KR20090052347A - Ｉｌ-17ａ에 대한 항체 - Google Patents

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Abstract

사람 IL-17A에 대한 가공된 항체 및 이의 용도가 기재되어 있다.
사람 IL-17A, 결합 화합물, 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 모노클로날 항체.

Description

ＩＬ-17Ａ에 대한 항체 {ANTIBODIES TO IL-17A}
본 발명은 일반적으로 IL-17A 특이 결합 화합물, 예를 들면, 항체 및 이의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 사람 IL-17A를 인지하고 특히 염증 질환, 자가면역 질환 및 증식 질환에서 이의 활성을 조절하는 키메라 항체 및 사람화된 항체에 관한 것이다.
면역계는 감염인자, 예를 들면, 세균, 다세포 유기체 및 바이러스 뿐만 아니라 암으로부터 개체를 보호하는 기능을 한다. 이러한 면역계는 몇 가지 유형의 림프구 및 골수 세포, 예를 들면, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포(DC), 호산구, T 세포, B 세포 및 호중구를 포함한다. 이러한 림프구 및 골수 세포는 종종 사이토킨으로서 공지된 시그널링 단백질을 생산한다. 면역 반응은 염증, 즉 전신에 또는 신체의 특정 위치에서의 면역 세포의 축적을 포함한다. 감염인자 또는 이물질에 대한 반응으로, 면역 세포는 사이토킨을 분비하며, 사이토킨은 면역 세포 증식, 발달, 분화 또는 이주를 조절한다. 면역 반응은, 예를 들면, 자기면역 질환에서와 같이 과도한 염증을 수반하는 경우에 병리학적 결과를 초래할 수 있다[문헌 참조; Abbas et al. (eds.) (2000) Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA; Oppenheim and Feldmann (eds.) (2001) Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, CA; von Andrian and Mackay (2000) New Engl. J. Med. 343:1020-1034; Davidson and Diamond (2001) New Engl. J. Med. 345:340-350].
인터루킨-17A(IL-17A; 세포독성 T-림프구-관련 항원 8(CTLA8), IL-17이라고도 공지되어 있음)는 항원 인식 후에 기억 T 세포에 의해 생산된 동종이합체(homodimeric) 사이토킨이다. 이러한 T 세포의 발달은 인터루킨-23(IL-23)에 의해 촉진된다[문헌 참조; McKenzie et al. (2006) Trends Immunol. 27(l):17-23; Langrish et al. (2005) J. Exp. Med. 201(2):233-40]. IL-17A는 두 개의 수용체, IL-17RA 및 IL-17RC를 통해 작용하여 호중구 생활사, 염증 및 기관 파괴에 관여하는 수많은 분자의 생산을 유도한다. 이러한 사이토킨은 조직 괴사 인자(tissue necrosis factor; TNF) 및 또는 인터루킨 1β(IL-1β)와 상승작용하여 보다 큰 전-염증 환경을 촉진시킨다. IL-17A의 활성을 항체 또는 항체의 항원 결합 단편으로 길항시키는 것이 류마티스 관절염(RA), 골관절염, 류마티스 관절염 골다공증, 염증성 섬유증(예를 들면, 공피증, 폐 섬유증 및 경화증), 치은염, 치주염 또는 기타의 염증성 치주병, 염증성 장 질병[예를 들면, 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염 및 염증성 장 질병], 천식(알레르기성 천식 포함), 알레르기, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 다발 경화증, 건선 및 암을 포함하는 각종 염증 질환, 면역 질환 및 증식 질환을 치료하기 위해 제안되어 왔다[예를 들면, 제US 2003/0166862호, 제WO 2005/108616호, 제WO 2005/051422호 및 제WO 2006/013107호 참조].
생체내에서 치료제로서 항체를 사용하는 데 있어 가장 중요한 제한은 항체의 면역원성이다. 대부분의 모노클로날 항체는 설치류로부터 기원하기 때문에, 사람에서 반복 사용하면, 치료 항체, 예를 들면, HAMA(human against mouse antibody)에 대해 면역 반응을 생성한다. 이러한 면역 반응은 치료 효능의 손실을 최소화하고 잠재적인 치사 아나필락시스 반응(fatal anaphylactic response)을 최대화시킨다. 설치류 항체의 면역원성을 감소시키려는 초기의 노력들은, 마우스 가변 영역(Fv)가 사람 고정 영역과 융합되어 있는 키메라 항체의 생산을 포함한다[문헌 참조; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-43]. 그러나, 사람 가변 영역과 마우스 고정 영역의 하이브리드(hybrid)를 주사한 마우스는 사람 가변 영역에 대해 지시된 강력한 항-항체 반응을 나타내는데, 이는, 이러한 키메라 항체에서 전체 설치류 Fv 영역의 잔류가 환자에서 여전히 원치않는 면역원성을 야기할 수 있음을 시사한다.
일반적으로, 가변 도메인의 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR) 루프가 항체 분자의 결합 영역을 포함하는 것으로 여겨진다. 이에 따라, 설치류 서열을 더욱 최소화하기 위해 사람 골격으로의 설치류 CDR 루프의 이식(즉, 사람화)을 시도하였다[문헌 참조; Jones et al. (1986) Nature 321:522; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534]. 그러나, CDR 루프 교환은 원래의 항체와 동일한 결합 특성을 갖는 항체를 한결같이 생성하지는 못한다. 사람화된 항체에서 CDR 루프 지지에 관여하는 잔기인 골격 잔기(framework residue; FR)내 변 화가 또한 항원 결합 친화도를 보존하는 데 종종 필요하다[문헌 참조; Kabat et al. (1991) J. Immunol. 147:1709]. 다수의 사람화된 항체 작제물에서의 CDR 이식 및 골격 잔기 보존의 사용이 보고된 바 있지만, 특정 서열이 목적하는 결합 특성 및 때때로 생물학적 특성을 갖는 항체를 야기하는지를 예측하기는 곤란하다[문헌 참조; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029, Gorman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181, and Hodgson (1991) Biotechnology (NY) 9:421-5]. 더욱이, 대부분의 선행 연구들은 동물 경쇄 및 중쇄 가변 서열에 대해 상이한 사람 서열을 사용하므로, 이러한 연구들의 예측성은 의문의 여지가 있다. 공지된 항체의 서열이 사용되거나, 보다 전형적으로는 항체 NEW 및 KOL과 같이 공지된 X선 결정 구조를 갖는 항체의 서열이 사용되었다[문헌 참조; Jones et al., 상기 참조; Verhoeyen et al., 상기 참조; 및 Gorman et al., 상기 참조]. 정확한 서열 정보는 몇가지 사람화 작제물의 경우에만 보고되어 있다.
염증 질환, 자가면역 질환 및 증식 질환과 같은 사람 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 항-IL-17A 모노클로날 항체와 같은 IL-17A의 길항제가 요구된다. 이러한 길항제는 바람직하게는 사람 대상체에서 낮은 면역원성을 나타내어, 불리한 면역 반응없이 반복 투여할 수 있다.
발명의 요지
본 발명은 사람 대상체에서 높은 결합 친화도, 중화 활성, 우수한 약동성 및 낮은 항원성을 포함하는 하나 이상의 목적하는 특성을 갖는 항-사람 IL-17A 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 질환의 치료에 있어서의 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다.
따라서, 한 가지 양태에서, 본 발명은 사람 IL-17A에 결합하여 이의 활성을 억제하는 결합 화합물, 예를 들면, 항체 분자 또는 이의 결합 단편을 제공한다. 몇몇 양태에서, 결합 화합물은 하나 이상의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 및 하나 이상의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인 또는 이들 도메인의 결합 단편을 포함하며, 여기서, VL 도메인은 서열 11 내지 13으로부터 선택된 서열을 갖는 특정 수 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고, VH 도메인은 서열 14 내지 20으로부터 선택된 서열을 갖는 적어도 특정 수 이상의 CDR을 포함하며, 여기서, 특정 수는 1, 2 또는 3이다. 특정 수의 CDR은 소정의 결합 화합물에서 경쇄 및 중쇄 가변 도메인에 대해 동일하거나 상이할 수 있다. 또 다른 양태에서, VH 도메인 CDR은 서열 14, 17 및 20으로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, VH 도메인 CDR은 서열 14, 16 및 19로부터 선택된다. 추가의 양태에서, VL 및 VH 도메인의 서열은 각각 서열 5 및 서열 6의 서열이다. 몇몇 양태에서, IL-17A 결합 화합물은 사람 IL-17A의 활성을 억제한다.
또 다른 양태에서, 결합 화합물은 하나 이상의 VL 도메인과 하나 이상의 VH 도메인, 또는 이들 도메인의 결합 단편을 포함하며, 여기서, VL 도메인은 서열 26 내지 28로부터 선택된 서열을 갖는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하고, VH 도메인은 서열 29 내지 31로부터 선택된 서열을 갖는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다. 또 다른 양태에서, VL 및 VH 도메인의 서열은 각각 서열 22 및 서열 23의 서열이다. 또 다른 양태에서, 결합 화합물은 ATCC 수탁 번호 PTA-7739(rat 30C10, 2006년 7월 20일자로 JL7-30C10.C3 균주로서 기탁됨)를 갖는 하이드리도마(hybridoma)로부터 생산된 항체와 동일한 CDR을 갖는다.
추가의 양태에서, 결합 화합물은 하나 이상의 VL 도메인 및 하나 이상의 VH 도메인, 또는 이들 도메인의 결합 단편을 포함하며, 여기서, VL 도메인은 서열 48 내지 50으로부터 선택된 서열을 갖는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하고, VH 도메인은 서열 51 내지 53으로부터 선택된 서열을 갖는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.
또 다른 양태에서, 결합 화합물은 하나 이상의 VL 도메인 및 하나 이상의 VH 도메인, 또는 이들 도메인의 결합 단편을 포함하며, 여기서, VL 도메인은 서열 34 내지 36으로부터 선택된 서열을 갖는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하고, VH 도메인은 서열 37 내지 39로부터 선택된 서열을 갖는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하거나, VL 도메인은 서열 56 내지 58로부터 선택된 서열을 갖는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하고, VH 도메인은 서열 59 내지 61로부터 선택된 서열을 갖는 1개, 2 개 또는 3개의 CDR을 포함한다.
다양한 또 다른 양태에서, 본 발명은 각각 서열 5 및 6의 서열과 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 50% 이상의 서열 상동성을 갖는 VL 및 VH 도메인을 갖는, 사람 IL-17A에 결합되는 결합 화합물을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 결합 화합물은 각각 서열 5 및 6의 서열에 대해 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)을 갖는 VL 및 VH 도메인을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 결합 화합물은 각각 서열 2 및 4의 서열의 성숙한 형태에 대해 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 및 중쇄를 갖는 항체이다.
한 가지 양태에서, 결합 화합물은 항체 또는 이의 결합 단편, 예를 들면, Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2 및 디아바디(diabody)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항체 단편이다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 결합 화합물은 서열 2(잔기 1번 내지 220번)의 성숙한 형태의 서열을 갖는 경쇄 및 서열 4(잔기 1번 내지 454번)의 성숙한 형태의 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체 hu16C10이다. 또 다른 양태에서, 결합 화합물은 ATCC 수탁 번호 PTA-7675(플라스미드 pAIL17AV1에서 hu16C10, 2006년 6월 28일자로 기탁됨)를 갖는 발현 벡터로부터 생산된 항체이다.
한 가지 양태에서, 본 발명의 결합 화합물은 중쇄 고정 영역, 예를 들면, γ1, γ2, γ3 또는 γ4 사람 중쇄 고정 영역 또는 이의 변이체와 같은 사람 고정 영역을 포함한다. 또 다른 양태에서, 결합 화합물은 경쇄 고정 영역, 예를 들면, 람 다 또는 카파 사람 경쇄 영역 또는 이의 변이체와 같은 사람 경쇄 고정 영역을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 사람 IL-17A에 결합되는 본 발명의 결합 화합물, 예를 들면, 항체(또는 이의 결합 단편)을 암호화하는 분리된 핵산, 예를 들면, DNA에 관한 것이다. 한 가지 양태에서, 분리된 핵산은 하나 이상의 항체 경쇄 가변(VL) 도메인 및 하나 이상의 항체 중쇄 가변(VH) 도메인, 또는 이들 도메인의 결합 단편을 포함하는 결합 화합물을 암호화하며, 여기서, VL 도메인은 서열 11 내지 13으로부터 선택된 서열을 갖는 특정 수 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고, VH 도메인은 서열 14 내지 20으로부터 선택된 서열을 갖는 특정 수 이상의 CDR을 포함하며, 여기서, 특정 수는 1, 2 또는 3이다.
또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 각각 서열 5 및 서열 6의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 중의 하나 또는 둘 다를 암호화한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 2의 성숙한 형태의 서열을 갖는 경쇄 및 서열 4의 성숙한 형태의 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체 16C10을 암호화한다. 몇몇 양태에서, 분리된 핵산은 서열 1 또는 서열 62의 뉴클레오타이드 58 내지 717을 포함하고, 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 3 또는 서열 63의 뉴클레오타이드 58 내지 1419를 포함한다. 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 1의 서열과 서열 3의 서열을 포함한다. 여전히 또 다른 양태에서, 분리된 핵산은 서열 62의 서열과 서열 63의 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서, 분리된 핵산은 단일 핵산 분자 상의 경쇄 및 중쇄 둘 다를 암 호화하며, 또 다른 양태에서, 경쇄 및 중쇄는 두개 이상의 별도의 핵산 분자 상에서 암호화된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 분리된 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이며, 여기서, 핵산은, 숙주 세포가 벡터로 형질감염되는 경우에 숙주 세포에 의해 인식되는 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 가지 양태에서, 발현 벡터는 ATCC 수탁 번호 PTA-7675(플라스미드 pAIL17AV1내 hu16C10, 2006년 6월 28일자로 기탁됨)을 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 배양 배지 속에 결합 화합물을 암호화하는 발현 벡터를 담고 있는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 결합 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 본 발명의 결합 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 사람 IL-17A 상에서 항체 16C10, 4C3, 30C10, 12E6, 23E12 또는 1D1O과 동일한 에피토프(epitope)에 결합되는, 항체 또는 이의 결합 단편과 같은 결합 화합물, 예를 들면, 본 발명의 특정 항체와 교차-차단 결합(cross-block binding)할 수 있는 항체, 또는 사람 IL-17A(서열 40)의 아미노산 잔기 74번 내지 85번에 의해 한정된 에피토프내에 결합되는 항체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 고친화도 사람 IL-17A 결합 화합물, 예를 들면, 항체 또는 이의 결합 단편, 예를 들면, 1000, 500, 100, 50, 20, 10, 5, 2pM 이하의 평형 해 리 상수(Kd)(즉, 보다 높은 친화도)로 결합하는 결합 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 정상 사람 피부 섬유모세포, 포피 섬유모세포 또는 윤활막세포로부터 IL-6의 IL-17A-자극된 생산과 같이 IL-17A 자극이 1000pM(1nM)의 농도에서 수행되는 생물학적 활성 검정으로 측정하여 5000, 2000, 1000, 500pM의 IC50와 같은 강력한 생물학적 활성을 갖는 결합 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, Ba/F3-hIL-17Rc-mGCSFR 증식 검정과 같이 IL-17A 자극이 100pM의 농도에서 수행되는 생물학적 활성 검정으로 측정하여 1000, 500, 200, 100, 50pM 이하의 IC50을 갖는 결합 화합물에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명은, 생물학적 검정시, IL-17A의 농도가, 예를 들면, 5, 10, 50, 100, 500 또는 1000pM 이상인 경우 IL-17A의 10X, 5X, 2X, IX 및 낮게는 0.5X 범위의 농도에서 사람 IL-17A의 활성을 억제할 수 있는 결합 화합물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 마우스에 투여시 폐로의 IL-17A 유도된 호중구 보충을 50% 이상까지 감소시켜 50, 40, 30, 20㎍/ml 이하의 결합 화합물 혈청 농도를 제공할 수 있는 결합 화합물에 관한 것이다.
한 가지 양태에서, 결합 화합물은 사람 IL-17A에 대한 친화도보다 5, 10 또는 20배 이하로 더 낮은 친화도(Kd)로 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이 IL-17A에 결합한다. 또 다른 양태에서, 결합 화합물은 마우스 또는 랫트 IL-17A에 대한 친화도보다 100, 500, 1000 또는 2000배 더 높은 친화도(Kd)로 사람 IL-17A에 결합한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 사람 IL-17A-결합 화합물을 사용한 치료가 요구되는 사람 대상체를 포함한 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 대상체는 염증 질환 또는 자가면역 질환, 예를 들면, 류마티스 관절염, 염증성 장 질병, 건선, 다발 경화증, 만성 폐쇄성 폐질환, 낭성 섬유증, 전신 피부경화증, 동종이식 거부, 자가면역 심근염 또는 복막 유착을 가질 수 있다. 이러한 치료방법은 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 면역억제제 또는 소염제를 투여함을 추가로 포함할 수 있다. 한 가지 양태에서, 대상체는 IL-17A-매개된 질병을 갖는 것으로 진단된다. 또 다른 양태에서, 대상체는 류마티스 관절염을 갖는 것으로 진단된다. 또 다른 양태에서, 대상체는 다발 경화증을 갖는 것으로 진단된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 항-사람 IL-17A 항체 또는 결합 단편을 하나 이상의 다른 치료제와 조합하여 투여함을 포함하는 치료방법을 제공한다. 한 가지 양태에서, 다른 치료제는 항-사람 IL-23 항체 또는 이의 결합 단편이다. 다양한 양태에서, 항-사람 IL-23 항체 또는 단편은 항-사람 IL-17A 항체 또는 단편 이전에, 이와 동시에 또는 이후에 투여한다. 한 가지 양태에서, 항 IL-17A 및 항 IL-23 항체는 불리한 면역 반응의 급성기 동안 제한된 시간 동안 함께 투여하며, 그 후에 항-IL-17A 항체를 사용한 치료는 중단하고 항 IL-23 항체를 사용한 치료를 계속한다. 또 다른 양태에서, 하나 이상의 다른 제제는 IL-1β, IL-6 또는 TGF-β의 길항제, 예를 들면, 항-IL-6 또는 항-TGF-β 항체, 또는 이들 길항제의 배합물을 포함한다.
또한, 본 발명은 결합 화합물과 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 및 임의로 하나 이상의 면역억제제 또는 소염제를 포함하는, 본 발명의 결합 화합물의 조성물 및 제형에 관한 것이다.
도 1A는 본 발명에 따르는 몇가지 항-사람 IL-17A 항체의 경쇄 가변 도메인의 정렬을 나타낸다. 랫트 16C10 VL = 서열 7; hum 16C10 VL = 서열 5; 랫트 4C3 VL = 서열 21; hum 4C3 VL = 서열 5; 랫트 23E12 VL = 서열 45; 랫트 30C10 VL = 서열 24; hum 30C10 VL = 서열 22; 랫트 12E6 VL = 서열 32; 랫트 1D10 VL = 서열 54. CDR이 나타나 있다(표 3에 제공되어 있음). 번호매김은 문헌[참조; Kabat et al. (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U. S. Department of Health and Human Services, NIH Pub. 91-3242, 5th Ed., 본원에서 "Kabat et al. (1991)"로 언급]에 따른다.
도 1B는 본 발명에 따르는 몇가지 항-사람 IL-17A 항체의 중쇄 가변 도메인의 정렬을 나타낸다. 랫트 16C10 VH = 서열 8; hum 16C10 VH = 서열 6; 랫트 4C3 VH = 서열 8; hum 4C3 VH = 서열 6; 랫트 23E12 VH = 서열 47; 랫트 30C10 VH = 서열 25; hum 30C10 VH = 서열 23; 랫트 12E6 VH = 서열 33; 랫트 1D10 VH = 서열 55. CDR이 나타나 있다(표 4에 제공되어 있음). 번호매김은 문헌[참조; Kabat et al. (1991)]에 따른다.
도 2A는 본 발명에 따르는 사람화된 항-IL-17A 항체 16C1O의 경쇄의 아미노산 서열(서열 2의 성숙한 형태, 즉 잔기 1번 내지 220번)을 나타낸다. CDR이 나타나 있다.
도 2B는 본 발명에 따르는 사람화된 항-IL-17A 항체 16C1O의 중쇄의 아미노산 서열(서열 4의 성숙한 형태, 즉 잔기 1번 내지 454번)을 나타낸다. CDR이 나타나 있다.
도 3A 내지 3D는 류마티스 관절염의 CIA 마우스 모델에서 병리상태에 대한 항-IL-17A 항체 치료의 효과를 나타낸다. 치료는 항-IL-17A 항체 1D10의 투여(28, 7 및 2mg/kg) 및 동형 대조군의 투여(7mg/kg)를 포함한다.
도 3A는 항체 치료의 함수로서의, 발 종창(paw swelling) 및 발적(redness)의 척도인 육안의 질병 중증도 스코어(visual disease severity score; DSS)를 나타낸다. 스코어는 다음과 같다: 0 = 발이 대조군(치료되지 않은) 발과 동일하게 보임; 1 = 소정의 발에서 한 개의 발가락의 염증; 2 = 소정의 발의 두 개의 발가락 또는 발바닥의 염증; 3 = 소정의 발의 발바닥 및 발가락(들)의 염증.
도 3B는 항체 치료의 함수로서의 (조직병리학에 의한) 연골 손상을 나타낸다. 스코어는 다음과 같다: 0 = 정상; 1 = 최소, 2 = 약함; 3 = 중간; 4 = 심각.
도 3C는 항체 치료의 함수로서의 (조직병리학에 의한) 골 침식을 나타낸다. 스코어는 다음과 같다: 0 = 정상; 1 = 최소, 2 = 약함; 3 = 중간; 4 = 심각.
도 3D는 육안의 DSS에서 스코어가 2 또는 3인 CIA 마우스로부터의 발, 즉 매우 염증이 심한 발에 대한 (조직병리학에 의한) 골 침식을 나타낸다. rIgG1은 동 형 대조군 항체이다. 스코어는 다음과 같다: 0 = 정상; 1 = 최소, 2 = 약함; 3 = 중간; 4 = 심각.
도 4는 본 발명의 각종 항-사람 IL-17A 항체(1D1O, 16C10, 4C3) 및 동형 대조군의 혈청 농도의 함수로서, 사람 IL-17A로 비내 처리한 마우스에서의 %BAL 호중구(폐로의 호중구 보충의 척도)를 나타낸다. 입방 삼각형은 항-IL-17A 항체를 첨가하지 않은 대조군 실험을 나타내고, 맨왼쪽 데이타 포인트(열린 삼각형)는 자극시키지 않은 대조군이다.
도 5A는 사람화된 항-IL-17A 항체 16C10의 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(서열 62)을 나타낸다.
도 5B는 사람화된 항-IL-17A 항체 16C10의 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(서열 63)을 나타낸다.
I. 정의
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록, 특정 기술적 및 과학적 용어가 아래에 구체적으로 정의되어 있다. 달리 구체적으로 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 다른 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 숙련가들에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
첨부된 청구의 범위를 포함한, 본원에서 사용되는 것으로서, "a", "an" 및 "the"와 같은 단수형 단어는 문맥이 명백히 달리 나타내지 않는 한 이의 상응하는 복수형을 포함한다.
세포 또는 수용체에 적용되는 바와 같은 "활성화", "자극" 및 "처리"는 동일한 의미를 가질 수 있으며, 문맥에 의해 달리 또는 명백히 나타내어지지 않는 한, 예를 들면, 리간드를 사용한 세포 또는 수용체의 활성화, 자극 또는 처리를 나타낸다. "리간드"는 천연 및 합성 리간드, 예를 들면, 사이토킨, 사이토킨 변이체, 유사체, 뮤테인, 및 항체로부터 유도된 결합 화합물을 포함한다. 또한, "리간드"는 소분자, 예를 들면, 사이토킨의 펩타이드 모사체(mimetics) 및 항체의 펩타이드 모사체를 포함한다. "활성화"는 내부 메카니즘 뿐만 아니라 외부 또는 환경적 요인에 의해 조절될 수 있는 세포 활성화를 나타낼 수 있다. "반응", 예를 들면, 세포, 조직, 기관 또는 유기체의 반응은 생화학적 또는 생리학적 거동의 변화, 예를 들면, 생물학적 구획내에서의 농도, 밀도, 유착 또는 이주에 있어서의 변화, 유전자 발현률 또는 분화 상태의 변화를 포함하며, 여기서, 변화는 활성화, 자극 또는 처리와 상관성이 있거나 유전자 프로그래밍과 같은 내부 메카니즘과 상관성이 있다.
분자의 "활성"은 리간드 또는 수용체로의 분자의 결합, 촉매 활성; 유전자 발현 또는 세포 시그널링, 분화 또는 성숙을 자극할 수 있는 능력; 항원 활성, 다른 분자의 활성의 조정 등을 설명하거나 나타낼 수 있다. 분자의 "활성"은 또한 세포-대-세포 상호작용, 예를 들면, 유착, 또는 세포, 예를 들면, 세포 막 또는 세포골격의 구조를 유지하는 데 있어서의 활성을 조정하거나 유지시키는 데 있어서의 활성을 나타낼 수 있다. 또한, "활성"은 특이 활성, 예를 들면, [촉매 활성]/[mg 단백질] 또는 [면역학적 활성]/[mg 단백질], 생물학적 구획에서의 농도 등을 의미할 수 있다. "활성"은 선천 또는 적응 면역계의 성분의 조정을 나타낼 수 있다. "증식 활성"은, 예를 들면, 정상적인 세포 분열 뿐만 아니라 암, 종양, 형성이상, 세포 형질전환, 전이 및 혈관형성을 촉진시키거나, 이에 필요하거나, 또는 이와 특이적으로 관련되는 활성을 포함한다.
동물, 사람, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 적용되는 "투여" 및 "치료"는 동물, 사람, 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 대한 외인성 약제, 치료제, 진단제 또는 조성물의 접촉을 나타낸다. "투여" 및 "치료"는, 예를 들면, 치료학적, 약동학적, 진단학적, 연구 및 실험 방법을 나타낼 수 있다. 세포의 처리는 시약을 세포에 접촉시킴 뿐만 아니라 시약을 유체에 접촉시킴을 포함하며, 여기서, 유체는 세포와 접촉된다. 또한, "투여" 및 "처리"는, 예를 들면, 시약, 진단제, 결합 화합물 또는 기타의 세포에 의한 세포의 시험관내 및 생체외 처리를 의미한다. 사람, 가축(veterinary) 또는 연구 대상체에 적용되는 바와 같은 "처리"는 치료적 처리, 예방 또는 보호적 조치, 연구 및 진단 용도를 나타낸다. 사람, 가축 또는 연구 대상체, 또는 세포, 조직 또는 기관에 적용되는 바와 같은 "처리"는 사람 또는 동물 대상체, 세포, 조직, 생리학적 구획 또는 생리학적 유체로의 IL-17A 효능제 또는 IL-17A 길항제의 접촉을 포함한다. 또한, "세포의 처리"는, IL-17A 효능제 또는 IL-17A 길항제가, 예를 들면, 유체상 또는 콜로이드상으로 IL-17A 수용체와 접촉하는 상황 뿐만 아니라 효능제 또는 길항제가 세포 또는 수용체와 접촉하지 않는 상황을 포함한다.
"처리한다" 또는 "처리하는"은 치료제, 예를 들면, 본 발명의 결합 화합물을 함유하는 조성물을 내부적으로 또는 외부적으로, 상기 제제가 공지된 치료 활성을 갖는 하나 이상의 질병 증상을 갖는 환자에게 투여함을 의미한다. 전형적으로, 제제는 임상적으로 측정 가능한 정도로 상기 증상(들)의 퇴행을 유도하거나 진행을 억제함으로써 처리된 환자 또는 개체군에서 하나 이상의 질병 증상을 완화시키는 데 유효한 양으로 투여된다. 특정 질병 증상을 완화시키는 데 유효한 치료제의 양("치료학적 유효량"이라고도 함)은 질병 상태, 환자의 연령 및 체중, 환자에서 목적하는 반응을 이끌어내는 약물의 능력과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 질병 증상이 완화되었는지의 여부는 이러한 증상의 중증도 또는 진행 상태를 평가하기 위해 의사 또는 기타의 숙련된 건강관리사가 통상적으로 사용하는 임상 측정법으로 평가할 수 있다. 본 발명의 양태(예를 들면, 치료방법 또는 제품)가 모든 환자에서 표적 질병 증상(들)을 완화시키는 데에는 유효하지 않을 수 있지만, 이것은 Student's t-시험, chi2-시험, 만 및 휘트니(Mann and Whitney)에 따르는 U-시험, Kruskal-Wallis 시험(H-검증), Jonckheere-Terpstra-시험 및 Wilcoxon-시험과 같은 당업계에 공지된 통계학적 시험에 의해 측정되는 바와 같이 통계적학으로 유의적인 숫자의 환자에서 표적 질병 증상(들)을 완화시킬 것이다.
사람 IL-17A 단백질의 네가지 변이체가 본원에 나타나 있다. i) 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "사람 IL-17A" 및 "천연의(native) 사람 IL-17A"("huIL-17A" 및 "humIL-17A")는 사람 IL-17A 단백질 수탁 번호 NP_002181 및 AAT22064의 성숙 형태(즉, 잔기 24번 내지 155번), 및 이의 천연적으로 존재하는 변이체 및 다형체를 나타낸다. ii) 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "rhIL-17A"는 2개의 추가의 아미노산(LE)이 천연의 사람 IL-17A의 성숙 형태의 N-말단에 부가되어 있는 천연의 사람 IL-17A의 재조합 유도체를 나타낸다. 이러한 명칭은 IL-17A의 다양한 형태를 나타내는데 편리하게 채택되며, 문헌에서의 관용법과 일치하지 않을 수 있다. iii) 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "FLAG-huIL-17A"는 N-말단 FLAG® 펩타이드 태그가 부가되어 있는 천연의 사람 IL-17A의 변이체를 나타낸다. 일부 실험에서, FLAG-huIL-17A가 비오티닐화된다. iv) 본원에서 언급되는 R&D 시스템스 사람 IL-17A는 추가의 N-말단 메티오닌을 갖는 사람 IL-17A 단백질 수탁 번호 NP_002181 및 AAT22064의 잔기 20번 내지 155번이다. 표 1은 본원에 나타낸 IL-17A 분자의 변이체 N-말단을 요약한 것이다.
IL-17A의 변이체 형태
IL-17A 변이체 서열(N→C) 서열
huIL-17A(천연형) GITIPRN...VHHVA 40
rhIL-17A LEGITIPRN...VHHVA 41
FLAG-huIL-17A DYKDDDDKLGITIPRN...VHHVA 42
R&D IL-17A MIVKAGITIPRN...VHHVA 43
달리 언급하지 않는 한, 아데노바이러스 벡터를 사용하여 생산되는, 본원에 기술된 실험에서 사용되는 특정 IL-17A는 rhIL-17A이다. 용어 "IL-17A"는 일반적으로 천연형 또는 재조합 사람 IL-17A, 및 사람 IL-17A의 비-사람 동족체를 나타낸다. 달리 언급하지 않는 한, IL-17A의 몰 농도는 IL-17A의 동종이합체의 분자량(예를 들면, 사람 IL-17A의 경우 30kDa)을 사용하여 계산한다.
본원에서 사용되는 것으로서, 용어 "항체"는 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 어떠한 형태의 항체를 나타낸다. 따라서, 이것은 광범위한 의미로 사용되며, 구체적으로 모노클로날 항체(전장(full length) 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다특이적 항체(예를 들면, 이특이적 항체)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 것으로서, 용어 "IL-17A 결합 단편" 또는 항체("모 항체")의 "결합 단편"은 모 항체의 결합 특이성의 적어도 일부를 보유하는, 전형적으로 적어도 모 항체의 항원 결합의 일부 또는 가변 영역(예를 들면, 하나 이상의 CDR)를 포함하는 항체의 단편 또는 유도체를 포함한다. 항체 결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 일본쇄(single-chain) 항체 분자, 예를 들면, sc-Fv; 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이적 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 결합 단편 또는 유도체는 해당 활성이 몰 기준으로 표현되는 경우 이의 IL-17A 결합 활성의 10% 이상을 보유한다. 바람직하게는, 결합 단편 또는 유도체는 모 항체로서의 IL-17A 결합 친화도의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 또한, IL-17A 결합 단편은 이의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 보존적 아미노산 치환(항체의 "보존적 변이체"라고 함)을 포함할 수 있다. 용어 "결합 화합물"은 항체 및 이의 결합 단편 둘 다를 나타낸다.
