ES2373069T3

ES2373069T3 - Anticuerpos para il-17a.

Info

Publication number: ES2373069T3
Application number: ES07836640T
Authority: ES
Inventors: Leonard G. Presta; Edward P. Bowman
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme Corp
Priority date: 2006-08-11
Filing date: 2007-08-09
Publication date: 2012-01-31
Anticipated expiration: 2027-08-09
Also published as: US20110052596A1; ZA200901402B; CA2660463C; US8193319B2; US20110038878A1; PE20080739A1; WO2008021156A3; US20090175881A1; MX2009001620A; JP2013009680A; AU2007284782A1; JP2010500028A; KR101218484B1; WO2008021156A2; US8753843B2; US7846443B2; BRPI0715917A2; CA2660463A1; IL196968A; AU2007284782B2

Abstract

Un compuesto de unión que se une a IL-17A humana que comprende al menos un región variable de la cadena ligera de anticuerpo, o fragmento de unión de la misma, que tiene las secuencias de CDR CDRL1 a CDRL3 de SEC ID Nº: 11-13; y al menos una región variable de la cadena pesada de anticuerpo, o fragmento de unión de la misma, que tiene las secuencias de CDR CDRH1 a CDRH3 de SEC ID Nº: 14, 17 y 20 o SEC ID Nº: 14, 16 y 19.

Description

Anticuerpos para IL-17A

Campo de la invención

La invención se refiere generalmente a compuestos de unión específica a IL-17A, tales como anticuerpos, y a usos de los mismos. Más específicamente, en este documento se desvelan anticuerpos quiméricos y humanizados que reconocen IL-17A humana y modulan su actividad, particularmente en trastornos inflamatorios, autoinmunes y proliferativos.

Antecedentes de la invención

El sistema inmunitario funciona para proteger a los individuos de agentes infecciosos, por ejemplo, bacterias, organismos multicelulares y virus, además de cánceres. Este sistema incluye varios tipos de células linfoides y mieloides tales como monocitos, macrófagos, células dendríticas (CD), eosinófilos, linfocitos T, linfocitos B y neutrófilos. Estas células linfoides y mieloides producen frecuentemente proteínas de señalización conocidas como citocinas. La respuesta inmunitaria incluye inflamación, es decir, la acumulación de células inmunitarias sistémicamente o en una localización particular del cuerpo. En respuesta a un agente infeccioso o sustancia extraña, las células inmunitarias secretan citocinas que, a su vez, modulan la proliferación, desarrollo, diferenciación o migración de células inmunitarias. La respuesta inmunitaria puede producir consecuencias patológicas, por ejemplo, cuando implica inflamación excesiva, como en los trastornos autoinmunes (véase, por ejemplo, Abbas y col. (eds.) (2000) Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA; Oppenheim y Feldmann (eds.) (2001) Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, CA; von Andrian and Mackay (2000) New Engl. J. Med. 343:1020-1034; Davidson y Diamond (2001) New Engl. J. Med. 345:340-350).

La interleucina 17A (IL-17A; también conocida como antígeno 8 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA8), IL-17) es una citocina homodimérica producida por linfocitos T de memoria tras el reconocimiento de antígenos. El desarrollo de tales linfocitos T es promovido por la interleucina 23 (IL-23). McKenzie y col. (2006) Trends Immunol. 27(1): 1723; Langrish y col. (2005) J. Exp. Med. 201(2):233-40. La IL-17A actúa por dos receptores, IL-17RA y IL-17RC, para inducir la producción de numerosas moléculas que participan en la biología de los neutrófilos, inflamación y destrucción de órganos. Esta citocina sinergiza con el factor de necrosis tisular (TNF) y o interleucina 1� (IL-1�) para promover un mayor entorno pro-inflamatorio. Se ha propuesto antagonizar la actividad de IL-17A con anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos para el tratamiento de una variedad de trastornos inflamatorios, inmunitarios y proliferativos que incluyen artritis reumatoide (AR), osteoartritis, osteoporosis por artritis reumatoide, fibrosis inflamatoria (por ejemplo, esclerodermia, fibrosis pulmonar y cirrosis), gingivitis, periodontitis u otras enfermedades periodontales inflamatorias, trastornos inflamatorios del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y enfermedad inflamatoria del intestino), asma (incluyendo asma alérgico), alergias, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), esclerosis múltiple, psoriasis y cáncer (véanse, por ejemplo, los documentos US 2003/0166862, WO 2005/108616, WO 2005/051422 y WO 2006/013107). El documento WO 2004/106377 desvela anticuerpos anti-IL17 humana producidos en ratas. El anticuerpo descrito en el documento WO 2004/106377 tiene la afinidad de unión de KD 15,1 pM y anula potentemente la producción de IL6 inducida por IL17 en fibroblastos 3T3.

La limitación más significativa en el uso de anticuerpos como agente terapéutico in vivo es la inmunogenicidad de los anticuerpos. Como la mayoría de los anticuerpos monoclonales se derivan de roedores, el uso repetido en seres humanos produce la generación de una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo terapéutico, por ejemplo, anticuerpos humanos contra ratón o HAMA. Una respuesta inmunitaria tal produce una pérdida de eficacia terapéutica a un mínimo y una respuesta anafiláctica potencialmente mortal a un máximo. Los esfuerzos iniciales para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos de roedor implicaron la producción de anticuerpos quiméricos, en los que regiones variables de ratón (Fv) se fusionaron con regiones constantes humanas. Liu y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-43. Sin embargo, los ratones inyectados con híbridos de regiones variables humanas y regiones constantes de ratón desarrollan una fuerte respuesta anti-anticuerpo dirigida contra la región variable humana, sugiriendo que la retención de la región Fv de roedor completa en tales anticuerpos quiméricos puede todavía producir inmunogenicidad no deseada en pacientes.

Generalmente se cree que los bucles de la región determinante de la complementariedad (CDR) de dominios variables comprenden el sitio de unión de moléculas de anticuerpo. Por tanto, se ha intentado injertar bucles de CDR de roedor en regiones estructurales humanas (es decir, humanización) para minimizar adicionalmente las secuencias de roedor. Jones y col. (1986) Nature 321:522; Verhoeyen y col. (1988) Science 239: 1534. Sin embargo, los intercambios de bucles de CDR todavía no producen uniformemente un anticuerpo con las mismas propiedades de unión que el anticuerpo de origen. Frecuentemente también se requieren cambios en los residuos de la región estructural (FR), residuos que participan en el soporte del bucle de CDR, en anticuerpos humanizados para preservar la afinidad de unión a antígeno. Kabat y col. (1991) J. Immunol. 147:1709. Aunque se ha informado del uso de injerto de CDR y preservación de los residuos de la región estructural en varias construcciones de anticuerpos humanizados, es difícil predecir si una secuencia particular producirá el anticuerpo con las propiedades de unión deseadas, y algunas veces biológicas. Véase, por ejemplo, Queen y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029, Gorman y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181, y Hodgson (1991) Biotechnology (NY) 9:421-5. Además, la mayoría de los estudios anteriores usaron diferentes secuencias humanas para secuencias variables ligeras y pesadas de animales, siendo cuestionable la naturaleza predictiva de tales estudios. Se han usado secuencias de anticuerpos conocidos o, más normalmente, aquellas de anticuerpos que tienen estructuras cristalinas por rayos X conocidas tales como anticuerpos NEW y KOL. Véase, por ejemplo, Jones y col., arriba; Verhoeyen y col., arriba; y Gorman y col., arriba. La información exacta de secuencias se ha informado para algunas construcciones humanizadas.

Existe la necesidad de antagonistas de IL-17A tales como anticuerpos monoclonales anti-IL-17A para su uso en el tratamiento de trastornos humanos tales como trastornos inflamatorios, autoinmunes y proliferativos. Tales antagonistas presentarán preferentemente baja inmunogenicidad en sujetos humanos, permitiendo la administración repetida sin respuestas inmunitarias adversas.

Resumen de la invención

La invención se refiere a anticuerpos anti-IL-17A humana que tienen una o más propiedades deseables que incluyen altas afinidades de unión, actividades neutralizantes, buena farmacocinética y baja antigenicidad en sujetos humanos. La invención también se refiere al uso de los anticuerpos de la invención en el tratamiento de enfermedad.

Por consiguiente, en este documento se describe un compuesto de unión, por ejemplo, una molécula de anticuerpo

o fragmento de unión de la misma que se une a IL-17A humana e inhibe su actividad. El compuesto de unión de la presente invención comprende al menos un dominio variable de la cadena ligera (VL) y al menos un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo, o fragmentos de unión de estos dominios, en los que el dominio VL comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que tienen las secuencias de SEC ID Nº: 11-13 y el dominio VH comprende CDR que tienen las secuencias de SEC ID Nº 14, 17 y 20 o SEC ID Nº: 14, 16 y 19.

Las secuencias de los dominios VL y VH son las secuencias de SEC ID Nº: 5 y 6, respectivamente. El compuesto de unión a IL-17A descrito en este documento inhibe la actividad de IL-17A humana.

La invención proporciona un compuesto de unión que se une a IL-17A humana que tiene dominios VL y VH con al menos el 90% de homología de secuencias con las secuencias de SEC ID Nº: 5 y 6, respectivamente.

El compuesto de unión de la presente invención comprende dominios VL y VH que tienen hasta 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 sustituciones de aminoácidos conservativas con referencia a las secuencias de SEC ID Nº: 5 y 6, respectivamente. El compuesto de unión de la invención es un anticuerpo que tiene una cadena ligera y una cadena pesada con hasta 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 sustituciones de aminoácidos conservativas con referencia a las formas maduras de las secuencias de SEC ID Nº: 2 y 4, respectivamente.

El compuesto de unión de la presente invención es un anticuerpo o fragmento de unión del mismo, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2 y un diacuerpo. El compuesto de unión de la presente invención es el anticuerpo hu16C10 que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de la forma madura de SEC ID Nº: 2 (residuos 1-220) y una cadena pesada que tiene la secuencia de la forma madura de SEC ID Nº: 4 (residuos 1-454). En otra realización, el compuesto de unión es el anticuerpo producido a partir del vector de expresión que tiene nº de acceso de ATCC PTA-7675 (hu16C10 en el plásmido pAIL17AV1, depositado el 28 de junio de 2006).

