSS), que mide la hinchazón y enrojecimiento en una escala de 0 a 3, donde 0 es una pata normal, 1 es inflamación de un dedo en la pata, 2 es inflamación de dos dedos o en la palma de esa pata, y 3 es inflamación de la palma y los dedos de la palma. Los resultados de 2 y 3 se denominan aquí, patas gravemente o sumamente inflamadas. Los resultados se presentan en las figuras 3A - 3C. Cada dato puntual representa una pata, en vez de un promedio para las cuatro patas de un animal o un promedio de todos los animales. La reducción en la cantidad de patas que muestran resultados de alta patología es estadísticamente significativa por tres mediciones de patología (DSS visual - hinchazón y enrojecimiento de la pata, daño del cartílago y erosión ósea) con concentraciones ensayadas de antilL-17A 1 D10 superiores (28 y 7 mg/kg). Los resultados con la concentración más baja (2 mg/kg) fueron estadísticamente significativos para la erosión ósea y reducidos para DSS visual y el daño en cartílagos. Se observaron beneficiosos simiales en la reducción de la producción de las enzimas degradantes de cartílagos dentro de las patas inflamadas (metaolproteasas de matriz MMP-2, MMP-3, MMP-13). La evaluación visual de la inflamación de la pata, sin embargo puede subestimar el beneficio terapéutico del tratamiento anti- IL-17A de los ratones CIA, por ejemplo, disminución de la erosión ósea. En otros experimentos, patas sumamente inflamadas (resultados de 2 o 3 en la DSS) de ratones CIA fueron analizados para la erosión ósea usando histopatología o tomografía micro-computada (micro-CT). Este estudio fue posible debido a que incluso a pesar de que los animales tratadados con anti-IL-17A tenía porcentajes drásticamente reducidos de patas sumamente inflamadas (ver, por ejemplo, la figura 3A), queda una cantidad de patas altamente inflamadas y fue posible comparar las patas altamente inflamadas (DSS = 2 o 3) de todos los grupos de tratamiento, incluyendo los controles sin anticuerpo. La figura 3D muestra un gráfico de la erosión ósea para patas altamente inflamadas de animales tratados con diluyente, tratados con control isotípico (rlgG1 ), y tratados con anticuerpo anti-IL-17A. La erosión ósea, medida por histopatología, se redujo significativamente en patas de animales tratados con anti-IL- 7A en comparación con controles sin anticuerpo, a pesar de sus resultados DSS similares. Los resultados sugieren que puede evitarse la erosión ósea con tratamiento anti-IL-17A incluso en patas en las cuales no hay ninguna mejoría aparente en la inflamación, medido según el resultado DSS. Se obtuvieron resultados similares cuando se usó micro-CT para medir la densidad mineral ósea (BMD) para articulaciones en patas sumamente inflamadas en ratones CIA. El cuadro 15 provee la BMD para patas con graves resultados de 0 o 3 de animales CIA tratados con un anticuerpo anti- IL-17A de la presente invención (1 D10) o un control isotípico (25D2). Incluso para articulaciones con la misma gravedad visual de la enfermedad, tratada con anticuerpo 1 D10 tuvo aproximadamente la mitad de disminución de densidad mineral ósea observada con animales tratados con control isotípico.