"Fab 단편"은 하나의 경쇄, 및 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 이루어진다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 디설파이드 결합을 형성할 수 없다.
"Fc" 영역은 항체의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 두 개의 중쇄 단편을 함유한다. 두 개의 중쇄 단편은 두 개 이상의 디설파이드 결합에 의해 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다.
"Fab' 단편"은 하나의 경쇄, 및 VH 도메인과 CH1 도메인 및 또한 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역을 함유하여 쇄내 디설파이드 결합이 두 개의 Fab' 단편의 두 개의 중쇄 사이에 형성되어 F(ab')2 분자를 형성하도록 하는 하나의 중쇄의 일부를 함유한다.
"F(ab')2 단편"은 두 개의 경쇄, 및 쇄내 디설파이드 결합이 두 개의 중쇄 사이에 형성되도록 CH1 및 CH2 도메인 사이의 고정 영역의 일부를 함유하는 두 개의 중쇄를 함유한다. 따라서, F(ab')2 단편은 두 개의 중쇄 사이의 디설파이드 결합에 의해 함께 유지되는 두 개의 Fab' 단편으로 이루어진다.
"Fv 영역"는 중쇄와 경쇄 둘 다로부터의 가변 영역을 포함하지만, 고정 영역이 결여되어 있다.
용어 "일본쇄(single-chain) Fv" 또는 "scFv" 항체는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 나타내며, 여기서, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄내에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 scFv가 항원 결합을 위해 바람직한 구조를 형성하도록 하는, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 개요에 대해서는 문헌[참조: Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315]을 참조한다. 또한, 국제 특허공개공보 제WO 88/01649호 및 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,260,203호를 참조한다.
"도메인 항체"는 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 함유하는 면역 기능성 면역글로불린 단편이다. 몇몇 예에서, 두 개 이상의 VH 영역은 펩타이드 링커와 공유결합하여 2가 도메인 항체를 생성한다. 2가 도메인 항체의 두 개의 VH 영역은 동일하거나 상이한 항원을 표적화할 수 있다.
"2가 항체"는 두 개의 항원 결합 영역을 포함한다. 몇몇 예에서, 두 개의 결합 영역은 동일한 항원 특이성을 갖는다. 그러나, 2가 항체는 이특이적(아래 참조)일 수 있다.
본원에서 사용되는 것으로서, 달리 언급되지 않는 한, "항-IL-17A" 항체는 사람 IL-17A 및 이의 변이체, 예를 들면, huIL-17A, rhIL-17A, FLAG-huIL-17A 및 R&D IL-17A, 또는 이의 항원성 단편에 대해 야기되는 항체를 나타낸다.
본원에서 사용되는 것으로서, 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내며, 즉, 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연적으로 존재하는 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이고 단일 항원 에피토프에 대해 지시된다. 대조적으로, 통상의 (폴리클로날) 항체 제제는 전형적으로 상이한 에피토프에 대해 지시된(또는 특이적인) 다수의 항체를 포함한다. 수식어구 "모노클로날"은 항체의 실질적인 상동성 집단으로부터 수득된 바와 같은 항체의 특성을 나타내며, 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지는 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌[참조: Kohler et al. (1975) Nature 256: 495]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(참조: 미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들면, 문헌[참조: Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 및 Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597 및 Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731]에 기술된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리할 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 "키메라" 항체(면역글로불린)을 포함하며, 여기서, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 기원하거나 또는 특정 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체내 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면, 쇄(들)의 나머지는, 이들이 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한, 다른 종으로부터 기원하거나 또는 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 및 이러한 항체의 단편내 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다[참조: 미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855].
본원에서 사용되는 것으로서, "키메라 항체"는 제1 항체로부터의 가변 도메인 및 제2 항체로부터의 고정 도메인을 갖는 항체이며, 여기서, 제1 및 제2 항체는 상이한 종으로부터 기원한다. 전형적으로, 가변 도메인은 설치류와 같은 실험 동물로부터의 항체("모 항체")로부터 수득되고, 고정 도메인 서열은 사람 항체로부터 수득됨으로써, 생성된 키메라 항체는 설치류 모 항체보다는 사람 대상체에서 불리한 면역 반응을 덜 나타낼 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 또한 카멜화된 단일 도메인 항체(camelized single domain antibody)를 포함한다. 예를 들면, 본원에 참조로 인용되어 있는 문헌[참조; Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem. Sd. 26:230; Reichmann et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:25; WO 94/04678; WO 94/25591; 미국 특허 제6,005,079호]을 참조한다. 한 가지 양태에서, 본 발명은 단일 도메인 항체가 형성되도록 하는 변형을 갖는 두 개의 VH 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체를 제공한다.
본원에서 사용되는 것으로서, 용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 영역을 갖는 작은 항체 단편을 나타내며, 여기서, 단편은 동일한 폴리펩타이드 쇄(VH-VL 또는 VL-VH)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 쇄에서 두 개의 도메인 사이에 쌍을 이루는 것을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인들을 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루도록 하여 2개의 항원-결합 영역을 생성한다. 디아바디는 문헌[참조: 유럽 특허 제404,097호; 제WO93/11161호; 및 Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448]에 보다 상세하게 기재되어 있다. 가공된 항체 변이체에 대한 개요는 일반적으로 문헌[참조; Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136]에서 찾아볼 수 있다.
본원에서 사용되는 것으로서, 용어 "사람화된 항체"는 사람 및 비-사람(예: 쥐, 랫트) 항체 둘 다로부터의 서열을 함유하는 항체의 형태를 나타낸다. 일반적으로, 사람화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-사람 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 구조[FR(framework)] 영역은 사람 면역글로불린 서열의 것이다. 사람화된 항체는 임의로 사람 면역글로불린 고정 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 변형된(또는 차단된) Fc 영역을 갖는 항체를 포함하여 변경된 효과기 기능을 제공할 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,624,821호; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702 참조). 이러한 변형은 면역계의 다양한 반응을 증강 또는 억제시키는 데 사용될 수 있으며, 가능하게는 진단 및 치료에 이로운 효과를 가질 수 있다. Fc 영역의 변경은 아미노산 변화(치환, 결실 및 삽입), 글리코실화 또는 탈글리코실화 및 다중 Fc 부가를 포함한다. Fc의 변화는 또한 치료학적 항체에서 항체의 반감기를 변경시킬 수 있어 투여량 빈도를 적게 할 수 있게 하고 이에 따라 편의를 증진시키고 물질의 사용을 감소시킬 수 있다[문헌 참조; Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 at 734-35].
용어 "완전한 사람 항체"는 사람 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 나타낸다. 완전한 사람 항체는, 마우스, 마우스 세포, 또는 마우스 세포로부터 기원한 하이드리도마에서 생산되는 경우, 쥐 탄수화물 쇄를 함유할 수 있다. 유사하게, "마우스 항체"는 마우스 면역글로불린 서열만을 포함하는 항체를 나타낸다. 대안적으로, 완전한 사람 항체는, 랫트, 랫트 세포, 또는 랫트 세포로부터 기원한 하이드리도마에서 생산되는 경우, 랫트 탄수화물 쇄를 함유할 수 있다. 유사하게, "랫트 항체"는 랫트 면역글로불린 서열만을 포함하는 항체를 나타낸다.
본원에서 사용되는 것으로서, 용어 "초가변 영역"은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기[즉, 경쇄 가변 도메인내 잔기 24번 내지 34번(CDRL1), 50번 내지 56번(CDRL2) 및 89번 내지 97번(CDRL3) 및 중쇄 가변 도메인내 잔기 31번 내지 35번(CDRH1), 50번 내지 65번(CDRH2) 및 95번 내지 102번(CDRH3)[참조: Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.] 및/또는 "초가변성 루프"로부터의 잔기[즉, 경쇄 가변 영역내 잔기 26번 내지 32번(CDRL1) 50번 내지 52번(CDRL2) 및 91번 내지 96번(CDRL3) 및 중쇄 가변 도메인내 26번 내지 32번(CDRH1), 53번 내지 55번(CDRH2) 및 96번 내지 101번(CDRH3)[참조: Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917]을 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "골격" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 CDR 잔기로 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다.
"결합 물질(binding substance)"은 표적에 결합할 수 있는 분자, 소분자, 거대분자, 항체, 이의 단편 또는 유사체, 또는 수용성 수용체를 나타낸다. "결합 물질"은 또한 분자의 착물, 예를 들면, 비공유 착물, 이온화된 분자, 및 예를 들면, 표적에 결합할 수 있는 포스포릴화, 아실화, 가교결합, 폐환 또는 제한된 분해에 의해 변형된 공유적 또는 비공유적으로 변형된 분자를 나타낼 수 있다. "결합 물질"은 또한 안정화제, 부형제, 염, 완충제, 용매 또는 첨가제와 조합하여 표적에 결합할 수 있는 분자를 나타낼 수 있다. "결합"은 결합 물질과 표적과의 연합으로서 정의할 수 있으며, 여기서, 결합 물질이 용액에 용해되거나 현탁될 수 있는 경우에, 연합에 의해 결합 물질의 정상적인 브라운 운동이 감소된다.
"보전적으로 변형된 변이" 또는 "보존적 치환"은 단백질의 생물학적 활성을 변경시키지 않으면서 변화가 빈번하게 이루어질 수 있도록 단백질내 아미노산이 유사한 특징(예를 들면, 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 골격 형상 및 강성 등)을 갖는 다른 아미노산으로 치환됨을 나타낸다. 당해 분야의 숙련가들은 일반적으로 폴리펩타이드의 비-필수 영역내 단일 아미노산 치환이 실질적으로 생물학적 활성을 변경하지 않는다는 것을 인지하고 있다[참조: Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)]. 또한, 구조적 또는 기능적으로 유사한 아미노산의 치환은 생물학적 활성을 덜 혼란시킬 것이다. 본 발명의 결합 화합물의 다양한 양태는, 본원에 기재된 특이 아미노산 서열, 예를 들면, 서열 2, 4, 5 또는 6과 비교하는 경우, 0(변화없음), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20개 이하 또는 그 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열을 갖는 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 본원에서 사용되는 것으로서, 용어 "X개 이하"의 보존적 아미노산 치환은 0개 치환 및 X개 치환을 포함하는 그 이하 횟수의 치환을 포함한다. 이러한 예시적인 치환은 바람직하게는 다음과 같이 표 2에 제시된 바에 따라 이루어진다:
예시적인 보존적 아미노산 치환
원래의 잔기 보존적 치환
Ala (A) Arg (R) Asn (N) Asp (D) Cys (C) Gln (Q) Glu (E) Gly (G) His (H) Ile (I) Leu (L) Lys (K) Met (M) Phe (F) Pro (P) Ser (S) Thr (T) Trp (W) Tyr (Y) Val (V) Gly;Ser Lys;His Gln;His Glu;Asn Ser;Ala Asn Asp;Gln Ala Asn;Gln Leu;Val Ile;Val Arg;His Leu;Ile;Tyr Tyr;Met;Leu Ala Thr Ser Tyr;Phe Trp;Phe Ile;Leu
명세서 및 청구의 범위 전반에 걸쳐 사용되는 것으로서, 용어 "본질적으로 이루어진"은 열거된 요소 또는 요소들의 그룹의 포함, 및 명시된 용량 섭생, 방법 또는 조성물의 기본적인 또는 신규한 특성을 실질적으로 변화시키지 않는, 열거된 요소와 동일하거나 상이한 특성의 다른 요소의 임의 포함을 나타낸다. 비제한적인 예로서, 열거된 아미노산 서열로 본질적으로 이루어진 결합 화합물은 결합 화합물의 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 아미노산을 또한 포함할 수 있다.
"유효량"은 의학적 상태의 증상 또는 징후를 완화시키거나 예방하는 데 충분한 양을 포함한다. 또한, 유효량은 진단을 가능케하거나 촉진시키는 데 충분한 양을 의미한다. 특정 환자 또는 가축 대상체에 대한 유효량은 치료되는 상태, 환자의 전반적인 건강, 투여방법 경로, 투여량 및 부작용의 중증도와 같은 요인에 따라 다를 수 있다(참조; 네티(Netti) 등에 허여된 미국 특허 제5,888,530호). 유효량은 상당한 부작용 또는 독성 효과를 피하는 최대 용량 또는 투여 프로토콜일 수 있다. 효과는 진단학적 척도 또는 매개변수를 5% 이상, 통상적으로 10% 이상, 보다 통상적으로 20% 이상, 가장 통상적으로 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 60% 이상, 이상적으로는 70% 이상, 보다 이상적으로는 80% 이상, 및 가장 이상적으로는 90% 이상까지 개선시킬 것이며, 여기서, 100%는 정상 대상체에 의해 나타나는 진단 파라미터로서 정의된다[문헌 참조; Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK].
"외인성(exogenous)"은 문맥에 따라 유기체, 세포 또는 인체 밖에서 생산되는 물질을 나타낸다. "내인성(endogenous)"은 문맥에 따라 세포, 유기체 또는 인체내에서 생산되는 물질을 나타낸다.
"상동성(homology)"은 두 개의 폴리뉴클레오타이드 서열간 또는 두 개의 폴리펩타이드 서열간의 서열 유사성을 나타낸다. 두 개의 비교된 서열 둘 다에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브단위에 의해 점유되는 경우, 예를 들면, 두 개의 DNA 분자 각각에서의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 상동성이다. 두 개의 서열간의 상동율(%)은 두 개의 서열에 의해 공유된 상동성 위치 또는 매칭의 수를 비교된 위치의 수로 나누고 100을 곱한 함수이다. 예를 들면, 서열이 최적으로 정렬되어 있는 경우, 두 개의 서열 중의 위치의 10개 중 6개가 매칭되거나 상동성이면, 두 서열은 60% 상동성이다. 일반적으로, 비교는, 두 서열이 최대 상동율을 제공하도록 정렬되는 경우에 이루어진다.
"면역 상태" 또는 "면역 장애"는, 예를 들면, 병리학적 염증, 염증 질환, 자가면역 질환 또는 질병을 포함한다. "면역 상태"는 또한 감염, 지속 감염 및 증식 상태, 예를 들면, 면역계에 의한 박멸을 방해하는 감염, 종양 및 암을 포함한 암, 종양 및 혈관형성을 나타낸다. "암성 상태(cancerous condition)"는, 예를 들면, 암, 암 세포, 종양, 혈관형성 및 전암성 상태(precancerous condition), 예를 들면, 형성이상을 포함한다.
"염증 질환"은, 병인이, 예를 들면, 면역계의 세포의 수의 변화, 이주 속도의 변화 또는 활성화의 변화로부터 전적으로 또는 부분적으로 야기되는 장애 또는 병리학적 상태를 의미한다. 면역계의 세포는, 예를 들면, T 세포, B 세포, 단핵구 또는 대식세포, 항원 제시 세포(APC), 수지상 세포, 미세아교세포, NK 세포, NKT 세포, 호중구, 호산구, 비만 세포, 또는 면역학과 특이적으로 관련된 기타의 세포, 예를 들면, 사이토킨-생산 내피 또는 내피 세포를 포함한다.
"분리된 결합 화합물"은 결합 화합물의 정제 상태를 나타내며, 이러한 문맥에서, 분자가 기타의 생물학적 분자, 예를 들면, 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물 또는 세포 조직파편 및 성장 매질과 같은 기타의 물질을 실질적으로 함유하지 않음을 의미한다. 일반적으로, 용어 "분리된"은, 본원에 기재된 바와 같은 결합 화합물의 실험적 또는 치료적 사용을 실질적으로 방해하는 양으로 존재하지 않는 한, 이러한 물질의 완전 부재 또는 물, 완충제 또는 염의 부재를 나타내고자 하는 것은 아니다.
"분리된 핵산 분자"는 분리된 폴리뉴클레오타이드가 천연에서 발견되는 뉴클레오타이드의 전부 또는 일부와 관련이 없거나, 천연에서는 결합되지 않는 폴리뉴클레오타이드에 결합되는 게놈의 DNA 또는 RNA, mRNA, cDNA, 합성 기원 또는 이의 몇 가지 조합을 의미한다. 본원의 기재를 목적으로 하여, 특정 뉴클레타이드 서열을 "포함하는 핵산 분자"는 완전한 염색체를 포함하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 특정 핵산 서열을 "포함하는" 분리된 핵산 분자는, 특정 서열 이외에, 10개 이하 또는 심지어 20개 이하 또는 그 이상의 다른 단백질 또는 이의 일부에 대한 암호화 서열을 포함할 수 있거나, 열거된 핵산 서열의 암호화 영역의 발현을 조절하는 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있고/있거나 벡터 서열을 포함할 수 있다.
표현 "조절 서열"은 특정 숙주 유기체내 작동가능하게 연결된 암호화 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 나타낸다. 원핵세포에 적합한 조절 서열은, 예를 들면, 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 영역을 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(enhancer)를 사용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 위치하는 경우에 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더용 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩타이드용 DNA에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 암호화 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 영역은 해독을 용이하게 하도록 위치하는 경우 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은, 연결되는 DNA 서열이 연속적이고, 분비 리더의 경우 연속적이며 리딩 상 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적이어서는 안된다. 연결은 편리한 제한 영역에서 연결(ligation)로 달성된다. 이러한 영역이 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(adaptor) 또는 링커를 통상의 실시에 따라 사용한다.
본원에서 사용되는 것으로서, "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며 모든 이러한 정의는 자손(progeny)을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 1차 대상체 세포 및 전이 횟수와는 상관없이 이로부터 기원한 배양물을 포함한다. 또한, 모든 자손이 계획적인 또는 우연한 돌연변이로 인해 DNA 함량이 정확하게 동일하지는 않을 수 있는 것으로 이해된다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가진 돌연변이체 자손도 포함된다. 명백한 명칭이 의도되는 경우, 문맥으로부터 자명할 것이다.
본원에 사용된 것으로서, "폴리머라제 (연)쇄 반응(polymerase chain reaction)" 또는 "PCR"은, 소량의 핵산, RNA 및/또는 DNA의 특정 조각이, 예를 들면, 미국 특허 제4,683,195호에 기술된 바와 같이 증폭되는 과정 또는 기술을 나타낸다. 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 설계될 수 있도록, 해당 영역의 말단 또는 이를 초과하는 영역으로부터의 서열 정보가 이용될 필요가 있으며; 이들 프라이머는 증폭될 주형의 반대쪽 쇄에 대해 서열에 있어 동일하거나 유사할 것이다. 2개의 프라이머의 5' 말단 뉴클레오타이드는 증폭된 물질의 말단과 일치할 수 있다. PCR을 사용하여 총 게놈 DNA로부터의 특정 RNA 서열, 특정 DNA 서열, 및 총 세포 RNA, 박테리오파아지 또는 플라스미드 서열로부터 전사된 cDNA를 증폭시킬 수 있다[참조: Mullis et al., (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N. Y.)]. 본원에 사용된 것으로서, PCR은 프라이머 및 핵산 폴리머라제로서 공지된 핵산을 사용하여 핵산의 특정 조각을 증폭시키거나 생성시키는 것을 포함하는 핵산 시험 샘플을 증폭시키기 위한 핵산 폴리머라제 반응 방법의 예중 하나로 간주되지만, 유일한 것은 아니다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "배선 서열(germline sequence)"은 재배열되지 않은 면역글로불린 DNA 서열의 서열을 나타낸다. 재배열되지 않은 면역글로불린의 적합한 공급원이 사용될 수 있다.
"억제제" 및 "길항제", 또는 "활성화제" 및 "효능제"는 각각, 예를 들면, 리간드, 수용체, 보조인자, 유전자, 세포, 조직 또는 기관의 활성화를 위한 억제 또는 활성 분자를 나타낸다. 예를 들면, 유전자, 수용체, 리간드 또는 세포의 조정인자(modulator)는 유전자, 수용체, 리간드 또는 세포의 활성을 변경하는 분자이며, 여기서, 활성은 활성화되거나 억제되거나 이의 조절 특성이 변경될 수 있다. 조정인자는 단독으로 작용할 수 있거나, 또는 보조인자, 예를 들면, 단백질, 금속 이온 또는 소분자를 사용할 수 있다. 억제제는, 예를 들면, 유전자, 단백질, 리간드, 수용체 또는 세포를 감소, 차단, 방지, 활성화 지연, 불활성화, 탈감작화 또는 하향조절하는 화합물이다. 활성화제는, 예를 들면, 유전자, 단백질, 리간드, 수용체 또는 세포를 증가, 활성화, 촉진, 활성화 증진, 감작화 또는 상향조절하는 화합물이다. 억제제는 또한 구조적 활성을 감소, 차단 또는 불활성화시키는 화합물로서 정의될 수 있다. "효능제"는 표적과 상호작용하여 표적의 활성화 증가를 야기하거나 촉진시키는 화합물이다. "길항제"는 효능제의 작용에 반대하는 화합물이다. 길항제는 효능제의 활성을 방지, 감소, 억제 또는 중화시킨다. 길항제는 또한, 확인된 효능제가 없는 경우에라도, 표적, 예를 들면, 표적 수용체의 구조적 활성을 방지, 억제 또는 감소시킬 수 있다.
억제도를 실험하기 위해, 소정의, 예를 들면, 단백질, 유전자, 세포 또는 유기체를 포함하는 샘플 또는 검정물을 가능한 활성화제 또는 억제제로 처리하고, 억제제를 함유하지 않는 대조군 샘플과 비교한다. 대조군 샘플, 즉 길항제로 처리하지 않은 샘플에 대해 100%의 상대 활성값을 할당한다. 억제는 대조군을 기준으로 한 활성값이 약 90% 이하, 전형적으로 85% 이하, 보다 전형적으로 80% 이하, 가장 전형적으로 75% 이하, 일반적으로 70% 이하, 보다 일반적으로 65% 이하, 가장 일반적으로 60% 이하, 전형적으로 55% 이하, 통상적으로 50% 이하, 보다 통상적으로 45% 이하, 가장 통상적으로 40% 이하, 바람직하게는 35% 이하, 보다 바람직하게는 30% 이하, 여전히 보다 바람직하게는 25% 이하, 가장 바람직하게는 25% 미만인 경우에 달성된다. 활성화는 대조군을 기준으로 한 활성값이 약 110%, 일반적으로 120% 이상, 보다 일반적으로 140% 이상, 보다 일반적으로 160% 이상, 빈번하게 180% 이상, 보다 빈번하게 2배 이상, 가장 빈번하게 2.5배 이상, 통상적으로 5배 이상, 보다 통상적으로 10배 이상, 바람직하게는 20배 이상, 보다 바람직하게는 40배 이상, 가장 바람직하게는 40배 초과인 경우에 달성된다.
활성화 및 억제에 있어서의 종말점(endpoint)은 다음과 같이 모니터링할 수 있다. 예를 들면, 세포, 생리학적 유체, 조직, 기관 및 동물 또는 사람 대상체의 처리에 대한 활성화, 억제 및 반응은 종말점에 의해 모니터링할 수 있다. 종말점은, 예를 들면, 염증, 발암성 또는 세포 탈과립 또는 분비, 예를 들면, 사이토킨, 독성 산소 또는 프로테아제의 방출의 지표의 소정의 양 또는 비율(%)을 포함할 수 있다. 종말점은, 예를 들면, 이온 유동 또는 전달의 소정의 양; 세포 이주; 세포 유착; 세포 증식; 전이에 대한 가능성; 세포 분화; 및 표현형의 변화, 예를 들면, 염증, 세포자멸사, 형질전환, 세포 주기 또는 전이에 대한 유전자의 발현 변화를 포함할 수 있다[참조; Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sd. 30:145-158; Hood and Cheresh (2002) Nature Rev. Cancer 2:91-100; Timme, et al. (2003) Curr. Drug Targets 4:251-261; Robbins and Itzkowitz (2002) Med. Clin. North Am. 86:1467-1495; Grady and Markowitz (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:101-128; Bauer, et al. (2001) Glia 36:235-243; Stanimirovic and Satoh (2000) Brain Pathol. 10:113-126].
억제의 종말점은 일반적으로 대조군의 75% 이하, 바람직하게는 대조군의 50% 이하, 보다 바람직하게는 대조군의 25% 이하, 및 가장 바람직하게는 대조군의 10% 이하이다. 일반적으로, 활성화의 종말점은 대조군의 150% 이상, 바람직하게는 대조군의 2배 이상, 보다 바람직하게는 대조군의 4배 이상, 및 가장 바람직하게는 대조군의 10배 이상이다.
"리간드"는, 예를 들면, 수용체의 효능제 또는 길항제로서 작용할 수 있는, 소분자, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 막-연합되거나 막-결합된 분자 또는 이의 복합체를 나타낸다. 또한, "리간드"는 효능제 또는 길항제는 아니지만 수용체에 결합할 수 있는 제제를 포함한다. 더욱이, "리간드"는, 예를 들면, 화학적 방법 또는 재조합 방법에 의해 막-결합된 리간드의 수용성 버젼으로 변화된 막-결합된 리간드를 포함한다. 편의상, 리간드가 제1 세포 위에 막-결합되는 경우, 수용체는 통상적으로 제2 세포에서 발생한다. 제2 세포는 제1 세포와 동일하거나 상이한 일치(identity)를 가질 수 있다. 리간드 또는 수용체는 전적으로 세포내에 있을 수 있으며, 즉 세포질, 핵 또는 몇몇 다른 세포내 구획에 존재할 수 있다. 리간드 또는 수용체는, 예를 들면, 세포내 구획에서 혈장 막의 외면으로 이의 위치를 변화시킬 수 있다. 리간드와 수용체의 복합체를 "리간드 수용체 복합체"라고 한다. 리간드와 수용체가 시그널링 경로에 관여하는 경우, 리간드는 시그널링 경로의 상부 위치에서 발생하고 수용체는 시그널링 경로의 하부 위치에서 발생한다.
"소분자(small molecule)"는, 분자량이 10kDa 미만, 전형적으로 2kDa 미만, 바람직하게는 1kDa 미만, 및 가장 바람직하게는 약 500Da 미만인 분자로서 정의된다. 소분자는 무기 분자, 유기 분자, 무기 성분을 함유하는 유기 분자, 방사성 원자를 포함하는 분자, 합성 분자, 펩타이드 모사체 및 항체 모사체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 치료제로서, 소분자는 거대분자보다 세포에 더 투과성이고 분해에 대해 덜 감수성이며 면역 반응을 덜 일으킬 수 있다. 소분자, 예를 들면, 항체 및 사이토킨의 펩타이드 모사체 및 소분자 독소가 문헌[참조; Casset, et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 307:198-205; Muyldermans (2001) J. Biotechnol. 74:277-302; Li (2000) Nat. Biotechnol 18:1251-1256; Apostolopoulos, et al. (2002) Curr. Med. Chem. 9:411-420; Monfardini, et al. (2002) Curr. Pharm. Des. 8:2185-2199; Domingues, et al. (1999) Nat. Struct. Biol. 6:652-656; Sato and Sone (2003) Biochem. J. 371:603-608; 스튜어트(Stewart) 등에 허여된 미국 특허 제6,326,482호]에 기재되어 있다.
리간드/수용체, 항체/항원 또는 다른 결합 쌍을 언급할 때, "특이적으로" 또는 "선택적으로" 결합한다란, 단백질 및 다른 생물제제의 불균질 집단에서의 단백질의 존재를 결정하는 결합 반응을 나타낸다. 따라서, 지정된 조건하에서, 특정 리간드는 특정 수용체에 결합되며 샘플에 존재하는 다른 단백질에 상당량으로 결합하지 않는다. 고려되는 방법의 항체, 또는 항체의 항원-결합 영역로부터 기원한 결합 화합물은, 다른 항원과의 친화도보다 2배 이상, 바람직하게는 10배 이상, 보다 바람직하게는 20배 이상, 가장 바람직하게는 100배 이상 더 큰 친화도로 이의 항원 또는 이의 변이체 또는 뮤테인에 결합한다. 바람직한 양태에서, 항체는, 예를 들면, 스캐차드 검정(Scatchard analysis)에 의해 측정시 약 109 M-1보다 큰 친화도를 가질 것이다[참조: Munsen et al. (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239].
본원에서 사용되는 것으로서, 용어 "면역조정제"는 면역 반응을 억제 또는 조정하는 천연 또는 합성 제제를 나타낸다. 면역 반응은 체액성 또는 세포성 반응일 수 있다. 면역조정제는 면역억제제 또는 소염제를 포함한다.
본원에서 사용되는 것으로서 "면역억제성 제제", "면역억제 약물" 또는 "면역억제제"는 면역계의 활성을 억제하거나 예방하기 위해 면역억제 치료에 사용되는 치료제이다. 임상적으로, 이들은 이식된 기관 및 조직(예를 들면, 골수, 심장, 신장, 간)의 거부 예방 및/또는 자가면역 기원일 가능성이 높은 자가면역병(들)(예를 들면, 류마티스 관절염, 중증 근육무력증, 전신 홍반 루푸스, 궤양성 대장염, 다발 경화증)의 치료에 사용된다. 면역억제 약물은 다음과 같이 분류할 수 있다: 글루코코르티코이드; 세포증식억제제(cytostatics); 항체(생물학적 반응 개질제); 이뮤노필린(immunophilin)에 작용하는 약물; 증식성 질환의 치료에 사용되는 공지된 화학요법제를 포함한 기타의 약물. 다발 경화증의 경우, 특히 본 발명의 항체를 코팍손(copaxone)으로 공지된 새로운 종류의 마이엘린 결합 단백질형 치료제와 함께 투여할 수 있다.
"소염제" 또는 "소염 약물"은 스테로이드 및 비스테로이드 치료제 둘 다를 나타낸다. 코르티코스테로이드로서도 공지된 스테로이드는 부신에 의해 천연적으로 생산되는 호르몬인 코르티솔과 매우 닮은 약물이다. 스테로이드는 특정 염증 상태, 예를 들면, 전신성 맥관염(혈관의 염증); 및 근육염(근육의 염증)의 주요 치료제로서 사용된다. 또한, 스테로이드는 염증 상태, 예를 들면, 류마티스 관절염(몸체의 양쪽에서 관절에 발생하는 만성 염증성 관절염); 전신 홍반 루푸스(비정상적인 면역계 기능에 의해 야기되는 전신병); 쇼그렌 증후군(눈마름증 및 구내건조증을 야기하는 만성 질환)을 치료하는 데 선택적으로 사용될 수 있다.
통상적으로 NSAID로 약칭되는 비스테로이드성 소염 약물은 진통, 해열 및 소염 효과를 갖는 약물이다 - 이들은 통증, 열 및 염증을 감소시킨다. 용어 "비스테로이드성"은 이들 약물을 스테로이드로부터 구분하기 위해 사용되며, 이는 (광범위한 다른 효과들 중에서도) 유사한 에이코사노이드-억제(eicosanoid-depressing), 소염 작용을 갖는다. NSAID는 일반적으로 다음의 상태의 증후성 완화를 위해 지시된다: 류마티스 관절염; 골관절염; 염증성 관절병증(예를 들면, 강직성 척추염, 건선 관절염, 라이터 증후군(Reiter's syndrome)); 급성 통풍; 월경통; 전이성 골 통증; 두통 및 편두통; 수술후 통증; 염증 및 조직 손상으로 인한 경증 내지 중증 통증; 발열; 및 신상통(renal colic). NSAID는 살리실레이트, 아릴알카노산, 2-아릴프로피온산(프로펜), N-아릴안트라닐산(페남산), 옥시캄, 콕시브 및 설폰아닐리드를 포함한다.