El compuesto de unión de la invención comprende una región constante de la cadena pesada, por ejemplo, una región constante humana tal como la región constante humana de la cadena pesada y1, y2, y3 o y4 o una variante de la misma. El compuesto de unión de la invención comprende una región constante de la cadena ligera, por ejemplo, una región constante de la cadena ligera humana tal como la región de la cadena ligera humana lambda o kappa o variante de la misma.

La invención también se refiere a: un ácido nucleico aislado, por ejemplo, ADN que codifica un compuesto de unión de la presente invención, por ejemplo, un anticuerpo (o fragmento de unión del mismo) que se une a IL-17A humana. En una realización, el ácido nucleico aislado codifica un compuesto de unión que comprende al menos un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y al menos un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo, o fragmentos de unión de estos dominios, en los que el dominio VL comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que tienen las secuencias de SEC ID Nº: 11-13 y el dominio VH comprende CDR que tienen las secuencias de SEC ID Nº: 14 17 y 20 ó 14, 16 y 19.

El ácido nucleico aislado codifica una o ambas de las secuencias de las regiones variables de la cadena ligera y pesada de SEC ID Nº: 5 y 6, respectivamente. El ácido nucleico aislado de la presente invención codifica el anticuerpo 16C10 que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de la forma madura de SEC ID Nº: 2 y una cadena pesada que tiene la secuencia de la forma madura de SEC ID Nº: 4. El ácido nucleico aislado también puede comprender los nucleótidos 58-717 de SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 62 y el ácido nucleico aislado también puede comprender los nucleótidos 58-1419 de SEC ID Nº: 3 o SEC ID Nº: 63. El ácido nucleico aislado de la presente invención comprende la secuencia de SEC ID Nº: 1 y la secuencia de SEC ID Nº: 3. El ácido nucleico aislado también puede comprender la secuencia de SEC ID Nº: 62 y la secuencia de SEC ID Nº: 63.

El ácido nucleico aislado codifica tanto una cadena ligera como una cadena pesada en una única molécula de ácido nucleico, y en otras realizaciones las cadenas ligeras y pesadas son codificadas en dos o más moléculas de ácidos nucleicos separadas.

La invención se refiere a vectores de expresión que comprenden los ácidos nucleicos aislados de la invención en los que el ácido nucleico está operativamente ligado para controlar las secuencias que son reconocidas por una célula huésped cuando la célula huésped se transfecta con el vector. En una realización, el vector de expresión tiene el nº de acceso de ATCC PTA-7675 (hu16C10 en el plásmido pAIL17AV1, depositado el 28 de junio de 2006).

La invención se refiere a una célula huésped que comprende un vector de expresión de la invención. La invención se refiere además a procedimientos de producción de un compuesto de unión de la invención que comprende cultivar una célula huésped que alberga un vector de expresión que codifica el compuesto de unión en medio de cultivo, y aislar el compuesto de unión de la célula huésped o medio de cultivo.

La invención también se refiere a compuestos de unión, tales como anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos, que se unen al mismo epítope en IL-17A humana como anticuerpos 16C10; por ejemplo, anticuerpos que pueden bloquear de forma cruzada la unión de cualquiera de estos anticuerpos de la invención, o anticuerpos que se unen dentro del epítope definido por los residuos de aminoácidos 74-85 de IL-17A humana (SEC ID Nº: 40).

La invención también se refiere a compuestos de unión a IL-17A humana de alta afinidad tales como anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos tales como compuestos de unión que se unen con constantes de disociación de equilibrio (Kd) de 1000, 500, 100, 50, 20, 10, 5, 2 pM o menos (es decir, mayor afinidad). La invención también se refiere a compuestos de unión que tienen potente actividad biológica, tal como una CI50 de 5000, 2000, 1000, 500 pM cuando se mide en un ensayo de actividad biológica en el que la estimulación de IL-17A se efectúa a una concentración de 1000 pM (1 nM), tal como producción estimulada por IL-17A de IL-6 de fibroblastos dérmicos humanos normales, fibroblastos del prepucio o sinoviocitos. La invención también se refiere a compuestos de unión que tienen una CI50 de 1000, 500, 200, 100, 50 pM o menos cuando se mide en un ensayo de actividad biológica en el que la estimulación de IL-17A se efectúa a una concentración de 100 pM, tal como el ensayo de proliferación de Ba/F3-hIL-17Rc-mGCSFR. En general, la invención se refiere a compuestos de unión que pueden inhibir la actividad de IL-17A humana en ensayos biológicos a concentraciones que oscilan de 10X, 5X, 2X, 1X y de tan sólo 0,5X la concentración de IL-17A, cuando la concentración de IL-17A es, por ejemplo, 5, 10, 50, 100, 500 ó 1000 pM o superior.

La invención también se refiere a compuestos de unión que pueden reducir el 50% o más el reclutamiento de neutrófilos inducido por IL-17A al pulmón cuando se administran a ratones para dar una concentración de compuesto de unión en suero de 50, 40, 30, 20 !g/ml o menos.

En una realización, el compuesto de unión se une a IL-17A de mono cinomolgo con una afinidad (Kd) que no es superior a 5, 10 ó 20 veces inferior a su afinidad por IL-17A humana. En otra realización, el compuesto de unión se une a IL-17A humana con una afinidad (Kd) que es 100, 500, 1000 o 2000 veces superior a su afinidad por IL-17A de ratón o de rata.

La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de unión a IL-17A humana de la invención para su uso en el tratamiento de sujetos, que incluye sujetos humanos. Tales sujetos pueden tener un trastorno inflamatorio o autoinmune tal como artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis, esclerosis múltiple, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística, esclerodermia sistémica, rechazo de aloinjerto, miocarditis autoinmune o adhesiones peritoneales. Tales composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento pueden comprender adicionalmente administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales tales como agentes inmunosupresores o antiinflamatorios. En una realización, al sujeto se le ha diagnosticado una enfermedad mediada por IL-17A. En otra realización, al sujeto se le ha diagnosticado artritis reumatoide. En otra realización más, al sujeto se le ha diagnosticado esclerosis múltiple.

La invención también se refiere a composiciones y formulaciones de los compuestos de unión de la invención que comprenden el compuesto de unión y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente uno o más agentes inmunosupresores o antiinflamatorios.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 A muestra alineamientos de los dominios variables de la cadena ligera de varios anticuerpos anti-IL-17A humana según la presente invención. VL de 16C10 de rata = SEC ID Nº: 7; VL de 16C10 humano = SEC ID Nº: 5; VL de 4C3 de rata = SEC ID Nº: 21; VL de 4C3 humano = SEC ID Nº: 5; VL de 23EI2 de rata = SEC ID Nº: 45; VL de 30C10 de rata = SEC ID Nº: 24; VL de 30C10 humano = SEC ID Nº: 22; VL de 12E6 de rata = SEC ID Nº: 32; VL de ID10 de rata = SEC ID Nº: 54. Se indican las CDR (y se proporcionan en la Tabla 3). La numeración es según Kabat y col. (1991) “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, Departamento estadounidense de salud y servicios sociales, NIH Pub. 91-3242, 5ª ed., denominado en este documento “Kabat y col. (1991)”. La Figura 1B muestra alineamientos de los dominios variables de la cadena pesada de varios anticuerpos anti-IL-17A humana según la presente invención. VH de 16C10 de rata = SEC ID Nº: 8; VH de 16C10 humano = SEC ID Nº: 6; VH de 4C3 de rata = SEC ID Nº: 8; VH de 4C3 humano = SEC ID Nº: 6; VH de 23EI2 de rata = SEC ID Nº: 47; VH de 30C10 de rata = SEC ID Nº: 25; VH de 30C10 humano = SEC ID Nº: 23; VH de 12E6 de rata = SEC ID Nº: 33; VH de 1D10 de rata = SEC ID Nº: 55. Se indican las CDR (y se proporcionan en la Tabla 4). La numeración es según Kabat y col. (1991). La Figura 2A muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo anti-IL-17A humanizado 6C10 según la presente invención (la forma madura de SEC ID NO: 2, es decir, los residuos 1220). Se indican las CDR. La Figura 2B muestra la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada del anticuerpo anti-IL-17A humanizado 16C10 según la presente invención (la forma madura de SEC ID Nº: 4, es decir, los residuos 1454). Se indican las CDR. Las Figuras 3A-3D muestra los efectos de tratamientos con anticuerpo anti-IL-17A en la patología en el modelo de ratón de AIC de artritis reumatoide. Los tratamientos incluyen administración del anticuerpo antiIL-17A ID10 (a 28, 7 y 2 mg/kg) y administración de un control de isotipo (7 mg/kg). La Figura 3A presenta la puntuación de la gravedad de la enfermedad visual (DSS), una medida de hinchazón de las patas y rojez visual, en función del tratamiento con anticuerpo. La puntuación es: 0 = las patas parecen iguales que la pata de control (sin tratar); 1 = inflamación de un dedo en una pata dada; 2 = inflamación de dos dedos o la palma de una pata dada; 3 = inflamación de la palma y dedo(s) de una pata dada. La Figura 3B presenta lesión de cartílago (por histopatología) en función del tratamiento con anticuerpo. La puntuación es: 0 = normal; 1 = mínima, 2 = leve; 3 = moderada; 4 = grave. La Figura 3C presenta erosión ósea (por histopatología) en función del tratamiento con anticuerpo. La puntuación es: 0 = normal; 1 = mínima, 2 = leve; 3 = moderada; 4 = grave. La Figura 3D presenta erosión ósea (por histopatología) para patas de ratones de AIC que puntuaron 2 ó 3 en DSS visual, es decir, patas altamente inflamadas. rIgG1 es un anticuerpo de control de isotipo. La puntuación es: 0 = normal; 1 = mínima, 2 = leve; 3 = moderada; 4 = grave. La Figura 4 presenta el % de neutrófilos en BAL (una medida del reclutamiento de neutrófilos al pulmón) en ratones que habían sido tratados intranasalmente con IL-17A humana en función de la concentración en suero de diversos anticuerpos anti-IL-17A humana de la presente invención (1D10, 16C10, 4C3) y un control de isotipo. Los triángulos rellenos representan experimentos de control sin ningún anticuerpo anti-IL17A añadido y los puntos de datos más a la izquierda (triángulos blancos) son controles sin estimular. La Figura 5A muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 62) que codifica la cadena ligera del anticuerpo anti-IL-17A humanizado 16C10. La Figura 5B muestra una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada del anticuerpo anti-IL17A humanizado 16C10 (SEC ID Nº: 63).