CUADRO 15 Densidad ósea para articulaciones en ratones CIA Tal como sucede con la erosión ósea, la destrucción de cartílago y la formación de paños sinoviales (proliferación del recubrimiento sinovial que forma excesivos dobleces de tejido inflamado) se redujeron también en ratones CIA tratados con anti-hlL-17A (1 D10). La histopatología mostró que el tratamiento con anticuerpos anti-IL-17A no redujo solamente la cantidada de patas que muestran patología grave, sino que redujo también la patología en patas que aparecen igualmente inflamadas en base a inspección visual (resultados DSS de 2 y 3) cuando se comparan con controles tratados con diluyente o isotipo. La observación de que el tratamiento con anticuerpos anti-IL-17A redujo significativamente la erosión ósea en el modelo CIA de inflamación de las articulaciones sugiere que dicha terapia puede ser útil para prevenir uno de los defectos más debilitantes e irreversibles de RA en seres humanos. Además, la observación de la erosión ósea se redujo incluso en patas sumamente inflamadas lo cual sugiere que puede suceder que la simple verificación visual de la inflamación de las articulaciones no mida exactamente la eficacia terapéutica en el laboratorio, y finalmente en la clínica. La medición de la erosión ósea puede ser necesaria para rastrear los efectos de los tratamientos terapéuticos. Dichos métodos incluyen, pero no están limitados a detección de rayos X estándar 2-D, tomografía computada (CT), formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), ultrasonido (US), y centellografía. Ver, por ejemplo, Guermazi et al. (2004) Semin. Musculoskelet. Radiol. 8(4):269-285.

EJEMPLO 17 Ensayo de anticuerpos anti-IL-17A por reclutamiento de neutrófilos BAL La capacidad de anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención para bloquear la actividad de IL-17A in vivo se verificó en un ensayo de reclutación de neutrófilos de un lavado broncoalveolar (BAL). Brevemente, el día 4, 5 ratones BALB/cAnN hembra de 5 semanas de vida (Taconic Farms, Germantown, New York, USA) se trataron con anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención o con un control isotípico, mediante inyección subcutánea de 0, 10, 30, 40, 60, o 100 pg de anticuerpo por ratón. En el día 1 los ratones fueron estimulados por administración nasal de 1 pg de rhlL-17A en 50 pl de PBS (o un control solamente de PBS) bajo anestesia leve con isoflurano. En el día 0, el nivel de neutrófilos presentes en el fluido BAL se determinó de la manera siguiente. Los ratones fueron asesinados sin dolor con CO2 y se recogieron muestras de sangre, a partir de las cuales se determinó la concentración de anticuerpo anti-IL-17A. Se insertó una aguja dentro de la traquea cervical superior a través de una traqueotomía y se recogió fluido BAL por introducción y remoción de 0.3 mi de PBS tres veces. El fluido BAL se centrifugó (400 x g durante 10 minutos a 4°C) y el granulado celular se resuspendió en PBS. El recuento total de células se determinó en un hemocitómetro usando una solución de azul tripano. Los recuentos diferenciales de células se llevaron a cabo en preparaciones de citospina mediante tinción de Wright-Giemsa (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA), de acuerdo con criterios morfológicos convencionales con el uso de un microscopio de inmersión (aumento original x 1000). El recuento de células se llevó a cabo en 200 o 300 células (linfocitos, monocitos, neutrófilos, eosinófilos) para determinar el porcentaje de neutrófilos BAL. Los resultados se proveen en la figura 4. Los datos se proveen para tres anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención (1 D10, 16C10 y 4C3), así como también en los controles. El porcentaje de neutrófilos en el fluido BAL como un porcentaje de todos los leucocitos para animales experimentales individuales se gráfica como función de la concentración de anticuerpo en el suero, donde el segmento izquierdo de las abscisas ("0" a "1") representa los controles, tal como se indica en la leyenda. Los controles muestran que el estímulo rhlL-17A induce un reclutamiento significativo de neutrófilos que no se reducen mediante la administración de un anticuerpo de control de isotipo (dosificado a los mismos niveles que los anticuerpos anti-IL-17A). En contraste, los datos de anti-IL-17A muestran una reducción dependiente de la dosis en el reclutamiento de neturófilos inducido por rhlL-17A, siendo el reclutamiento de neutrófilos bloqueado esencialmente en las concentraciones de anticuerpo del suero por arriba de 40-60 g/ml.