질병-변경 항-류마티스 약물(DMARD)은 종종 NSAID와 조합하여 투여할 수 있다. 통상적으로 처방되는 DMARD는 하이드록시클로로퀸/클로로퀸, 메토트렉세이트, 금 치료(gold therapy), 설파살라진 및 아자티오프린을 포함한다.
II. 사람 IL-17A에 특이적인 항체
본 발명은 류마티스 관절염(RA), 골관절염, 류마티스 관절염 골다공증, 염증성 섬유증(예를 들면, 공피증, 폐 섬유증 및 경화증), 염증성 장 장애(예를 들면, 크론병, 궤양성 대장염 및 염증성 장 질병), 천신(알레르기성 천식 포함), 알레르기, COPD, 다발 경화증, 건선 및 암을 포함한 다양한 염증, 면역 및 증식 질환을 치료하기 위한 가공된 항-IL-17A 항체 및 이의 용도를 제공한다.
모노클로날 항체를 생성하는 데 적합한 방법을 사용하여 본 발명의 항-IL-17A 항체를 생성할 수 있다. 예를 들면, 수용체 동물을 결합되거나 결합되지 않은(예를 들면, 천연) 형태의 IL-17A 동종이합체 또는 이의 단편으로 면역화할 수 있다. 적합한 어떠한 면역화 방법이라도 사용 가능하다. 이러한 방법은 보조제(adjuvant), 기타의 면역자극제, 반복된 부스터 면역화(booster immunization) 및 하나 이상의 면역화 경로의 사용을 포함할 수 있다.
모든 적합한 형태의 IL-17A를 IL-17A에 특이적인 비-사람 항체의 생산을 위한 면역원(항원)으로서 사용할 수 있으며, 여기서, 항체는 생물학적 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 나타나는 면역원은 단일 에피토프 또는 다중 에피토프를 포함한, 결합된 및 천연적으로 존재하는 동종이합체를 포함하는 전장의 성숙한 사람 IL-17A 또는 이의 펩타이드일 수 있다. 면역원은 단독으로 사용되거나 당업계에 공지된 하나 이상의 면역원성 증진제와 조합하여 사용될 수 있다. 면역원은 천연 공급원으로부터 정제되거나, 유전적으로 변형된 세포에서 생산될 수 있다. 면역원을 암호화하는 DNA는 게놈 또는 비-게놈(예를 들면, cDNA) 기원일 수 있다. 면역원-암호화 DNA는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 바쿨로바이러스 벡터, 플라스미드 및 비-바이러스 벡터, 예를 들면, 양이온성 지질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 적합한 유전 벡터를 사용하여 발현될 수 있다.
목적하는 생물학적 특성을 갖는 항체 반응을 이끌어내기 위해, 예를 들면, 수용체에 대한 IL-17A 결합을 억제하기 위해 모든 적합한 방법을 사용할 수 있다. 몇몇 양태에서, 항체는 마우스, 설치류, 영장류, 사람 등과 같은 포유류 숙주에서 야기된다. 모노클로날 항체를 제조하기 위한 기술은, 예를 들면, 문헌[참조; Stites et al. (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 및 여기에 인용된 문헌; Harlow and Lane (1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL CSH Press; Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed.) Academic Press, New York, NY]에서 찾아볼 수 있다. 따라서, 모노클로날 항체는 당업계의 숙련가들에게 친숙한 각종 기술에 의해 수득할 수 있다. 전형적으로, 목적하는 항원으로 면역화된 동물로부터의 비장 세포를 일반적으로 골수종 세포와의 융합에 의해 무한증식시킨다[문헌 참조; Kohler and Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519]. 또 다른 무한증식(immortalization) 방법은 엡스타인 바르 바이러스(Epstein Barr Virus), 종양유전자 또는 레트로바이러스를 사용한 형질전환 또는 당업계에 공지된 기타의 방법을 포함한다[문헌 참조; Doyle et al. (eds.) (1994 and periodic supplements) CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley and Sons, New York, NY]. 단일의 무한증식된 세포로부터 야기된 콜로니를 항원에 대한 목적하는 특이성과 친화성의 항체를 생산하기 위해 스크리닝한다. 이러한 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 수율은 척추동물 숙주의 복막안으로의 주사를 포함한 다양한 기술에 의해 증진될 수 있다.
다른 적합한 기술은 파아지 또는 유사한 벡터에서의 항체의 라이브러리의 선택을 포함한다[문헌 참조; Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); 및 Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)]. 본 발명의 항체는 변형없이, 예를 들면, 모 설치류 항체로서 사용되거나, 또는 키메라 항체 또는 사람화된 항체와 같이 사람 대상체에서 치료제로서의 이의 사용을 촉진시키기 위해 변형하여 사용될 수 있다. 몇몇 양태에서, 항체는 검출 가능한 시그널을 제공하는 물질로 공유 또는 비-공유적으로 표지될 것이다. 광범위한 표지 및 접합 기술이 공지되어 있으며, 과학지 및 특허 문헌 둘 다에 널리 보고되어 있다. 적합한 표지는 방사선핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광 잔기, 화학발광 잔기, 자기 입자(magnetic particle) 등을 포함한다. 이러한 표지의 사용을 교시하는 특허들은 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호를 포함한다. 또한, 재조합 면역글로불린이 제조되거나[문헌 참조; Cabilly 미국 특허 제4,816,567호; 및 Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033]; 또는 유전자삽입 마우스(transgenic mice)에서 제조될 수 있다[문헌 참조; Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Abgenix and Medarex technologies].
IL-17A의 소정의 단편에 대한 항체는 IL-17A의 소정의 단편과 담체 단백질과의 접합물로 동물을 면역화시킴으로써 야기될 수 있다. 모노클로날 항체는 목적하는 항체를 분비하는 세포로부터 생산된다. 이들 항체는 정상 또는 결함 IL-17A로의 결합에 대해 스크리닝할 수 있다. 이러한 모노클로날 항체는 통상적으로 약 1μM 이상, 보다 통상적으로 약 300, 30, 10 또는 3nM 이상, 바람직하게는 약 300, 100, 30, 10, 3 또는 1pM 이상의 Kd로 결합될 것이다. Kd 값과 친화도와의 역관련성으로 인해, 주어진 Kd 또는 "그 미만"의 결합에 대한 참고는 적어도 언급된 수치만큼 높은 친화도로, 즉 적어도 언급된 값만큼 낮은 Kd로 결합됨을 나타낸다. 결합 친화도는 ELISA(특히 실시예 5-6 참조) 또는 Biacore® 표면 플라스몬 공명 분광검정법(plasmon resonance spectroscopy), KinExA 또는 ECL 방법(특히 실시예 7 참조)에 의해 측정할 수 있다. 적합한 비-사람 항체는 또한 실시예 8-11 및 16-17에 기재된 생물학적 검정을 사용하여 동정할 수 있다.
본 발명의 항-사람 IL-17A 항체를 생산하는 예시적인 방법이 실시예 2에 기재되어 있다.
III. IL-17A 특이 항체의 사람화
모든 적합한 비-사람 항체를 본 발명의 항-IL-17A 항체의 초가변 영역을 위한 공급원으로서 사용할 수 있다. 비-사람 항체에 대한 공급원은 설치류(예를 들면, 마우스, 랫트), 토끼류(래빗 포함), 암소 및 비사람 영장류를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 대개의 경우, 사람화된 항체는 수용체의 초가변 영역 잔기가 목적하는 특이성과 친화도를 갖는 마우스, 랫트, 래빗 또는 비사람 영장류와 같은 비-사람 종(공여자 항체)으로부터의 초가변 영역에 의해 대체되어 있는 사람 면역글로불린(수용체 항체)이다. 추가로, 사람화된 항체는 목적하는 생물학적 활성의 항체 성능을 더욱 정련하기 위해 이루어진 변형과 같이 수용체 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 보다 상세한 설명을 위해 문헌[참조; Jones et al. (1986) Nature 321 : 522-525; Reichmann et al. (1988) Nature 332: 323-329; 및 Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596]을 참조한다.
항체를 재조합에 의해 가공하거나 생산하기 위한 방법이, 예를 들면, 문헌[참조; Boss et al.(미국 특허 제4,816,397호), Cabilly et al.(미국 특허 제4,816,567호), Law et al.(유럽 공개특허공보 제438 310호) 및 Winter(유럽 공개특허공보 제239 400호)]에 기재되어 있다.
본 발명의 사람화된 항-IL-17A 항체의 아미노산 서열 변이체는 적당한 뉴클레오타이드 변화를 사람화된 항-IL-17A 항체 DNA에 도입하여 제조하거나 또는 펩타이드 합성에 의해 제조할 수 있다. 결실, 삽입 및 치환을 조합하여 최종 작제물에 도달할 수 있으며, 단 최종 작제물은 목적하는 특징을 가져야 한다. 아미노산 변화는 또한 글리코실화 영역의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같은 사람화된 항-IL-17A 항체의 해독후 프로세싱을 변화시킬 수 있다.
돌연변이유발(mutagenesis)을 위한 바람직한 위치인 사람화된 항-IL-17A 항체의 잔기 또는 영역을 확인하기 위한 한 가지 유용한 방법을 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발(alanine scanning mutagenesis)"라고 한다[문헌 참조; Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085]. 표적 잔기의 그룹이 동정되며(예를 들면, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu와 같은 하전된 잔기) 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 아미노산과 IL-17A와의 상호작용을 변화시킨다. 이후, 알라닌 치환에 대해 작용성 민감도를 나타내는 잔기를 추가의 아미노산 치환을 도입하여 정련시킨다. 한 가지 양태에서, 소정의 표적 코돈에서의 돌연변이의 효과는 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발에 이어 생성된 사람화된 항-IL-17A 항체 변이체의 활성 및 결합 검정에 의해 측정된다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기에서 수백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드에 이르는 길이의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합 및 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 사람화된 항-IL-17A 항체 또는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다. 다른 변이체는 N- 또는 C-말단에 대한 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩타이드의 융합을 포함한다. 또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이러한 변이체는 사람화된 항-IL-17A 항체 분자 중의 하나 이상의 아미노산 잔기를 제거시키고 그 자리에 다른 잔기를 삽입시킨다. 치환된 돌연변이유발에 가장 중요한 영역은 초가변 루프를 포함하지만, FR 변형도 고려된다. 항원 결합에 관여하는 초가변 영역 잔기 또는 FR 잔기는 일반적으로 상대적으로 보존적인 방식으로 치환된다.
항체의 다른 아미노산 변이체는, 예를 들면, 하나 이상의 탄수화물 잔기를 제거하고/하거나 하나 이상의 글리코실화 영역을 가함으로써 항체의 원래의 글리코실화 패턴을 변경시킨다. 항체의 글리코실화는 전형적으로 N-결합되거나 O-결합된다. N-결합된이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착됨을 나타낸다. 트리펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 잔기의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 폴리펩타이드에서의 이러한 트리펩타이드 서열의 존재는 가능한 글리코실화 영역을 생성한다. O-결합된 글리코실화는 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 대한 N-아세틸갈락토사민, 갈락토즈 또는 크실로즈의 부착을 포함하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신이 사용될 수도 있다.
글리코실화 영역은 하나 이상의 상기한 트리펩타이드 서열의 삽입(N-결합된 글리코실화 영역의 경우) 또는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가(O-결합된 글리코실화 영역의 경우)에 의해 본 발명의 항체에 부가할 수 있다. 사람화 IL-17A-특이 항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법은 천연 공급원으로부터의 분리(천연 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오타이드-매개된(또는 부위-지시된) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 또는 카세트 돌연변이유발(cassette mutagenesis)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
대개, 사람화된 항-IL-17A 항체의 아미노산 서열 변이체는 중쇄 또는 경쇄의 원래의 사람화된 항체 아미노산 서열과 50% 이상의 아미노산 서열 일치, 바람직하게는 70%, 80%, 85%, 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 일치를 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 이러한 서열에 대한 일치 또는 상동성은, 서열 일치의 일부로서 보존적 치환을 고려하지 않고서, 서열이 최적으로 정렬되는 경우(즉, 서열을 정렬하고, 필요에 따라, 갭을 도입하여 최대 서열 일치도(%)를 달성한 후) 사람화 항-IL-17A 잔기와 일치하는 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 비율(%)로서 본원에서 정의된다. 항체 서열로의 N-말단, C-말단 또는 내부 연장, 결실 또는 삽입 중의 어떠한 것도 서열 일치 또는 상동성에 영향을 미치지 않은 것으로 간주된다.
사람화된 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함한 부류의 면역글로불린으로부터 선택될 수 있다. 한 가지 양태에서, 항체는 IgG 항체이다. IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한 IgG의 동형이 사용될 수 있다. IgG 동형의 변이체가 또한 고려된다. 사람화된 항체는 하나 이상의 부류 또는 동형으로부터의 서열을 포함할 수 있다. 목적하는 생물학적 활성을 생성시키기 위한 필요한 고정 도메인 서열의 최적화는 아래 실시예에 기재된 생물학적 검정에서 항체를 스크리닝함으로써 용이하게 달성된다.
마찬가지로, 경쇄의 부류를 본원의 화합물 및 방법에서 사용할 수 있다. 구체적으로는, 카파, 람다 또는 이의 변이체가 본 발명의 화합물 및 방법에서 유용하다.
비-사람 항체로부터의 CDR 서열의 어떠한 적합한 부위라도 본 발명의 사람화된 항체를 생성하는 데 사용할 수 있다. CDR 서열은 치환, 삽입 또는 결실에 의해 돌연변이를 일으킬 수 있지만, IL-17A 결합 친화도 및 특이성을 유지하기 위한 필요성 때문에 이러한 돌연변이는 최소일 것이다. 전형적으로, 사람화된 항체 CDR 잔기의 75% 이상, 보다 빈번하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상, 종종 100%가 비-사람 CDR 잔기에 상응할 것이다. 사람 항체로부터의 FR 서열의 어떠한 적합한 부분이라도 사용할 수 있다. FR 서열은, FR 서열이 사용되는 사람 및 비-사람 항체 서열로부터 구분되도록, 하나 이상의 잔기의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 돌연변이를 일으킬 수 있다. 이러한 돌연변이는 최소일 것으로 고려된다. 전형적으로, 사람화된 항체 잔기의 75% 이상, 보다 빈번하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상이 사람 FR 잔기에 상응할 것이다.
또한, 키메라 항체 또는 이의 단편이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 키메라 항체 또는 이의 단편이 고려된다[문헌 참조; 미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 6851-6855]. 앞서 주지한 바와 같이, 전형적인 키메라 항체는 상이한 종으로부터 수득된 항원-특이 항체의 가변 도메인에 결합된 하나의 종으로부터의 항체로부터의 고정 도메인 서열을 포함한다.
본 발명의 결합 화합물은 이특이적 항체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 것으로서, 용어 "이특이적 항체"는 적어도 두 개의 상이한 항원성 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체, 전형적으로 모노클로날 항체를 나타낸다. 한 가지 양태에서, 에피토프는 동일한 항원으로부터 기원한다. 또 다른 양태에서, 에피토프는 두 개의 상이한 항원으로부터 기원한다. 이특이적 항체의 제조방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 이특이적 항체는 두 개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 동시-발현을 사용하여 재조합에 의해 생산할 수 있다[문헌 참조; Milstein et al. (1983) Nature 305: 537-39]. 대안적으로, 이특이적 항체는 화학적 결합을 사용하여 제조할 수 있다[문헌 참조; Brennan, et al. (1985) Science 229: 81]. 이특이적 항체는 이특이적 항체 단편을 포함한다[문헌 참조; Hollinger, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6444-48, Gruber, et al, J. Immunol. 152: 5368 (1994)].
본 발명의 항-사람 IL-17A 항체를 사람화하는 예시적인 방법은 실시예 3에 기재되어 있다.
IV. IL-17A 특이 항체의 특성화
실시예 2 및 3에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 방법을 사용하여 사람 IL-17A와 면역반응성인 모노클로날 항체를 생성한다. 도 1A 및 1B는 본 발명의 다양한 항-IL-17A 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 서열 정렬을 보여준다. CDR 영역이 나타나 있으며, 번호매김은 문헌[참조; Kabat et al. (1991)]에 따른다.
사람화된 16C10 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 플라스미드를 부다페스트 조약에 따라 2006년 7월 28일자로 수탁 번호 PTA-7675하에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; ATCC - Manassas, Virginia, USA)에 기탁하였다. 항체 3OC10 및 23E12를 발현하는 하이브리도마를 부다페스트 조약에 따라 2006년 7월 20일자로 수탁 번호 PTA-7739 및 PTA-7740하에 각각 JL7-3OC10.C3 및 JL7-23E12.B10으로서 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 기탁하였다.
본 발명의 각종 사람화된 항체의 경쇄 및 중쇄 CDR이 각각 표 3 및 4에 제공되어 있다. 또한, 표 4는, 하나 이상의 아미노산이 사용될 수 있는 가변 위치를 갖는 hu16C10의 VH에 대한 추가의 CDR을 제공한다.
Figure 112009014713672-PCT00001
Figure 112009014713672-PCT00002
일반적으로, 사람화된 항체에 대한 CDR은 hum 16C10 및 hum 4C3의 CDRH2 및 CDRH3(여기서, 각각은 각각의 랫트 CDR로부터의 단일 아미노산 변화를 갖는다)을 제외하고는, 모 랫트 항체의 CDR과 동일하다. 이들이 독립적인 클론으로서 수득되기는 하지만, 모 랫트 항체 16C10 및 4C3은, VH 영역의 서열이 동일하고 골격 치환에 의해 VL 영역만 다르다(16C10에서 위치 15에서 이소류신이 4C3에서는 발린이다). 그 결과, CDR은 이러한 두 개의 모 랫트 항체와 동일하며, 이에 따라 이들의 사람화 형태와 동일하다.
서열은 각각 서열 5 및 22에서 항체 16C10/4C3 및 30C10의 사람화된 VL 영역에 대해 제공된다. 서열은 각각 서열 6 및 23에서 항체 16C10/4C3 및 30C10의 사람화된 VH 영역에 대해 제공된다. 이러한 사람화 가변 도메인은, 적당한 고정 도메인 서열을 부가함으로써 전장 키메라 항체 또는 사람화된 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 양태는, 예를 들면, 표 4에 열거되어 있는 바와 같이, 16C10 중쇄에서의 CDR 아미노산 잔기의 또 다른 다양한 변형을 포함한다. 도 1B의 잔기 번호매김을 참고하면, 표 4(및 서열 17 및 20)에 기재된 변형은 N54A, N54Q, N60A, N60Q, M96L, M96A, M96K, M96F, MlOOhF, MlOOhL이다.
본 발명의 한 가지 양태에서, 항체 16C10의 키메라 경쇄 및 중쇄는 사람 고정 도메인(각각 사람 카파 경쇄 및 사람 IgGl 고정 도메인)을 사람화된 VL(서열 5) 및 VH 영역(서열 6)의 C-말단에 부착함으로써 생성된다. 키메라 16C10 경쇄 및 중쇄의 서열은 서열 9 및 10에 제공된다. 또 다른 양태에서, 항체 3OC10 및 4C3의 키메라 형태는 키메라 16C10로부터의 동일한 고정 도메인을 이의 각각의 사람화된 VL 및 VH 영역(30C10에 대해 서열 22 및 23; 4C3에 대해 서열 5 및 서열 6)에 융합시킴으로써 생성된다. 사람화 4C3의 키메라 형태는 물론 사람화 16C10의 키메라형과 동일할 것이다.
또 다른 양태에서, 전장의 사람화된 항체는, 실시예 3에 보다 상세하게 기재되어 있는 바와 같이, 키메라 형태 항체의 골격 잔기(즉, CDR의 일부가 아닌 가변 도메인내 아미노산 잔기)를 사람 배선 골격 서열로 치환함으로써 생성된다. 생성된 항체는 랫트 항체로부터의 CDR 서열만을 보유하며, 이때 고정 도메인 및 골격 서열이 사람-기원한 서열로 대체된다. 시그널 서열을 포함한 사람화된 항체 16C10에 대한 전장 경쇄 및 중쇄는 각각 서열 2 및 4에서 제공된다. 또 다른 양태에서, 사람화된 형태의 항체 4C3 및 23E12는 16C10에 대해 기재된 방법과 유사하게, 즉 적합한 사람 골격 서열을 이들 항체의 키메라 버젼의 서열(상기함)로 치환시켜 생성된다(실시예 3 참조).
추가의 양태에서, 본 발명의 사람화된 항체의 전장 경쇄 및 중쇄는 N-말단에 단일 펩타이드 갖도록 클로닝되어 항체가 생산되는 경우에 세포로부터의 분비를 촉진시킨다. 한 가지 양태에서, 19개의 아미노산 시그널 서열이 사람화 16C10 항체(서열 2 및 4의 잔기 -19번 내지 -1번)의 경쇄와 중쇄 둘 다에 부가된다. 시그널 서열이 부가된, 사람화 16C10의 전장 경쇄 및 중쇄의 DNA 서열은 서열 1 및 3에서 제공된다. 이러한 DNA 서열은 본 발명의 사람화된 항체의 생산을 위해 적합한 발현 벡터에서 클로닝되고 발현될 수 있다. 또 다른 양태에서, 시그널 서열은, 항체 16C10에 대해 기재된 바와 같이, 사람화된 항체 30C10 및 4C3의 경쇄 및 중쇄에 부가될 수 있다. 또 다른 양태에서, 고려되는 항체의 생산방법에 따라 서열 1 내지 4에서 제공된 특이 시그널 서열과는 상이한 시그널 서열 펩타이드가 부가된다. 이러한 시그널 서열은 과학 문헌[참조; Choo et al.(2005) "SPdb - a signal peptide database," BMC Bioinformatics 6:249]으로부터 입수할 수 있다.
또 다른 양태에서, 상이한 고정 도메인이 본원에 제공된 사람화 VL 및 VH 영역에 부가될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체(또는 단편)의 특정의 의도된 용도가 변경된 효과기 작용을 필요로 하는 것이라면, IgG1 이외의 중쇄 고정 도메인을 사용할 수 있다. IgG1 항체가 긴 반감기 및 효과기 작용, 예를 들면, 보체 활성화 및 항체-의존적 세포 세포독성을 제공하기는 하지만, 이러한 활성은 항체의 모든 용도에 대해 바람직하지는 않을 수 있다 이러한 경우, 예를 들면, IgG4 고정 도메인이 사용될 수 있다.
V. 사람화 항-IL-17A의 친화도 및 생물학적 활성
사람화된 항-IL-17A 항체에서 바람직한 것으로서 본원에 정의된 특성을 갖는 항체는 시험관내, 생체내 생물학적 억제 활성에 대해 스크리닝하거나, 또는 결합 친화도를 측정하여 스크리닝할 수 있다. 목적 항체(예를 들면, 이의 수용체에 대한 사이토킨의 결합을 차단하는 것)에 의해 결합된 사람 IL-17A 상에서 동일한 에피토프에 결합하는 항체에 대해 스크리닝하기 위해, 문헌[참조: ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기술된 바와 같은 정규의 교차-차단 검정(cross-blokcing assay)을 수행할 수 있다. 대안적으로, 문헌[참조: Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 1388-1394]에 기술된 바와 같이 에피토프 맵핑(epitope mapping)을 수행하여 항체가 목적 에피토프에 결합하는지를 측정할 수 있다. 항체 친화도(예를 들면, 사람 IL-17A에 대한 친화도)는 실시예 7에 기재된 것을 포함한 표준 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 바람직한 사람화된 항체는 약 100nM(1x1O-7M) 이하; 바람직하게는 약 1OnM 이하; 보다 바람직하게는 약 1nM 이하의 Kd 값으로 사람 IL-17A에 결합하는 것들이다. 항체가 약 200pM(2x10-10M), 100pM, 50pM, 20pM, 10pM, 5pM 또는 심지어 2pM 이하의 Kd 값을 갖는 양태가 보다 더 바람직하다.
본 발명의 화합물 및 방법에 유용한 항체 및 이의 단편은 생물학적으로 활성인 항체 및 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "생물학적으로 활성인"은 직접 또는 간접적으로 생물학적 효과를 발휘하며 바람직한 항원 에피토프에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 나타낸다. 통상적으로, 이러한 효과는, IL-17A가 이의 수용체에 결합하지 못하는 것에서 초래된다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "특이적"은 표적 항원 에피토프에 대한 항체의 선택적인 결합을 나타낸다. 항체는 제공된 조건하에서 IL-17A에 대한 결합을 관련이 없는 항원 또는 항원 혼합물에 대한 결합과 비교함으로써 결합의 특이성에 대해 시험할 수 있다. 항체가 관련이 없는 항원 또는 항원 혼합물보다 10배 이상, 바람직하게는 50배 더 높은 친화도로 IL-17A에 결합하는 경우, 특이적인 것으로 고려한다. IL-17A를 포함하는 단백질에 "특이적으로 결합된" 항체(또는 이의 단편)는 IL-17A-기원한 서열을 포함하지 않는 단백질에 결합되지 않으며, 즉 본원에서 사용되는 바와 같은 "특이성"은 IL-17A 특이성에 관한 것이며, 해당 단백질에 존재할 수 있는 다른 서열에 관한 것이 아니다. 예를 들면, 본원에서 사용되는 것으로서, IL-17A 및 FLAG® 펩타이드 태그를 포함하는 융합 단백질인 FLAG-hIL-17A에 "특이적으로 결합된" 항체는 단독으로 또는 IL-17A 이외의 단백질에 융합되는 경우 FLAG® 펩타이드 태그에 결합되지 않는다.
하기 실시예(예를 들면, 실시예 7)에 나타낸 데이타는 사람화된 항체 16C10(모 랫트 중쇄 CDR을 기준으로 한 N54Q 및 M96A 치환 포함)이 KinExA 검정으로 측정하여 1 내지 10pM 범위의 Kd로 사람 IL-17A로의 결합에 대해 높은 친화도를 갖는다는 것을 보여준다. 시험관내 활성 검정, 예를 들면, Ba/F3 hIL-17Rc-GCSFR 세포 증식 검정(실시예 11), 정상 사람 피부 섬유모세포(NHDF) 검정(실시예 9) 및 사람 류마티스 관절염(RA) 윤활막세포 검정(실시예 8)은, 관찰된 IC50 값이 전형적으로 검정에 존재하는 hIL-17A의 농도의 50% 이하(3회 검정에서 각각 100pM, 1000pM 및 1000pM)이기 때문에 hu16C1O이 고친화도 항체임을 입증한다. 실험에 사용된 항체의 이가 특성(bivalent character) 및 IL-17A 이합체 형성에 대한 가능성으로 인해 0.5몰당량 미만의 항체로 소정 농도의 IL-17A의 50% 억제를 달성할 수 있다. 생체내 활성 검정, 예를 들면, 콜라겐-유도된 관절염을 나타내는 마우스에게의 투여(실시예 16) 및 BAL 호중구 보충 검정(실시예 17)은, 동물에서 본 발명의 수 개의 항-IL-17A 항체의 활성을 입증한다. 시험관내 및 생체내 활성 검정은 또한 사람화된 항체 16C10이 단독으로는 결합 실험으로부터 공지되지 않은 중화 항체임을 입증한다.
본 발명의 수 개의 항체가 cyno IL-17A 및 사람 IL-17A에 결합하는 능력은, 이러한 잠재적인 치료학적 항체가 독성 연구를 위해 별도의 cyno-특이 항체를 개발하지 않고 이러한 연구를 위해 시노몰구스 원숭이에서 직접 사용될 수 있기 때문에 유리하다. 본 발명의 수 개의 항체의 높은 친화도는 또한 사람(및 기타의) 대상체에서 필요 투여량을 감소시킬 수 있다는 점에서 유리하며, 이것은 특정 부작용의 가능성을 감소시킨다. 또한, 높은 친화도는 대상체에 투여해야만 하는 용적을 감소시키고 치료 비용을 절감할 수 있다.
hu16C1O의 혈청 반감기를 마우스 및 시노몰구스 원숭이에서 측정하였다. cyno에서, 정맥내(iv) 투여후의 반감기를 0.4, 4.0 및 40mg/kg 투여한 투여량 범위 연구에서 평가하였다. 약물의 혈청 농도를 42일간 주기적으로 측정하였다. cyno에서의 피하(sc) 투여에 대한 반감기를 4mg/kg 투여하여 측정하며, 또한 42일간 측정하였다. 시노몰구스 원숭이에서 반감기는 약물 농도 대 시간 프로파일의 말단 기울기(terminal slope)에 의해 측정하여 10 내지 19일 iv이고, 28일 sc였다. 보다 높은 투여량에서의 이례적인 특정 데이타포인트는 검정으로부터 배제하였다. 마우스에서의 유사한 실험에서는, hu16C10 항체의 반감기가 13 내지 25일 iv 및 12 내지 22일 sc인 것으로 나타났다.
실시예 19는 본 발명의 예시적인 항-IL-17A 항체(16C10)에 의해 결합된 에피토프, 즉 사람 IL-17A(서열 40)의 L74-Y85의 영역에 있는 잔기를 측정하는 데 사용되는 방법을 기재한다. 본원에 제시된 생물학적 검정 데이타가 항체 16C10이 고친화도 중화 항체임을 입증하기 때문에, 동일한 에피토프에 결합하는 다른 항체도 중화 항체이며 또한 아마도 높은 결합 친화도를 가질 것으로 예상할 수 있다. 본원에서 측정되는 바와 같은 에피토프는 구조 측정이라기 보다는 기능 측정에 의해 수득되며, 본원에서 보고된 에피토프는 구조적 방법으로 측정된 에피토프와는 세밀하게 다를 수 있다. 본원에 보고된 에피토프는 항체 16C10 결합을 위해 중요한 아미노산 잔기의 전부는 아니지만 적어도 일부를 포함한다. 본 발명의 항체에 의해 결합된 에피토프는 또한 교차-차단 실험(실시예 12 참조)과 같은 다른 방법에 의해 또는 X-선 결정 구조 측정과 같은 구조적 방법에 의해 측정할 수 있다. 항체 16C10과 동일한 에피토프에 결합하는 추가의 항체는, 예를 들면, hIL-17A에 대해 야기되는 항체의 스크리닝 또는 에피토프 서열을 포함하는 펩타이드를 사용한 동물의 면역화에 의해 수득할 수 있다.
V. 항체 생산
항체의 재조합 생산을 위해, 이를 암호화하는 핵산을 분리하고 추가의 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제 가능한 벡터로 삽입한다. 모노클로날 항체를 암호화하는 DNA는 통상의 방법을 사용하여(예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리하고 서열검정한다. 다수의 벡터가 이용 가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 다음의 것들 중의 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 시그널 서열, 복제의 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열. 한 가지 양태에서, 본 발명의 사람화된 항-IL-17A 항체의 경쇄 및 중쇄 둘 다는 동일한 벡터, 예를 들면, 플라스미드 또는 아데노바이러스 벡터로부터 발현된다.
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 한 가지 양태에서, 항체는 배양액 중의 포유동물 또는 곤충 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터난소(Chinese hamster ovary;CHO) 세포, 사람 배아 신장(HEK) 293 세포, 마우스 골수종 NSO 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 스포돕테라 프루기페르다 난소(Spodoptera frugiperda ovarian)(Sf9) 세포에서 발현된다. 한 가지 양태에서, CHO 세포로부터 분비된 항체는 회수하여 표준 크로마토그래피 방법, 예를 들면, 단백질 A, 양이온 교환, 음이온 교환, 소수성 상호작용 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피로 정제한다. 수득된 항체는 농축시키고 20mM 아세트산나트륨, pH 5.5 속에서 저장한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 국제 공개공보 제WO2005/040395호에 기재된 방법에 따라 효모에서 생산된다. 간략하게 말하면, 목적 항체의 개별 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 벡터를 상이한 효모 일배체(haploid) 세포, 예를 들면, 상이한 교배형(mating type)의 효모 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에 도입하며, 여기서, 효모 일배체 세포는 임의로 상보성 영양요구균주(complementary auxotroph)이다. 이어서, 형질전환된 일배체 효모 세포를 교배 또는 융합시켜, 중쇄와 경쇄 둘 다를 생산할 수 있는 이배체 효모 세포를 수득할 수 있다. 이후, 이배체 균주는 완전 조립되고 생물학적으로 활성인 항체를 분비할 수 있다. 두 가지 쇄의 상대적 발현 수준은, 예를 들면, 상이한 카피수를 갖는 벡터를 사용하거나, 상이한 강도의 전사 프로모터를 사용하거나, 쇄 중의 하나 또는 둘 다를 암호화하는 유전자의 전사를 추진하는 유도 프로모터(inducible promoter)로부터 발현을 유도함으로써 최적화될 수 있다.