Descripción detallada

I. Definiciones.

De manera que la invención pueda entenderse más fácilmente, ciertos términos técnicos y científicos se definen específicamente a continuación. A menos que se defina específicamente en cualquier otro sitio en este documento, todos los otros términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.

Como se usa en este documento, que incluye las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de palabras tales como “un”, “una”, “el” y “la” incluyen sus correspondientes referencias plurales, a menos que el contexto dice claramente de otro modo.

“Activación”, “estimulación” y “tratamiento”, como se aplica a células o a receptores, puede tener el mismo significado, por ejemplo, activación, estimulación o tratamiento de una célula o receptor con un ligando, a menos que se indique de otro modo por el contexto o explícitamente. “Ligando” engloba ligandos naturales y sintéticos, por ejemplo, citocinas, variantes de citocinas, análogos, muteínas y compuestos de unión derivados de anticuerpos. “Ligando” también engloba moléculas pequeñas, por ejemplo, peptidomiméticos de citocinas y peptidomiméticos de anticuerpos. “Activación” puede referirse a la activación de células como se regula por mecanismos internos, además de por factores externos o medioambientales. “Respuesta”, por ejemplo, de una célula, tejido, órgano u organismo engloba un cambio en el comportamiento bioquímico o fisiológico, por ejemplo, concentración, densidad, adhesión o migración dentro de un compartimento biológico, velocidad de expresión génica o estado de diferenciación, en el que el cambio guarda relación con la activación, estimulación o tratamiento, o con mecanismos internos tales como programación genética.

“Actividad” de una molécula puede describir o se refiere a la unión de la molécula a un ligando o a un receptor, a actividad catalítica; a la capacidad para estimular expresión génica o señalización celular, diferenciación o maduración; a actividad antigénica, a la modulación de actividades de otras moléculas y similares. “Actividad” de una molécula también puede referirse a actividad en la modulación o el mantenimiento de interacciones célula a célula, por ejemplo, adhesión, o actividad en el mantenimiento de una estructura de una célula, por ejemplo, membranas celulares o citoesqueleto. La “actividad” también puede significar actividad específica, por ejemplo, [actividad catalítica]/[mg de proteína], o [actividad inmunológica]/[mg de proteína], concentración en un compartimento biológico, o similares. La “actividad” puede referirse a modulación de componentes de los sistemas inmunitarios innatos o adaptativos. “Actividad proliferativa” engloba una actividad que promueve, que es necesaria para o que está específicamente asociada a, por ejemplo, división de células normales, además de cáncer, tumores, displasia, transformación de células, metástasis y angiogénesis.

5 “Administración” y “tratamiento”, como se aplica a un animal, ser humano, sujeto experimental, célula, tejido, órgano

o fluido biológico, se refiere al contacto de un agente farmacéutico, terapéutico, de diagnóstico o composición exógena con el animal, ser humano, sujeto, célula, tejido, órgano o fluido biológico. “Administración” y “tratamiento” pueden referirse, por ejemplo, a procedimientos terapéuticos, farmacocinéticos, diagnósticos, de investigación y experimentales. El tratamiento de una célula engloba poner en contacto un reactivo con la célula, además de poner 10 en contacto un reactivo con un fluido, estando el fluido en contacto con la célula. “Administración” y “tratamiento” también significan tratamientos in vitro y ex vivo, por ejemplo, de una célula, por un reactivo, compuesto de diagnóstico, de unión, o por otra célula. “Tratamiento”, como se aplica a un sujeto humano, veterinario o de investigación, se refiere a tratamiento terapéutico, medidas profilácticas o preventivas, a aplicaciones de investigación y de diagnóstico. “Tratamiento” como se aplica a un sujeto humano, veterinario o de investigación, o

15 célula, tejido u órgano, engloba el contacto de un agonista de IL-17A o antagonista de IL-17A con un sujeto humano

o animal, una célula, tejido, compartimento fisiológico o fluido fisiológico. “Tratamiento de una célula” también engloba situaciones en las que el agonista de IL-17A o antagonista de IL-17A se pone en contacto con el receptor de IL-17A, por ejemplo, en la fase fluida o fase coloidal, pero también situaciones en las que el agonista o antagonista no se pone en contacto con la célula o el receptor.

20 “Tratar” significa administrar un agente terapéutico, tal como una composición que contiene cualquiera de los compuestos de unión de la presente invención, internamente o externamente a un paciente que tiene uno o más síntomas de enfermedad para los que el agente tiene actividad terapéutica conocida. Normalmente, el agente se administra en una cantidad eficaz para aliviar uno o más síntomas de enfermedad en el paciente tratado o población, tanto induciendo la regresión de cómo inhibiendo la progresión de tal(es) síntoma(s) por cualquier grado

25 clínicamente medible. La cantidad de un agente terapéutico que es eficaz para aliviar cualquier síntoma de enfermedad particular (también denominada en lo sucesivo la “cantidad terapéuticamente eficaz”) puede variar según factores tales como el estado de enfermedad, edad y peso del paciente, y la capacidad del fármaco para provocar una respuesta deseada en el paciente. Si un síntoma de enfermedad se ha aliviado puede evaluarse por cualquier medición clínica normalmente usada por médicos y otros profesionales sanitarios expertos para evaluar la

30 gravedad o el estado de progresión de ese síntoma. Aunque una realización de la presente invención (por ejemplo, un procedimiento de tratamiento o artículo de fabricación) puede no ser eficaz en aliviar el (los) síntoma(s) de enfermedad diana en un paciente, debe aliviar el (los) síntoma(s) de enfermedad diana en un número estadísticamente significativo de pacientes como se ha determinado por cualquier prueba estadística conocida en la técnica tal como la prueba de la t de Student, la prueba de chi2, la prueba de U según Mann y Whitney, la prueba de

35 Kruskal-Wallis (prueba de la H), la prueba de Jonckheere-Terpstra y la prueba de Wilcoxon.

En este documento se mencionan cuatro variantes de la proteína IL-17A humana. i) Como se usa en este documento, los términos “IL-17A humana” y “IL-17A humana nativa” (“huIL-17A” y “humIL-17A”) se refieren a las formas maduras (es decir, los residuos 24-155) de los números de acceso de la proteína IL-17A humana NP_002181 y AAT22064, y variantes que se producen naturalmente y polimorfismos de la misma. ii) Como se usa 40 en este documento, el término “rhIL-17A” se refiere a un derivado recombinante de IL-17A humana nativa en el que dos aminoácidos adicionales (LE) están unidos al extremo N de la forma madura de IL-17A humana nativa. Esta nomenclatura es adoptada por comodidad con referencia a diversas formas de IL-17A, y no puede coincidir el uso en la bibliografía. iii) Como se usa en este documento, el término “FLAG-huIL-17A” se refiere a una variante de IL-17A humana nativa que tiene unida una marca de péptido FLAG® en el extremo N. En algunos experimentos, la FLAG

45 huIL-17A se biotinila. iv) IL-17A humana R&D Systems citada en este documento son los residuos 20-155 de los números de acceso de la proteína IL-17A humana NP_002181 y AAT22064, con una metionina adicional en el extremo N. La Tabla 1 es un resumen de los extremos N de las variantes de las moléculas de IL-17A citadas en este documento.

TABLA 1

Formas variantes de IL-17A humana

Variante de IL-17A: Secuencia (N�C) SEC ID Nº:

huIL-17A (nativa): GITIPRN . . . VHHVA 40

rhIL-17A: LEGITIPRN . . . VHHVA 41

FLAG-huIL-17A: DYKDDDDKLGITIPRN . . .VHHVA 42

IL-17A R&D: MIVKAGITIPRN . . . VHHVA 43

A menos que se observe de otro modo, cualquier IL-17A usada en los experimentos descritos en este documento que se produzca usando vectores adenovíricos es rhIL-17A. El término “IL-17A” se refiere generalmente a IL-17A humana, nativa o recombinante, y no a homólogos humanos de IL-17A humana. A menos que se indique de otro modo, las concentraciones molares de IL-17A se calculan usando el peso molecular de un homodímero de IL-17A (por ejemplo, 30 kDa para IL-17A humana).

Como se usa en este documento, el término “anticuerpo” se refiere a cualquier forma de anticuerpo que presente la actividad biológica deseada. Por tanto, se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente, pero no se limita a, anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos). Como se usa en este documento, los términos “fragmento de unión a IL-17A” o “fragmento de unión” de un anticuerpo (el “anticuerpo parental”) engloban un fragmento o un derivado de un anticuerpo que normalmente incluye al menos una parte de las regiones de unión a antígeno o variables (por ejemplo, una o más CDR) del anticuerpo parental que retiene al menos algo de la especificidad de unión del anticuerpo parental. Ejemplos de fragmentos de unión de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenarias, por ejemplo, sc-Fv; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir fragmentos de anticuerpos. Normalmente, un fragmento de unión o derivado retiene al menos el 10% de su actividad de unión a IL-17A cuando esa actividad se expresa en una base molar. Preferentemente, un fragmento de unión o derivado retiene al menos el 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% o el 100% o más de la afinidad de unión a IL-17A como el anticuerpo parental. También está previsto que un fragmento de unión a IL-17A pueda incluir sustituciones de aminoácidos conservativas (denominadas en lo sucesivo “variantes conservativas” del anticuerpo) que no alteran sustancialmente su actividad biológica. El término “compuesto de unión” se refiere tanto a anticuerpos como a fragmentos de unión de los mismos.

Un “fragmento Fab” comprende una cadena ligera y las regiones CH1 y variables de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula de Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de la cadena pesada.

Una región “Fc” contiene dos fragmentos de la cadena pesada que comprenden los dominios CH1 y CH2 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de la cadena pesada se mantienen juntos por dos o más enlaces disulfuro y por interacciones hidrófobas de los dominios CH3.

Un fragmento “Fab'” contiene una cadena ligera y una parte de una cadena pesada que contiene el dominio VH y el dominio CH1 y también la región entre los dominios CH1 y CH2, de forma que puede formarse un enlace disulfuro entre las cadenas entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab' para formar una molécula F(ab')2.