EJEMPL0 18 Tratamiento de artritis reumatoide (RA) usando anticuerpos anti-IL-17A Sujetos humanos a los que se les diagnosticó RA que habían tenido una respuesta inadecuada a uno o más DMARD fueron seleccionados para el tratamiento con un anticuerpo anti-IL-17A humanizado de la presente invención. Los sujetos se mantuvieron con metotexato (10 mg/semana), y se trataron opcionalmente con prednisona durante dos semanas. Se administró también a los sujetos dosis mensuales de 50 o 100 mg de anticuerpo anti-IL-17A, administradas subcutáneamente. Las dosis se ajustaron para sujetos específicos de acuerdo con los criterios clínicos convencionales y en base a la respuesta clínica. La respuesta al tratamiento se verificó determinando el resultado ACR el cual se basa en criterios desarrollados por el American College of Rheumatology. El resultado ACR es un resultado compuesto que integra parámetros clínicos múltiples y resultados radiográficos, tales como la reducción de la cantidad de articulaciones hinchadas y débiles, la verificación global del paciente, verificación global del médico, escala de dolor, incapacidad auto-verificada, y reactivos de fase aguda (régimen de sedimentación de eritrocitos o proteínas C-reactivas). Ver, Felson et al. (1995) Arthritis & Rheumatology 38; 727-735. Se considera que un sujeto tiene mejoría si el o ella exhibe un resultado de ACR20 o superior en la semana 24 de tratamiento. Además, la proporción de sujetos que logran varios resultados ACR (por ejemplo, ACR20, ACR50 y ACR70) pueden usarse para comparar grupos de tratamiento y placebo en pruebas clínicas para verificar la eficacia clínica del anticuerpo anti- IL-17A humanizado de la presente invención.

EJEMPLO 19 Determinación de epítope Los residuos aminoácido críticos para la adhesión de los anticuerpos de la presente invención, por ejemplo 16C10 de rata, se determinaron de la manera siguiente. Un primer grupo de experimentos se basó en la observación de que el anticuerpo 16C10 de rata podía adherirse a IL-17A humano (hlL-17A) pero era incapaz de adherirse a IL-17A de ratón (mlL-17A) o IL-17F humano de citocina relacionada. Cada una de estas tres proteínas estaba unida a un marbete peptídico FLAG® N-terminal (ver residuos 1 a 9 de la SEQ ID NO: 42). Con el fin de identificar los residuos aminoácidos críticos para la adhesión a 16C10, varias subsecuencias peptídicas de NL-17A, mlL-17A y IL-17F marcadas con FLAG, se combinaron mezclando los fragmentos de restricción de los genes relevantes para formar polipéptidos híbridos. La adhesión de estos polipéptidos híbridos al anticuerpo 16C10 fue determinada en un Ensayo Homogéneo de Proximidad Luminiscente Amplificada (AlphaScreen, Packard BioScience, Wellesley, Massachusetts, USA) para determinar cuales segmentos de hlL-17A eran críticos para la adhesión. El anticuerpo biotinilado 16C10 se adhirió al granulado donador de estreptavidina, y los polipéptidos híbridos se adhirieron al granulado aceptor que tiene anticuerpos anti-FLAG® (Packard BioScience). Los granulados donador y aceptor se mezclaron, se iluminaron a 680nm, y se midió la emisión a 520-620 nm. La adhesión se midió como fluorescencia realzada en muestras que contenían polipéptidos híbridos que se adhieren al anticuerpo 16C10 debido a que el granulado aceptor se mantuvo en proximidad íntima con el granulado donador y emitió luz cuando el singlete oxígeno del granulado donador saliente se difundió en el granulado aceptor. Los resultados mostraron que el anticuerpo 16C10 se adhiere a los polipéptidos híbridos que comprenden los residuos aminoácido 50-132, 63-132, 1 -87, 1 -112 y 63-87 de hlL-17A, lo cual demuestra que los residuos críticos para la adhesión 16C10 están presentes en los residuos 63-87 de hlL-17A (PSVIWEAKCR HLGCINADG NVDYHM). Toda la numeración de residuos en este ejemplo se da con referencia a la secuencia de hlL-17A (SEQ ID NO: 40). Por ejemplo, los polipéptidos mlL-17A y IL-17F sustituidos con residuos 63-87 de hlL-17A fueron capaces de adherirse al anticuerpo 