한 가지 양태에서, 다수의 상이한 항-IL-17A 항체("원래의" 항체)의 각각의 중쇄 및 경쇄가 효모 일배체 세포에 도입되어, 다수의 경쇄를 발현하는 하나의 교배형의 일배체 효모 균주의 라이브러리 및 다수의 중쇄를 발현하는 다른 교배형의 일배체 효모 균주의 라이브러리를 생성한다. 이러한 일배체 균주의 라이브러리가 교배(또는 스페로플라스트(spheroplast)로서 융합)되어 경쇄 및 중쇄의 각종 가능한 순열로 이루어진 항체의 복합 라이브러리를 발현하는 이배체 효모 세포류를 생산할 수 있다. 이어서, 항체의 복합 라이브러리를 스크리닝하여, 항체가 원래의 항체보다 우수한 특성(IL-17A에 대해 보다 높은 친화도)을 갖는지를 결정할 수 있다(예를 들면, 국제 공개공보 제WO2005/040395호 참조).
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 항체 가변 도메인의 일부가, 분자량이 대략 13kDa인 폴리펩타이드에서 연결되어 있는 사람 도메인 항체이다(예를 들면, 미국 특허공보 제2004/0110941호 참조). 이러한 단일 도메인, 저분자량 제제는 합성 용이성, 안정성 및 투여 경로 측면에서 다수의 잇점을 제공한다.
VI. 약제학적 조성물 및 투여
본 발명의 항-huIL-17A 항체의 약제학적 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해, 항체를 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합한다[문헌 참조; Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)].
치료제 및 진단제의 제형은, 예를 들면, 동결건조된 분말, 슬러리, 수용액 또는 현탁액 형태의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써 제조할 수 있다[문헌 참조; Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY]. 한 가지 양태에서, 본 발명의 항-IL-17A 항체를 아세트산나트륨 용액 pH 5-6에서 적당한 농도로 되도록 희석시키고, 긴장성을 위해 NaCl 또는 수크로즈를 첨가한다. 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80과 같은 추가의 제제를 가하여 안정성을 증진시킬 수 있다.
단독으로 투여되거나 다른 제제와 병용하여 투여되는 항체 조성물의 독성 및 치료 효능은, 예를 들면, LD50(개체군의 50%가 치사되는 투여량) 및 ED50(개체군의 50%에서 치료적으로 유효한 투여량)을 결정하기 위해, 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 과정에 의해 결정할 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 투여량 비가 치료 지수(therapeutic index)(LD50/ED50)이다. 높은 치료 지수를 나타내는 항체가 바람직하다. 이러한 세포 배양액 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이타는 사람에서 사용하기 위한 투여량 범위를 제형화하는데 사용할 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 투여 경로에 따라 상기 범위내에서 변할 수 있다.
투여 유형은 특히 중요하지 않다. 적합한 투여 경로는 경구, 직장, 경점막 또는 장내 투여; 근육내, 피하, 골수내 주사, 및 경막내, 직접 내실내, 정맥내, 복강내, 비강내 또는 안구내 주사를 포함하는 비경구 전달을 포함한다. 투여는 경구 소화, 흡입, 통기, 국소 적용 또는 피부, 경피, 피하, 복강내, 비경구, 동맥내 또는 정맥내 주사와 같은 각종 통상의 방법으로 수행할 수 있다. 환자에게 정맥내 투여하는 것이 바람직하다.
대안적으로, 예를 들면, 흔히 데포트(depot) 또는 서방출 제형으로 면역병리학에 의해 특징화되는 병원체-유발된 병변 또는 관절염성 관절내로의 직접 항체 주사를 통해 전신계 방식보다는 국소로 항체를 투여할 수 있다. 또한, 항체를 표적화된 약물 전달 시스템, 예를 들면, 면역병리학에 의해 특징화되는 병원체-유발된 병변 또는 관절염성 관절을 표적으로 하는 조직-특이 항체로 피복된 리포솜으로 투여할 수 있다. 리포솜은 고통을 받는 조직에 의해 표적화되고 선택적으로 취해질 것이다.
투여 섭생은 치료학적 항체의 혈청 또는 조직 전환율(turnover rate), 증상의 수준, 치료학적 항체의 면역원성 및 생물학적 기질에서의 표적 세포의 접근성을 포함한 몇 가지 인자들에 따라 좌우된다. 바람직하게는, 투여 섭생은 표적 질병 상태를 개선시키는 동시에 바람직하지 않은 부작용을 최소화시키기에 충분한 치료학적 항체를 전달한다. 따라서, 전달되는 생물제제의 양은 부분적으로 특정 치료학적 항체 및 치료되는 상태의 중증도에 따라 좌우된다. 적합한 투여량의 치료학적 항체를 선택하는데 있어서의 지침이 이용 가능하다[문헌 참조; Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602].
적합한 투여량의 결정은, 예를 들면, 치료에 영향을 미치는 것으로 당업계에 공지되어 있거나 여겨지고 있는 파라미터 또는 인자를 사용하여 임상의에 의해 결정된다. 일반적으로, 투여량은 최적 투여량보다 약간 적은 양에서 시작하며, 그후 부정적인 부작용에 비해 바람직하거나 최적인 효과가 달성될 때까지 소량씩 증가시킨다. 중요한 진단 척도는, 예를 들면, 염증의 증상 또는 생산된 염증성 사이토킨의 수준을 포함한다. 바람직하게는, 사용될 생물제제는 치료를 위해 표적화된 동물과 동일한 종으로부터 유도되며, 이에 의해 시약에 대한 염증성, 자가면역 또는 증식성 반응을 최소화시킨다. 사람 대상체의 경우, 예를 들면, 키메라 항체, 사람화된 항체 및 완전한 사람 항체가 바람직하다.
항체, 항체 단편 및 사이토킨은 연속 주입에 의해 제공되거나 매일, 1주당 1 내지 7회, 1주마다, 2주마다, 1달마다, 2달마다 등으로 투여되는 투여량으로 제공될 수 있다. 투여량은 정맥내, 피하, 국소, 경구, 비강, 직장, 근육내, 뇌내, 척수내 또는 흡입에 의해 제공될 수 있다. 총 1주 투여량은 일반적으로 적어도 0.05㎍/kg 체중, 보다 일반적으로 적어도 0.2㎍/kg, 0.5㎍/kg, 1㎍/kg, 10㎍/kg, 100㎍/kg, 0.25 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/ml, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg 또는 그 이상이다[문헌 참조; Yang, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold, et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu, et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji, et al. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144]. 투여량은 또한 대상체의 혈청 중의 항-IL-17A 항체의 소정의 표적 농도, 예를 들면, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300㎍/ml 또는 그 이상을 달성하도록 제공될 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 사람화된 항-IL-17A 항체는 10, 20, 50, 80, 100, 200, 500, 1000 또는 2500mg/대상체의 양으로 1주마다, 2주마다 또는 "4주마다" 피하 또는 정맥내 투여된다.
본원에 사용된 것으로서, "억제하다" 또는 "치료하다" 또는 "치료"는 질환과 관련된 증상의 진행의 지연 및/또는 이러한 질환의 증상의 중증도에 있어서의 감소를 포함한다. 상기 용어는 또한 존재하는 조절되지 않거나 원치않는 증상을 완화시키고, 추가의 증상을 예방하며, 이러한 증상의 근본적인 원인을 완화시키거나 예방하는 것을 포함한다. 따라서, 상기 용어는 질환, 질병 또는 증상을 갖거나 이러한 질환, 질병 또는 증상으로 진행될 잠재력을 지닌 척추동물 대상체에 유리한 결과를 부여하는 것을 나타낸다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "치료학적 유효량", "치료학적 유효 투여량" 또는 "유효량"은 단독으로 투여되거나 또는 추가의 치료체와 병용하여 세포, 조직 또는 대상체에 투여되는 경우, 질병 또는 상태의 하나 이상의 증상 또는 상기 질병 또는 상태의 진행을 예방하거나 완화하는데 효과적인, 본 발명의 IL-17A 결합 화합물의 양을 나타낸다. 치료학적 유효 투여량은 또한 증상들의 완화, 예를 들면, 관련 의학적 상태의 치료, 치유, 예방 또는 완화, 또는 이러한 상태의 치료, 치유, 예방 또는 완화율의 증가를 초래하기에 충분한 결합 화합물의 양을 나타낸다. 단독 투여된 개개의 활성 성분에 적용시키는 경우, 치료학적 유효 투여량은 성분 단독을 나타낸다. 배합물에 적용되는 경우, 치료학적 유효 투여량은 조합적으로, 연속으로 또는 동시에 투여하는 것에 상관없이 치료학적 효과를 야기하는 활성 성분의 조합된 양을 나타낸다. 치료학적 유효량은 진단 척도 또는 파라미터를 10% 이상, 통상적으로 20% 이상; 바람직하게는 약 30% 이상; 보다 바람직하게는 40% 이상, 가장 바람직하게는 50% 이상까지 개선시킬 것이다.
제2 치료제, 예를 들면, 사이토킨, 또 다른 치료학적 항체, 스테로이드, 화학요법제 또는 항생제와 동시-투여하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다[문헌 참조; Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman 's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA]. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 면역억제제 또는 면역조정제를 함유할 수 있다. 소염제, 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 타크롤리무스(예: FK-506), 시롤리무스, 인터페론, 가용성 사이토킨 수용체(예: sTNRF 및 sIL-1R), 사이토킨 활성을 중화시키는 제제(예: 인플릭스마브, 에타너셉트), 마이코페놀레이트 모페틸, 15-데옥시스페르구알린, 탈리도마이드, 글라티라머, 아자티오프린, 레플루노마이드, 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 적합한 면역억제제를 사용할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 광치료요법 및 방사선과 같은 기타의 치료학적 양식과 함께 사용할 수 있다.
본 발명의 IL-17A 결합 화합물은 또한 IL-23, IL-1β, IL-6 및 TGF-β를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 사이토킨의 하나 이상의 길항제(예를 들면, 항체)와 조합하여 사용할 수 있다[문헌 참조; Veldhoen (2006) Immunity 24:179-189; Dong (2006) Nat. Rev. Immunol. 6(4):329-333]. 다양한 양태에서, 본 발명의 IL-17A 결합 화합물은 다른 길항제 또는 효능제를 투여하기 전, 투여와 동시에, 투여한 후에 투여된다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 IL-17A 결합 화합물은 불리한 면역 반응(예를 들면, MS, 크론병)의 급성 초기 단계를 치료하는데 단독으로 또는 IL-23 길항제와 조합하여 사용된다. 후자의 경우에, IL-17A 결합 화합물은 점차로 감소시킬 수 있으며, 불리한 반응의 억제를 유지하기 위해 IL-23의 길항제만으로 계속 치료한다. 대안적으로, IL-1β, IL-6 및/또는 TGF-β의 길항제를 본 발명의 IL-17A 결합 화합물과 동시에, 이전에 또는 이후에 투여할 수 있다[문헌 참조; Cua and Kastelein (2006) Nat. Immunol. 7:557-559; Tato and O'Shea (2006) Nature 441:166-168; Iwakura and Ishigame (2006) J. Clin. Invest. 116:1218-1222].
전형적인 가축 대상체, 실험 대상체 또는 연구 대상체는 원숭이, 개, 고양이, 랫트, 마우스, 토끼, 귀니피그, 말 및 사람을 포함한다.
VII. 용도
본 발명은 염증성 질환 및 상태 뿐만 아니라 자가면역 및 증식성 장애의 치료 및 진단을 위해 가공된 항-IL-17A 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 염증성 장 질병(IBD), 다발 경화증(MS), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 낭성 섬유증(CF), 건선, 전신 피부경화증, 동종이식 거부, 자가면역 심근염 및 복막 유착을 진단, 예방 또는 치료하기 위한 방법이 제공된다(문헌 참조; Chung et al. (2002) J. Exp. Med. 195:1471-78).
건선
피부는 내환경과 주위 사이의 중요한 경계로서 작용하여, 잠재적으로 해로운 항원과의 접촉을 방지한다. 항원/병원체 침투의 경우, 항원을 제거하기 위해 염증성 반응이 유도된다. 이러한 반응은, 주로 T 세포, 다형핵 세포 및 대식세포로 이루어진 피부 침윤물을 야기한다[문헌 참조; Williams and Kupper (1996) Life Sci., 58:1485-1507]. 통상적으로, 병원체에 의해 야기되는 이러한 염증성 반응은 엄격한 제어하에 있으며 병원체의 제거시 중단될 것이다.
특정 경우에, 이러한 염증성 반응은 외부 자극 및 적당한 조절없이 일어나, 피부 염증을 야기한다. 본 발명은 피부 염증을 치료 및 진단하는 방법을 제공한다. 상기한 바와 같은 세포 침윤물 및 이들 세포로부터의 분비된 사이토킨의 결과인 피부 염증은 반흔성 유천포창, 공피증, 화농성 한선염, 독성 표피 괴사, 여드름, 골염, 이식편 대 숙주 질환(GvHD), 괴저성 농피증 및 베체트 증후군과 같은 몇 가지 염증성 장애를 포함한다[문헌 참조; Willams and Griffiths (2002) Clin. Exp. Dermatol, 27:585-590]. 피부 염증의 가장 일반적인 형태가 건선이다.
건선은 염증성 침윤물과 결합된 각질형성세포의 T 세포 매개된 과증식을 특징으로 한다. 질환은 만성 플라크 병변, 피부 발진 및 농포성 병변을 포함한 특정의 뚜렷한 중첩되는 임상적 표현형을 갖는다[문헌 참조; Gudjonsson et al. (2004) Clin Exp. Immunol. 135:1-8]. 건선 환자의 대략 10%가 관절염을 나타낸다. 질환은, 일란성 쌍생아에서 60% 일치하는, 강하지만 복잡한 유전 소인(genetic predisposition)을 갖는다.
전형적인 건선 병변은 두꺼운 은백색 비늘에 의해 덮혀진 뚜렷한 홍반성 플라크이다. 건선 조직의 염증 및 과증식은 정상 피부와는 상이한 조직학, 항원 및 사이토킨 프로파일과 관련된다. 사이토킨 중에서 TNFα, IL-19, IL-18, IL-15, IL-12, IL-7, IFNγ, IL-17A 및 IL-23이 건선과 관련된다[문헌 참조; Gudjonsson et al., 상기 참조]. IL-17A가 건선 피부에서 검출되었다.
본 발명의 항-IL-17A 항체는 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여, 건선 발전(psoriasis flareup)의 예방, 치료, 진단 및 예측에 사용될 수 있다. 건선 발병의 예측 및 치료에 있어서의 항-IL-17A 항체의 사용은 공동으로 양도된 미국 공개특허공보 제2005/0287593호 및 PCT 특허공보 제WO 2005/108616호에 기재되어 있으며, 이들의 기재내용은 본원에 전문이 참고로 인용되어 있다.
류마티스 관절염(RA)
RA는 전세계 인구의 약 0.5%에 영향을 미치는 윤활 관절의 염증을 특징으로 하는 진행성 전신 질환이다[문헌 참조; Emery (2006) BMJ 332: 152-155]. 관절 염증은 관절의 변형, 통증, 경직 및 종창을 야기하며, 궁극적으로는 비가역적 퇴화를 야기할 수 있다. 영향을 받는 관절은 무릎, 팔꿈치, 목 및 손과 발의 관절을 포함한다. 통상의 치료는 NSAID를 사용하여 증상을 완화시킨 다음 금, 페니실라민, 설파살라진 및 메토트렉세이트와 같은 질병-변경 항-류마티스 약물(DMARD)을 투여하는 것을 포함한다. 최근의 진보는 인플릭시맙, 아달루미맙 및 골리무맙과 같은 모노클로날 항체 및 에타너셉트와 같은 수용체 융합 단백질을 포함한 TNF-α 억제제를 사용한 치료를 포함한다. 이러한 TNF-α 억제제를 사용한 치료는 질환으로부터의 구조적인 손상을 극적으로 감소시킨다.
본 발명의 항-IL-17A 항체는 RA의 치료를 필요로 하는 대상체에서 RA를 치료하는 데 사용될 수 있다. 실시예 16은 RA의 콜라겐-유도된 관절염(CIA) 모델을 포함한 실험을 기재하고 있으며, 이에 대한 데이타가 도 3A 내지 3D 및 표 15에 제시되어 있다. 결과는, 희석제와 동형 대조군과 비교하여, 본 발명의 항-IL-17A 항체로 치료한 동물에서 높은 질병 중증도 스코어를 갖는 발의 부분이 감소됨을 보여준다.
본 발명의 항-IL-17A 항체는 또한 RA를 위한 다른 치료제, 예를 들면, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 스테로이드, 마이코페놀레이트 모페틸, NSAID 또는 TNF-α 억제제(항체 또는 수용체 단편)와 조합할 수 있다.
한 가지 양태에서, 본 발명의 항-IL-17A 항체는 이미 DMARD 단독으로의 치료에 대해 적절하게 반응하지 않는 사람 대상체를 치료하는 데 사용된다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 항-IL-17A 항체를 사용한 치료는 DMARD 치료법의 사전 실패를 필요로 하지 않으면서 질환 과정에서 조기에 시작된다. 이러한 조기 중재(intervention)는, 예를 들면, 항체 요법의 안전성이 확실히 정립된 경우에 적합할 수 있다.
임상적 개선여부는 실시예 18에 보다 상세하게 기재되어 있는 바와 같이 ACR 스코어를 결정함으로써 측정한다. 다양한 양태에서, 20, 50 및 70의 ACR 스코어가 바람직한 종말점이며, 이러한 종말점은 5, 10, 15, 24, 40, 50 이상의 주와 같은 치료 과정에서의 적합한 시점에서 평가할 수 있다.
다발 경화증(MS)
MS는 플라크 또는 병변을 야기하는 신경섬유로부터의 마이엘린(myelin)의 손실을 포함하는 중추신경계(CNS)의 자가면역 질환으로 여겨진다. 가장 일반적인 형태는 뚜렷한 증후성 발적이 일어난 다음 부분적인 또는 전체적인 완화 기간이 뒤따르는 재발/완화성 MS이다. 통상적인 치료 방안은 인터페론-β-1a 및 -1b, 미톡산트론, 테트라펩타이드 글리티라머 아세테이트, 치료학적 알파--4-인테그린-특이 항체(나탈리주맙) 또는 알파-4-인테그린의 소분자 길항제(예를 들면, 국제 공개특허공보 제WO2003/084984호에 기재된 것들)를 포함한다.
본 발명의 항-IL-17A 항체는 MS의 치료를 필요로 하는 대상체에서 MS를 치료하는 데 사용될 수 있다. 항-IL-17A 항체는 또한 MS를 위한 다른 치료제, 예를 들면, 인터페론-β, 인터페론-α, 스테로이드 또는 알파-4-인테그린-특이 항체와 조합할 수 있다.
염증성 장 질병(IBD)
IBD는 장에 염증이 일어나 복부 경련 및 통증, 설사, 체중 감소 및 장 출혈을 야기하는 질환군(예를 들면, 크론병 및 궤양성 대장염)의 명칭이다. 600,000명에 이르는 미국인들이 IBD에 영향을 받고 있다. 통상적인 치료 방안은 크론병의 경우 살파살라진, 코르티코스테로이드(예를 들면, 프레드니손), 면역계 억제제, 예를 들면, 아자티오프린 및 머캅토퓨린, 또는 항생제(예를 들면, 메트로니다졸)을 포함한다. 치료학적 모노클로날 항체 치료는 에타너셉트, 나탈리주맙 및 인플릭시맙을 포함한다.
본 발명의 항-IL-17A 항체는 IBD의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IBD를 치료하는 데 사용될 수 있다[문헌 참조; Yen et al. (2006) J. Clin. Invest. 116:1310-1316; Fujimo et al. (2003) Gut 52:65-70]. 본 발명의 항-IL-17A 항체는 또한 IBD를 위한 다른 치료제, 예를 들면, IL-10(미국 특허 제5,368,854호, 제7,052,686호 참조), 스테로이드 및 설파살라진과 조합할 수 있다.
또 다른 양태에서, 이의 수용체에 대한 IL-17A의 결합을 차단하지 않는 본 발명의 항체(예를 들면, 비-중화 항체 12E6)가 연장된 IL-17A 활성을 필요로 하는 대상체에서 IL-17A를 안정화시키는 데 치료학적으로 사용된다. 이러한 대상체는 감염 또는 암을 앓고 있는 환자를 포함한다.
본 발명의 다수의 변형 및 변화가, 당업계의 숙련가들에게 자명한 바와 같이, 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다. 본 발명은 청구의 범위에 의해 권리가 주어지는 전범위의 등가물과 함께 첨부된 청구의 범위 측면에서 정의된다. 하기 실시예를 포함하여 본원에 기재된 특정 양태들은 단지 예로서 제공되며, 본 발명의 범위를 구체적으로 제한하지는 않는다.
실시예 1
일반적인 방법
분자 생물학에서의 표준 방법이 문헌[참조; Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA]에 기재되어 있다. 표준 방법은 또한 문헌[참조; Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY]에도 나타나 있으며, 여기에는 세균 세포에서의 클로닝 및 DNA 돌연변이유발(Vol. 1), 포유동물 세포 및 효모에서의 클로닝(Vol. 2), 당접합체 및 단백질 발현(Vol. 3) 및 생물정보학(Vol. 4)이 기재되어 있다.
면역침전, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리 및 결정화를 포함한 단백질 정제방법이 문헌[참조; Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York]에 기재되어 있다. 화학적 검정, 화학적 변형, 해독후 변형, 융합 단백질의 생산 및 단백질의 글리코실화가 문헌[참조; Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391]에 기재되어 있다. 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 생산, 정제 및 단편화가 문헌[참조; Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane, 상기 참조]에 기재되어 있다. 리간드/수용체 상호작용을 특성화하기 위한 표준 기술이 이용 가능하다[문헌 참조; Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York].
모노클로날, 폴리클로날 및 사람화 항체는 제조할 수 있다[문헌 참조; Sheperd and Dean (eds.) (2000) Mnoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY; Kontermann and Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer- Verlag, New York; Harlow and Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 139-243; Carpenter, et al. (2000) J. Immunol. 165:6205; He, et al. (1998) J. Immunol. 160:1029; Tang et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378; Baca et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883; Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499; 미국 특허 제6,329,511호]. 사람화의 또 다른 방법은 유전자삽입 마우스에서 파아지 또는 사람 항체 라이브러리 상에 나타나는 사람 항체 라이브러리를 사용하는 것이다[문헌 참조; Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839; Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Hoogenboom and Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377; Barbas et al. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Kay et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruin et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:397-399].
일본쇄 항체 및 디아바디는 문헌[참조; Malecki et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 99:213-218; Conrath et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:7346-7350; Desmyter et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:26285-26290; Hudson and Kortt (1999) J. Immunol. Methods 231:177-189; 및 미국 특허 제4,946,778호]에 기재되어 있다. 양기능 항체는 문헌[참조; Mack, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025; Carter (2001) J. Immunol. Methods 248:7-15; Volkel, et al. (2001) Protein Engineering 14:815-823; Segal, et al. (2001) J. Immunol. Methods 248:1-6; Brennan, et al. (1985) Science 229:81-83; Raso, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:27623; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Traunecker, et al. (1991) EMBO J. 10:3655-3659; 미국 특허 제5,932,448호, 제5,532,210호 및 제6,129,914호]에 제공되어 있다.
이특이적 항체가 또한 문헌[참조; Azzoni et al. (1998) J. Immunol. 161:3493; Kita et al. (1999) J. Immunol. 162:6901; Merchant et al. (200O) J. Biol. Chem. 74:9115; Pandey et al. (2000) J. Biol Chem. 275:38633; Zheng et al. (2001) J. Biol Chem. 276:12999; Propst et al. (2000) J. Immunol. 165:2214; Long (1999) Ann. Rev. Immunol. 17:875]에 기재되어 있다.
항원의 정제는 항체의 생성에 필요하지 않다. 동물을 목적 항원을 갖는 세포로 면역화할 수 있다. 이어서, 면역화된 동물로부터 비세포(splenocyte)를 분리할 수 있으며, 비세포를 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마를 생산할 수 있다[문헌 참조; Meyaard et al. (1997) Immunity 7:283-290; Wright et al. (2000) Immunity 13:233-242; Preston et al., 상기 참조; Kaithamana et al. (1999) J. Immunol. 163:5157-5164]. 항체는 통상적으로 약 10-6M 이상, 전형적으로 10-7M 이상, 보다 전형적으로 10-8M 이상, 바람직하게는 약 10-9M 이상, 보다 바람직하게는 10-10M 이상, 가장 바람직하게는 10-11M 이상의 Kd로 결합할 것이다[문헌 참조; Presta et al. (2001) Thromb. Haemost. 85:379-389; Yang et al. (2001) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 38:17-23; Carnahan et al. (2003) Clin. Cancer Res. (Suppl.) 9:3982s-3990s].
항체는, 예를 들면, 작은 약물 분자, 효소, 리포솜, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합할 수 있다. 항체는 치료용, 진단용, 키트 또는 기타의 목적에 유용하며, 예를 들면, 염료, 방사성 동위원소, 효소 또는 금속, 예를 들면, 콜로이드성 금에 커플링된 항체를 포함한다[문헌 참조; Le Doussal et al. (1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibellini et al. (1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing and Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Everts et al. (2002) J. Immunol. 168:883-889].
형광 활성 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting; FACS)을 포함한 유세포 검정법(flow cytometry)이 이용 가능하다[문헌 참조; Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ]. 예를 들면, 진단 시약으로서 사용하기 위해, 핵산 프라이머 및 프로브를 포함한 핵산, 폴리펩타이드 및 항체를 변형시키는 데 적합한 형광 시약이 이용 가능하다[문헌 참조; Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO].
면역계의 조직학의 표준 방법은 문헌[참조; Muller-Harmelink(ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY]에 기재되어 있다.
예를 들면, 항원 단편, 리더 서열, 단백질 폴딩(protein folding), 작용성 도메인, 글리코실화 영역 및 서열 정렬을 측정하기 위한 소프트웨어 패키지 및 데이타베이스가 이용 가능하다[문헌 참조; GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher®(TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne, et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren, et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690].
실시예 2
랫트 항 사람 IL-17A 모노클로날 항체
사람 IL-17A에 대한 모노클로날 항체는 다음과 같이 입수하였다. 8주령된 암컷 루이스 랫트(Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, Indiana, USA)에게, HEK 293 세포의 아데노바이러스 벡터로부터 발현된 재조합 사람 IL-17A(rhIL-17A)의 연속 주사를 제공하였다. 주사는 0, 14, 32, 46 및 83일째에 제공하였다.
0일째 주사는 프로인트 완전 보조제의 복강내(ip) 주사를 수반한 50㎍ rhIL-17A의 피하(sc) 주사였다. 25㎍ rhIL-17A의 14, 32 및 46일째 sc 주사는 프로인트 불완전 보조제의 ip 주사를 수반하였다. 83일째 주사는 프로인트 불완전 보조제 중의 20㎍ rhIL-17A의 ip 주사와 식염수 중의 rhIL-17A의 정맥내(iv) 꼬리 정맥 주사의 조합이었다.
시험 채혈은 53일째에 실시하였다. 랫트 비세포의 융합은 웰당 총 1.13 X 105 세포를 제공하도록 30개의 96웰 플레이트로 나눈 1.6 X 108 비세포 및 1.8 X 108 골수종 세포를 사용하여 87일째에 실시하였다.
생성된 모노클로날 항체(수천개)의 1차 스크리닝은 간접 rhIL-17A ELISA(실시예 5 참조)에 의해 실시하였다. 생성된 항체에 대한 2차 스크리닝은 ST2(마우스 간질) 세포에 의한 쥐 IL-6의 rhIL-17A-유도된 발현의 중화 및 Ba/F3 hIL-17Rc:mGCSFR 세포의 rhIL-17A-유도된 증식의 중화를 포함하였다(실시예 11 참조). 대략 11개의 모노클로날을 제1 스크리닝 및 제2 스크리닝 후에 추가로 연구하였다. 후속 실험을 실시하여, 후보 항체가 천연의 huIL-17A에 결합하여 이들이 다양한 치료적, 진단적 및/또는 연구 목적에 유용할 수 있음을 입증하였다. 이러한 스크리닝은 결합 검정(예: 간접 ELISA 또는 샌드위치 ELISA)을 사용하여 시험관내 활성 검정 또는 생체내 활성 검정에 의해 수행할 수 있으며, 이의 예는 본원에 제공되어 있다.
실시예 3
랫트 항 사람 IL-17A 항체의 사람화
랫트 항 사람 IL- 17 모노클로날 항체 16C10의 사람화는 필수적으로, 전문이 본원에 참고로 인용되어 있는 국제 공개특허공보 제WO 2005/047324호 및 제WO 2005/047326호에 기재된 바와 같이 실시하였다. 간략하게 말하면, 아래에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 사람 고정 도메인을 사용하여 모 (랫트) 고정 도메인을 대체하고, 랫트 가변 도메인 서열에 상동성인 사람 배선 서열을 선택하여 랫트 CDR에 대한 사람 골격을 제공하는 데 사용하였다.
사람 배선 골격 서열의 선택을 위한 과정
본 발명의 항-사람 IL-17A 항체를 사람화하는 데 적합한 배선 골격 서열을 선택하는 데 있어서 다음의 단계들을 사용한다:
1) 비-사람 VL 및 VH 도메인을 클로닝하고 서열검정하며, 아미노산 서열을 측정한다.
중쇄
2) 비-사람 VH 서열을 5개의 사람 VH 배선 아미노산 서열의 그룹과 비교한다; 아그룹 IGHV1 및 IGHV4로부터의 대표적인 것 및 아그룹 IGHV3으로부터의 3개의 대표적인 것. VH 아그룹은 문헌[참조; M.-P. Lefranc (2001) "Nomenclature of the Human Immunoglobulin Heavy (IGH) Genes", Experimental and Clinical Immunogenetics, 18:100-116]에 열거되어 있다. 5개의 배선 서열과의 비교는 다음과 같이 실시한다:
A) 문헌[참조; Kabat et al. (1991)]에 따라 비-사람 VH 서열에 잔기 번호를 지정한다.
B) 비-사람 VH 서열을 5개의 사람 배선 서열 각각과 정렬시킨다. V 유전자는 단지 VH 잔기 1번 내지 94번만을 포함하기 때문에, 이들 잔기만이 정렬에 고려된다.
C) 서열내 상보성-결정(CDR) 및 골격(FR) 영역을 묘사한다. CDR 및 FR은 문 헌[참조; Kabat et al. (1991) (Id.) and Chothia and Lesk (1987) "Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulines", Journal of Molecular Biology, 196:901-917]에 제공된 정의의 조합으로서 정의된다. 따라서, 정의는 다음과 같다: VH CDR1 = 26-35, CDR2 = 50-65, CDR3 = 95-102.