Un “fragmento F(ab')2” contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una parte de la región constante entre los dominios CH1 y CH2 de forma que se forma un enlace disulfuro entre las cadenas entre las dos cadenas pesadas. Por tanto, un fragmento F(ab')2 está compuesto por dos fragmentos Fab' que se mantienen juntos por un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas.

La “región Fv” comprende las regiones variables de tanto las cadenas pesadas como las ligeras, pero carece de las regiones constantes.

El término “Fv monocatenario” o anticuerpo “scFv” se refiere a fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una única cadena de polipéptidos. Generalmente, el polipéptido de Fv comprende además un ligador de polipéptidos entre los dominios VH y VL que permite que scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de scFv véase Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, pág. 269-315. Véase también la publicación de solicitud de patente internacional nº WO 88/01649 y las patentes de EE.UU. nº 4.946.778 y 5.260.203.

Un “anticuerpo de dominio” es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que sólo contiene la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones VH están covalentemente unidas con un ligador de péptidos para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones VH de un anticuerpo de dominio bivalente pueden elegir como diana los mismos antígenos o diferentes.

Un “anticuerpo bivalente” comprende dos sitios de unión a antígeno. En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades de antígeno. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos (véase más adelante).

Como se usa en este documento, a menos que se indique de otro modo, un anticuerpo “anti-IL-17A” se refiere a un anticuerpo que se produce contra IL-17A humana o una variante de la misma, tal como huIL-17A, rhIL-17A, FLAGhuIL-17A y IL-17A R&D, o cualquier fragmento antigénico de las mismas.

El término “anticuerpo monoclonal” como se usa en este documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único epítope antigénico. A diferencia, las preparaciones convencionales de anticuerpos (policlonales) normalmente incluyen una multitud de anticuerpos dirigidos contra (o específicos por) epítopes diferentes. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo que se obtiene a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a usarse según la presente invención puede prepararse por el procedimiento de hibridomas descrito por primera vez por Kohler y col. (1975) Nature 256: 495, o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” también pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos en fago usando las técnicas descritas en, por ejemplo, Clackson y col. (1991) Nature 352: 624-628 y Marks y col. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597. Véase también Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731.

Los anticuerpos monoclonales en este documento incluyen específicamente anticuerpos “quiméricos” (inmunoglobulinas) en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico a u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, además de fragmentos de tales anticuerpos, mientras que presentan la actividad biológica deseada (patente de EE.UU. nº 4.816.567; y Morrison y col., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).

Como se usa en este documento, un “anticuerpo quimérico” es un anticuerpo que tiene el dominio variable de un primer anticuerpo y el dominio constante de un segundo anticuerpo, siendo el primer y segundo anticuerpo de diferentes especies. Normalmente, los dominios variables se obtienen de un anticuerpo de un animal experimental (el “anticuerpo parental”) tal como un roedor y las secuencias del dominio constante se obtienen de anticuerpos humanos, de manera que será menos probable que el anticuerpo quimérico resultante provoque una respuesta inmunitaria adversa en un sujeto humano que el anticuerpo de roedor parental.

Los anticuerpos monoclonales en este documento también incluyen anticuerpos de un solo dominio camelizados. Véanse, por ejemplo, Muildermans y col. (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230; Reichmann y col. (1999) J. Immunol Methods 231:25; documentos WO 94/04678; WO94/25591; patente de EE.UU. nº 6.005.079.

También se describen anticuerpos de un solo dominio que comprenden dos dominios VH con modificaciones de forma que se forman anticuerpos de un solo dominio.

Como se usa en este documento, el término “diacuerpos” se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptidos (VH-VL o VL-VH). Usando un ligador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y a crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, los documentos EP 404,097; WO 93/11161; y Holliger y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. Para una revisión de variantes de anticuerpos manipulados por ingeniería véase generalmente Holliger y Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:11261136.

Como se usa en este documento, el término “anticuerpo humanizado” se refiere a formas de anticuerpos que contienen secuencias de anticuerpos tanto humanos como no humanos (por ejemplo, murino, de rata). En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos un, y normalmente dos, dominios variables, correspondiéndose todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables con aquellos de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones estructurales (FR) son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina humana (Fc).

Los anticuerpos descritos en este documento también incluyen anticuerpos con regiones Fc modificadas (o bloqueadas) para proporcionar funciones efectoras alteradas. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.624.821; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702. Tal modificación puede usarse para potenciar o suprimir diversas reacciones del sistema inmunitario, con posibles efectos beneficiosos en el diagnóstico y la terapia. Las alteraciones de la región Fc incluyen cambios de aminoácidos (sustituciones, deleciones e inserciones), glicosilación o desglicosilación, y añadir múltiples Fc. Los cambios a Fc también pueden alterar la semivida de los anticuerpos en anticuerpos terapéuticos, permitiendo una dosificación menos frecuente y, por tanto, elevada comodidad y disminución del uso de material. Véase Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 a 734-35.

El término “anticuerpo completamente humano” se refiere a un anticuerpo que sólo comprende secuencias de proteína de inmunoglobulina humana. Un anticuerpo completamente humano puede contener cadenas de hidratos de carbono murinos si se produce en un ratón, en una célula de ratón o en un hibridoma derivado de una célula de ratón. Similarmente, “anticuerpo de ratón” se refiere a un anticuerpo que sólo comprende secuencias de inmunoglobulina de ratón. Alternativamente, un anticuerpo completamente humano puede contener cadenas de hidratos de carbono de rata si se produce en una rata, en una célula de rata o en un hibridoma derivado de una célula de rata. Similarmente, “anticuerpo de rata” se refiere a un anticuerpo que sólo comprende secuencias de inmunoglobulina de rata.

Como se usa en este documento, el término “región hipervariable” se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una “región determinante de la complementariedad” o “CDR” (es decir, los residuos 24-34 (CDRL1). 50-56 (CDRL2) y 89-97 (CDRL3) en el dominio variable de la cadena ligera y los residuos 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) y 95-102 (CDRH3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, Md.) y/o aquellos residuos de un “bucle hipervariable” (es decir, los residuos 26-32 (CDRL1), 50-52 (CDRL2) y 91-96 (CDRL3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (CDRH1), 53-55 (CDRH2) y 96-101 (CDRH3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). Como se usa en este documento, el término residuos de la “región estructural” o “FR” se refiere a aquellos residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable definidos en este documento como residuos de CDR.

“Sustancia de unión” se refiere a una molécula, molécula pequeña, macromolécula, anticuerpo, un fragmento o análogo de los mismos, o receptor soluble, que puede unirse a una diana. “Sustancia de unión” también puede referirse a un complejo de moléculas, por ejemplo, un complejo no covalente, a una molécula ionizada y a una molécula covalentemente o no covalentemente modificada, por ejemplo, modificada por fosforilación, acilación, reticulación, ciclación o escisión limitada que puede unirse a una diana. “Sustancia de unión” también puede referirse a una molécula que puede unirse a una diana en combinación con un estabilizador, excipiente, sal, tampón, disolvente o aditivo. “Unión” puede definirse como una asociación de la sustancia de unión con una diana en la que la asociación produce reducción en el movimiento browniano normal de la sustancia de unión, en los casos en los que la sustancia de unión pueda disolverse o suspenderse en disolución.

“Variantes conservativamente modificadas” o “sustitución conservativa” se refiere a sustituciones de aminoácidos en una proteína con otros aminoácidos que tienen características similares (por ejemplo carga, tamaño de las cadenas laterales, hidrofobia/hidrofilia, conformación del esqueleto y rigidez, etc.), de forma que los cambios puedan hacerse frecuentemente sin alterar la actividad biológica de la proteína. Aquellos expertos en esta materia reconocen que, en general, las sustituciones de un solo aminoácido en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson y col. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., pág. 224 (4tª ed.)). Además, es menos probable que las sustituciones de aminoácidos estructuralmente o funcionalmente similares perturben la actividad biológica. Diversas realizaciones de los compuestos de unión de la presente invención comprenden cadenas de polipéptidos con secuencias que incluyen hasta 0 (sin cambios), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20 o más sustituciones de aminoácidos conservativas cuando se comparan con las secuencias de aminoácidos específicas desveladas en este documento, por ejemplo, SEC ID Nº: 2, 4, 5 ó 6. Como se usa en este documento, la frase “hasta X” sustituciones de aminoácidos conservativas incluye 0 sustituciones y cualquier número de sustituciones hasta e incluyendo X sustituciones. Tales sustituciones a modo de ejemplo se hacen preferentemente según aquellas expuestas en la Tabla 2 del siguiente modo:

TABLA 2 Sustituciones de aminoácidos conservativos a modo de ejemplo

Residuo original Sustitución conservativa Ala (A) Gly; Ser Arg (R) Lys; His Asn (N) Gln; His Asp (D) Glu; Asn Cys (C) Ser; Ala Gln (Q) Asn Glu (E) Asp; Gln Gly (G) Ala His (H) Asn; Gln

Ile (I) Leu; Val Leu (L) Ile; Val Lys (K) Arg; His Met (M) Leu; Ile; Tyr Phe (F) Tyr; Met; Leu Pro (P) Ala Ser (S) Thr Thr (T) Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr (Y) Trp; Phe Val (V) Ile; Leu

Las expresiones “consiste esencialmente en” o variaciones tales como “consisten esencialmente en” o “consistir esencialmente en” como se usan en este documento indican la inclusión de cualquier elemento citado o grupo de

5 elementos, y la inclusión opcional de otros elementos, de naturaleza similar o diferente a la de los elementos citados, que no cambian materialmente las propiedades básicas o novedosas de la pauta de dosificación especificada, procedimiento o composición. Como ejemplo no limitante, un compuesto de unión que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos citada también puede incluir uno o más de los aminoácidos que no afectan materialmente las propiedades del compuesto de unión.