16C10, mientras que los mlL-17A y IL-17F no lo fueron. Se introdujeron también mutaciones puntuales en hlL-17A para determinar cuales residuos aminoácido eran críticos para la adhesión del anticuerpo 16C10. En un experimento, se llevó a cabo mutagenesis de escaneo con alanina donde se introdujo un codón alanina en lugar del aminoácido nativo en varios residuos (45, 46, 51 , 52, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 61 , 62, 67, 68, 70, 72, 73, 78, 80, 82, 84, 85, 86, 88, 93, 94, 95, 100, 101 , 102, 105, 108, 1 10, 11 1 , 1 13, 114). Los plásmidos de expresión en mamíferos con genes que codifican las formas mutantes de hlL-17A fueron transfectados transitoriamente en células de riñon embriónico humano (HEK) 293T. Los sobrenadantes fueron analizados para la cuantificación con el marbete pepetídico FLAG® y para la adhesión del anticuerpo 16C10 mediante AlphaScreen, tal como se describió anteriormente. Ninguna de las sustituciones únicas de aminoácido alanina redujo significativamente la adhesión del anticuerpo 16C10. Se efectuaron otras mutaciones puntuales en las cuales los residuos IL-17F humanos o IL-17A de ratón fueron sustituidos en varias posiciones dentro del fragmento 63-87, es decir, L74Q, G75R, V83E, Y85H. Aunque ninguna de las mutaciones puntuales individuales inhibió la adhesión del anticuerpo 16C10, un hlL-17A que tenía todos los cuatro cambios exhibidos sustancialmente disminuyó la adhesión, lo cual confirma que los residuos en el fragmento 63-87 de hlL-17A, y más specificamente residuos en el fragmento 74-85 (LGCINADGNVDY), son importantes para la adhesión de 16C10.

CUADRO 16 Indentificadores de secuencia SEQ ID NO: Descripción 1 ADN de cadena liviana 16C10 hu con secuencia de señal Aminoácido de cadena liviana 16C10 hu con secuencia de 2 señal 3 ADN de cadena pesada 16C10 hu con secuencia de señal Aminoácido de cadena pesada 16C10 hu con secuencia 4 de señal 5 Dominio variable de cadena liviana 16C10/4C3 hu 6 Dominio variable de cadena pesada 16C10/4C3 hu 7 Dominio variable de cadena liviana 16C10 de rata 8 Dominio variable de cadena pesada 16C10 de rata 9 Cadena liviana 16C10 quimérica 10 Cadena pesada 16C10 quimérica 11 CDRL1 de 16C10/4C3 de rata/hu 12 CDRL2 de 16C10/4C3 de rata/hu 13 CDRL3 de 16C10/4C3 de rata/hu 14 CDRH1 de 16C10/4C3 de rata/hu 15 CDRH2 de 16C10/4C3 de rata 16 CDRH2 (N54Q) de 16C10/4C3 hu 17 CDRH2 (N54N/Q/A) 16C10 de rata 18 CDRH3 de 16C10/4C3 de rata 19 CDRH3 (M96A) de 16C10/4C3 hu 20 CDRH3 (M96M/A/K, M100hM/F) de 16C10 de rata 21 Dominio variable de cadena liviana 4C3 de rata 22 Dominio variable de cadena liviana 30C10 hu 23 Dominio variable de cadena pesada 30C10 hu 24 Dominio variable de cadena liviana 30C10 de rata 25 Dominio variable de cadena pesada 30C10 de rata 26 CDRL1 de 30C10 hu 27 CDRL2 de 30C10 de rata/hu 28 CDRL3 de 30C10 de rata/hu 29 CDRH1 de 30C10 de rata/hu 30 CDRH2 de 30C10 de rata/hu 31 CDRH3 de 30C10 de rata/hu 32 Dominio variable de cadena liviana de 12E6 de rata 33 Dominio variable de cadena pesada de 12E6 de rata 34 CDRL1 de 12E6 de rata/hu 35 CDRL2 de 12E6 de rata/hu 36 CDRL3 de 12E6 de rata/hu 37 CDRH1 de 12E6 de rata/hu 38 CDRH2 de 12E6 de rata/hu 39 CDRH3 de 12E6 de rata/hu 40 hulL-17A (nativo) 41 rhlL-17A 42 FLAG-IL-17A 43 R&D IL-17A ADN de cadena liviana de dominio variable 23E12 de rata con 44 secuencia de señal Aminoácido de cadena liviana de dominio variable 23E12 de 45 rata con secuencia de señal ADN de cadena pesada de dominio variable de 23E12 de rata 46 con secuencia de señal Aminoácido de cadena pesada de dominio variable de 23E12 de 47 rata con secuencia de señal 48 CDRL1 de 23E12 de rata/hu 49 CDRL2 de 23E12 de rata/hu 50 CDRL3 de 23E12 de rata/hu 51 CDRH1 de 23E12 de rata/hu 52 CDRH2 de 23E12 de rata/hu 53 CDRH3 de 23E12 de rata/hu 54 Dominio variable de cadena liviana 1 D10 de rata 55 Dominio variable de cadena pesada 1 D10 de rata 56 CDRL1 de 1 D10 de rata 57 CDRL2 de 1 D10 de rata 58 CDRL3 de 1 D10 de rata 59 CDRH1 de 1 D10 de rata 60 CDRH2 de 1 D10 de rata 61 CDRH3 de 