D) 각각의 열거된 하기 잔기 위치에 대해(표 1), 비-사람 및 사람 서열이 동일한 각각의 잔기 위치에서 수치 스코어를 지정한다:
[표 1]
잔기 번호 점수 이유
2 4 CDR-H1,3에 영향을 미침*
4 3 CDR-H1,3에 영향을 미침
24 3 CDR-H1에 영향을 미침
26 4 CDR-H1에 영향을 미침*
27 4 CDR-H1,3에 영향을 미침*
29 4 CDR-H1에 영향을 미침*
34 4 CDR-H1에 영향을 미침*
35 2 VH/VL 인터페이스
37 2 VH/VL 인터페이스
39 2 VH/VL 인터페이스
44 2 VH/VL 인터페이스
45 2 VH/VL 인터페이스
47 4 VH/VL 인터페이스, CDRL3
48 3 CDR-H2에 영향을 미침
49 3 CDR-H2에 영향을 미침
50 2 VH/VL 인터페이스
51 3 CDR-H2에 영향을 미침
58 2 VH/VL 인터페이스
59 3 CDR-H2에 영향을 미침
60 2 VH/VL 인터페이스
63 3 CDR-H2에 영향을 미침
67 3 CDR-H2에 영향을 미침
69 3 CDR-H2에 영향을 미침
71 4 CDR-H2에 영향을 미침*
73 3 CDR-H1에 영향을 미침
76 3 CDR-H1에 영향을 미침
78 3 CDR-H1에 영향을 미침
91 2 VH/VL 인터페이스
93 3 CDR-H3에 영향을 미침
94 4 CDR-H3에 영향을 미침*
최대 89
* 문헌[참조; C. Chothia et al. (1989) "Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions", Nature 342:877-883]에서 CDR 입체형태에 영향을 미치는 것으로 간주됨.
E) 모든 잔기 위치 스코어를 더한다. 수용체 배선 서열은 가장 높은 총 스코어를 갖는 것이다. 두 개 이상의 배선 서열이 동일한 스코어를 갖는 경우:
1) 다음의 잔기 위치 중에서, 비-사람 및 사람 서열이 동일한 각 위치에 대해 총 스코어에 1을 더한다: 1, 3, 5-23, 25, 36, 38, 40-43, 46, 66, 68, 70, 72, 74, 75, 77, 79-90, 92(최대 49).
2) 수용체 배선 서열은 가장 높은 총 스코어를 갖는 것이다. 두 개 이상의 배선 서열이 여전히 동일한 스코어를 갖는 경우, 이들 중 하나는 수용체로서 허용 가능한다.
경쇄
III) VL 서열이 VL의 카파 아부류의 구성원인 경우, 비-사람 VL 서열을 4개의 사람 VL 카파 배선 아미노산 서열의 그룹과 비교한다. 4개의 그룹은 문헌[참조; Barbie and Lefranc (1998) "The Human Immunoglobulin Kappa Variable (IGKV) Genes and Joining (IGKJ) Segments", Experimental and Clinical Immunogenetics, 15:171-183, and M.-P. Lefranc (2001) "Nomenclature of the Human Immunoglobulin Kappa (IGK) Genes", Experimental and Clinical Immunogenetics, 18:161-174]에 열거된 4개의 확립된 사람 VL 아그룹 각각으로부터의 대표적인 것으로 이루어진다. 4개의 아그룹은 또한 문헌[참조; Kabat et al. (1991) at pp. 103-130]에 열거된 4개의 아그룹에 상응한다. 4개의 배선 서열과의 비교는 다음과 같이 실시한다:
A) 문헌[참조; Kabat et al. (1991)]에 따라 비-사람 VL 서열에 잔기 번호를 지정한다.
B) 비-사람 VL 서열을 4개의 사람 배선 서열 각각과 정렬시킨다. V 유전자는 VL 잔기 1번 내지 95번만을 포함하기 때문에, 이들 잔기만이 정렬에 고려된다.
C) 서열내 상보성-결정(CDR) 및 골격 (FR) 영역을 묘사한다. CDR 및 FR은 문헌[참조; Kabat et al. (1991) and Chothia and Lesk (1987) "Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 196:901-917]에 제공된 정의의 조합으로서 정의된다. 따라서, 정의는 다음과 같다: VL CDR1 = 24-34, CDR2 = 50-56, CDR3 = 89-97.
D) 각각의 열거된 하기 잔기 위치에 대해(표 2), 비-사람 및 사람 서열이 동일한 각각의 잔기 위치에서 수치 스코어를 지정한다:
[표 2]
잔기 번호 점수 이유
2 4 CDR-L1,3에 영향을 미침*
4 3 CDR-L1,3에 영향을 미침
25 4 CDR-L1에 영향을 미침*
29 4 CDR-L1,3에 영향을 미침*
33 4 CDR-L1,3에 영향을 미침*
34 2 VL/VH 인터페이스
36 2 VL/VH 인터페이스
38 2 VL/VH 인터페이스
43 2 VL/VH 인터페이스
44 2 VL/VH 인터페이스
46 4 VL/VH 인터페이스, CDR-H3
47 3 CDR-L2에 영향을 미침
48 4 CDR-L2에 영향을 미침*
49 2 VL/VH 인터페이스
55 2 VL/VH 인터페이스
58 3 CDR-L2에 영향을 미침
62 3 CDR-L2에 영향을 미침
64 4 CDR-L2에 영향을 미침*
71 4 CDR-L1에 영향을 미침*
87 2 VL/VH 인터페이스
89 2 VL/VH 인터페이스
90 4 CDR-L3에 영향을 미침*
91 2 VL/VH 인터페이스
94 2 VL/VH 인터페이스
95 4 CDR-L3에 영향을 미침*
* 문헌[참조; C. Chothia et al. (1989) "Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions", Nature 342:877-883]에서 CDR 입체형태에 영향을 미치는 것으로 간주됨.
E) 모든 잔기 위치 스코어를 더한다. 수용체 배선 서열은 가장 높은 총 스코어를 갖는 것이다. 두 개 이상의 배선 서열이 동일한 스코어를 갖는 경우:
1) 다음의 잔기 위치 중에서, 비-사람 및 사람 서열이 동일한 각 위치에 대해 총 스코어에 1을 더한다: 1, 3, 5-23, 35, 37, 39-42, 57, 59-61, 63, 65-70, 72-86, 88.
2) 수용체 배선 서열은 가장 높은 총 스코어를 갖는 것이다. 두 개 이상의 배선 서열이 여전히 동일한 스코어를 갖는 경우, 이들 중 하나는 수용체로서 허용 가능하다. VL 서열이 VL의 람다 아부류의 구성원인 경우, 앞서 인용한 문헌으로부터 사람 VL 람다 배선 아미노산 서열을 사용하여 유사한 과정을 실시한다.
항-사람 IL-17A 항체의 사람화
고정 도메인의 변형과 관련하여, 항체 16C10(랫트 항-사람 IL-17A IgG1)의 가변 경쇄 및 중쇄 도메인을 클로닝하고 각각 사람 카파 경쇄(CL 도메인) 및 사람 IgG1 중쇄(CH1-힌지-CH2-CH3)에 융합시켰다. 이러한 랫트 가변 도메인과 사람 고정 도메인과의 조합은 항체 16C10의 키메라 버젼을 포함한다. 이러한 키메라 16C10의 경쇄 및 중쇄의 서열은 각각 서열 9 및 10에 제공된다.
가변 도메인의 골격 영역의 변형과 관련하여, 항체 16C10의 VH 도메인의 아미노산 서열을 5개의 사람 VH 배선 아미노산 서열의 그룹과 비교하였다; 아그룹 IGHV1 및 IGHV4로부터의 대표적인 것 및 아그룹 IGHV3으로부터의 3개의 대표적인 것. VH 아그룹은 문헌[참조; M.-P. Lefranc, "Nomenclature of the Human Immunoglobulin Heavy (IGH) Genes," Experimental and Clinical Immunogenetics, 18:100-116, 2001]에 열거되어 있다. 항체 16C10은 아그룹 IV에서 사람 중쇄 배선 DP-71에 대해 가장 높은 스코어를 나타내었다.
16C10의 VL 서열은 카파 아부류의 것이다. 이러한 서열을 4개의 사람 VL 카파 배선 아미노산 서열의 그룹과 비교하였다. 4개의 그룹은 문헌[참조; V. Barbie & M.-P. Lefranc, "The Human Immunoglobulin Kappa Variable (IGKV) Genes and Joining (IGKJ) Segments", Experimental and Clinical Immunogenetics, 15:171-183, 1998 및 M.-P. Lefranc, "Nomenclature of the Human Immunoglobulin Kappa (IGK) Genes", Experimental and Clinical Immunogenetics, 18:161-174, 2001]에 열거된 4개의 확립된 사람 VL 아그룹 각각으로부터의 대표적인 것으로 이루어진다. 4개의 아그룹은 또한 문헌[참조; Kabat et al. (1991) at pp. 103-130]에 열거된 4개의 아그룹에 상응한다. 항체 16C10은 아그룹 II에서 사람 경쇄 배선 Z-A19에 대해 가장 높은 스코어를 나타내었다.
일단 목적하는 배선 골격 서열이 결정되면, 전장의 사람화된 가변 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 플라스미드를 생성하였다. 모 랫트 항체 16C10의 골격 잔기 대신에 사람 골격 잔기를 치환하는 것은 랫트 16C10 CDR을 사람 골격 서열로 이식시키는 것과 등가인 것으로 간주할 수 있다. 생성된 항체를 본원에서 "16C10wt"라고 하며, 여기서, "wt"는 아래에 논의되는 최적화된 CDR(2개의 단일 아미노산 변형을 가짐)과는 구분되는 바와 같이, 모 랫트 16C10과 동일한 CDR의 존재를 나타낸다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다 코돈 최적화되고, 합성되며, 고정 도메인으로 삽입되어 잠재적으로 최적의 발현을 제공한다. 클로닝된 항체의 발현을 개선시킬 수 있는 코돈 최적화(codon optimization)는 순전히 임의적이다.
사람 고정 도메인 및 골격 서열의 치환 이외에, 사람화 16C10wt 항체를 또한 두 개의 CDR 잔기에서 변형시켜 최종 사람화 항체의 보다 큰 화학적 안정성을 제공한다. 도 1B에 도시된 "hu16C10" VH 서열에서 두드러진 아미노산 잔기에 의해 두 가지 변화가 나타난다. 도 1B에서 사용된 카배트 번호매김(Kabat numbering)과 관련하여, CDR2의 잔기 54번은 랫트 항체에서 N(아스파라긴)으로부터 사람화 항체에서 Q(글루타민)으로 변하여 잔기 54 내지 55번에서 NG서열에서의 이소아스파르테이트의 형성 가능성을 감소시킨다. 이소아스파르테이트 형성은 표적 항원으로의 항체의 결합을 약하게 하거나 완전히 폐기시킬 수 있다[문헌 참조; Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 at 734]. 또한, CDR3의 잔기 96번은 랫트 항체에서 M(메티오닌)으로부터 사람화 항체에서 A(알라닌)으로 변하여, 메티오닌 황이 산화되어 항원 결합 친화도를 감소시키고 또한 최종 항체 제조시 분자 이질성에 기여하게 될 가능성을 감소시킨다. 이러한 단일-잔기 변형을 N54Q 및 M96A로서 나타낼 수 있다. 본원에 기재된 최종 사람화 16C10 항체는 모 랫트 16C10 CDR에 비해 이러한 2개의 치환을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 키메라(사람화되지 않은) 16C10 항체는 사람화 형태, 즉 N54Q 및 M96A에 대해 상기한 두 개의 단일-잔기 변형을 삽입하도록 변경된다.
사람화된 항체 16C10(hu 16C10)의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 각각 도 2A와 2B, 및 서열 2 및 4(시그널 서열을 포함함)에서 제공된다. hu 16C10의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 한 가지 양태가 서열 1 및 3에 나타나 있다. hu 16C10의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 또 다른 양태가 도 5A(서열 62) 및 도 5B(서열 63)에 나타나 있다.
명명법과 관련하여 명료함을 위해, 각종 항체들 중에서 CDR 및 골격 영역의 길이에 있어서의 변화를 조정하기 위해 카배트 번호매김 시스템이 비-수치 아미노산 서열 명칭(예를 들면, VH 잔기 83a, 83b, 83c)을 포함한다는 것을 인지하는 것이 중요하다. 이러한 번호매김 시스템이 상이한 길이의 CDR을 갖는 각종 항체들 중에서 상응하는 아미노산 잔기에 대한 언급을 용이하게 할 수 있다는 측면에서 유리하기는 하지만, 이것은 엄격한 순차-수치 서열 번호매김(sequential-numeric sequence numbering)(예를 들면, 서열 목록)과 비교하여 특정 아미노산에 대한 명칭과 상충될 수 있다. 본원에서 아미노산 잔기 명칭은 달리 언급하지 않는 한 관련 서열 목록을 참조하여, 예를 들면, "카배트 번호매김"을 참조하여 명명한다.
명명법과 관련한 명료화의 추가의 포인트로서, 서열 2 및 4(사람화 16C10)는 N-말단 시그널 펩타이드의 서열(각각의 처음 19개 잔기)을 포함하며, 여기서, 아미노산은 항체의 성숙한 형태로 제거된다. 서열 1, 3, 62 및 63은 시그널 서열을 암호화하는 57개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에서 사용되는 것으로서, 단백질의 "성숙한" 형태는 시그널 서열을 갖지 않는 단백질을 나타낸다.
사람화된 항체 4C3은 항체 16C10에 대해 앞서 기재한 바와 유사한 방법으로 생성한다. 모 랫트 4C3 항체는 경쇄의 골격 영역의 단일 아미노산 잔기에서만 상 이하고 이러한 골격 영역은 사람화 동안 사람 배선 골격 서열로 대체되기 때문에, 최종의 사람화 4C3 항체 서열은 사람화 16C10 항체의 서열과 동일하다.
사람화된 항체 3OC10 또한 항체 16C10에 대해 앞서 기재한 바와 유사한 방법으로 생성한다. 사용하고자 하는 적합한 사람 골격 서열을 결정하는 데 있어서, 모 랫트 3OC10 항체는 아그룹 III에서 사람 중쇄 배선 DP-46에 대해 가장 높은 스코어를 나타내고, 아그룹 II에서 사람 경쇄 배선 Z-A19에 대해 가장 높은 스코어를 나타내므로, 이러한 골격 서열이 랫트 골격 서열을 대체한다. 사람화 30C10 VL 및 VH 서열은 각각 서열 22 및 23에서 제공된다. 또 다른 양태에서, 랫트 3OC10의 CDR에서 하나 이상의 메티오닌 잔기가 돌연변이되어 사람화 30C10 항체에서 메티오닌 황의 산화 가능성을 없앤다. 구체적으로, 중쇄 잔기 34(CDRH1에서) 및/또는 경쇄 잔기 3Of(카배트 번호매김, 도 1A 참조)는 메티오닌으로부터 다른 아미노산, 예를 들면, 알라닌으로 변한다. 이어서, 이러한 항체를 스크리닝하여, 메티오닌 치환이 IL-17A 결합 친화도를 허용되지 않는 수준으로 감소시키지 않음을 확인한다.
항체 12E6의 키메라, 사람화 및 시그널 서열-함유 버젼은 모 랫트 항체 16C10을 기본으로 한 이러한 항체의 제조로부터 유추하여 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성한다. 모 랫트 항체 12E6에 대한 경쇄 및 중쇄 CDR은 서열 34-36 및 37-39에서 제공된다. 사람 고정 도메인 및 가변 도메인 골격 서열은 상기한 바와 같이 도입된다. 한 가지 양태에서, 중쇄 잔기 34(CDRH1에서)는 메티오닌에서 다른 아미노산, 예를 들면, 알라닌으로 변하여, 사람화 12E6 항체에서 메티오닌 황의 산 화 가능성을 없앤다. 이어서, 생성된 항체를 스크리닝하여, 메티오닌 치환이 IL-17A 결합 친화도를 허용되지 않는 수준으로 감소시키지 않음을 확인한다.
항체 23E12의 키메라, 사람화 및 시그널 서열-함유 버젼은 모 랫트 항체 16C10을 기본으로 한 이러한 항체의 제조와 유사하게 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성한다. 모 랫트 항체 23E12에 대한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열은 서열 44 및 46(DNA), 및 45 및 47(아미노산)에서 제공된다. 모 랫트 항체 23E12에 대한 CDR은 서열 48-50(경쇄) 및 51-53(중쇄)에서 제공된다. 사람 고정 도메인 및 가변 도메인 골격 서열은 상기한 바와 같이 모 랫트 항체에 도입된다.
실시예 4
완전한 사람 항-IL-17A 항체
완전한 사람 항-IL-17A 모노클로날 항체는 마우스 면역계보다는 사람 면역계의 유전자삽입 마우스 보유 부분(transgenic mice carrying part)을 사용하여 생성한다. 본원에서 "HuMAb" 마우스라고 하는 이러한 유전자삽입 마우스는, 내인성 μ 및 κ 쇄 위치를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재정렬되지 않은 사람 중쇄(μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 암호화하는 사람 면역글로불린 유전자 미니위치를 함유한다[문헌 참조; Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474):856-859]. 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내며, 면역화에 반응하여, 도입된 사람 중쇄 및 경쇄 트랜스유전자(transgene)는 종류 변환(class switching) 및 체세포 돌연변이를 거쳐 고친화도 사람 IgGκ 모노 클로날 항체를 생성한다[문헌 참조; Lonberg et al. (1994), 상기 참조; reviewed in Lonberg (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg et al. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, and Harding et al. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546]. HuMab 마우스의 제조는 당업계에 통상적으로 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[참조; Taylor et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg et al. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93; 및 Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; 이의 내용은 전문이 본원에 참고로 인용되어 있음]에 기재되어 있다. 또한, 미국 특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,789,650호; 제5,877,397호; 제5,661,016호; 제5,814,318호; 제5,874,299호; 제5,770,429호 및 제5,545,807호 및 국제 특허 출원 공보 제WO 98/24884호; 제WO 94/25585호; 제WO 93/1227호; 제WO 92/22645호 및 제WO 92/03918호를 참조하며, 이들 모두의 기재내용은 전문이 본원에 참고로 인용되어 있다.
IL-17A에 대한 완전한 사람 모노클로날 항체를 생성하기 위해, HuMab 마우스를 문헌[참조; Lonberg et al. (1994); Fishwild et al. (1996) 및 제WO 98/24884 호]에 기재된 바와 같이 항원성 IL-17A 폴리펩타이드로 면역화한다. 바람직하게는, 마우스는 처음 면역화시 6 내지 16주령이다. 예를 들면, IL-17A의 정제된 제제를 사용하여 HuMab 마우스를 복강내 면역화할 수 있다. 또한, 마우스를 IL-17 유전자로 안정하게 형질전환되거나 형질감염된 전체 HEK293 세포로 면역화시킬 수 있다. "항원성 IL-17A 폴리펩타이드"는 HuMab 마우스에서 항-IL-17A 면역 반응을 이끌어내는 IL-17A 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 나타낼 수 있다.
일반적으로, HuMAb 유전자삽입 마우스는, 초기에 프로인트 완전 보조제 중의 항원으로 복강내(IP) 면역화한 다음, 프로인트 불완전 보조제 중의 항원으로 2주마다 IP 면역화(통상적으로 총 6회까지)할 경우에 최선으로 반응한다. 마우스를 먼저 IL-17A를 발현하는 세포(예를 들면, 안정하게 형질전환된 HEK293 세포)로 면역화한 다음 IL-17A의 가용성 단편으로 면역화하고, 이어서, 두 개의 항원을 교대로 면역화한다. 면역 반응을 면역화 프로토콜의 과정에 걸쳐 모니터링하며, 이때 혈장 샘플을 안와후부 채혈에 의해 입수한다. 혈장을, 예를 들면, ELISA에 의해 항-IL-17A 항체의 존재여부에 대해 스크리닝하고, 충분한 역가의 면역글로불린을 갖는 마우스를 융합에 사용한다. 희생시켜 비장을 제거하기 전에, 마우스에게 3일간 항원을 정맥내 추가접종한다. 각각의 항원에 대해 2회 내지 3회 융합이 필요할 수 있다. 각각의 항원에 대해 몇 마리의 마우스를 면역화시킨다. 예를 들면, HCO7 및 HCO12 균주의 총 12마리의 HuMAb 마우스를 면역화시킬 수 있다.
모노클로날의 완전한 사람 항-IL-17A 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 코흘러 등에 의해 처음으로 개발된 하이브리도마 기술[문헌 참조; Kohler et al. (1975) (Nature 256:495-497)]; 트리오마 기술(trioma technique)[문헌 참조; Hering et al. (1988) Biomed. Biochim. Acta. 47:211-216 및 Hagiwara et al. (1993) Hum. Antibod. Hybridoma 4:15]; 사람 B-세포 하이브리도마 기술[문헌 참조; Kozbor et al. (1983) Immunology Today 4:72 및 Cote et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030]; 및 EBV-하이브리도마 기술[문헌 참조; Cole et al. (1985) in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96]과 같이 당업계에 통상적으로 공지된 방법으로 제조한다. 바람직하게는, 마우스 비세포를 분리하고 PEG와 함께 표준 프로토콜에 기초하여 마우스 골수종 세포주에 융합시킨다. 이어서, 생성된 하이브리도마를 항원-특이 항체의 생산에 대해 스크리닝할 수 있다. 한 가지 양태에서, 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을 50% PEG와 함께 P3X63-Ag8.653 비분비 마우스 골수종 세포(ATCC, CRL 1580) 수의 1/6에 융합시킨다. 세포를 평편 바닥 미세 역가 플레이트에서 대략 2 x 105 세포/mL로 플레이팅한 다음 20% 태아 클론 혈청(fetal Clone Serum), 18% "653" 컨디셔닝된 배지, 5% 오리겐, 4mM L-글루타민, 1mM 나트륨 피루베이트, 5mM HEPES, 0.055mM 2-머캅토에탄올, 50단위/ml 페니실린, 50mg/ml 스트렙토마이신, 50mg/ml 겐타마이신 및 IX HAT(Sigma; HAT는 융합시킨지 24시간 후에 가한다)를 함유하는 선택 배지에서 2주간 배양한다. 2주 후, HAT가 HT로 대체된 배지에서 배양한다. 이어서, 각각의 웰을 사람 항-IL-17A 모노클로날 IgG 항체에 대해 ELISA로 스크리닝한다. 일단 대규모의 하이브리도마 성장이 일어나면, 통상적으로 10 내지 14일 후에 배지를 관찰한다. 항체 분비 하이브리도마를 재평판 배양하고, 다시 스크리닝하며, 사람 IgG에 대해 여전히 양성인 경우, 항-IL-17A 모노클로날 항체를 희석을 제한함으로써 2회 이상 아클로닝한다. 이어서, 안정한 아클론을 시험관내에서 배양하여 특성화를 위한 조직 배양 배지 중에 소량의 항체를 생성한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항-IL-17A 항체 분자는 (예를 들면, 이. 콜라이(E.coli)/T7 발현 시스템에서) 재조합에 의해 생산한다. 이러한 양태에서, 본 발명의 항체 분자를 암호화하는 핵산(예를 들면, VH 또는 VL)을 pET-계 플라스미드에 삽입하고 이. 콜라이/T7 시스템에서 발현시킨다. 재조합 항체를 제조하는 몇 가지 방법이 당업계에, 예를 들면, 본원에 참고로 인용되어 있는 미국 특허 제4,816,567호에 공지되어 있다. 항체 분자는 또한 CHO 또는 NSO 세포에서 재조합에 의해 생산할 수 있다.
실시예 5
항-IL-17A 모노클로날 항체의 간접 ELISA
rhIL-17A에 대한 항-사람-IL-17A 모노클로날 항체의 결합을 간접 효소-결합된 면역흡착 검정(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)을 사용하여 평가한다. 간략하게 말하면, 고정 농도의 rhIL-17A를 미세 역가 플레이트의 웰에 직접 결합시킨다. 이어서, 검정하고자 하는 모노클로날 항-IL-17A를 rhIL-17A 피복된 플레이트에 가하며, 여기에 항체가 포획되면 이를 정량한다. 보다 상세한 프로토콜은 다음과 같다.
96-웰 U-바닥 MaxiSorp 플레이트를 카보네이트 피복 완충액 중의 50㎕/웰의 rhIL-17A(0.5㎍/ml)로 피복시킨다("검정 플레이트"). 카보네이트 피복 완충액은 2.9g/L NaHCO3, 1.6g/L Na2CO3, pH 9.4이다. 플레이트를 4℃에서 밤새 피복한 채로 배양한다. 스크리닝하고자 하는 모노클로날 항체를, 최종 용적이 60㎕/웰로 되도록 V-바닥 플레이트의 열을 따라 이중으로 일련으로 희석시킨다("일련의 희석 플레이트"). 검정 플레이트를 플레이트 세척기[제품명; SkanWasher, 제조원; 미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 몰레큘러 디바이스(Molecular Devices)] 및 블로팅된 건조기에서 PBS-트윈으로 3회 세척한다. PBS-트윈은 0.5ml/L 트윈 20을 1X PBS에 가하여 수득한다. 일련의 희석 플레이트의 각각의 웰로부터 50㎕를 검정 플레이트로 옮기고 25℃에서 1시간 동안 배양한다. 이차 항체를 희석제(PBS-BSA-트윈, 이것은 1g/L BSA를 갖는 PBS-트윈이다) 속에서 1/2000로 되도록 희석시킨다. 랫트 모노클로날 항체에 대한 이차 항체는 염소 항-랫트 IgG(H+L)-HRP[제조원; 미국 펜실바니아주 웨스트 그로브 소재의 잭슨 임뮤노리서치 래보러토리즈, 인크.(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)]이다. 키메라 및 사람화 모노클로날 항체에 대한 이차 항체는 F(ab')2 염소 항-사람 IgG Fcγ-HRP(제조원; 잭슨 임뮤노리서치 래보러토리즈, 인크.)이다. 검정 플레이트를 이전과 같이 세척한다. 희석된 이차 항체(100㎕/웰)를 검정 플레이트 중의 적합한 웰에 가하고, 플레이트를 25℃에서 45분간 배양한다. 검정 플레이트를 이전과 같이 세척한다. ABTS(100㎕/웰)[제조원; 미국 매릴랜드주 게이더스버그 소재의 키크가드 앤 페리 래보러토리즈(Kirkegaard & Perry Laboratories)]를 가하고, 플레이트를 25℃에서 5 내지 10분간 배양한 다음, 플레이트 판독기(제품명; Versamax, 제조원; 미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 몰레큘러 디바이스)에서 405nm에서 흡광도를 판독하며, 이때 판독하기 전에 5초간 진탕시킨다.
본 발명의 항체 16C10의 다양한 형태에 대한 간접 ELISA 결과가 표 5에 나타나 있다. 결합은 EC50(최대치의 절반의 시그널을 수득하는 데 필요한 항체의 농도)로서 보고된다. 상기 결과는 16C10의 모든 형태에서 결합이 검출됨을 보여준다. 이러한 간접 ELISA 검정이 항-IL-17A 항체의 존재 또는 부재를 신속하게 측정하는 데 유용하기는 하지만, 수득된 EC50 수치는 검정-의존적일 수 있으며, 전형적으로 소정의 항체에 대한 절대 결합 친화도를 평가하는 데에는 사용되지 않는다.
간접 항-IL-17A 항체 ELISA
mAb rhIL-17A(㎍) EC50(pM)
랫트 16C10 0.025 274
키메라 16C10 0.025 157
사람화 16C10 wt 0.025 212
실시예 6
항-IL-17A 모노클로날 항체의 ELISA
rhIL-17A에 대한 항-사람-IL-17A 모노클로날 항체의 결합을 ELISA를 사용하여 다음과 같이 평가한다. 간략하게 말하면, 포획 항체(capture antibody)를 미세 역가 플레이트의 웰에 결합시킨 다음, 고정 농도의 rhIL-17A를 가한다. 이어서, 검정하고자 하는 모노클로날 항-IL-17A를 플레이트 상의 결합된 rhIL-17A에 대해 적정하여 최대치의 절반의 결합을 달성하는 데 필요한 항체의 농도를 측정한다. 보다 상세한 프로토콜은 다음과 같다.
96-웰 미세 역가 플레이트을 카보네이트 피복 완충액 pH 9.5 중의 100㎕/웰의 포획 항체(랫트 항-hIL-17A 12E6, 0.5㎍/ml)으로 피복시킨다("검정 플레이트"). 플레이트를 4℃에서 24 내지 48시간 동안 피복한 채로 배양한다. 검정 플레이트를 플레이트 세척기(제품명; SkanWasher, 제조원; 미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 몰레큘러 디바이스) 및 블로팅된 건조기에서 3회 세척한다. 이어서, 플레이트를 오비탈 진탕기(orbital shaker)에서 25℃에서 1시간 동안 200㎕/웰의 ELISA 검정 완충액(20mM 트리스-HCl, 0.15M NaCl, pH7.4, 0.5% BSA, 0.05% 트윈-20, 2mM EDTA)으로 차단시킨다. 플레이트를 세척하고, 100㎕/웰의 아데노바이러스-기원한 rhIL-17A 또는 이. 콜라이-기원한 사람 IL-17(IL-17A)[제조원; 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재의 알앤디 시스템스(R&D Systems)](0.1㎍/ml)을 ELISA 검정 완충액에 가하고 오비탈 진탕기에서 25℃에서 2시간 동안 배양한다. 플레이트를 세척하고, 스크리닝하고자 하는 모노클로날 항체를 4배 일련 희석을 사용하여 1000ng/ml 내지 0.0813ng/ml 범위로 7개의 웰의 열을 따라 일련으로 희석시킨다. 플레이트를 오비탈 진탕기에서 25℃에서 1.5시간 동안 배양한다. 플레이트를 세척하고, 100㎕/웰의 이차 항체[F(ab')2 염소 항-사람 카파 경쇄-HRP, 1:20,000 희석, 제조원; 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 바이오소스(BioSource)]를 검정 블랭크 웰을 제외하고 가한다. 플레이트를 2회 세척하고(즉, 사이클당 3개 세척기로 2회 사이클), 이때 사이클 사이에 플레이트를 회전시킨다. TMB 기질(제조원; 미국 매릴랜드주 게이더스버그 소재의 키크가드 앤 페리 래보러토리즈)을 100㎕/웰로 가하고, 오비탈 진탕기에서 3 내지 5분간 배양한다. 정지 용액을 가하고(100㎕/웰), 플레이트를 플레이트 판독기(제품명; Versamax, 제조원; 미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 몰레큘러 디바이스)에서 450 내지 570nm에서 흡광도를 판독한다.
본 발명의 항체 16C10의 다양한 형태의 ELISA 결과가 표 6에 나타나 있다. 결합은 EC50(최대치의 절반의 시그널을 수득하는 데 필요한 항체의 농도)로서 보고된다. 상기 결과는 16C10의 모든 형태에서 결합이 검출됨을 보여준다. 오차 범위와 함께 나타낸 값은 표준 편차를 갖는 다중 측정치의 평균을 나타낸다.
항-IL-17A 항체 ELISA
mAb 사람 IL-17A EC50 (pM)
hu 16C10 wt rhIL-17A 66±14
hu 16C10 wt R&D 시스템 130±19
hu 16C10 VH N54A rhIL-17A 75
hu 16C10 VH N54Q rhIL-17A 65
hu 16C10 VH N60A rhIL-17A 63
hu 16C10 VH N60Q rhIL-17A 74
hu 16C10 VH M96L rhIL-17A 66
hu 16C10 VH M96A rhIL-17A 60
hu 16C10 VH M96K rhIL-17A 68
hu 16C10 VH M96F rhIL-17A 125
hu 16C10 VH M100hF rhIL-17A 49
hu 16C10 VH M100hL rhIL-17A 53
hu 16C10 (= VH N54Q/M96A) rhIL-17A 92
hu 16C10 (= VH N54Q/M96A) R&D 시스템 136
hu 16C10 VH 54Q/M96A/M100hF rhIL-17A 80
hu 16C10 VH 54Q/M96A/M100hF R&D 시스템 118
실시예 7
항-사람 IL-17A 항체의 결합 친화도
전기화학발광(ECL) 검정을 사용한 랫트 및 키메라 항-사람 IL-17A 항체의 결합 측정
아이젠 인코포레이티드(IGEN, Inc. 미국 매릴랜드주 게이더스버그 소재)에서 개발된 오리겐 전기화학발광 기술(Origen electrochemiluminescence technology)을 사용하여 FLAG-huIL-17A에 대한 랫트 항-사람 BL-17A 항체(및 한 가지 키메라 항체)의 결합을 측정한다[참조; Elecsys® immunoassay system, Roche Diagnostics (Indianapolis, Indiana, USA)]. 전기화학발광 기술은 안정한 루테늄 금속 킬레이트(Ori-TAG)를 사용하며, 이것은, 트리프로필아민(TPA)의 존재하에서 전압 인가시 전기화학발광을 생성한다. 직경이 마이크론인 상자성 비드(Paramagnetic bead)가 고체상으로서 작용하며 신속한 검정 역학을 촉진시킨다. 비드/복합체를 유동 셀(flow cell)을 통해 전달하고 자기 인가에 의해 전극에서 포획한다. 전압을 인가하고, 생성된 전기화학발광을 측정한다.