10 “Cantidad eficaz” engloba una cantidad suficiente para mejorar o prevenir un síntoma o signo de la afección médica. Cantidad eficaz también significa una cantidad suficiente para permitir o facilitar el diagnóstico. Una cantidad eficaz para un paciente particular o sujeto veterinario puede variar dependiendo de factores tales como la afección que está tratándose, la salud general del paciente, la vía de procedimiento y la dosis de administración y la gravedad de efectos secundarios (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.888.530 concedida a Netti, y col.). Una cantidad

15 eficaz puede ser la máxima dosis o protocolo de dosificación que evita efectos secundarios significativos o efectos tóxicos. El efecto producirá una mejora de una medida o parámetro de diagnóstico de al menos el 5%, normalmente de al menos el 10%, más normalmente de al menos el 20%, lo más normalmente de al menos el 30%, preferentemente de al menos el 40%, más preferentemente de al menos el 50%, lo más preferentemente de al menos el 60%, idealmente de al menos el 70%, más idealmente de al menos 80% y lo más idealmente de al menos

20 90%, definiéndose el 100% como el parámetro de diagnóstico mostrado por un sujeto normal (véase, por ejemplo, Maynard y col. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., Londres, RU).

“Exógeno” se refiere a sustancias que se producen fuera de un organismo, célula o cuerpo humano, dependiendo del contexto. “Endógeno” se refiere a sustancias que se producen dentro de una célula, organismo o cuerpo humano, dependiendo del contexto.

“Homología” se refiere a la similitud de secuencias entre dos secuencias de polinucleótidos o entre dos secuencias de polipéptidos. Si una posición en ambas de las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma base o subunidad monomérica de aminoácido, por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces las moléculas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias es una función del número de coincidencias o posiciones homólogas compartidas por las dos secuencias dividido entre el número de posiciones comparadas × 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias coinciden o son homólogas cuando las secuencias se alinean óptimamente, entonces las dos secuencias son homólogas el 60%. Generalmente, la comparación se hace cuando las dos secuencias están alineadas para dar la máxima homología en porcentaje.

“Afección inmunitaria” o “trastorno inmunitario” engloba, por ejemplo, inflamación patológica, un trastorno inflamatorio y un trastorno o enfermedad autoinmunitaria. “Afección inmunitaria” también se refiere a infecciones, infecciones persistentes y afecciones proliferativas tales como cáncer, tumores y angiogénesis que incluyen infecciones, tumores, y cánceres que resisten a la erradicación por el sistema inmunitario. “Afección cancerígena” incluye, por ejemplo, cáncer, células cancerosas, tumores, angiogénesis y afecciones precancerígenas tales como displasia.

“Trastorno inflamatorio” significa un trastorno o afección patológica en el que la patología resultada, en conjunto o en parte, de, por ejemplo, un cambio en el número, cambio en la velocidad de migración o cambio en la activación de células del sistema inmunitario. Las células del sistema inmunitario incluyen, por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B, monocitos o macrófagos, células presentadoras de antígeno (APC), células dendríticas, microglía, células NK, células NKT, neutrófilos, eosinófilos, mastocitos, o cualquier otra célula específicamente asociada a la inmunología, por ejemplo, células endoteliales o epiteliales productoras de citocinas.

“Compuesto de unión aislado” se refiere al estado de purificación de un compuesto de unión y en tal contexto significa que la molécula está sustancialmente libre de otras moléculas biológicas tales como ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, hidratos de carbono u otro material tal como residuos celulares y medios de crecimiento. Generalmente, el término “aislado” no pretende referirse a una ausencia completa de material tal o a una ausencia de agua, tampones o sales, a menos que estén presentes en cantidades que interfieran sustancialmente con el uso experimental o terapéutico del compuesto de unión como se describe en este documento.

“Molécula de ácido nucleico aislada” significa un ADN o ARN de origen genómico, de ARNm, ADNc o sintético, o alguna combinación de los mismos que no está asociada a todo un polinucleótido o a una parte de un polinucleótido en el que el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, o está ligado a un polinucleótido al que no está ligado en la naturaleza. Para los fines de esta divulgación debe entenderse que “una molécula de ácido nucleico que comprende” una secuencia de nucleótidos particular no engloba cromosomas intactos. Moléculas de ácidos nucleicos aisladas “que comprenden” secuencias de ácidos nucleicos especificadas pueden incluir, además de las secuencias especificadas, secuencias codificantes para hasta diez o incluso hasta veinte o más otras proteínas o porciones de las mismas, o pueden incluir secuencias reguladoras operativamente ligadas que controlan la expresión de la región codificante de las secuencias de ácidos nucleicos citadas, y/o pueden incluir secuencias de vector.

La frase “secuencias de control” se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operativamente ligada en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. Las células eucariotas son conocidas por usar promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Un ácido nucleico está “operativamente ligado” cuando se pone en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o conductor secretor está operativamente ligado a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente ligado a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosoma está operativamente ligado a una secuencia codificante si está posicionado de manera que facilite la traducción. Generalmente, “operativamente ligado” significa que las secuencias de ADN que están ligadas son contiguas y, en el caso de un conductor secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. El enlace se lleva a cabo por ligación en sitios de restricción convenientes. Si no existen tales sitios se usan adaptadores o ligadores de oligonucleótidos sintéticos según la práctica convencional.

Como se usa en este documento, las expresiones “célula”, “línea celular” y “cultivo celular” se usan indistintamente y todas tales designaciones incluyen progenie. Por tanto, las palabras “transformantes” y “células transformadas” incluyen la célula objeto primaria y cultivos derivados de la misma sin considerar el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el ADN contenido, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Está incluida la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada en la célula originariamente transformada. Si están previstas distintas designaciones, será evidente a partir del contexto.

Como se usa en este documento, “reacción en cadena de la polimerasa” o “PCR” se refiere a un procedimiento o técnica en el que cantidades diminutas de un trozo específico de ácido nucleico, ARN y/o ADN se amplifican como se describe en, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.683.195. Generalmente, la información de secuencias de los extremos de la región de interés o más allá necesita estar disponible, de forma que puedan diseñarse cebadores de oligonucleótidos; estos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a las cadenas opuestas del molde que va a amplificarse. Los nucleótidos del extremo 5' de los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR puede usarse para amplificar secuencias de ARN específicas, secuencias de ADN específicas de ADN genómico total y ADNc transcrito a partir de ARN celular total, secuencias de bacteriófagos o plásmidos, etc. Véase generalmente Mullis y col. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.) Como se usa en este documento, la PCR se considera que es un ejemplo, pero no el único, de un procedimiento de reacción de la polimerasa de ácido nucleico para amplificar una muestra de prueba de ácido nucleico que comprende el uso de un ácido nucleico conocido como cebador y una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar un trozo específico de ácido nucleico.

Como se usa en este documento, la expresión “secuencia de la línea germinal” se refiere a una secuencia de las secuencias de ADN de inmunoglobulina sin reordenar. Puede usarse cualquier fuente de inmunoglobulina adecuada sin reordenar.

“Inhibidores” y “antagonistas”, o “activadores” y “agonistas”, se refieren a moléculas inhibidoras o activantes, respectivamente, por ejemplo, para la activación de, por ejemplo, un ligando, receptor, cofactor, un gen, célula, tejido u órgano. Un modulador de, por ejemplo, un gen, un receptor, un ligando o una célula es una molécula que altera una actividad del gen, receptor, ligando o célula, en el que la actividad puede activarse, inhibirse o alterarse en sus propiedades reguladoras. El modulador puede actuar solo o puede usar un cofactor, por ejemplo, una proteína, ión metálico o molécula pequeña. Los inhibidores son compuestos que disminuyen, bloquean, previenen, retrasan la activación, inactivan, insensibilizan o regulan por disminución, por ejemplo, un gen, proteína, ligando, receptor o célula. Los activadores son compuestos que aumentan, activan, facilitan, potencian la activación, sensibilizan o regulan por incremento, por ejemplo, un gen, proteína, ligando, receptor o célula. Un inhibidor también puede definirse como un compuesto que reduce, bloquea o inactiva una actividad constitutiva. Un “agonista” es un compuesto que interactúa con una diana para producir o promover un aumento en la activación de la diana. Un “antagonista” es un compuesto que opone las acciones de un agonista. Un antagonista previene, reduce, inhibe o neutraliza la actividad de un agonista. Un antagonista también puede prevenir, inhibir o reducir actividad constitutiva de una diana, por ejemplo, un receptor diana, incluso cuando no haya agonista identificado.

Para examinar el grado de inhibición, por ejemplo, muestras o ensayos que comprenden, por ejemplo, una proteína, gen, célula u organismo dado se tratan con un posible activador o inhibidor y se comparan con muestras de control sin el inhibidor. A las muestras de control, es decir, las muestras no tratadas con antagonista, se les asigna un valor de actividad relativo del 100%. La inhibición se logra cuando el valor de actividad con respecto al control es aproximadamente el 90% o menos, normalmente el 85% o menos, más normalmente el 80% o menos, lo más normalmente el 75% o menos, generalmente el 70% o menos, más generalmente el 65% o menos, lo más generalmente el 60% o menos, normalmente el 55% o menos, normalmente el 50% o menos, más normalmente el 45% o menos, lo más normalmente el 40% o menos, preferentemente el 35% o menos, más preferentemente el 30%

: o menos, todavía más preferentemente el 25% o menos, y lo más preferentemente menos del 25%. La activación se logra cuando el valor de actividad con respecto al control es aproximadamente el 110%, generalmente al menos el 120%, más generalmente al menos el 140%, más generalmente al menos el 160%, frecuentemente al menos el 180%, más frecuentemente al menos 2 veces, casi siempre al menos 2,5 veces, normalmente al menos 5 veces, más normalmente al menos 10 veces, preferentemente al menos 20 veces, más preferentemente al menos 40 veces, y lo más preferentemente más de 40 veces mayor.

Los criterios de valoración en la activación o inhibición pueden monitorizarse del siguiente modo. La activación, inhibición y respuesta a tratamiento, por ejemplo, de una célula, fluido fisiológico, tejido, órgano y sujeto animal o humano pueden monitorizarse por un criterio de valoración. El criterio de valoración puede comprender una cantidad

: o porcentaje predeterminado de, por ejemplo, indicios de inflamación, oncogenicidad o desgranulación o secreción de células tal como la liberación de una citocina, oxígeno tóxico o una proteasa. El criterio de valoración puede comprender, por ejemplo, una cantidad predeterminada de flujo o transporte de iones; migración de células; adhesión de células; proliferación celular; posibilidades de metástasis; diferenciación de células; y cambio en el fenotipo, por ejemplo, cambio en la expresión de gen relacionado con la inflamación, apoptosis, transformación, ciclo celular o metástasis (véase, por ejemplo, Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sci. 30:145-158; Hood y Cheresh (2002) Nature Rev. Cancer 2:91-100; Timme y col. (2003) Curr. Drug Targets 4:251-261; Robbins y Itzkowitz (2002) Med. Clin. North Am. 86:1467-1495; Grady y Markowitz (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:101-128; Bauer y col. (2001) Glia 36:235-243; Stanimirovic y Satoh (2000) Brain Patol. 10:113-126).