1 D10 de rata 62 ADN de cadena liviana 16C10 hu con secuencia de señal 63 ADN de cadena pesada 16C10 hu con secuencia de señal Las citas de las publicaciones o documentos anteriores no constituyen una admisión de que cualquiera de los que preceden es técnica anterior pertinente ni constituyen ningúna admisión en cuanto al contenido o fecha de estas publicaciones o documentos. Todas las referencias citadas aquí se incorporan como referencia hasta el mismo grado que si cada una las publicaciones individuales, solicitudes de patente o patentes, estuvieran específicamente e individualmente indicadas para ser incorporadas como referencia.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un compuesto de adhesión que se adhiere a IL-17A humana, que comprende: por lo menos una región variable de cadena liviana de un anticuerpo, o un fragmento de adhesión de éste, que tiene por lo menos un número específico de secuencias de CDR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1 1 -13; y por lo menos una región variable de cadena pesada de un anticuerpo, o un fragmento de adhesión de éste, que tiene por lo menos un número específico de secuencias de CDR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 14-20, donde el número específico es uno. 2. - El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el número especificado es dos. 3. - El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el número especificado es tres. 4. - El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la región variable de cadena liviana comprende las secuencias de CDR de las SEQ ID NOS: 11 -13; y donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR de las SEQ ID NOS: 14, 17 y 20. 5. - El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la región variable de cadena liviana comprende las secuencias de CDR de las SEQ ID NOS: 11 -13; y donde la región variable de cadena pesada comprende las secuencias de CDR de las SEQ ID NOS: 14, 16 y 19. 6.- El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la región variable de cadena liviana comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 5 que tiene hasta diez sustituciones conservadoras y donde la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 6 que tiene hasta diez sustituciones de aminoácido conservadoras. 7. - El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el compuesto de adhesión es un anticuerpo que comprende: una región variable de cadena liviana que comprende la SEQ ID NO: 5; y una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6. 8. - El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la cadena liviana consiste esencialmente en aminoácidos 1 -220 de la SEQ ID NO: 2 que tiene hasta diez sustituciones conservadoras y la cadena pesada consiste esencialmente en los aminoácidos 1-454 de la SEQ ID NO: 4 que tiene hasta diez sustituciones conservadoras. 9. - El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la cadena liviana consiste esencialmente en los aminoácidos 1 -220 de la SEQ ID NO: 2 y la cadena pesada consiste esencialmente en los aminoácidos 1 -454 de la SEQ ID NO: 4. 10. - El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la cadena liviana consiste en los aminoácidos 1 -220 de la SEQ ID NO: 2 y la cadena pesada consiste esencialmente en los aminoácidos 1 -454 de la SEQ ID NO: 4. 1 1. - Un compuesto de adhesión que se adhiere a IL-17A humana, donde el compuesto de adhesión comprende una región variable de cadena liviana que tiene por lo menos 90% de homología con la SEQ ID NO: 5 y una región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 90% de homología con la SEQ ID NO: 6. 12. - Un ácido nucleico aislado que codifica por lo menos una de las regiones variables de cadena liviana y la región variable de cadena pesada del compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 3. 13.- El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena liviana es la SEQ ID NO: 5 y la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada es la SEQ ID NO: 6. 