ECL 검정은 다음과 같이 수행한다. 검정 완충액 50㎕ 중의 항-사람 IL-17A mAb의 3배 일련 희석을 96웰 미세 역가 플레이트에서 수행하여 제1 웰에 1 내지 3㎍/ml 최종 농도를 제공한다. 검정 완충액 50㎕ 및 50ng/ml의 비오티닐화 FLAG-huIL-17A 50㎕를 각 웰에 가한 다음 OriTag-표지된 염소 항-랫트 IgG(H+L) pAb(450ng/ml에서 50㎕) 또는 항-hIgG mAb(500ng/ml에서 50㎕)를 가한다. 최종적으로, 0.1mg/ml의 오리겐 스트렙트아비딘-디나비드(Origen Streptavidin-Dynabeads) 50㎕를 각 웰에 가한다. 25℃에서 1시간 동안 배양한 후, 플레이트를 Origen M-series M8/384 검정기로 프로세싱한다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어(GraphPad Prism software)[제조원; 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software)]를 사용하여 데이타를 플롯팅하고 곡선아래 면적을 계산하며, 이것이 결합의 개략적인 크기이다.
결과는 표 7에 제시되어 있다(이것은 몇몇 중복 측정을 포함한다). FLAG-huIL-17A에 대한 랫트 16C10의 결합을 보여주는 두 개의 열은 중복 측정을 나타낸다. 표에서 모든 랫트 항-사람 IL-17A 항체(1D1O, 16C10, 30C10, 23E12)는 FLAG-huIL-17A에 결합되며, 키메라 16C10도 마찬가지이다. 모든 4개의 항체 또한 cyno IL-17A에 결합된다. 항체 16C10 및 30C10은 이러한 검정 조건하에서 마우스 IL-17A에 결합되지 않는 반면, 항체 1D10 및 23E12는 결합된다.
ECL에 의해 측정된 항체 결합
mAb 항원 피크 아래 면적
랫트 1D10 FLAG-hu-IL-17A 477474
랫트 16C10 FLAG-hu-IL-17A 285792
랫트 16C10 FLAG-hu-IL-17A 374445
랫트 30C10 FLAG-hu-IL-17A 311752
랫트 23E12 FLAG-hu-IL-17A 285145
키메라 16C10 FLAG-hu-IL-17A 345982
랫트 1D10 cyno IL-17 136497
랫트 16C10 cyno IL-17 151543
랫트 30C10 cyno IL-17 123916
랫트 23E12 cyno IL-17 111242
랫트 1D10 mu IL-17 252121
랫트 1D10 mu IL-17 384999
랫트 16C10 mu IL-17 결합되지 않음
랫트 16C10 mu IL-17 결합되지 않음
랫트 30C10 mu IL-17 결합되지 않음
랫트 30C10 mu IL-17 결합되지 않음
랫트 23E12 mu IL-17 143206
랫트 23E12 mu IL-17 289185
KinExA 기술을 사용한 랫트 및 사람화 항-사람 IL-17A 항체에 대한 평형 해리 상수(Kd)의 측정
항 사람 IL-17A 항체에 대한 평형 해리 상수(Kd)는 KinExA 3000 기기[제조원; 미국 아이다호주 보이즈 소재의 사피다인 인스트루먼츠 인크.(Sapidyne Instruments Inc.)]를 사용하여 측정한다. KinExA는 항체, 항원 및 항체-항원 복합체의 혼합물중 착화되지 않은 항체의 농도를 측정하는 것을 기본으로 하는 역학적 배제 검정(Kinetic Exclusion Assay)의 원리를 이용한다[문헌 참조; Darling and Brault (2004) Assay Drug Dev. Technol. 2(6):647-57]. 유리 항체의 농도는 당해 혼합물을 매우 짧은 기간 동안 고체-상 고정화된 항원에 노출시킴으로써 측정한다. 실제로, 이는 유동 셀에 트래핑된 항원-피복된 입자를 통해 용액상 항원-항체 혼합물을 유동시킴으로써 달성된다. 상기 기기에 의해 생성된 데이타는 통상의 소프트웨어를 사용하여 검정한다. 평형 상수는 다음 추정을 기준으로 하는 수학적 이론을 사용하여 계산한다:
1. 결합은 평형에 대한 가역적인 결합 방정식을 따른다:
Kon[Ab][Ag] = Koff[AbAg](여기서, Kd = Koff/Kon)
2. 항체(Ab) 및 항원(Ag)은 1:1로 결합하며, 총 항체는 항원-항체 복합체(AbAg) + 유리 항체이다.
3. 기기 시그널은 유리 항체 농도에 직선으로 비례한다.
KinExA 검정은 몇 가지 랫트 항-사람 IL-17A 항체, 이의 사람화 변이체 및 이들 사람화된 항체의 서열 변이체에 대해 수행한다. IL-17A는 사람("hu"), 시노몰구스 원숭이("cyno") 또는 마우스("mu")로부터 기원한다. 동일한 종으로부터의 IL-17A를 각각의 KinExA 측정을 위해 고정 상 및 용액 상 둘 다에 사용한다. 폴리(메틸-메타크릴레이트)(PMMA) 입자(98마이크론)를 문헌[참조; Sapidyne "Protocol for coating PMMA particles with biotinylated ligands having short or nonexistent linker arms."]에 따라 사람, cyno 또는 마우스 IL-17A로 피복시킨다. 모든 실험 과정은 KinExA 3000 메뉴얼에 따라 실시한다. 모든 수행은 중복 실시한다. KinExA에 대한 조건은 표 8에 제공되어 있다.
KinExA 조건
IL-17A: 사람, cyno 마우스
샘플 용적: 2ml 4ml
샘플 유속: 0.25ml/분 0.25ml/분
라벨 용적: 1ml 1ml
라벨 유속: 0.25ml/분 0.25ml/분
항체 농도: 0.02-0.1nM 0.1nM
최고 항원 농도: 4nM 64nM(23E12) 4.0nM(1D10)
최저 항원 농도: 1pM 62pM(23E12) 3.9pM(1D10)
항원의 2배 일련 희석물을 제조하고, 일정 농도로 항체와 혼합한다. 혼합물을 평형으로 되도록 25℃에서 2시간 동안 배양한다.
표 9는 KinExA 검정의 결과를 보여준다. KinexA 검정에 대한 몰 농도는 항체 상의 2개의 결합 영역의 존재 및 IL-17A의 이합체 성질을 고려하여 항체에 대한 분자량 75kDa 및 IL-17A에 대한 분자량 15kDa을 기준으로 하여 계산한다. 몇몇 항체의 경우, 항체 및/또는 항원의 배취를 상이하게 하여 반복 실험을 수행하며, 이 경우에는 평균값이 표준 오차와 함께 표 9에 제공된다. 사람화 16C10wt 항체 및 모 랫트 16C10 항체에 대한 결합 상수는 대략 5 내지 10pM으로 유사하며, 이것은 사람화가 사람 IL-17A에 대한 모 랫트 16C10의 높은 친화도를 상당히 감소시키지 않았음을 보여준다. 최종 사람화 16C10 항체를 포함한(랫트 16C10와 비교하여 N54Q 및 M96A 치환을 갖는), 각종 아미노산 치환(N54Q, M96A, M10OhF)을 삽입한 사람화 16C10을 또한 검정하며, 1 내지 10pM 범위의 유사하게 높은 결합 상수를 갖는 것으로 나타났다. 결합된 hu 16C10의 Fab 단편은 완전 항체와 비교하여 높은 친화도(16pM)를 보유한다. 본 발명의 또 다른 항체(랫트 1D10, 랫트 23E12, 랫트 30C10) 또한 높은 친화도로 FLAG-huIL-17A 및 cyno IL-17A에 결합된다. 랫트 1D10은 사람 및 cyno IL-17A에 대한 친화도와 유사하게 10pM 친화도로 마우스에 결합되지만, 랫트 23E12는 마우스 IL-17A에 대해 200-2000 더 낮은 친화도를 갖는다(7000pM). 항체 16C10 및 30C10은 마우스 IL-17A에 결합되지 않는다(데이타에 나타내지 않음).
KinExA에 의해 측정된 Kd 값
mAb 항원 Kd(pM)
랫트 16C10 rh IL-17A 6.0
랫트 16C10 FLAG-huIL-17A 3.6
hu 16C10 wt rh IL-17A 8.8±3.0
hu 16C10 [= VH N54Q/M96A] rh IL-17A 3.9±2.7
hu 16C10 Fab rh IL-17A 16.1
hu 16C10 VH N54A rh IL-17A 10.8
hu 16C10 VH N54Q rh IL-17A 7.0
hu 16C10 VH M96A rh IL-17A 9.9
hu 16C10 N54Q/M96A/M100hF rh IL-17A 10.0
랫트 1D10 FLAG-huIL-17A 1.7
랫트 22E12 FLAG-huIL-17A 2.8
랫트 30C10 FLAG-huIL-17A 11.0
랫트 1D10 cyno IL-17A 9.8
랫트 23E12 cyno IL-17A 28.0
랫트 30C10 cyno IL-17A 32.6
랫트 16C10 cyno IL-17A 1.7
hu 16C10 cyno IL-17A 16.3
랫트 1D10 mu IL-17A 10.3
랫트 23E12 mu IL-17A 7,000
당업계에 공지된 다른 방법, 예를 들면, Biacore® 표면 플라스몬 공명 분광검정법을 사용하여 본 발명의 항체의 친화도를 측정할 수 있다. Biacore® 검정을 본 발명의 몇 가지 항체에 대해 수행하였지만, 결합 친화도가 일반적으로 너무 높아서 정확하게 측정할 수 없었으며, 구체적으로, 해리 속도가 너무 느려 이 방법으로 측정할 수 없었다. 그러나, 이러한 검정은 보다 빠른 해리 속도 상수를 갖는 항-IL-17A 항체 또는 저-친화도 항-IL-17A 항체를 검정하는 데 사용할 수 있다.
실시예 8
항-IL-17A 항체에 대한 윤활막 세포 검정
IL-17A(rhIL-17A 또는 천연의 huIL-17A)의 생물학적 활성을 차단하는 본 발명의 항-IL-17A 항체의 능력은 사람 윤활막 세포의 1차 배양액에서 IL-6 및 IL-8의 IL-17A-유도된 발현을 모니터링함으로써 다음과 같이 측정한다. 윤활막 세포를 인공슬관절 환자로부터 입수한 류마티스 관절염 윤활막의 콜라게나제 분해에 의해 분리한다. 윤활막 세포를 성장 배지(DMEM, 10% BCS, 1X Pen-Strep(50IU/ml 페니실린, 55㎍/ml 스트렙토마이신), 1X 베타-머캅토에탄올(50μM), 1X 글루타민(20mM), 25mM HEPES)에 연속 통과시켜 보강시키고, 3회 통과 횟수에서 동결시키며, 액체 질소에 저장한다. 검정에 사용하기 위해 준비하는 경우, 세포의 바이알을 해동시키고, 평판배양하고, 세포를 거의 합치점(confluence)까지 성장되도록 한다. 이어서, 세포를 트립신/EDTA를 사용하여 보다 큰 플라스크로 1:2로 통과시킨다. 충분한 세포가 퍼지면, 세포를 트립신처리하고, 96웰 또는 48웰 플레이트로 평판배양하며, 총 합류점까지 성장하도록 함으로써 실험을 개시한다.
IL-17A를 120ng/ml로, 즉 30ng/ml(1nM)의 최종 농도의 4배로 되도록 희석시킨다. IL-17A는 사람(rhTL-17A 및 천연의 huIL-17A) 또는 비-사람 영장류, 이 경우, 시노몰구스 원숭이(cyno)로부터의 것이다. 4X IL-17A 스톡 100㎕ 및 300㎕ 분취량을 비어있는 96웰 및 48웰 플레이트에 각각 가한다.
검정하고자 하는 항-IL-17A 항체를 성장 배지 속에서 실험에서 시험하고자 하는 최대 농도의 4배로 되도록 희석시킨다. 4X 항-IL-17A 스톡을 검정의 동적 억제 범위를 포괄하도록 1:2로 일련 희석시킨다. 일련 희석된 항체 샘플(모두 4X 이들의 최대 농도이다) 각각을 비어있는 플레이트 속에서 4X IL-17A 용액과 1:1로 혼합하여 IL-17A와 항-IL-17A 항체 둘 다의 2X 농도를 갖는 혼합물을 생성한다. 이들 혼합물을 조직 배양액 배양기 속에서 4시간 이상 동안 37℃에서 평형화되도록 한다.
배지를 유착 융합성 윤활막 세포로부터 제거하고 100㎕(96웰 플레이트) 또는 200㎕(48-웰 플레이트)의 성장 배지로 대체한다. 등용적의 2X 리간드/2X 항체 용액을 윤활막 세포에 가하여 1X IL-17A(30ng/ml 최종) 및 1X 항체를 수득한다. 각각의 웰(데이타 포인트)은 중복 수행한다. 윤활막 세포를 3일간 활성화(즉, IL-17A/항체 혼합물에 노출)시키고, 이 시점에서 상층액을 96웰 플레이트로 옮기며, 임의로 동결시키고, 검정할 때까지 -80℃에서 저장한다. 상층액을 함유한 미세 역가 플레이트을 해동시키고, 각각의 용액을 성장 배지를 사용하여 1:10으로 희석시킨다. 상층액을 Luminex 비드 쌍[제조원; 미국 버지니아주 샤롯테스빌 소재의 업스테이트(Upstate)]을 사용하여 제조업자의 지침에 따라 IL-6 및 IL-8에 대해 검정한다.
결과가 표 10(IL-6) 및 11(IL-8)에 제공되어 있다. 오차 범위와 함께 제시된 값은 다중 측정치의 평균과 표준 편차를 나타낸다. 원래의 랫트 CDR을 갖는 16C10의 사람화 형태("hu16C10 (wt)") 및 중쇄 CDR에 1, 2 또는 3개의 변화를 갖는 몇 가지 변이체(일반적으로 "hu16C10 X##Z", 여기서, X는 hu16C10 (wt)의 중쇄에서 잔기 ##에서의 아미노산이고, Z는 새로운 아미노산이다)를 포함한, 항체 16C10의 다양한 형태에 대한 결과가 나타나 있다. "NHP IL-17A"는 비-사람 영장류-기원한 IL-17A, 이 경우 시노몰구스 원숭이 IL-17A이다. "천연형 huIL-17A"는 전구체 단백질이 천연 시그널 서열을 사용하여 생성되는 경우에 생산되는 성숙한 huIL-17A를 나타내며, 2개의 N-말단 아미노산의 부재에 의해 rhIL-17A와는 상이하다. 농도 및 IC50 값은 ng/ml로 표현되지만, pM 단위로 표현될 수 있다. 예를 들면, 30ng/ml rhIL-17A는 1000pM(MW = 30kDa)에 상응하고, 70ng/ml 항-IL-17A 항체는 대략 470pM(MW =150 kDa)에 상응한다.
윤활막 세포 IL-6 생산에 의해 측정된 항-IL-17A의 IC50(ng/ml)
항체 rhIL-17A (30ng/ml) NHP IL-17A (30ng/ml) 천연형 huIL-17A (10ng/ml)
랫트 1D10 105±28 65±15 25
랫트 16C10 63±7 60±10
hu16C10(wt) 80±10 -
hu16C10(N54A) 60 -
hu16C10(N54Q) 60 -
hu16C10(M96A) 60 -
hu16C10(M96K) 60 -
hu16C10(M100hF) 70 -
hu16C10 (N54Q/M96A) 70±8 70±0 25
hu16C10 (N54Q/M96A/M100hF) 70 -
윤활막 세포 IL-8 생산에 의해 측정된 항-IL-17A의 IC50(ng/ml)
항체 rhIL-17A (30ng/ml) NHP IL-17A (30ng/ml) 천연형 huIL-17A (10ng/ml)
랫트 1D10 59±41 38±13 40
랫트 16C10 38±14 33±8
hu16C10(wt) 42±16 -
hu16C10(N54A) 25 -
hu16C10(N54Q) 25 -
hu16C10(M96A) 25 -
hu16C10(M96K) 25 -
hu16C10(M100hF) 50 -
hu16C10 (N54Q/M96A) 38±10 38±13 50
hu16C10 (N54Q/M96A/M100hF) 40 -
실시예 9
항-IL-17A 항체에 대한 NHDF 검정
IL-17A의 생물학적 활성을 차단하는 본 발명의 항-IL-17A 항체의 능력은 정상 사람(성인) 피부 섬유모세포(NHDF) 일차 세포주에서 IL-6의 rhIL-17A-유도된 발현을 모니터링함으로써 측정한다. 간략하게 말하면, 검정하고자 하는 다양한 농도의 항-IL-17A 항체를 rhIL-17A와 함께 배양한 다음, 생성된 혼합물을 NHDF 세포의 배양액에 가한다. 그후, IL-6 생산을 IL-17A 활성을 억제하는 해당 항체의 능력의 척도로서 측정한다. 보다 상세한 프로토콜은 다음과 같다.
관심있는 항-IL-17A 항체의 일련의 2배 희석물을, 40㎍/ml의 스톡 용액으로부터 출발하여 (이중으로) 제조한다. rhIL-17A의 스톡 용액을 120ng/ml로 제조한다. rhIL-17A 스톡 용액 70㎕를 미세 역가 플레이트의 웰에서 항-IL-17A 항체 희석물 70㎕와 혼합하고 실온에서 20분 동안 배양한다. 이어서, 이러한 혼합물 각 100㎕를, 전날 밤에 1XlO4 NHDF 세포/웰(100㎕)로 접종된 미세 역가 플레이트의 웰에 가하고, 37℃에서 배양한다. NHDF 세포(4회 통과)는 캄브렉스 바이오 사이언스(Cambrex Bio Science, 미국 매릴랜드주 발티모어 소재)로부터 입수한다. 수득된 rhIL-17A의 최종 농도는 30ng/ml(1nM)이며, 항체 범위는 10㎍/ml로부터 2배 간격으로 하향한다. 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 상층액을 수거하고 IL-6 ELISA에서 사용하기 위해 50㎕를 제거한다.
사람 IL-6의 검출을 위한 ELISA는 다음과 같이 수행한다. 시약은 일반적으로 알앤디 시스템스(R&D Systems, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)로부터 입수한다. hIL-6 포획 항체(50㎕/웰의 4㎍/ml 용액)를 미세 역가 플레이트의 웰로 옮기고, 이것을 밀봉하여 4℃에서 밤새 배양한다. 플레이트를 3회 세척한 다음 1시간 이상 동안 차단 완충액 100㎕/웰로 차단시킨다. 이어서, 플레이트를 다시 3회 세척한다. 실험 샘플(배양물 상층액 50㎕) 및 대조군(IL-6 단백질의 일련의 희석물)을 50㎕로 웰에 가하고, 2시간 동안 배양한다. 플레이트를 3회 세척하고, 50㎕/웰의 비오티닐화 항-IL-6 검출 항체(300ng/ml)를 가한다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양하고, 3회 세척하고, 100㎕/웰의 스트렙트아비딘 HRP를 가하여 20분 동안 배양한다. 플레이트를 다시 세척하고, ABTS(제조원; BioSource, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 가하며(100㎕/웰), 20분 동안 배양한다. 정지 용액을 가하고(100㎕/웰), 405nm에서 흡광도를 측정한다.
관심있는 항-IL-17A 항체의 IC50는 rhIL-17A-유도된 IL-6 생산도를 첨가된 항-IL-17A 항체의 부재하에서 관찰되는 수준의 50%로 감소시키는 데 필요한 항체의 농도이다.
결과는 표 12에 제공되어 있다.
NHDF 세포에서의 IL-6 생산의 항-IL-17A 항체 억제
항체 rhIL-17A IC50(nM) cyno IL-17A IC50(nM)
랫트 4C3 0.5 0.2
랫트 16C10 0.5 0.2
랫트 30C10 0.5 0.2
랫트 6C3 0.8 0.2
랫트 1D10 1 0.4
랫트 8G9 1 0.4
랫트 12B12 1 0.4
랫트18H6 1 0.3
23E12 1 0.3
29G3 1.5 2
29H1 1.5 0.5
12E6 >70 >70
실시예 10
포피 섬유모세포 검정 항-IL-17A 항체
IL-17A의 생물학적 활성을 차단하는 본 발명의 항-IL-17A 항체의 능력은 HS68 포피 섬유모세포 세포주에서 IL-6의 rhIL-17A-유도된 발현을 모니터링함으로써 측정한다. rhIL-17A에 대한 반응으로 감소된 IL-6 생산이 본 발명의 항-IL-17A 항체에 의한 차단 활성의 척도로서 사용된다.
섬유모세포 세포주의 패널에서의 IL-17RC(IL-17A 수용체)의 발현을 검정하여 잠재적인 IL-17A 반응성 세포주로서 사람 포피 섬유모세포 세포주 HS68(ATCC CRL1635)을 동정하였다. 이것은 폴리클로날 염소 항-사람 IL-17R 항체(제조원; 알앤디 시스템스, 미국 매릴랜드주 게이더스버그 소재)에 이어 피코에리트린(phycoerythrin) (PE)-F(ab')2 당나귀 항-염소 IgG(제조원; 미국 펜실바니아주 웨스트 그로브 소재의 잭슨 임뮤노리서치 래보러토리즈, 인크.)를 사용하여 간접 면역형광염색을 수행하고 PE 면역형광 시그널을 유동세포측정기(flow cytometer)[제품명; FACScan, 제조원; 미국 뉴 저지주 프랭클린 레이크스 소재의 벡톤-딕킨슨(Becton-Dickinson)]에서 분석함으로써 확인된다. 모델의 추가의 확인으로서, IL-17A(둘 다 아데노바이러스-기원한 rhIL-17A 및 시판 이. 콜라이-기원한 IL-17A, 제조원; 알앤디 시스템스)가, EC50이 5 내지 10ng/ml인 HS68 세포에서의 IL-6의 투여량-반응성 유도를 유도하며, 여기서, 유도는 시판 폴리클로날 및 모노클로날 항-IL-17A 항체(제조원; 알앤디 시스템스)와 예비배양함으로써 차단된다.
IL-17A 억제 검정은 다음과 같이 수행한다. HS68 세포(대략 2 X 106 세포)의 합치성 T-75 플라스크를 Ca++ 및 Mg++가 없는 둘베코 PBS로 세척한 다음 5% CO2에서 배양기 속에서 37℃에서 2 내지 5분간 세포 해리 배지[제조원; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)] 5ml와 함께 배양한다. 이어서, 세포를 조직 배양액(TC) 배지 5ml를 사용하여 수거하고 1000rpm에서 5분간 원심분리한다. TC 배지는 둘베코 개질된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(글루타민 포함), 10% 열-불활성화된 태아 소 혈청(Hyclone), 10mM Hepes, 1mM 나트륨 피루베이트, 페니실린 및 스트렙토마이신이다. 세포를 TC 배지 2ml에 재현탁시키고, 트리판 블루로 1:1로 희석시켜 계수한다. 세포 농도를 TC 배지 속에서 1 X 105 세포/ml로 조절하고, 0.1ml/웰을 TC 배지 0.1ml를 함유하는 평판 플레이트의 웰에 분취한다. 세포를 밤새 성장시키고, 상층액을 흡인시키며, 세포를 신선한 TC 배지 0.2ml로 세척한다.
검정하고자 하는 항-IL-17A 항체를 2배 또는 3배 단계로 일련으로 희석시켜, IL-17A 억제 검정에서 1 내지 0.001㎍/ml의 최종 항체 농도를 생성하는 데 사용될 수 있는 일련의 스톡 용액을 제공한다. 랫트 IgG 대조군을 각 검정에 사용할 뿐만 아니라 배지-단독 샘플을 HS68 세포에서의 자발적 IL-6 생산을 측정하기 위한 대조군으로서 사용한다. TC 배지를 HS68 세포를 함유하는 플레이트의 웰로부터 흡인시킨다. 20ng/ml rhIL-17A 0.1ml를 가하기 전에, 분취량의 다양한 농도의 항-IL-17A 항체(각각 0.1ml)를 웰 속에서 HS68 세포와 함께 37℃에서 5분간 예비배양하여, 10ng/ml(IL-17A 이합체 대략 330pM)의 rhIL-17A의 최종 농도를 제공한다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 상층액(50 내지 100㎕)을 수거하여, 예를 들면, 사람 IL-6 ELISA 키트(제조원; Pharmingen(OptEIA - BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey, USA))를 사용하여 IL-6에 대해 검정한다.
포피 섬유모세포 IL-17A 억제 검정에서 본 발명의 몇가지 랫트 항-사람 IL-17A 항체에 대한 결과가 표 13에 제공되어 있다.
포피 섬유모세포 검정
항-IL-17A 항체 IC50(pM)
랫트 16C10 67
랫트 1D10 65
랫트 8G9 29
랫트 29H1 247
랫트 29G3 63
랫트 23E12 126
랫트 6C3 192
랫트 4C2 107
랫트 1gG1 결합되지 않음
실시예 11
Ba/F3-hIL-17Rc-mGCSFR 증식 검정
IL-17A의 생물학적 활성을 차단하는 본 발명의 항-IL-17A 항체의 능력은 IL-17A 자극에 반응하여 증식하도록 가공된 세포주의 rhIL-17A-유도된 증식을 모니터링함으로써 측정한다. 구체적으로, Ba/F3 세포주(IL-3 의존성 쥐 pro-B 세포)를, 마우스 과립구 콜로니-자극 인자 수용체(GCSFR)의 세포질 영역 및 막통과(transmembrane) 도메인에 융합된 사람 IL-17A 수용체(hIL-17RC)의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질을 발현하도록 변형시킨다. 생성된 세포주를 본원에서 Ba/F3 hIL-17Rc-mGCSFR이라고 한다. 세포외 DL-17RC 도메인에 대한 동종이합체성 IL-17A의 결합은 hIL-17Rc-mGCFR 융합 단백질 수용체의 이합체화를 야기하며, 이것이 이들의 mGCSFR 세포질 도메인을 통해 Ba/F3 세포의 증식을 신호한다. 이러한 세포는 IL-17A에 반응하여 증식하므로, 항-IL-17A 항체와 같은 IL-17A 억제제에 대한 편리한 검정을 제공한다.
IL-17A 자극에 대한 Ba/F3-hIL-17Rc-mGCSFR 증식 검정의 민감도로 인해 강하고 용이하게 측정 가능한 증식 반응을 여전히 유지하면서 다른 검정에 비해 상대적으로 낮은 농도의 rhIL-17A(예를 들면, 3ng/ml, 100pM)에서 실험을 수행할 수 있다. 이것은, 검정에서 rhIL-17A를 능가하는 몰 과량을 달성하는 데 보다 낮은 농도의 항-IL-17A 항체가 요구됨을 의미한다. 보다 낮은 항체 농도에서 실험을 수행함으로써, 달리 구분할 수 없는 고친화도 항체와 식별할 수 있다(즉, 실험을 플래토(plateau)가 아니라 항체-IL-17A 결합 곡선의 직선 범위에 더 가깝게 수행할 수 있다).
작용 스톡 농도로 희석시킨 후, 실험 샘플에 첨가하기 전에 항체 및 IL-17A를 0.22㎛ 필터를 통해 여과한다. 4개 세트의 샘플을 96웰 평편 바닥 조직 배양 플레이트의 열을 가로질러 중복으로 준비한다. 당해 실시예에서 사용되는 바와 같이, 성장 배지는 RPMI 1640 w/Glutamax[제조원; 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐(Invitrogen)], 55μm 2-머캅토에탄올, 10% 포뮬라 공급된 송아지 혈청[제조원; 미국 캘리포니아주 산타 아나 소재의 어빈 사이언티픽(Irvine Scientific)], 50㎍/mL 젠타마이신, 2㎍/mL 푸로마이신 및 10ng/mL mIL-3이고, 생검정 배지는 푸로마이신 및 mIL-3이 없는 것을 제외하고는 성장 배지와 동일하다. 당해 실시예에서 모든 일련의 희석물은 생검정 배지로 제조한다.
하기 실험 샘플(75㎕)을 제조한다: 1) 성장 배지(10ng/ml mIL-3 포함)의 일련의 희석물; 2) rhIL-17A의 일련의 희석물; 3) "항체-비함유" 대조군을 포함한, 3ng/ml IL-17A(세포를 가한 후의 최종 농도)와 혼합된 본 발명의 항-IL-17A 항체의 일련의 희석물; 및 4) 항체, IL-17A 또는 mIL-3이 첨가되지 않은 "세포 단독" 대조군. 이어서, Ba/F3 hIL-17Rc-mGCSFR 세포(7500세포/웰)를 가하여 총 용적이 100㎕/웰로 되도록 하고, 플레이트를 약 40시간 동안 37℃/5% CO2 속에서 배양한다. AlamarBlue® 지시제 염료(11㎕/웰)를 가하고, 플레이트를 37℃/5% CO2 속에서 6 내지 8시간 동안 배양한다. 이어서, 플레이트를 570nm 및 600nm에서의 흡광도의 차에 대해 판독한다. 비선형 피트/S자형 투여량-반응(sigmoidal dose-response)/가변 기울기를 사용하여 IC50 값을 결정한다.
Ba/F3 hIL-17Rc-mGCSFR 증식 검정의 결과가 표 14에 제공되어 있다.
Ba/F3 hIL-17Rc-mGCSFR 증식 검정
mAb IL-17A [rhIL-17A](pM) IC50(pM)
랫트 16C10 사람 100 20±8
랫트 16C10 사람 276 162
랫트 16C10 cyno 100 27
키메라 16C10 사람 100 29
hu 16C10 사람 100 15±2
hu 16C10 VH N54Q/M96A 사람 100 13
hu 16C10 사람 100 27
hu 16C10 사람 276 149
hu 16C10 cyno 100 17
hu 16C10 N54Q/M96A/M100hF 사람 100 11
랫트 1D10 사람 276 223
랫트 1D10 cyno 100 19
랫트 29H1 사람 28 ≥30
랫트 4H12 사람 28 ≥400
랫트 29G3 사람 28 ≥400
실시예 12
항-IL-17A 항체의 교차-차단
본 발명의 상이한 항-IL-17A 항체를, 둘 이상의 항체가 하나의 IL-17A 단량체에 동시에 결합할 수 있는 충분히 독특한 에피토프를 포함하여, 동일한 에피토프, 중첩된 에피토프 또는 중첩되지 않은 에피토프에 결합시킬 수 있다. 수용체 결합에 중요한 IL-17A의 부분에 결합된 항체는 IL-17A의 수용체-매개된 생물학적 활성을 차단할 것이다. 이러한 항체를 본원에서는 "중화 항체"라고 한다. 결합하지만 수용체 결합을 차단하지 않는 항체는 비-중화 항체라고 한다.