Un criterio de valoración de la inhibición es generalmente el 75% del control o menos, preferentemente el 50% del control o menos, más preferentemente el 25% del control o menos, y lo más preferentemente el 10% del control o menos. Generalmente, un criterio de valoración de la activación es al menos el 150% del control, preferentemente al menos dos veces el control, más preferentemente al menos cuatro veces el control, y lo más preferentemente al menos diez veces el control.

“Ligando” se refiere, por ejemplo, a una molécula pequeña, péptido, polipéptido y molécula asociada a membrana o unida a membrana, o complejo de los mismos, que puede actuar de agonista o antagonista de un receptor. “Ligando” también engloba un agente que no es un agonista o antagonista, pero que puede unirse al receptor. Además, “ligando” incluye un ligando unido a membrana que se ha cambiado, por ejemplo, por procedimientos químicos o recombinantes, a una versión soluble del ligando unido a membrana. Por convenio, si un ligando está unido a membrana en una primera célula, el receptor normalmente se produce en una segunda célula. La segunda célula puede tener la misma identidad o diferente a la de la primera célula. Un ligando o receptor puede ser completamente intracelular, es decir, puede residir en el citosol, núcleo o algún otro compartimento intracelular. El ligando o receptor puede cambiar su localización, por ejemplo, de un compartimento intracelular a la cara externa de la membrana plasmática. El complejo de un ligando y receptor se llama un “complejo ligando-receptor”. Si un ligando y receptor participan en una ruta de señalización, el ligando se produce en una posición en la dirección 5' y el receptor produce en una posición en la dirección 3' de la ruta de señalización.

“Molécula pequeña” se define como una molécula con un peso molecular que es inferior a 10 kDa, normalmente inferior a 2 kDa, preferentemente inferior a 1 kDa, y lo más preferentemente menos de aproximadamente 500 Da. Moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas, moléculas orgánicas que contienen un componente inorgánico, moléculas que comprenden un átomo radiactivo, moléculas sintéticas, peptidomiméticos y miméticos de anticuerpos. Como agente terapéutico, una molécula pequeña puede ser más permeable a las células, menos susceptible a la degradación y menos apta para provocar una respuesta inmunitaria que las moléculas grandes. Se han descrito moléculas pequeñas tales como peptidomiméticos de anticuerpos y citocinas, además de toxinas de molécula pequeña, (véase, por ejemplo, Casset y col. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 307:198-205; Muildermans (2001) J. Biotechnol. 74:277-302; Li (2000) Nat. Biotechnol. 18:1251-1256; Apostolopoulos y col. (2002) Curr. Med. Chem. 9:411-420; Monfardini y col. (2002) Curr. Pharm. Des. 8:2185-2199; Domingues y col. (1999) Nat. Struct. Biol. 6:652-656; Sato y Sone (2003) Biochem. J. 371:603-608; patente de EE.UU. nº 6.326.482 concedida a Stewart y col.).

Se une “específicamente” o “selectivamente”, cuando se refiere a un ligando/receptor, anticuerpo/antígeno u otro par de unión, indica una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros agentes biológicos. Por tanto, bajo condiciones designadas, un ligando especificado se une a un receptor particular y no se une en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. El anticuerpo, o compuesto de unión derivado del sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, del procedimiento contemplado se une a su antígeno, o una variante o muteína del mismo, con una afinidad que es al menos dos veces mayor, preferentemente al menos diez veces mayor, más preferentemente al menos 20 veces mayor, y lo más preferentemente al menos 100 veces mayor que la afinidad por cualquier otro antígeno. El anticuerpo descrito en este documento tendrá una afinidad que es superior a aproximadamente 109 M-1 como se determina, por ejemplo, por análisis de Scatchard (Munsen y col. (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239).

Como se usa en este documento, el término “agente inmunomodulador” se refiere a agentes naturales o sintéticos que suprimen o modulan una respuesta inmunitaria. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta humoral o celular. Los agentes inmunomoduladores engloban agentes inmunosupresores o antiinflamatorios.

“Agentes inmunosupresores”, “fármacos inmunosupresores” o “inmunodepresores” como se usa en este documento son agentes terapéuticos que se usan en terapia inmunosupresora para inhibir o prevenir la actividad del sistema inmunitario. Clínicamente se usan para prevenir el rechazo de órganos y tejidos trasplantados (por ejemplo, médula ósea, corazón, riñón, hígado) y/o en el tratamiento de enfermedades autoinmunes o enfermedades que lo más probable es que sean de origen autoinmune (por ejemplo, artritis reumatoide, miastenia grave, lupus eritematoso sistémico, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple). Los fármacos inmunosupresores pueden clasificarse como: glucocorticoides; citóstaticos; anticuerpos (modificadores de la respuesta biológica); fármacos que actúan sobre inmunofilinas; otros fármacos, que incluyen agentes quimioterapéuticos conocidos usados en el tratamiento de trastornos proliferativos. Para esclerosis múltiple, en particular, los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse conjuntamente con una nueva clase de agentes terapéuticos similares a proteína de unión a mielina conocidos como copaxonas.

“Agentes antiinflamatorios” o “fármacos antiinflamatorios” se refieren a agentes terapéuticos tanto esteroideos como no esteroideos. Los esteroides, también conocidos como corticosteroides, son fármacos que se parecen mucho al cortisol, una hormona producida naturalmente por las glándulas suprarrenales. Los esteroides se usan como tratamiento principal para ciertas afecciones inflamatorias tales como: vasculitis sistémica (inflamación de los vasos sanguíneos); y miositis (inflamación de músculo). Los esteroides también podrían usarse selectivamente para tratar afecciones inflamatorias tales como: artritis reumatoide (artritis inflamatoria crónica que se produce en las articulaciones en ambos lados del cuerpo); lupus eritematoso sistémico (una enfermedad generalizada producida por una función anormal del sistema inmunitario); síndrome de Sjögren (trastorno crónico que produce xeroftalmía y xerostomía).

Los fármacos antiinflamatorios no esteroideos, normalmente abreviados como AINE, son fármacos con efectos analgésicos, antipiréticos y antiinflamatorios – reducen el dolor, la fiebre y la inflamación. El término “no esteroideo” se usa para distinguir estos fármacos de los esteroides que (entre una amplia gama de otros efectos) tienen una acción antiinflamatoria depresora de eicosanoides similar. Los AINE están generalmente indicados para el alivio sintomático de las siguientes afecciones: artritis reumatoide; osteoartritis; artropatías inflamatorias (por ejemplo, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, síndrome de Reiter); gota aguda; dismenorrea; dolor óseo metastásico; cefalea y migraña; dolor posoperatorio; dolor de leve a moderado debido a inflamación y lesión de tejido; pirexia; y cólico nefrítico. Los AINE incluyen salicilatos, ácidos arilalcanoicos, ácidos 2-arilpropiónicos (profenos), ácidos Narilantranílicos (ácidos fenámicos), oxicams, coxibs y sulfonanilidas.

Los fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (FARME) pueden administrarse frecuentemente en combinación con AINE. Los FARME comúnmente prescritos incluyen hidroxicloroquina/cloroquina, metotrexato, auroterapia, sulfasalazina y azatioprina.

II. Anticuerpos específicos para IL-17A humana

En este documento se describen anticuerpos anti-IL-17A manipulados por ingeniería y usos de los mismos para tratar diversos trastornos inflamatorios, inmunes y proliferativos que incluyen artritis reumatoide (AR), osteoartritis, osteoporosis por artritis reumatoide, fibrosis inflamatoria (por ejemplo, esclerodermia, fibrosis pulmonar y cirrosis), trastornos inflamatorios del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y enfermedad inflamatoria del intestino), asma (incluyendo asma alérgico), alergias, EPOC, esclerosis múltiple, psoriasis y cáncer.

Cualquier procedimiento adecuado para generar anticuerpos monoclonales puede usarse para generar los anticuerpos anti-IL-17A descritos en este documento. Por ejemplo, un animal receptor puede inmunizarse con una forma ligada o sin ligar (por ejemplo, que se produce naturalmente) del homodímero de IL-17A, o un fragmento del mismo. Puede usarse cualquier procedimiento adecuado de inmunización. Tales procedimientos pueden incluir adyuvantes, otros inmunoestimulantes, inmunizaciones de refuerzo repetidas y el uso de una o más vías de inmunización.

Puede usarse cualquier forma adecuada de IL-17A como inmunógeno (antígeno) para la generación del anticuerpo no humano específico para IL-17A, anticuerpo que puede cribarse para actividad biológica. El inmunógeno desencadenante puede ser IL-17A humana madura de longitud completa, que incluye homodímeros ligados y que se producen naturalmente, o péptidos de la misma que engloba epítopes únicos o múltiples epítopes. El inmunógeno puede usarse solo o en combinación con uno o más agentes potenciadores de la inmunogenicidad conocidos en la técnica. El inmunógeno puede purificarse a partir de una fuente natural o producirse en una célula genéticamente modificada. El ADN que codifica el inmunógeno puede ser de origen genómico o no genómico (por ejemplo, ADNc). El ADN que codifica inmunógeno puede expresarse usando vectores genéticos adecuados que incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovíricos, vectores víricos adenoasociados, vectores baculovíricos, plásmidos y vectores no víricos tales como lípidos catiónicos.

Puede usarse cualquier procedimiento adecuado para provocar una respuesta de anticuerpo con las propiedades biológicas deseadas, por ejemplo, para inhibir la unión de IL-17A a su receptor. Los anticuerpos que se describen en este documento se producen en huéspedes de mamífero tales como ratones, roedores, primates, seres humanos, etc. Las técnicas para preparar anticuerpos monoclonales pueden encontrarse en, por ejemplo, Stites y col. (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4ª ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y referencias citadas en su interior; Harlow y Lane (1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL CSH Press; Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2ª ed.) Academic Press, Nueva York, NY. Por tanto, los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse mediante una variedad de técnicas familiares a los investigadores expertos en la materia. Normalmente, las células del bazo de un animal inmunizado con un antígeno deseado se inmortalizan, comúnmente por fusión con una célula de mieloma. Véase Kohler y Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519. Procedimientos alternativos de inmortalización incluyen transformación con el virus de Epstein Barr, oncogenes o retrovirus, u otros procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Doyle y col. (eds.) (1994 y suplementos periódicos) CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley and Sons, Nueva York, NY. Las colonias que se producen a partir de las células inmortalizadas individuales se criban para la producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad deseada por el antígeno. El rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidos por tales células puede potenciarse por diversas técnicas que incluyen inyección en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado.