14. - El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque comprende las secuencias de las SEQ ID NOS: 1 y 3, o la secuencias de las SEQ ID NOS: 62 y 63. 15. - Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 14 ligado operativamente para controlar las secuencias que son reconocidas por una célula huésped donde la célula huésped es transfectada con el vector. 16. - El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el vector de expresión tiene el No. de Acceso ATCC PTA-7675. 17. - Una célula huésped que comprende el vector de conformidad con la reivindicación 16. 18. - Un método para producir un polipéptido que comprende: cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 17 en un medio de cultivo bajo condiciones donde se expresa la secuencia de ácido nucleico, produciendo por lo tanto polipéptidos que comprenden las regiones variables de cadena liviana y cadena pesada; y recuperar los polipéptidos de la célula huésped o el medio de cultivo. 19. - Un anticuerpo hu16C10 anti-IL- 7A humana, donde la secuencia de anticuerpo es codificada mediante el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 16. 20. - Un anticuerpo que es capaz de adhesión por bloqueo cruzado del compuesto de adhesión de la reivindicación 10 a IL-17A humana, en un ensayo de bloqueo cruzado. 21.- Un anticuerpo que se adhiere al mismo epítope en IL-17A humano como el epítope que está adherido por el anticuerpo 16C10 de conformidad con la reivindicación 19. 22.- Un anticuerpo que se adhiere a IL-17A humano en un epítope que comprende los residuos aminoácidos 74-85 de la secuencia de proteína de IL-17A humana de la SEQ ID NO: 40. 23. - Un compuesto de adhesión que se adhiere a IL-17A humana, que comprende: una región variable de cadena liviana que comprende las secuencias CDR de las SEQ ID NOS: 26-28; y una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias CDR de las SEQ ID NOS: 29-31. 24. - El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la región variable de cadena liviana comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 22 y la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 23. 25. - El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el compuesto de adhesión es un anticuerpo monoclonal. 26.- Un compuesto de adhesión que se adhiere a IL-17A humana, que comprende: (a) una región variable de cadena liviana que comprende las secuencias CDR de las SEQ ID NOS: 48-50 y la región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de CDR de las SEQ ID NOS: 51 -53; o (b) una región variable de cadena liviana que comprende las secuencias CDR de las SEQ ID NOS: 56-58 y una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias CDR de las SEQ ID NOS: 59-61. 27.- El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el compuesto de adhesión es un anticuerpo monoclonal humanizado. 28. - Un compuesto de adhesión que se adhiere a IL-17A humana, donde el compuesto de adhesión tiene por lo menos una de las siguientes propiedades: a) el compuesto de adhesión se adhiere a IL-17A humana con una constante de disociación en equilibrio (Kd) de 100 pM o menos; b) el compuesto de adhesión tiene una Cl50 de 5 nM o menos en un ensayo para la inhibición de la producción de IL-6 en fibroblastos dérmicos humanos normales estimulados por IL-17 A humana, donde la estimulación de IL-17A humana es efectuada con 1 nM de IL-17A humana; c) el compuesto de adhesión tiene una Cl50 de 500 pM o menos en un ensayo in vitro de la actividad biológica de IL-17A humana, donde el ensayo in vitro mide la actividad biológica de 100 pM de IL-17A humana; d) el compuesto de adhesión es capaz de reducir el reclutamiento de neutrófilos inducido por IL-17A en el pulmón en un 50% o más (medido como porcentaje de neutrófilos BAL) cuando se administra a ratones en una concentración en el suero de 50 pg/ml; e) el compuesto de adhesión se adhiere a IL-17A de macacos con una afinidad (Kd) que es no más de 20 veces inferior a la afinidad para IL-17A humana, donde el compuesto de adhesión inhibe también la actividad de IL-17A