IL-17A 및 항-IL-17A 항체에 대해 실험을 실시하는 경우, 예를 들면, 샌드위치 ELISA에 의해 샘플 중의 IL-17A(또는 항-IL-17A)의 수준을 측정하는 것이 유용하다(실시예 6 참조). 한 가지 포맷에서, IL-17A ELISA는 미세 역가 플레이트의 웰을 포획 항체로 피복시키고, 가능하게는 IL-17A를 함유하는 실험 샘플을 첨가하며, 검출 항체를 결합시킴을 포함한다. 포획 항체 및 검출 항체는 IL-17A에 동시에 결합할 수 있어야 한다.
유사한 검정을 사용하여 항-IL-17A 항체의 수준을 측정할 수 있으며, 여기서, IL-17A의 표준 용액을 포획 항체로 피복된 웰에 결합시킨 다음, 가능하게는 항-IL-17A 항체를 함유하는 실험 샘플을 가하고, 이차 검출 항체(예를 들면, 본 발명의 IgG 사람화된 항체의 경우 항-사람 IgG 항체)를 결합시킨다. IL-17A 샌드위치 ELISA에서와 같이, 포획 항체는 검정하고자 하는 항체의 결합을 방해하지 않아야 한다.
당해 실시예에 요약된 ELISA 실험에서 사용하기에 바람직한 항체의 쌍은 교차-차단 실험을 실시함으로써 결정할 수 있다. 교차 차단 실험에서, 제1 항체를 미세 역가 플레이트의 웰에 피복한다. 이어서, 비오티닐화된 이차 항체를 IL-17A와 혼합하고 결합되도록 한 다음 혼합물을 피복된 웰에 가하여 배양한다. 비오티닐화된 이차 항체를 다양한 농도로 가하여(즉, 적정하여), 적어도 일부의 샘플에서 항체가 동종이합체성 IL-17A의 2배(또는 그 이상) 몰 과량으로 존재하도록 한다. 이어서, 플레이트를 세척하고, 웰에 결합된 비오티닐화된 이차 항체의 존재 또는 부재에 대해 표준방법으로 측정한다.
두 개의 항체가 교차-차단되는 경우, 이차 항-IL-17A 항체를 함유하지 않는(또는 동형 대조물을 함유하는) 대조 샘플과 비교하여 이차 항-IL-17A 항체의 존재하에서 플레이트로의 시그널(IL-17A 결합)이 감소할 것이다. 교차-차단되지 않는 항체의 쌍을, 예를 들면, 샌드위치 ELISA와 같은 검정에서 함께 사용할 수 있다. IL-17A의 이합체 성질로 인해 특정 포맷(예를 들면, 검출 항체를 첨가하기 전에 플레이트 위에서 IL-17A가 포획 항체에 결합되는 경우)에서 ELISA에서 교차-차단 항체의 쌍을 사용할 수 있지만, 항체의 비-교차-차단 쌍이 일반적으로 바람직하다.
본 발명의 몇 가지 항-IL-17A 항체(클론 4C3, 6C3, 8G9, 12E6, 16C10, 18H6, 23E12, 29H1, 30C1O, 1D1O, 21B12, 29G3)를 교차-차단에 대해 쌍방향(pairwise) 시험한다. 29G3/1D1O 및 29G3/21B12를 제외한 모든 쌍이 교차-차단되었고, 이에 따라 이러한 항체 쌍을 ELISA에 사용할 수 있다. ELISA에서 사용할 수 있는 항-IL-17A 항체의 쌍을 동정하는 이외에, 이러한 결과는, 항체 29G3에 의해 결합된 에피토프가 항체 1D1O 및 21B12에 의해 결합된 에피토프(들)와는 기능적으로 또는 물리적으로 구분된다는 것을 보여준다. 이러한 데이타는 또한 1D1O 및 21B12에 대한 에피토프가 16C10에 대한 에피토프와 중첩되지만 이와 동일한 것은 아님을 입증한다.
기능적으로 구별되는 에피토프에 결합되는 이러한 항-IL-17A 항체의 쌍은, 예를 들면, 항-IL-17A 면역조직화학(immunohistochemistry; IHC)을 입증하는 데 유용하다. 예를 들면, 조직 샘플이 기능적으로 구별되는 에피토프에 결합한 두 개의 상이한 항-IL-17A 항체로 실시한 IHC에서 동일한 패턴의 IL-17A 발현을 나타내는 경우, 검정은 조직 샘플에서 몇 가지 다른 가성(spurious) 가교-결합 단백질 보다는 IL-17A를 검출할 가능성이 훨씬 더 크다.
이러한 비-교차-차단 항체의 쌍은, 예를 들면, 항-IL-17A 항체 치료요법을 받고 있는 환자로부터의 샘플에서 치료학적 항-IL-17A 항체의 존재하에 IL-17A의 검출을 위한 ELISA를 고안하는 데 유용하며, 여기서, 과량의 치료학적 항-IL-17A 항체의 존재는, ELISA 항체가 치료학적 항체를 비-교차-차단하지 않는 한, 항-IL-17A ELISA에 의한 검출을 차단할 것이다.
실시예 13
항-IL-17A 항체를 사용한 유전자 치료요법
본 발명의 항-IL-17A 항체는 또한 유전자 치료요법으로 대상체에 투여할 수 있다. 유전자 치료요법에서, 대상체의 세포를 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산으로 형질전환시킨다. 이후, 핵산을 포함하는 대상체가 항체 분자[인트라바디(intrabody)]를 내인적으로 생산할 것이다. 예를 들면, 알바레즈 등(Alvarez et al.)은 유전자 치료요법을 사용하여 대상체에 일본쇄 항-ErbB2 항체를 도입하였다[문헌 참조; Alvarez et al. (2000) Clinical Cancer Research 6:3081-3087]. 알바레즈 등에 의해 기재된 방법은 본 발명의 항-IL-17A 항체 분자를 암호화하는 핵산을 대상체에 도입하는 데 용이하게 채택될 수 있다. 한 가지 양태에서, 유전자 치료요법에 의해 도입된 항체 분자는 완전한 사람, 일본쇄 항체이다.
본원에 기재된 유전자 치료요법은, 장기간 유전자 발현이 달성되는 한, 치료를 단지 1회 또는 기껏 제한된 횟수로 수행할 필요가 있다는 잠재적인 잇점을 갖는다. 이것은 대상체에서 적당한 치료학적 수준을 유지하기 위해 정기적으로 반복해야 하는 항체 투여와는 대조된다.
핵산은 당업계에 공지된 방법으로 대상체의 세포에 도입할 수 있다. 몇몇 양태에서, 핵산은 바이러스성 벡터의 일부로서 도입된다. 벡터가 기원할 수 있는 바이러스의 예는 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(adeno-associated viruse; AAV), 백시니아 바이러스, 바쿨로바이러스, 알파바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 목적하는 세포 추향성(cellular tropism)을 갖는 기타의 재조합 바이러스를 포함한다. 다양한 회사들이 바이러스 벡터를 시판하고 있으며, 예를 들면, 아비겐 인코포레이티드(Avigen, Inc.)(캘리포니아주 알라메다 소재; AAV 벡터); 셀 제네시스(Cell Genesys)(캘리포니아주 포스터 시티 소재; 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV 벡터 및 렌티바이러스 벡터); 클론테크(Clontech)(레트로바이러스 및 바쿨로바이러스 벡터); 제노보, 인코포레이티드(Genovo, Inc.)(필라델피아주 샤론 힐 소재; 아데노바이러스 및 AAV 벡터); 젠벡(Genvec)(아데노바이러스 벡터); 인그로젠(IngroGene)(네덜란드 라이텐 소재; 아데노바이러스 벡터); 몰레큘러 메디신(Molecular Medicine)(레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV 및 헤르페스 바이러스 벡터); 노르겐(Norgen)(아데노바이러스 벡터); 옥스포드 바이오메디카(Oxford BioMedica)(역국 옥스포드 소재; 렌티바이러스 벡터); 및 트랜스젠(Transgene)(프랑스 스트라스부르크 소재; 아데노바이러스, 백시니아, 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터)이 있다.
바이러스 벡터의 작제방법 및 사용방법은 당업계에 공지되어 있다[문헌 참조; Miller et al. (1992) BioTechniques 7:980-990]. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 복제 결함(자발적으로 복제할 수 없음)이 있으며, 이에 따라 표적 세포에 전염성이 없다. 바람직하게는, 복제 결함 바이러스는 바이러스 입자를 생산하기 위해 게놈을 캡시드화(encapsidation)하는 데 필요한 이의 게놈의 서열만을 보유하는 극소형 바이러스이다. 전적으로 또는 거의 전적으로 바이러스 유전자가 결여된 결함 바이러스가 가장 바람직하다. 결함 바이러스 벡터의 사용은, 벡터가 다른 세포를 감염시키는 염려없이 특정의 국소화된 영역에서 세포에 투여할 수 있어 조직-특이적 표적화를 가능케 한다[문헌 참조; Kanno et al. (1999) Cancer Gen. Ther. 6:147-154; Kaplitt et al. (1997) J. Neurosci. Meth. 71:125-132; 및 Kaplitt et al. (1994) J. Neuro-Onc. 19:137-142].
아데노바이러스는 각종 세포 유형으로 본 발명의 핵산을 효율적으로 전달하도록 변형될 수 있는 진핵세포 DNA 바이러스이다. 약독화 아데노바이러스 벡터, 예를 들면, 문헌[참조; Stratford-Perricaudet et al. (1992) (J. Clin. Invest. 90:626-630)]에 기재된 벡터가 몇몇 경우에 바람직하다. 각종 복제 결함 아데노바이러스 및 극소형 아데노바이러스 벡터가 기재되어 있다(PCT 공보 제WO94/26914호, 제WO94/28938호, 제WO94/28152호, 제WO94/12649호, 제WO95/02697호 및 제WO96/22378호). 본 발명의 복제 결함 재조합 아데노바이스는 당업계의 숙련가들에게 공지된 기술로 제조할 수 있다[문헌 참조; Levrero et al. (1991) Gene 101:195; EP 185573; Graham (1984) EMBO J. 3:2917; Graham et al. (1977) J. Gen. Virol 36:59].
아데노-관련 바이러스(AAV)는, 안정하고 영역-특이적인 방식으로 이들이 감염시키는 세포의 게놈으로 통합될 수 있는 비교적 작은 크기의 DNA 바이러스이다. 이들은 세포 성장, 형태 또는 분화에 대한 효과를 유도하지 않으면서 광범위한 세포를 감염시킬 수 있으며, 사람 병리상태에는 관련되지 않는 것으로 보인다. 시험관내 및 생체내에서 유전자를 전달하기 위해 AAV-유도된 벡터를 사용하는 것은 문헌[참조; Donsante et al. (2001) Gene Ther. 8:1343-1346; Larson et al. (2001) Adv. Exp. Med. Bio. 489:45-57; PCT 공보 제WO91/18088호 및 제WO93/09239호; 미국 특허 제4,797,368호 및 제5,139,941호; 및 제EP 488528B1호]에 기재되어 있다.
또 다른 양태에서, 유전자는, 예를 들면, 미국 특허 제5,399,346호, 제4,650,764호, 제4,980,289호 및 제5,124,263호; 문헌[참조; Mann et al. (1983) Cell 33:153; Markowitz et al. (1988) J. Virol. 62:1120]; 제EP 453242호 및 제EP178220호에 기재된 바와 같이, 레트로바이러스 벡터에 도입될 수 있다. 레트로바이러스는 분화 세포를 감염시키는 통합 바이러스이다.
렌티바이러스 벡터는 뇌, 망막, 근육, 간 및 혈액을 포함한 몇 가지 조직 유형에서 본 발명의 항체 분자를 암호화하는 헥산의 직접 전달 및 지속성 발현을 위한 제제로서 사용될 수 있다. 벡터는 이러한 조직에서 분화 세포 및 비분화 세포를 효율적으로 변환시키고 항체 분자의 장기간 발현을 유지할 수 있다. 검토를 위해 문헌[참조; Zufferey et al. (1998) J. Virol. 72:9873-80 및 Kafri et al. (2001) Curr. Opin. Mol. Ther. 3:316-326]을 참조한다. 렌티바이러스 패키징 세포주가 이용 가능하고 당업계에 일반적으로 공지되어 있으며, 이것은 유전자 치료요법을 위한 고-역가(high-titer) 렌티바이러스 벡터의 생산을 촉진시킨다. 예는 3 내지 4일 이상 동안 106 IU/ml 이상의 역가로 바이러스 입자를 생성할 수 있는 테트라사이클린-유도성 VSV-G 슈도형 렌티바이러스 패키징 세포주이다[문헌 참조; Kafri et al. (1999) J. Virol. 73: 576-584]. 유도성 세포주에 의해 생산된 벡터는 시험관내 및 생체내에서 비분화 세포를 효율적으로 변환시키기 위해 필요에 따라 농축시킬 수 있다.
신드비스 바이러스(sindbis virus)는 1953년을 시작으로 전세계의 다양한 부분에서 발견된 이래로 광범위하게 연구되어 온 알파바이러스 유전자의 일원이다. 알파유전자, 특히 신드비스 바이러스를 기초로 하는 유전자 변환은 시험관내에서 널리 연구되었다[문헌 참조; Straus et al. (1994) Microbiol. Rev. 58:491-562; Bredenbeek et al. (1993) J. Virol. 67; 6439-6446; Iijima et al. (1999) Int. J. Cancer 80: 110-118; 및 Sawai et al. (1998) Biochim. Biophys. Res. Comm. 248:315-323). 발현 작제물의 신속한 가공, 감염성 입자의 고-역가 스톡의 생산, 비분화 세포의 감염 및 높은 발현 수준을 포함한 알파바이러스 벡터의 다수의 특성으로 인해 이들은 개발되는 다른 바이러스-기원한 벡터 시스템에 대한 바람직한 대안이 되고 있다[문헌 참조; Strauss et al. (1994) Microbiol. Rev. 58:491-562]. 유전자 치료요법을 위한 신드비스 바이러스의 사용이 문헌[참조; Wahlfors et al. (2000) Gene. Ther. 7:472-480 및 Lundstrom (1999) J. Recep. Sig. Transduct. Res. 19(1-4):673-686)]에 기재되어 있다.
또 다른 양태에서, 벡터는 지질감염(lipofection)에 의해 또는 다른 형질감염 촉진제(펩타이드, 중합체 등)에 의해 세포에 도입될 수 있다. 합성 양이온성 지질을 사용하여 마커를 암호화하는 유전자의 생체내 및 시험관내 형질감염을 위한 리포솜을 제조할 수 있다[문헌 참조; Felgner et al. (1987) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 84:7413-7417 및 Wang et al. (1987) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 84:7851-7855]. 핵산의 전달을 위한 유용한 지질 화합물 및 조성물이 PCT 공보 제WO 95/18863호 및 제WO96/17823호 및 미국 특허 제5,459,127호에 기재되어 있다.
네이키드(naked) DNA 플라스미드로서 생채내에 벡터를 도입하는 것이 또한 가능하다. 유전자 치료요법을 위한 네이키드 DNA 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들면, 전기천공(electroporation), 미세주사(microinjection), 세포 융합, DEAE 텍스트란, 인산칼슘 침전법, 유전자 총(gun)의 사용 또는 DNA 벡터 전달체의 사용에 의해 목적하는 숙주 세포에 도입할 수 있다[문헌 참조; Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:963-967; Williams et al. (1991) Proc. Nat'l 7. Acad. Sci. USA 88:2726-2730]. 수용체-매개된 DNA 전달 방법이 또한 사용될 수 있다[문헌 참조; Wu et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14621-14624]. 미국 특허 제5,580,859호 및 제5,589,466호에는 포유동물에서 형질감염 촉진제없이 외인성 DNA 서열을 전달하는 것이 기재되어 있다. 전기전달법(electrotransfer)이라고 하는 비교적 낮은 전압, 높은 효율의 생체내 DNA 전달 기술이 또한 기재되어 있다[문헌 참조; Vilquin et al. (2001) Gene Ther. 8:1097; Payen et al. (2001) Exp. Hematol. 29:295-300; Mir (2001) Bioelectrochemistry 53:1-10; PCT 공보 제WO99/01157호, 제WO99/01158호 및 제WO99/01175호].
본원에 요약된 유전자 치료요법은 생체내에서 수행할 수 있거나, 또는 생체외에서 수행할 수 있으며, 여기서, 세포를 대상체로부터 입수하고, 시험관내에서 유전자 치료요법으로 형질전환시킨 다음 대상체에 재도입시킨다[문헌 참조; Worgall (2005) Pediatr. Nephrol. 20(2) : 118-24].
실시예 14
모 항체의 CDR의 카세트 돌연변이유발
본 발명의 항-사람 IL-17A 항체(예를 들면, 16C10)의 CDR 서열의 최적화는 샷건 스캐닝 돌연변이유발(shotgun scanning mutagenesis)을 사용하여 수행한다. 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 사용하여, CDR내의 어떤 잔기가 IL-17A 결합에 가장 중요한지를 결정한다(실시예 19 참조). 하나 이상의 CDR내의 하나 이상의 잔기에 대한 코돈을 알라닌 코돈으로 대체하거나, 또는 알라닌 코돈을 글리신 코돈으로 대체하고, 생성된 항체를 관련 활성(예를 들면, IL-17A 결합 친화도, 본원의 각종 다른 실시예에 제공된 바와 같은 경쟁 검정, 생검정에서의 수용체 차단에 대한 IC50)에 대해 시험한다. 코돈 치환은 부위-지시된 돌연변이유발(예를 들면, 문헌[참조; Kunkel, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA (1985) 82:488]) 및 PCR 돌연변이유발을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. IL-17A 결합에 중요한 잔기는 또한 IL-17A-항체 복합체의 구조, 예를 들면, X-선 결정 구조를 조사함으로써 결정할 수 있다. IL-17A의 접촉 거리내의 항체 CDR 잔기, 또는 IL-17A-항체 복합체의 형성시 실질적으로 매몰되는 항체 CDR 잔기가 추가의 최적화를 위한 후보이다.
이후에, 돌연변이에 대해 최대의 민감도를 갖는 잔기를, 예를 들면, 상동성 스캐닝 돌연변이유발에 의해 추가로 연구한다. 이러한 양태에서, 상동성 아미노산으로의 보존적 아미노산 치환을 표적 잔기에서 실시하여 보다 우수한 품질을 갖는 항체를 찾는다. IL-17A 결합을 붕괴시키는 위험에도 불구하고, 비-보존적 돌연변이 또한 가능하다.
대안적으로, 개선된 항체 서열은 친화도 성숙(affinity maturation)을 사용하여 생성할 수 있으며, 이때, CDR내 선택된 잔기를 돌연변이시켜 그 위치에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성한다. 또 다른 양태에서, 20개 미만의 가능한 천연 아미노산을 치환물로서 사용하여, 제WO2005/044853호에서와 같이 최적으로 다양화되도록 선택된 제한된 수의 아미노산(예를 들면, 대표적인 소수성 아미노산, 극성-비하전 아미노산, 염기성 아미노산 및 산성 아미노산)을 사용하여 각각의 위치에서 화학적 다양성을 여전히 제공하면서, 잠재적인 서열의 수를 보다 조정하기 쉬운 수준으로 감소시킨다. 이러한 친화도 성숙은, 비-표준 또는 변형된 아미노산이 포함되는 경우, 해당 위치에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상을 포함한 갯수의 아미노산으로 치환시킴으로써 수행할 수 있다.
실시예 15
사람 조직과의 교차-반응성(cross-reactivity)
사람 대상체에서 비-표적 조직과의 교차-반응성에 대한 사람화 항-사람 IL-17A 항체 hu16C10의 경향을 다음과 같이 평가하였다. hu16C10을 조직 샘플에 노출시키기 전에 비오티닐화 이차 항체와 예비배양하여 예비-복합체를 형성하였다. 이어서, 항체 복합체(항체 20㎍/ml 포함)를 조직 또는 다른 샘플과 혼합하여 결합되도록 배양하였다. 이어서, 결합된 이차 항체를 ABC 면역과산화효소 검출법을 사용하여 검출하였다[문헌 참조; Vector Labs, Burlingame, California, USA. Tuson et al. (1990) J. Histochem Cytochem.38(7):923-6]. 비관련 사람 IgGl 항체를 갖는 샘플을 음성 대조군으로서 포함시켰다.
면역조직화학(IHC) 염색은 UV-수지 슬라이드[제품명; Adhesive Coated Slides, 제조원; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 인스트루메딕스, 인크.(Instrumedics, Inc.)] 상의 rhIL-17A 단백질 점적, 아데노바이러스-암호화 IL-17A로 감염된 마우스 간 세포 및 사람 류마티스 관절염 조직을 포함하는 몇 가지 양성 대조군 표적 조직에 대해 hu16C10을 사용하여 수행하였다. IHC 결과, 세 개의 모든 양성 대조군에서 결합(+++)이 나타났다.
이어서, IHC를 사람 조직의 패널(그중 32개)에 대해 수행하여 교차-반응성을 평가하였다. 이러한 모든 사람 조직 샘플을 UV-수지 슬라이드 상에 고정시켰다. 샘플은 각각의 조직에 대한 세 가지 공여자로부터 수득하였다. 스크리닝된 사람 조직은 부신, 방광, 소뇌, 대뇌 피질, 결장, 나팔관, 심근, 신장, 간, 폐, 림프절, 유선, 난소, 췌장, 부갑상샘, 뇌하수체, 태반, 전립선, 망막, 골격근, 피부, 소장, 척수, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상샘, 요관, 자궁 및 자궁경부(자궁)이었다. IHC는 모든 32개 조직에서 음성이었다.
이러한 교차-반응성의 결핍은 (치료학적 효과의 감소를 초래하는) 다른 조직에 대한 비-특이적 결합으로 인한 항체의 손실을 감소시키고, 바람직하지 않은 조직에의 결합과 관련된 불리한 효과의 가능성을 감소시키는 것과 같이 본 발명의 항-IL-17A 항체의 치료학적 사용에 있어서 몇 가지 잠재적인 이익을 갖는다.
실시예 16
항-IL-17A 항체를 사용한 콜라겐-유도된 관절염의 치료
콜라겐-유도된 관절염(CIA)은 사람에서의 류마티스 관절염에 대한 널리 인정되는 마우스 모델이다. 본 발명의 항-IL-17A 항체 1D10(모 랫트 항체의 사람화 형태가 아니라 모 랫트 항체임)을 CIA를 발현하는 마우스에 투여하여 류마티스 관절염을 치료하는 항-IL-17A 치료요법의 능력을 평가한다.
과정은 다음과 같다. 0일째에, 수컷 B10.RIII 마우스를 프로인트 완전 보조제 속에 유화시킨 소 타입 II 콜라겐으로 꼬리 기저에서 피내로 면역화시킨다. 21일째에 마우스를 꼬리 기저에 전달된 프로인트 불완전 보조제 속에 유화시킨 소 타입 II 콜라겐으로 피내로 챌린지한다. 면역화된 그룹에서 중증 관절염의 최초 징후가 발행하는 경우(21일 후), 모든 나머지 면역화된 마우스를 각종 처리군으로 무작위화한다. 동물을 800㎍, 200㎍ 또는 50㎍의 항-IL-17A 항체 1D1O으로 처리하거나; 200㎍의 동형 대조군 항체로 처리하거나; 희석제로 처리한다. 처리는 면역화된 마우스에서 질환 발명 첫째날에 피하로 제공하며, 그 후에 매주 4회 더 제공한다. 마우스를 35일째에 희생시키고, 발을 조직 프로세싱 및 단편을 위해 10% 중성-완충된 포르말린에 고정시킨다. 병리학자가 하기 조직병리학 파라미터에 대해 발을 검정한다: 반응성 윤활막, 염증, 판누스(pannus) 형성, 연골 파괴, 골 침식 및 골 형성. 각각의 파라미터를 다음의 질환 스케일을 사용하여 등급을 매긴다: 0 = 질환 없음; 1 = 최소, 2 = 약간, 3 = 중간, 4 = 중증. 또한, 육안의 질병 중증도 스코어(disease severity score; DSS)를 사용하여 발을 평가하며, 이것은 0 내지 3의 스케일로 종창 및 발적을 측정하는 것으로, 이때 0은 정상적인 발, 1은 발가락 중의 하나의 염증, 2는 발의 발바닥 또는 발가락 중의 2개의 염증; 3은 발바닥 및 발가락(들)의 염증을 나타낸다. 본원에서 스코어 2 및 3은 심하게 또는 매우 염증이 있는 발을 나타낸다.
결과가 도 3A 내지 3C에 도시되어 있다. 각각의 데이타 포인트는 동물의 4개의 발에 대한 평균 또는 모든 동물에 대한 평균이라기 보다는 1개의 발을 나타낸다. 높은 병리 스코어를 나타내는 발의 수의 감소는, 보다 높은 항-IL-17A 1Dl0 농도(28 및 7mg/kg)에서 시험한 병리상태(육안 DSS - 발 종창 및 발적, 연골 손상 및 골 침식)의 3회 측정에 의해 통계학적으로 유의적이었다. 최저 농도(2mg/kg)의 결과는 골 침식에 대해 통계학적으로 유의적이고 육안 DSS 및 연골 손상에 대해 감소되었다. 유사한 잇점은 염증이 일어난 발내의 연골 퇴화성 효소(기질 메탈로프로테아제 MMP-2, MMP-3, MMP-13)의 생산 감소에서 관찰되었다.
그러나, 발 염증의 육안 평가는 CIA 마우스의 항-IL-17A 처리의 치료학적 이익(예를 들면, 감소된 골 침식)을 과소평가할 수 있다. 다른 실험에서, CIA 마우스로부터의 매우 염증이 심한 발(DSS 스코어 2 또는 3)을 조직병리학 또는 마이크로-컴퓨터 단층촬영술(micro-computed tomography; micro-CT)을 사용하여 골 침식에 대해 검정하였다. 상기 연구는, 항-IL-17A-처리된 동물에서 매우 염증이 심한 발의 비율(%)이 극적으로 감소되기는 하였지만(예를 들면, 도 3A 참조), 매우 염증이 심한 발의 수가 여전히 많기 때문에 가능하며, 매우 염증이 심한 발(DSS = 2 또는 3)을 항체-비함유 대조군을 포함한 모든 처리군으로부터 비교할 수 있다. 도 3D는 희석제 처리된 동물, 동형 대조(rIgG1) 처리된 동물 및 항-IL-17A 항체 처리된 동물로부터의 매우 염증이 심한 발에 대한 골 침식의 플롯을 보여준다. 조직병리학에 의해 측정되는 바와 같이, 골 침식은, 항체-비함유 대조군과 비교하는 경우, 유사한 DSS 스코어에도 불구하고, 항-IL-17A로 처리한 동물로부터의 발에서 유의적으로 감소하였다. 이러한 결과는, 골 침식의 감소(sparing)가 DSS 스코어에 의해 측정되는 바와 같이 염증의 명확한 개선이 없는 경우의 발에서도 항-IL-17A 처리에 의해 달성될 수 있음을 시사한다.
CIA 마우스의 매우 염증이 심한 발의 관절에 대한 골밀도(bone mineral density;BMD)를 측정하기 위해 micro-CT를 사용하는 경우에 유사한 결과가 수득되었다. 표 15는 본 발명의 항-IL-17A 항체(1D1O) 또는 동형 대조물(25D2)로 처리한 CIA 동물로부터 0 내지 3의 질병 중증도 스코어를 가진 발에 대한 BMD를 제공한다. 동일한 육안 질병 중증도를 가진 관절에 대해서도, 처리된 1D1O 항체는 동형 대조물로 처리된 동물에서 관찰되는 골밀도의 대략 절반의 감소율을 나타낸다.
CIA 마우스의 관절의 골밀도
처리 DSS BMD(mg/cc)
25D2 3 95
25D2 3 108
1D10 3 288
1D10 3 299
1D10 0 502
1D10 0 480
골 침식에서와 같이, 연골 파괴 및 판누스 형성(염증이 있는 조직의 과도한 추벽(fold)을 형성하는 윤활막 내층의 증식) 또한 항-hIL-17A(1D1O)-처리된 CIA 마우스에서 감소한다. 조직병리학은, 항-IL-17A 항체 처리가 희석제 처리 대조군 또는 동형 처리 대조군과 비교하여, 심한 병리를 나타내는 발의 수를 감소시킬 뿐만 아니라 육안 검사를 기초로 하여 동일하게 염증이 있는 것으로 보이는 발(DSS 스코어 2 및 3)에서의 병리를 감소시킨다는 것을 보여준다.
항-IL-17A 항체로의 처리가 관절 염증의 CIA 모델에서 골 침식을 유의적으로 감소시킨다는 관찰은, 이러한 치료요법이 사람에서 RA의 가장 쇠약하게 하고 비가역적인 효과 중의 하나를 예방하는 데 유용할 수 있음을 시사한다. 또한, 골 침식이 매우 염증이 심한 발에서도 감소된다는 관찰은, 관절 염증의 단순 육안 평가가 실험실 또는 궁극적으로 클리닉에서 치료학적 효능을 정확하게 측정할 수 없음을 시사한다. 골 침식의 측정은 치료학적 처리의 효과를 추적하는데 필요할 수 있다. 이러한 방법은 표준 2-D X-선 검출, 컴퓨터 단층촬영술(CT), 자기 공명 영상(MRI), 초음파(US) 및 섬광조영술을 포함하지만 이에 제한되지 않는다[문헌 참조; Guermazi et al. (2004) Semin. Musculoskelet. Radiol. 8(4):269-285].
실시예 17
항-IL-17A 항체의 BAL 호중구 보충 검정
생체내 IL-17A의 활성을 차단하는 본 발명의 항-IL-17A 항체의 능력은 기관지폐포세척(bronchoalveolar lavage; BAL) 호중구 보충 검정으로 평가하였다. 간략하게 말하면, -4일째에, 5주령 암컷 BALB/cAnN 마우스[미국 뉴욕주 저먼타운 소재의 타코닉 팜스(Taconic Farms)]를 마우스당 항체 0, 10, 30, 40, 60 또는 100㎍을 피하 주사에 의해 본 발명의 항-IL-17A 항체 또는 동형 대조물로 처리하였다. -1일째에, 마우스를 경미한 이소플루란 마취하에 PBS 50㎕ 중의 rhIL-17A 1㎍(또는 대조군의 경우 PBS만)을 비강 투여하여 자극시켰다.
0일째에, BAL액에 존재하는 호중구의 수준을 다음과 같이 측정하였다. 마우스를 CO2로 안락사시키고, 혈액 샘플을 수집하여, 이로부터 항-IL-17A 항체의 농도를 측정하였다. 침을 기관절개를 통해 상부 경부 기관에 삽입하고, PBS 0.3ml를 도입하고 3회 제거하여 BAL액을 수집하였다. BAL액을 원심분리(4℃, 400xg에서 10분)하고, 세포 펠렛을 PBS에 재현탁시켰다. 총 세포 수를 트리판 블루 용액을 사용하여 혈구계로 측정하였다. 오일 주입 현미경(oil immersion microscope)(원래의 배율 x 1000)을 사용하여 표준 형태론적 기준에 따라, 라이트-김사 염색(Wright-Giemsa staining)(제조원; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치)에 의해 사이토스핀 제제(cytospin preparation) 상에서 감별 세포 계수를 수행하였다. 세포 계수를 200 내지 300개 세포(림프구, 단핵구, 호중구, 호산구)에서 수행하여 BAL 호중구(%)를 측정하였다.
결과가 도 4에 제공되어 있다. 본 발명의 세가지 항-IL-17A 항체(1D1O, 16C10 및 4C3)에 대한 데이타 뿐만 아니라 대조군에 대한 데이타가 제공되어 있다. 개별 실험 동물에 대한 모든 백혈구의 비율(%)로서의 BAL액 중의 호중구의 비율(%)을 혈청 항체 농도의 함수로서 플롯팅하며, 여기서, 범례에 나타낸 바와 같이, 가로 좌표의 좌측 선분("0" 내지 "1")은 대조군을 나타낸다. 대조군은, rhIL-17A 자극이 (항-IL-17A 항체와 동일한 수준으로 투여된) 동형 대조 항체의 투여에 의해 감소되지 않은 유의적인 호중구 보충을 유도함을 보여준다. 이와 달리, 항-IL-17A 데이타는 rhIL-17A-유도된 호중구 보충에 있어서 용량-의존적인 감소를 나타내며, 이때 호중구 보충은 본질적으로 40 내지 60㎍/ml 이상의 혈청 항체 농도에서 차단되었다.