Otras técnicas adecuadas implican la selección de bibliotecas de anticuerpos en fago o vectores similares. Véase, por ejemplo, Huse y col., Science 246:1275-1281 (1989); y Ward y col., Nature 341:544-546 (1989). Los anticuerpos descritos en este documento pueden usarse sin modificación, por ejemplo, como el anticuerpo de roedor parental, o con modificaciones para facilitar su uso como agentes terapéuticos en sujetos humanos tales como anticuerpos quiméricos o humanizados. En algunas realizaciones, los anticuerpos se marcarán, covalentemente o no covalentemente, con una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conoce una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación y se informan ampliamente tanto en la bibliografía científica como de patentes. Marcas adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, restos fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que enseñan el uso de tales marcas incluyen las patentes de EE.UU. nº 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. Por tanto, pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes, véanse la patente de EE.UU. de Cabilly nº 4.816.567; y Queen y col. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; o prepararse en ratones transgénicos, véase Mendez y col. (1997) Nature Genetics 15:146-156; véanse también las tecnologías Abgenix y Medarex.

Los anticuerpos contra fragmentos predeterminados de IL-17A pueden producirse por inmunización de animales con conjugados del fragmento predeterminado de IL-17A con proteínas portadoras. Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos pueden cribarse para la unión a IL-17A normal o defectuosa. Estos anticuerpos monoclonales se unirán normalmente con al menos una Kd de aproximadamente 1 !M, más normalmente de al menos aproximadamente 300, 30, 10 ó 3 nM, preferentemente de al menos aproximadamente 300, 100, 30, 10, 3 ó 1 pM. Debido a la relación inversa de los valores de Kd y la afinidad, las referencias a la unión con una Kd dada “o menos” se refieren a la unión con una afinidad que es al menos hasta el valor numérico citado, es decir, con una Kd que es al menos de tan sólo el valor citado. Las afinidades de unión pueden determinarse por ELISA (véanse los Ejemplos 5-6, abajo), o por espectroscopía por resonancia de plasmones superficiales Biacore®, procedimientos KinExA o de ECL (véase el Ejemplo 7, abajo). También pueden identificarse anticuerpos no humanos adecuados usando los ensayos biológicos descritos en los Ejemplos 8-11 y 16-17, abajo.

Un procedimiento a modo de ejemplo de producción de anticuerpos anti-IL-17A humana descritos en este documento se describe en el Ejemplo 2.

III. Humanización de anticuerpos específicos para IL-17A

Cualquier anticuerpo no humano adecuado puede usarse como fuente para la región hipervariable de un anticuerpo anti-IL-17A descrito en este documento. Fuentes para anticuerpos no humanos incluyen, pero no se limitan a, roedores (por ejemplo, ratón, rata), lagomorfos (incluyendo conejos), vacas y primates no humanos. En general, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo del receptor) en las que los residuos de la región hipervariable del receptor están sustituidos con residuos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo del donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad y afinidad deseada. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo de receptor ni en el anticuerpo de donante tal como modificaciones hechas para refinar adicionalmente el rendimiento de los anticuerpos de la actividad biológica deseada. Para más detalles véanse Jones y col. (1986) Nature 321: 522-525; Reichmann y col. (1988) Nature 332: 323-329; y Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593

596.

Se han descrito procedimientos para manipular recombinantemente y producir anticuerpos, por ejemplo, por Boss y col. (patente de EE.UU. nº 4.816.397), Cabilly y col. (patente de EE.UU. nº 4.816.567), Law y col. (publicación de solicitud de patente europea nº 438 310) y Winter (publicación de solicitud de patente europea nº 239 400).

Las variantes de secuencias de aminoácidos de anticuerpos anti-IL-17A humanizados descritos en este documento pueden prepararse introduciendo cambios de nucleótido apropiados en el ADN de anticuerpos anti-IL-17A humanizados, o por síntesis de péptidos. Puede prepararse cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar el procesamiento pos-traducción del anticuerpo anti-IL-17A humanizado, tal como cambiando el número o posición de los sitios de glicosilación.

Un procedimiento útil para identificar residuos o regiones de un anticuerpo anti-IL-17A humanizado que son localizaciones preferidas para mutagénesis se llama “mutagénesis por cribado con alanina”. Cunningham y Wells (1989) Science 244: 1081-1085. Se identifica un grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se sustituyen con un aminoácido neutro o negativamente cargado (lo más preferentemente alanina o polialanina) para alterar la interacción de los aminoácidos con IL-17A. Entonces, los residuos que muestran sensibilidad funcional a sustituciones de alanina se refinan introduciendo otras sustituciones de aminoácidos. En una realización, el efecto de las mutaciones en un codón diana dado se determina por cribado con alanina o mutagénesis al azar, seguido de análisis de actividad y de unión de variantes de anticuerpos anti-IL17A humanizados resultantes.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones de los extremos amino y/o carboxilo que oscilan de longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, además de inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen anticuerpo anti-IL17A humanizado con un residuo de metionilo del extremo N o el anticuerpo fusionado a una marca de epítope. Otras variantes incluyen la fusión de una enzima o un polipéptido que aumenta la semivida en suero de un anticuerpo para el extremo N o C. Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen quitado al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anti-IL-17A humanizada de anticuerpo y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitucional incluyen los bucles hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR. Los residuos de la región hipervariable o residuos FR que participan en la unión a antígeno están generalmente sustituidos de un modo relativamente conservativo.

Otras variantes de aminoácidos del anticuerpo alteran el patrón de glicosilación original del anticuerpo, por ejemplo, eliminando uno o más restos de hidrato de carbono y/o añadiendo uno o más sitios de glicosilación. La glicosilación de anticuerpos está tópicamente tanto ligada a N como ligada a O. Ligado a N se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-Xserina y asparagina-X-treonina en las que X es cualquier aminoácido, excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. La presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un posible sitio de glicosilación. La glicosilación ligada a O implica la unión de N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

Los sitios de glicosilación pueden añadirse a los anticuerpos de la presente invención insertando una o más de las secuencias de tripéptidos anteriormente descritas (para sitios de glicosilación ligados en N), o adición de uno o más residuos de serina o treonina (para sitios de glicosilación ligada a O). Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican variantes de secuencias de aminoácidos de anticuerpo específico para IL-17A humanizado se preparan mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos que se producen naturalmente), o por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida a sitio), mutagénesis por PCR o mutagénesis por inserción de un casete.

Generalmente, las variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-IL-17A humanizado tendrán una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 50% de identidad de secuencias de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos del anticuerpo humanizado original de tanto la cadena pesada como la ligera, preferentemente al menos el 70%, 80%, 85%, 90%, y lo más preferentemente al menos el 95%. La identidad u homología con respecto a esta secuencia se define en este documento como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos de anti-IL-17A humanizada cuando las secuencias están óptimamente alineadas (es decir, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr la máxima identidad de secuencias en porcentaje), y no considerando ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencias. Ni el extremo N, extremo C ni las extensiones internas, deleciones o inserciones en la secuencia de anticuerpos se considera que afecte la identidad de secuencias u homología.

El anticuerpo humanizado puede seleccionarse de cualquier clase de inmunoglobulinas que incluyen IgM, IgG, IgD, IgA y IgE. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. Puede usarse cualquier isotipo de IgG, que incluye IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4. También se contemplan variantes de los isotipos de IgG. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo. La optimización de las secuencias del dominio constante necesarias para generar la actividad biológica deseada se consigue fácilmente cribando los anticuerpos en los ensayos biológicos descritos más adelante en los ejemplos.

Asimismo, cualquier clase de cadena ligera puede usarse en los compuestos y procedimientos en este documento. Específicamente, kappa, lambda, o variantes de las mismas, son útiles en los presentes compuestos y procedimientos.

Cualquier porción adecuada de las secuencias de CDR del anticuerpo no humano puede usarse para crear los anticuerpos humanizados descritos en este documento. Las secuencias de CDR pueden mutagenizarse por sustitución, inserción o deleción, aunque tales mutaciones serían mínimas debido a la necesidad de mantener la afinidad y especificidad de unión a IL-17A. Normalmente, al menos el 75% de los residuos de CDR de los anticuerpos humanizados se corresponderán con aquellos de los residuos de CDR no humanos, más frecuentemente el 90%, y lo más preferentemente más del 95%, y frecuentemente el 100%.

Puede usarse cualquier porción adecuada de las secuencias de FR del anticuerpo humano. Las secuencias de FR pueden mutagenizarse por sustitución, inserción o deleción de al menos un residuo de forma que la secuencia de FR sea distinta de la secuencia del anticuerpo humano y no humano empleado. Se contempla que tales mutaciones serían mínimas. Normalmente, al menos el 75% de los residuos del anticuerpo humanizado se corresponderá con aquellos de los residuos de FR humanos, más frecuentemente el 90%, y lo más preferentemente más del 95%.

También se contemplan anticuerpos quiméricos o fragmentos de los mismos, mientras que presenten la actividad biológica deseada (patente de EE.UU. nº 4.816.567; y Morrison y col. (1984) Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 68516855). Como se observa antes, anticuerpos quiméricos típicos comprenden secuencias del dominio constante de anticuerpos de una especie ligada al dominio variable de un anticuerpo específico de antígeno obtenido a partir de una especie diferente.

Los compuestos de unión descritos en este documento pueden comprender anticuerpos biespecíficos. Como se usa en este documento, el término “anticuerpo biespecífico” se refiere a un anticuerpo, normalmente un anticuerpo monoclonal, que tiene especificidades de unión por al menos dos epítopes antigénicos diferentes.