de macaco; y f) el compuesto de adhesión para IL-17A humana con una afinidad (Kd) que es por lo menos 100 veces mayor que su afinidad para IL-17A de ratón o rata. 29. - El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el compuesto de adhesión tiene por lo menos una de las siguientes propiedades: a) el compuesto de adhesión se adhiere a IL-17A con una constante de disociación de equilibrio (Kd) de 20 pM o menos; b) el compuesto de adhesión tiene una Cl50 de 1 nM o menos en un ensayo para la inhibición de la producción de IL-6 en fibroblastos dérmicos humanos normales estimulados por IL-17A humana, donde la estimulación de IL-17A humana es efectuada con 1 nM de IL-17A humana; y c) el compuesto de adhesión tiene una C o de 100 pM o menos en un ensayo in vitro de la actividad biológica de IL-17A humana, donde el ensayo in vitro mide la actividad biológica de 100 pM de IL-17A humana; 30. - El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el compuesto de adhesión es un anticuerpo monoclonal humanizado o completamente humano. 31 . - El uso de un compuesto de adhesión que se adhiere a IL-17A humana y neutraliza la actividad de IL-17A humana, donde el compuesto de adhesión comprende una región variable de cadena liviana de anticuerpo y una región variable de cadena pesada de anticuerpo, donde la región variable de cadena liviana comprende la SEQ ID NO: 5 y la región variable de cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 6, en la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de un trastorno inflamatorio o autoinmune en un sujeto humano. 32. - El uso como se reclama en la reivindicación 31 , en donde el compuesto de adhesión es un anticuerpo monoclonal. 33. - El uso como se reclama en la reivindicación 31 , en donde el trastorno es artritis reumatoide. 34. - El uso como se reclama en la reivindicación 31 , en donde el trastorno es enfermedad de inflamación intestinal. 35.- El uso como se reclama en la reivindicación 3 , en donde el medicamento es adaptado para ser administrable con otro agente inmunosupresor o anti-inflamatorio. 36.- Una composición que comprende: un compuesto de adhesión que se adhiere a IL-17A humana y neutraliza la actividad de IL-17A humana, donde el compuesto de adhesión comprende una región variable de cadena liviana de anticuerpo y una región variable de cadena pesada de anticuerpo, donde la región variable de cadena liviana comprende la SEQ ID NO: 5 y la región variable de cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 6; y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. 37.- La composición de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque comprende además otro agente inmunosupresor o anti-inflamatorio. 38. - El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque comprende además una región constante de cadena pesada donde la región constante de cadena pesada comprende una región constante de cadena pesada humana ?1 , ?2, ?3, o ?4 o una variante de ésta. 39. - El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque comprende una región constante de cadena pesada humana ?1 o una variante de ésta. 40. - El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque comprende una región constante de cadena pesada humana ?4 o una variante de ésta. 41. - El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque comprende además una región constante de cadena liviana, donde la región constante de cadena liviana comprende una región constante de cadena liviana kappa humana. 42.- El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el compuesto de adhesión es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, y un diacuerpo. 43. - El compuesto de adhesión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el compuesto de adhesión es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, y un diacuerpo. 44. - El compuesto de adhesión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 1 1 , 23, 26 o 28, caracterizado además porque el compuesto de adhesión inhibe la actividad de IL-17A humana.