실시예 18
항-IL-17A 항체를 사용한 류마티스 관절염(RA)의 치료
하나 이상의 DMARD에 대해 부적절한 반응을 보이는 RA로 진단된 사람 대상체를 본 발명의 사람화된 항-IL-17A 항체로 처리하기 위해 선택한다. 대상체에게 메토트렉세이트(10mg/주)를 유지시키고, 임의로 2주간 프레드니솔론으로 처리한다. 또한, 대상체에게 매달 50 또는 100mg의 항-IL-17A 항체를 피하 투여에 의해 투여한다. 투여량은 임상 반응을 기초로 하여 표준 임상 기준에 따라 특정 대상체에 대해 조절한다.
처리에 대한 반응을 ACR 스코어를 측정함으로써 평가하며, 이것은 ACR(the American College of Rheumatology)이 개발한 기준을 기초로 한다. ACR 스코어는 종창이나 동통이 있는 관절의 수에 있어서의 감소, 환자의 전반적인 평가, 의사의 전반적인 평가, 통증 크기, 자가-평가 활동제한성(self-assessed disability) 및 급성기 반응물(acute phase reactant)(적혈구 침강 속도 또는 C-반응성 단백질)과 같은 다수의 임상 파라미터와 방사선 촬영 스코어를 통합한 복합 스코어이다[문헌 참조; Felson et al. (1995) Arthritis & Rheumatology 38; 727-735]. 대상체가 24주간의 치료에서 ACR20 이상의 스코어를 나타내는 경우 호전된 것으로 간주한다. 또한, 다양한 ACR 스코어(예를 들면, ACR20, ACR50 및 ACR70)를 달성한 대상체의 비율을 사용하여 임상 시도에서 처리군과 위약군을 비교함으로써 본 발명의 사람화된 항-IL-17A 항체의 임상 효율을 평가한다.
실시예 19
에피토프 측정
본 발명의 항체, 예를 들면, 랫트 16C10의 결합에 중요한 아미노산 잔기를 다음과 같이 측정하였다.
제1 세트의 실험은, 랫트 항체 16C10가 사람 IL-17A(hIL-17A)에는 결합할 수 있지만 마우스 IL-17A(mIL-17A) 또는 관련 사이토킨 사람 IL-17F에는 결합할 수 없다는 관찰을 기초로 하였다. 이러한 세 가지 단백질 각각을 N-말단 FLAG®] 펩타이드 태그(서열 42의 잔기 1번 내지 9번 참조)에 결합시켰다. 16C10 결합에 중요한 아미노산 잔기를 동정하기 위해, FLAG-표지된 hIL-17A, mIL-17A 및 IL-17F의 다양한 펩타이드 하위서열을 관련 유전자의 제한 단편을 혼합함으로써 조합하여 하이브리드 폴리펩타이드를 형성하였다. 항체 16C10에 대한 이들 하이브리드 폴리펩타이드의 결합을 증폭된 발광 근접 상동성 검정(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)[제품명; AlphaScreen, 제조원; 미국 매사추세츠주 웰즐리 소재의 팩커드 바이오사이언스(Packard BioScience)]으로 측정하여 hIL-17A의 어떠한 단편이 결합에 중요한지를 측정하였다. 비오티닐화 항체 16C10를 스트렙트아비딘 공여체 비드에 결합시키고, 하이브리드 폴리펩타이드를 항-FLAG® 항체(제조원; Packard BioScience)를 갖는 수용체 비드에 결합시켰다. 공여체 및 수용체 비드를 혼합하고, 680nm에서 조명을 비추며, 520 내지 620nm에서 방출을 측정하였다. 수용체 비드가 공여체 비드에 매우 근접하게 유지되고 방출된 공여체 비드로부터의 일중항 산소가 수용체 비드로 확산되는 경우에 광을 방출하기 때문에, 항체 16C10에 결합된 하이브리드 폴리펩타이드를 함유하는 샘플에서의 증진된 형광으로서 결합도를 측정하였다.
결과는, 항체 16C10가 hIL-17A로부터의 아미노산 잔기 50-132, 63-132, 1-87, 1-112 및 63-87을 포함하는 하이브리드 폴리펩타이드에 결합함을 보여주며, 이것은 16C10 결합에 중요한 잔기가 hIL-17A의 잔기 63-87(PSVIWEAKCR HLGCINADG NVDYHM)에 존재함을 입증한다. 당해 실시예에서의 모든 잔기 번호매김은 hIL-17A의 서열(서열 40)을 참고한다. 예를 들면, hIL-17A의 잔기 63-87로 치환된 mIL-17A 및 IL-17F 폴리펩타이드는 항체 16C10에 결합할 수 있는 반면, 천연 mIL-17A 및 IL-17F는 그러하지 않다.
점 돌연변이(point mutation)를 또한 hIL-17A에 도입하여 어떠한 아미노산 잔기가 항체 16C10 결합에 중요한지를 측정하였다. 한 가지 실험에서, 수 개의 잔기(45, 46, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 61, 62, 67, 68, 70, 72, 73, 78, 80, 82, 84, 85, 86, 88, 93, 94, 95, 100, 101, 102, 105, 108, 110, 111, 113, 114)에서 알라닌 코돈이 천연형 아미노산 대신에 도입되는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발을 수행하였다. hIL-17A의 돌연변이체 형태를 암호화하는 유전자를 갖는 포유동물 발현 플라스미드를 사람 배아 신장(HEK) 293T 세포로 일시적으로 형질감염시켰다. 상층액을, 상기한 바와 같이 FLAG® 펩타이드 태그 정량 및 AlphaScreen에 의한 항체 16C10 결합에 대해 검정하였다. 단일 아미노산 알라닌 치환은 항체 16C10의 결합을 유의적으로 감소시키지 않았다. 사람 IL-17F 또는 마우스 IL-17A 잔기를 63번-87번 단편 내의 다양한 위치, 즉 L74Q, G75R, V83E, Y85H에서 치환시키는 또 다른 점 돌연변이를 수행하였다. 이러한 개별 점 돌연변이가 항체 16C10 결합을 억제시키지는 않지만, 네개의 모든 변화를 갖는 hIL-17A는 실질적으로 감소된 결합을 나타내며, 이것은 hIL-17A의 63번-87번 단편의 잔기, 보다 구체적으로 74번-85번 단편의 잔기(LGCINADGNVDY)가 16C10 결합에 중요하다는 것을 입증한다.
서열 인식자
서열 설명
1 시그날 서열을 갖는 hu 16C10 경쇄 DNA
2 시그날 서열을 갖는 hu 16C10 경쇄 아미노산
3 시그날 서열을 갖는 hu 16C10 중쇄 DNA
4 시그날 서열을 갖는 hu 16C10 중쇄 아미노산
5 hu 16C10/4C3 경쇄 가변 도메인
6 hu 16C10/4C3 중쇄 가변 도메인
7 랫트 16C10 경쇄 가변 도메인
8 랫트 16C10/4C3 중쇄 가변 도메인
9 키메라 16C10 경쇄
10 키메라 16C10 중쇄
11 랫트/hu 16C10/4C3 CDRL1
12 랫트/hu 16C10/4C3 CDRL2
13 랫트/hu 16C10/4C3 CDRL3
14 랫트/hu 16C10/4C3 CDRH1
15 랫트 16C10/4C3 CDRH2
16 hu 16C10/4C3 CDRH2(N54Q)
17 랫트 16C10 CDRH2(N54N/Q/A)
18 랫트 16C10/4C3 CDRH3
19 hu 16C10/4C3 CDRH3(M96A)
20 랫트 16C10 CDRH3(M96M/A/K, M100hM/F)
21 랫트 4C3 경쇄 가변 도메인
22 hu 30C10 경쇄 가변 도메인
23 hu 30C10 중쇄 가변 도메인
24 랫트 30C10 경쇄 가변 도메인
25 랫트 30C10 중쇄 가변 도메인
26 랫트/hu 30C10 CDRL1
27 랫트/hu 30C10 CDRL2
28 랫트/hu 30C10 CDRL3
29 랫트/hu 30C10 CDRH1
30 랫트/hu 30C10 CDRH2
31 랫트/hu 30C10 CDRH3
32 랫트 12E6 경쇄 가변 도메인
33 랫트 12E6 중쇄 가변 도메인
34 랫트/hu 12E6 CDRL1
서열 설명
35 랫트/hu 12E6 CDRL2
36 랫트/hu 12E6 CDRL3
37 랫트/hu 12E6 CDRH1
38 랫트/hu 12E6 CDRH2
39 랫트/hu 12E6 CDRH3
40 huIL-17A(천연형)
41 rhIL-17A
42 FLAG-IL-17A
43 R&D IL-17A
44 시그날 서열을 갖는 랫트 23E12 경쇄 가변 도메인 DNA
45 시그날 서열을 갖는 랫트 23E12 경쇄 가변 도메인 아미노산
46 시그날 서열을 갖는 랫트 23E12 중쇄 가변 도메인 DNA
47 시그날 서열을 갖는 랫트 23E12 중쇄 가변 도메인 아미노산
48 랫트/hu 23E12 CDRL1
49 랫트/hu 23E12 CDRL2
50 랫트/hu 23E12 CDRL3
51 랫트/hu 23E12 CDRH1
52 랫트/hu 23E12 CDRH2
53 랫트/hu 23E12 CDRH3
54 랫트 1D10 경쇄 가변 도메인
55 랫트 1D10 중쇄 가변 도메인
56 랫트 1D10 CDRL1
57 랫트 1D10 CDRL2
58 랫트 1D10 CDRL3
59 랫트 1D10 CDRH1
60 랫트 1D10 CDRH2
61 랫트 1D10 CDRH3
62 시그날 서열을 갖는 hu 16C10 경쇄 DNA
63 시그날 서열을 갖는 hu 16C10 중쇄 DNA
상기 공보 또는 서류의 인용은 선행 분야에 해당된다는 승인으로 의도되는 것은 아니며 이들 공보 또는 서류의 내용 또는 날짜에 대한 어떠한 승인으로서 의도되는 것도 아니다. 본원에 언급된 모든 참고문헌은 각각의 개별 공보, 특허 출원 또는 특허가 구체적으로 및 개별적으로 참고로 인용되어 나타내는 바와 동일한 정도로 본원에 문헌 참조로 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> SCHERING CORPORATION <120> ANTIBODIES TO IL-17A <130> BP06474 <150> US 60/837,197 <151> 2006-08-11 <160> 63 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Humanized 16C10 Antibody Light Chain with Signal Sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(717) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(57) <220> <221> mat_peptide <222> (58)..(717) <400> 1 atg gct cca gtg cag ctg ctg ggg ctg ctg gtg ctg ttc ctg cca gcc 48 Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala -15 -10 -5 atg aga tgt gat atc gtg atg acc cag tct cca ctg tcc ctg cct gtg 96 Met Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val -1 1 5 10 aca ccc gga gag cca gcc agc atc agc tgc aag agc agc cag agc ctg 144 Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 15 20 25 ctg ttc agc gag aac cag aag aac tac ctg gcc tgg tat ctg cag aaa 192 Leu Phe Ser Glu Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys 30 35 40 45 cca ggg cag agc cct cag ctg ctg atc tat 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gag agt gtc aca gag cag gac 576 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 160 165 170 agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa 624 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 175 180 185 gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag 672 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 190 195 200 205 ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt taa 720 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 2 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala -15 -10 -5 Met Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val -1 1 5 10 Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 15 20 25 Leu Phe Ser Glu Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys 30 35 40 45 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Gln 50 55 60 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 80 85 90 Cys Gln Gln Ser Tyr Tyr Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 95 100 105 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 110 115 120 125 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 130 135 140 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 145 150 155 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 160 165 170 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 175 180 185 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 190 195 200 205 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 3 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Humanized 16C10 Antibody Heavy Chain with Signal Sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(1419) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(57) <220> <221> mat_peptide <222> (58)..(1419) <400> 3 atg 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aga aat gca tac atc acc gac tac tat tac gag aac tac 384 Tyr Cys Ala Arg Asn Ala Tyr Ile Thr Asp Tyr Tyr Tyr Glu Asn Tyr 95 100 105 ttc atg gat gcc tgg gga cag ggc acc ctg gtg acc gtg agc tcc gct 432 Phe Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 110 115 120 125 agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc 480 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc 528 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc 576 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 160 165 170 gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc 624 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 175 180 185 agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac 672 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 190 195 200 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Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Trp Ser 20 25 30 Glu Ser His Met Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys His His 85 90 95 His Tyr Asp Ser His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 23 <211> 117 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Humanized 30C10 Heavy Chain Variable Domain <400> 23 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Val Ser Asn Thr Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Pro Ala Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ala Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 113 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 24 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Trp Ser 20 25 30 Glu Ser His Met Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His His 85 90 95 His Tyr Asp Ser His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Arg <210> 25 <211> 117 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Val Ser Asn Thr Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Pro Ala Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Ala Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 26 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Trp Ser Glu Ser His Met Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 27 Tyr Ala Ser Thr Arg Gln Ser 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 28 His His His Tyr Asp Ser His Thr 1 5 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 29 Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Trp Met Thr 1 5 10 <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 30 Ser Val Ser Asn Thr Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Pro Ala Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 31 Glu Gly Ala Tyr Tyr Leu Asp Tyr 1 5 <210> 32 <211> 108 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 32 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Gly Asn Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Leu Met Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Lys Tyr Pro Asn 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 33 <211> 117 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 33 Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Tyr Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Tyr Gly Glu Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Gly Phe Asn Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Val Met 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 34 Arg Thr Ser Gln Asp Ile Gly Asn Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 35 Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 36 Leu Gln Tyr Asp Lys Tyr Pro Asn Thr 1 5 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 37 Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr Tyr Met Val 1 5 10 <210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Rat/Humanized 12E6 CDRH2 <400> 38 Ser Ile Ser Tyr Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Tyr Gly Glu Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 39 His Gly Phe Asn Pro Phe Asp Tyr 1 5 <210> 40 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys 1 5 10 15 Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn 20 25 30 Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr 35 40 45 Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser 50 55 60 Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp 65 70 75 80 Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile 85 90 95 Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 100 105 110 Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val 115 120 125 His His Val Ala 130 <210> 41 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant human IL-17A <400> 41 Leu Glu Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu 1 5 10 15 Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn 20 25 30 Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg 35 40 45 Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr 50 55 60 Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn 65 70 75 80 Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln 85 90 95 Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe 100 105 110 Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro 115 120 125 Ile Val His His Val Ala 130 <210> 42 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FLAG-tagged human IL-17A <400> 42 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn 1 5 10 15 Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met 20 25 30 Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg 35 40 45 Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg 50 55 60 Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys 65 70 75 80 Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met 85 90 95 Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro 100 105 110 Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val 115 120 125 Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala 130 135 140 <210> 43 <211> 137 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Met Ile Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro 1 5 10 15 Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn 20 25 30 Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr 35 40 45 Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro 50 55 60 Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly 65 70 75 80 Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro 85 90 95 Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro 100 105 110 Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys 115 120 125 Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala 130 135 <210> 44 <211> 384 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(384) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(60) <220> <221> mat_peptide <222> (61)..(384) <400> 44 atg ggc gtg ccc act cag ctc ctg ggg ttg ttg ctg ctg tgg att aca 48 Met Gly Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Ile Thr -20 -15 -10 -5 gat gtc ata tgt gac atc cag atg aca cag tct cca gct tcc ctg tct 96 Asp Val Ile Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser -1 1 5 10 gca tct ctg gga gaa act gtc acc atc caa tgt caa gca agt gag gac 144 Ala Ser Leu Gly Glu Thr Val Thr Ile Gln Cys Gln Ala Ser Glu Asp 15 20 25 att tac agt ggt tta gcg tgg tat cat cag aag cca ggg aag tct cct 192 Ile Tyr Ser Gly Leu Ala Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro 30 35 40 caa ctc ctg atc ctt ggt gct agt agg tta cac gac ggc gtc cca tca 240 Gln Leu Leu Ile Leu Gly Ala Ser Arg Leu His Asp Gly Val Pro Ser 45 50 55 60 cga ttc agt ggc agt gga tct ggc ata gag tat tct ctc aag atc aac 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ile Glu Tyr Ser Leu Lys Ile Asn 65 70 75 aac atg caa act gaa gat gaa ggg att tat ttc tgt caa cag ggt tta 336 Asn Met Gln Thr Glu Asp Glu Gly Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Leu 80 85 90 aag tat cct ccg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa ttg aaa cgg 384 Lys Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 95 100 105 <210> 45 <211> 128 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 45 Met Gly Val Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Ile Thr -20 -15 -10 -5 Asp Val Ile Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser -1 1 5 10 Ala Ser Leu Gly Glu Thr Val Thr Ile Gln Cys Gln Ala Ser Glu Asp 15 20 25 Ile Tyr Ser Gly Leu Ala Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro 30 35 40 Gln Leu Leu Ile Leu Gly Ala Ser Arg Leu His Asp Gly Val Pro Ser 45 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ile Glu Tyr Ser Leu Lys Ile Asn 65 70 75 Asn Met Gln Thr Glu Asp Glu Gly Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Leu 80 85 90 Lys Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 95 100 105 <210> 46 <211> 411 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(411) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(57) <220> <221> mat_peptide <222> (58)..(411) <400> 46 atg gct gtc ctg gtg ctg ttg ctc tgc ctg gtg aca ttc cca aga tgt 48 Met Ala Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Phe Pro Arg Cys -15 -10 -5 gtc ctg tcc cag gtg cag ttg aag gag tca gga cct ggt ctg gtg cag 96 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln -1 1 5 10 ccc tca cag acc ctg tct ctc acc tgc act gtc ttt gga ttc tca ttg 144 Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Phe Gly Phe Ser Leu 15 20 25 acc aac aat ggt gtg acc tgg gtt cgc cag cct cca gga aag ggt ctg 192 Thr Asn Asn Gly Val Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45 gag tgg att gca gaa gta tca agc ggt ggc agc aca gat tat aat tca 240 Glu Trp Ile Ala Glu Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser 50 55 60 gcc ctc aaa tcc cga ctg agc atc agt agg gac acc tcc aag agc caa 288 Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln 65 70 75 gtt ttc tta aga atg aac agt ctg cag act gaa gac aca gcc att tac 336 Val Phe Leu Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 80 85 90 ttc tgt gcc aga cag gag gta ttt acc gga tta ttg gat tat tgg ggc 384 Phe Cys Ala Arg Gln Glu Val Phe Thr Gly Leu Leu Asp Tyr Trp Gly 95 100 105 caa gga gtc atg gtc aca gtc tcc tcg 411 Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 47 <211> 137 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 47 Met Ala Val Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Phe Pro Arg Cys -15 -10 -5 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln -1 1 5 10 Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Phe Gly Phe Ser Leu 15 20 25 Thr Asn Asn Gly Val Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45 Glu Trp Ile Ala Glu Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser 50 55 60 Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln 65 70 75 Val Phe Leu Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 80 85 90 Phe Cys Ala Arg Gln Glu Val Phe Thr Gly Leu Leu Asp Tyr Trp Gly 95 100 105 Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 48 Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly Leu Ala 1 5 10 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 49 Gly Ala Ser Arg Leu His Asp 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 50 Gln Gln Gly Leu Lys Tyr Pro Pro Thr 1 5 <210> 51 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 51 Gly Phe Ser Leu Thr Asn Asn Gly Val Thr 1 5 10 <210> 52 <211> 16 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 52 Glu Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 53 Gln Glu Val Phe Thr Gly Leu Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 54 <211> 108 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 54 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Tyr 20 25 30 Leu Asp Trp Phe Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Asp Asn Leu His Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Phe Ser Asp Phe Ile Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Arg Glu Ser Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 55 <211> 122 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 55 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Val Trp Asn Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Arg 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Leu Leu 65 70 75 80 Lys Met Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Gly Arg Glu Gly Phe Val Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp 100 105 110 Gly Pro Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 56 Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Tyr Leu Asp 1 5 10 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 57 Asn Ala Asp Asn Leu His Thr 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 58 Leu Gln Arg Glu Ser Trp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 59 Ser Leu Thr Asn Tyr Tyr Val His Trp Val 1 5 10 <210> 60 <211> 16 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 60 Gly Val Trp Asn Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Arg Ser 1 5 10 15 <210> 61 <211> 14 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 61 Glu Gly Arg Glu Gly Phe Val Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala 1 5 10 <210> 62 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Humanized 16C10 Antibody Light Chain with Signal Sequence <400> 62 atggcccccg tgcagctgct gggcctgctg gtgctgttcc tgcccgccat gagatgcgac 60 atcgtgatga cccagagccc cctgagcctg cccgtgaccc caggcgagcc cgccagcatc 120 agctgcaaga gcagccagag cctgctgttc agcgagaacc agaagaacta cctggcctgg 180 tatctgcaga agcccggcca gtccccccag ctgctgatct actggaccag caccaggcag 240 agcggcgtgc ccgacaggtt cagcggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 300 agcagggtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgcc agcagagcta ctacaccccc 360 tacaccttcg gccagggcac caaggtggag atcaagcgta cggtggctgc ccccagcgtg 420 ttcatcttcc cccccagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 480 ctgaacaact tctacccccg ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 540 agcggcaaca gccaggaaag cgtcaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg 600 agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgag 660 gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgctag 720 <210> 63 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 16C10 Antibody Heavy Chain with Signal Sequence <400> 63 atggccgtgc tgggcctgct gttctgcctg gtgaccttcc ccagctgcgt gctgtcccag 60 gtgcagctgc aggaaagcgg cccaggcctg gtgaagccca gcgagaccct gagcctgacc 120 tgcaccgtga gcggcttcag cctgcccagc cacagcgtga gctggatcag gcagccccca 180 ggcaagggcc tggaatggat cggcatcatc tggaaccagg gcggcaccga ctacaacagc 240 gccttcaaga gcagggtgac catcagcgtg gacaccagca agaaccagtt cagcctgaag 300 ctgtccagcg tgacagccgc cgacaccgcc gtgtactact gcgccaggaa cgcctacatc 360 accgactact actacgagaa ctacttcatg gacgcctggg gccagggcac cctggtgacc 420 gtgagcagcg ctagcaccaa gggcccaagc gtgttccccc tggcccccag cagcaagagc 480 acctccggcg gcacagccgc cctgggctgt ctggtgaagg actacttccc cgagcccgtg 540 accgtgtcct ggaacagcgg agccctgacc agcggcgtgc acaccttccc cgccgtgctg 600 cagagcagcg gcctgtacag cctgagcagc gtggtgacag tgcccagcag cagcctgggc 660 acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaag 720 gtggagccca agagctgcga caagacccac acctgccccc cctgccctgc cccagagctg 780 ctgggcggac ccagcgtgtt cctgttcccc cccaagccca aggacaccct gatgatcagc 840 aggacccccg aggtgacctg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaggaccc agaggtgaag 900 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cacaacgcca agaccaagcc cagagaggaa 960 cagtacaaca gcacctacag ggtggtgtcc gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg 1020 aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaggccc tgccagcccc catcgagaaa 1080 accatcagca aggccaaggg ccagccacgg gagccccagg tgtacaccct gccccccagc 1140 cgggacgagc tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgcc tggtgaaggg cttctacccc 1200 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac ggccagcccg agaacaacta caagaccacc 1260 cccccagtgc tggacagcga cggcagcttc ttcctgtaca gcaagctgac cgtggacaag 1320 agcaggtggc agcagggcaa cgtgttcagc tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac 1380 cactacaccc agaagagcct gagcctgtcc cccggcaagt ga 1422

Claims (45)

  1. 서열 11 내지 13으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 특정 수 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 서열을 갖는 하나 이상의 항체 경쇄 가변 영역 또는 이의 결합 단편 및
    서열 14 내지 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 특정 수 이상의 CDR 서열을 갖는 하나 이상의 항체 중쇄 가변 영역 또는 이의 결합 단편을 포함하며,
    상기 특정 수가 1인, 사람 인터루킨(IL)-17A에 결합하는 결합 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 특정 수가 2인 결합 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 특정 수가 3인 결합 화합물.
  4. 제3항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열 11 내지 13의 CDR 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열 14, 17 및 20의 CDR 서열을 포함하는 결합 화합물.
  5. 제3항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열 11 내지 13의 CDR 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열 14, 16 및 19의 CDR 서열을 포함하는 결합 화합물.
  6. 제3항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 10개 이하의 보존적 치환(conservative substitution)을 갖는 서열 5의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 10개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 6의 서열을 포함하는 결합 화합물.
  7. 제6항에 있어서, 서열 5를 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 6을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체인 결합 화합물.
  8. 제3항에 있어서, 경쇄가 10개 이하의 보존적 치환을 갖는 서열 2의 아미노산 1번 내지 220번으로 본질적으로 이루어지고, 중쇄가 10개 이하의 보존적 치환을 갖는 서열 4의 아미노산 1번 내지 454번으로 본질적으로 이루어지는 결합 화합물.
  9. 제8항에 있어서, 경쇄가 서열 2의 아미노산 1번 내지 220번으로 본질적으로 이루어지고, 중쇄가 서열 4의 아미노산 1번 내지 454번으로 본질적으로 이루어지는 결합 화합물.
  10. 제9항에 있어서, 경쇄가 서열 2의 아미노산 1번 내지 220번으로 이루어지고, 중쇄가 서열 4의 아미노산 1번 내지 454번으로 본질적으로 이루어지는 결합 화합물.
  11. 서열 5에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 경쇄 가변 영역과 서열 6에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 사람 IL-17A에 결합하는 결 합 화합물.
  12. 제3항의 결합 화합물의 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역 중의 하나 이상을 암호화하는 분리된 핵산.
  13. 제12항에 있어서, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 5이고, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 6인 핵산.
  14. 제13항에 있어서, 서열 1 및 3의 서열, 또는 서열 62 및 63의 서열을 포함하는 핵산.
  15. 숙주 세포가 벡터로 형질감염될 때 숙주 세포에 의해 인식되는 조절 서열에 작동가능하게 연결되는, 제14항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  16. 제15항에 있어서, ATCC 수탁 번호 PTA-7675를 갖는 발현 벡터.
  17. 제16항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  18. 제17항의 숙주 세포를, 핵산 서열이 발현되는 조건하에서 배양 배지 속에서 배양함으로써, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및
    숙주 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 폴리펩타이드의 생산방법.
  19. 제16항의 발현 벡터에 의해 암호화되는, 항-사람 IL-17A 항체 hu16C10.
  20. 교차-차단 검정(cross-blocking assay)에서 사람 IL-17A에 대한 제10항의 결합 화합물의 결합을 교차-차단할 수 있는 항체.
  21. 제19항의 항체 16C10에 의해 결합된 에피토프(epitope)와 동일한 사람 IL-17A 상의 에피토프에 결합하는 항체.
  22. 서열 40의 사람 IL-17A 단백질 서열의 아미노산 잔기 74번 내지 85번을 포함하는 에피토프에서 사람 IL-17A에 결합하는 항체.
  23. 서열 26 내지 28의 CDR 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및
    서열 29 내지 31의 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 사람 IL-17A에 결합하는 결합 화합물.
  24. 제23항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 서열 22의 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 서열 23의 서열을 포함하는 결합 화합물.
  25. 제23항에 있어서, 모노클로날(monoclonal) 항체인 결합 화합물.
  26. (a) 서열 48 내지 50의 CDR 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 51 내지 53의 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 또는
    (b) 서열 56 내지 58의 CDR 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 59 내지 61의 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 사람 IL-17A에 결합하는 결합 화합물.
  27. 제26항에 있어서, 사람화 모노클로날 항체인 결합 화합물.
  28. (a) 결합 화합물이 100pM 이하의 평형 해리 상수(Kd)로 사람 IL-17A에 결합하고,
    (b) 결합 화합물이 사람 IL-17A-자극된 정상 사람 피부 섬유모세포(여기서, 사람 IL-17A 자극은 1nM 사람 IL-17A를 사용하여 실시한다)에서의 IL-6 생산의 억제에 대한 검정에서 5nM 이하의 IC50을 갖고,
    (c) 결합 화합물이 사람 IL-17A의 생물학적 활성의 시험관내 검정(여기서, 시험관내 검정은 사람 IL-17A 100pM의 생물학적 활성을 측정한다)에서 500pM 이하 의 IC50을 갖고,
    (d) 결합 화합물이, 50㎍/㎖의 혈청 농도로 마우스에 투여하는 경우, 폐로의 IL-17A-유도된 호중구 보충을 (BAL 호중구의 %로 측정하여) 50% 이상까지 감소시킬 수 있고,
    (e) 결합 화합물이 사람 IL-17A에 대한 친화도보다 20배 이하로 더 낮은 친화도(Kd)로 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이 IL-17A에 결합하고, 결합 화합물이 또한 시노몰구스 원숭이 IL-17A 활성을 억제하며,
    (f) 결합 화합물이 마우스 또는 랫트 IL-17A에 대한 친화도보다 1000배 이상 더 높은 친화도(Kd)로 사람 IL-17A에 결합하는 특성들 중의 하나 이상을 갖는, 사람 IL-17A에 결합하는 결합 화합물.
  29. 제28항에 있어서,
    (a) 결합 화합물이 20pM 이하의 평형 해리 상수(Kd)로 사람 IL-17A에 결합하고,
    (b) 결합 화합물이 사람 IL-17A-자극된 정상 사람 피부 섬유모세포(여기서, 사람 IL-17A 자극은 1nM 사람 IL-17A를 사용하여 실시한다)에서의 IL-6 생산의 억제에 대한 검정에서 1nM 이하의 IC50을 갖고,
    (c) 결합 화합물이 사람 IL-17A의 생물학적 활성의 시험관내 검정(여기서, 시험관내 검정은 사람 IL-17A 100pM의 생물학적 활성을 측정한다)에서 100pM 이하의 IC50을 갖는 특성들 중의 하나 이상을 갖는 결합 화합물.
  30. 제28항에 있어서, 사람화되거나 완전한 사람 모노클로날 항체인 결합 화합물.
  31. 사람 IL-17A에 결합하고 사람 IL-17A 활성을 중화시키는 치료학적 유효량의 결합 화합물(여기서, 결합 화합물은 항체 경쇄 가변 영역과 항체 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 5를 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열 6을 포함한다)을 이를 필요로 하는 대상체에 투여함을 포함하여, 사람 대상체를 치료하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 결합 화합물이 모노클로날 항체인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 사람 대상체가 염증 질환 또는 자가면역 질환을 갖는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 사람 대상체가 류마티스 관절염을 갖는 방법.
  35. 제33항에 있어서, 사람 대상체가 염증성 장 질병을 갖는 방법.
  36. 제31항에 있어서, 다른 면역억제제 또는 소염제를 투여함을 추가로 포함하는 방법.
  37. 사람 IL-17A에 결합하고 사람 IL-17A 활성을 중화시키는 결합 화합물(여기서, 결합 화합물은 항체 경쇄 가변 영역과 항체 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열 5를 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열 6을 포함한다)과, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 다른 면역억제제 또는 소염제를 추가로 포함하는 조성물.
  39. 제5항에 있어서, γ1, γ2, γ3 또는 γ4 사람 중쇄 고정 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 고정 영역을 추가로 포함하는 결합 화합물.
  40. 제39항에 있어서, γ1 사람 중쇄 고정 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 화합물.
  41. 제39항에 있어서, γ4 사람 중쇄 고정 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 결합 화합물.
  42. 제5항에 있어서, 카파 사람 경쇄 고정 영역을 포함하는 경쇄 고정 영역을 추가로 포함하는 결합 화합물.
  43. 제5항에 있어서, Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2 및 디아바디(diabody)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항체 단편인 결합 화합물.
  44. 제6항에 있어서, Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2 및 디아바디로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항체 단편인 결합 화합물.
  45. 제1항, 제11항, 제23항, 제26항 및 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 사람 IL-17A 활성을 억제하는 결합 화합물.
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