Los epítopes son del mismo antígeno. De otro modo, los epítopes son de dos antígenos diferentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden producirse recombinantemente usando la co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Milstein y col. (1983) Nature 305: 537-39. Alternativamente, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse usando enlace químico. Véase, por ejemplo, Brennan y col. (1985) Science 229: 81. Los anticuerpos biespecíficos incluyen fragmentos biespecíficos de

5 anticuerpos. Véase, por ejemplo, Hollinger y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6444-48, Gruber, y col., J. Immunol. 152: 5368 (1994).

Un procedimiento a modo de ejemplo de humanizar anticuerpos anti-IL-17A humana descritos en este documento se describe en el Ejemplo 3.

IV. Caracterización de anticuerpos específicos para IL-17A

10 Los procedimientos descritos en este documento se usaron para generar anticuerpos monoclonales inmunorreactivos con IL-17A humana, como se describe en mayor detalle en los Ejemplos 2 y 3. Las FIGS. 1A y 1B muestran alineamientos de secuencias de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, respectivamente, de diversos anticuerpos anti-IL-17A descritos en este documento. Se indican las regiones CDR, y la numeración es según Kabat y col. (1991).

15 Un plásmido que contiene las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las cadenas ligeras y pesadas de 16C10 humanizado se depositó de acuerdo al Tratado de Budapest el 28 de julio de 2006, con Colección americana de cultivos tipo (ATCC - Manassas, Virginia, EE.UU.) con el número de acceso PTA-7675. Los hibridomas que expresan anticuerpos 30C10 y 23E12 se depositaron como JL7-30C10.C3 y JL7-23E12.B10, respectivamente, de acuerdo al Tratado de Budapest el 20 de julio de 2006, con Colección americana de cultivos tipo (ATCC - Manassas,

20 Virginia, EE.UU.) con los números de acceso PTA-7739 y PTA-7740.

Las CDR de la cadena ligera y pesada de diversos anticuerpos humanizados de la presente invención se proporcionan en las Tablas 3 y 4, respectivamente. Además, la Tabla 4 proporciona CDR adicionales para VH de hu16C10 con posiciones variables en las que puede usarse más de un aminoácido.

Tabla 3. Secuencias de CDR variables de la cadena ligera Tabla 4. Secuencias de CDR variables de la cadena pesada

Anticuerpo: CDRL1 CDRL2 CDRL3

16C10 humano: KSSQSLLFSENQKNYLA (SEC ID Nº: 11) WTSTRQS (SEC ID Nº: 12) QQSYYTPYT (SEC ID Nº: 13)

4C3 humano: KSSQSLLFSENQKNYLA (SEC ID Nº: 11) WTSTRQS (SEC ID Nº: 12) QQSYYTPYT (SEC ID Nº: 13)

23E12 humano: QASEDIYS.GLA (SEC ID Nº: 48) GASRLHD (SEC ID Nº: 49) QQGLKYPPT (SEC ID Nº: 50)

30C10 humano: KSSQSLFWSESHMNYLA (SEC ID Nº: 26) YASTRQS (SEC ID Nº: 27) HHHYDSHT (SEC ID Nº: 28)

12E6 humano: RTSQDIGNYLS (SEC ID Nº: 34) GASNLED (SEC ID Nº: 35) LQYDKYPNT (SEC ID Nº: 36)

1D10 de rata: KASQNINKYLD (SEC ID Nº: 56) NADNLHT (SEC ID Nº: 57) LQRESWPYT (SEC ID Nº: 58)

Anticuerpo: CDRH1 CDRH2 CDRH3

16C10 humano: GFSLPSHSVS (SEC ID Nº: 14) IIWNQGGTDYNSAFKS (SEC ID Nº: 16) NAYITDYYYENYFMDA (SEC ID Nº: 19)

16C10 humano variable: GFSLPSHSVS (SEC ID Nº: 14) IIWNX1GGTDYX2SAFKS X1 = N, A, Q X2 = N, A, Q (SEC ID Nº: 17) NX3YITDYYYENYFX4DA X3 = M, L, A, K, F X4 = M, F, L (SEC ID Nº: 20)

4C3 humano: GFSLPSHSVS (SEC ID Nº: 14) IIWNQGGTDYNSAFKS (SEC ID Nº: 16) NAYITDYYYENYFMDA (SEC ID Nº: 19)

23E12 humano: GFSLTNNGVT (SEC ID Nº: 51) EVSSGGSTDYNSALKS (SEC ID Nº: 52) QEVFTGLLDY (SEC ID Nº: 53)

30C10 humano: GFTFNNYWMT (SEC ID Nº: 29) SVSNTGSSTYYPASVKG (SEC ID Nº: 30) EGAYYLDY (SEC ID Nº: 31)

12E6 humano: GFTFRDYYMV (SEC ID Nº: 37) SISYEGSSIYYGESVKG (SEC ID Nº: 38) HGFNPFDY (SEC ID Nº: 39)

1D10 de rata: GFSLTNYYVH (SEC ID Nº: 59) GVWNDGDTSYNSVLRS (SEC ID Nº: 60) EGREGFVGYYVMDA (SEC ID Nº: 61)

En general, las CDR para los anticuerpos humanizados son idénticas a las CDR de los anticuerpos de rata parentales, siendo la excepción CDRH2 y CDRH3 de 16C10 humano y 4C3 humano, que tienen cada uno un único

5 cambio de aminoácido de las CDR de rata respectivas. Aunque se obtuvieron como clones independientes, los anticuerpos de rata parentales 16C10 y 4C3 son idénticos en la secuencia de la región VH y se diferencian en la región VL sólo por una sustitución de la región estructural (isoleucina en la posición 15 en 16C10 es valina en 4C3). Como resultado, las CDR son idénticas para estos dos anticuerpos de rata parentales y, por tanto, para sus formas humanizadas.

10 Se proporcionan secuencias para regiones VL humanizadas de anticuerpos 16C10/4C3 y 30C10 en SEC ID Nº: 5 y 22, respectivamente. Se proporcionan secuencias para regiones VH humanizadas de anticuerpos 16C10/4C3 y 30C10 en SEC ID Nº: 6 y 23, respectivamente. Estos dominios variables humanizados pueden usarse para crear anticuerpos quiméricos o humanizados de longitud completa añadiendo las secuencias de dominio constante apropiadas. Otras realizaciones incluyen diversas otras alteraciones en los residuos de aminoácidos de CDR en la

15 cadena pesada de 16C10, por ejemplo, como se ilustra en la Tabla 4. Con referencia a la numeración de residuos de la FIG. 1B, las alteraciones descritas en la Tabla 4 (y en SEC ID Nº: 17 y 20) son N54A, N54Q, N60A, N60Q, M96L, M96A, M96K, M96F, M100hF, M100hL.

Las cadenas ligeras y pesadas quiméricas del anticuerpo 16C10 descrito en este documento se crean uniendo dominios constantes humanos (cadena ligera kappa humana y dominio constante de IgG1 humana, 20 respectivamente) al extremo C de las regiones VL (SEC ID Nº: 5) y VH (SEC ID Nº: 6) humanizadas. Las secuencias de cadenas ligeras y pesadas de 16C10 quimérico se proporcionan en SEC ID Nº: 9 y 10. Las formas quiméricas de los anticuerpos 30C10 y 4C3 descritos en este documento se crean fusionando los mismos dominios constantes de 16C10 quimérico a sus regiones VL y VH humanizadas respectivas (SEC ID Nº: 22 y 23 para 30C10; SEC ID Nº: 5 y 6 para 4C3). La forma quimérica de 4C3 humanizado sería, por supuesto, idéntica a la forma quimérica de 16C10

25 humanizado.

Los anticuerpos humanizados de longitud completa como se describen en este documento se crean sustituyendo residuos de la región estructural (es decir, aquellos residuos de aminoácidos en el dominio variable que no son parte de una CDR) de las formas quiméricas de anticuerpos con secuencias de la región estructural de la línea germinal humana como se describe en más detalle en el Ejemplo 3. Los anticuerpos resultantes sólo retienen las secuencias 30 de CDR de los anticuerpos de rata, con los dominios constantes y las secuencias de la región estructural sustituidos

por secuencias derivadas de humanas. Las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa para el anticuerpo humanizado 16C10, que incluye secuencias señal, se proporcionan en SEC ID Nº: 2 y 4, respectivamente. Las formas humanizadas de anticuerpos 4C3 y 23E12 como se describen en este documento se crean por analogía al procedimiento descrito para 16C10, es decir, sustituyendo las secuencias de la región estructural humana apropiadas en la secuencia de las versiones quiméricas de estos anticuerpos (descritos arriba). Véase el Ejemplo 3.

Las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa de los anticuerpos humanizados descritos en este documento se clonan para tener un péptido señal en su extremo N para facilitar la secreción de células cuando se produce el anticuerpo. Una secuencia señal de 19 aminoácidos se añade tanto a las cadenas ligeras como a las pesadas del anticuerpo 16C10 humanizado (residuos -19 a -1 de SEC ID Nº: 2 y 4) descrito en este documento. Las secuencias de ADN de las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa de 16C10 humanizado, con secuencia señal añadida, se proporcionan en SEC ID Nº: 1 y 3. Tales secuencias de ADN pueden clonarse y expresarse en cualquier vector de expresión adecuado para la producción de los anticuerpos humanizados descritos en este documento.

Las secuencias señal pueden añadirse a las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos humanizados 30C10 y 4C3, como se ha descrito para el anticuerpo 16C10. Se añaden péptidos de la secuencia señal que son diferentes a los de la secuencia señal específica proporcionada en SEC ID Nº: 1-4, dependiendo del procedimiento de producción previsto de los anticuerpos. Tales secuencias señal pueden obtenerse a partir de la bibliografía científica, por ejemplo, Choo y col. (2005) “SPdb – a signal peptide database”, BMC Bioinformatics 6:249.

En todavía otras realizaciones, diferentes dominios constantes pueden unirse a las regiones VL y VH humanizadas proporcionadas en este documento. Por ejemplo, si un uso previsto particular de un anticuerpo (o fragmento) de la presente invención fuera exigir funciones efectoras alteradas, podría usarse un dominio constante de la cadena pesada distinto de IgG1. Aunque los anticuerpos IgG1 proporcionan semivida larga y funciones efectoras tales como activación del complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, tales actividades pueden no desearse para todos los usos del anticuerpo. En tales casos puede usarse, por ejemplo, un dominio constante de IgG4.

V. Afinidad y actividad biológica de anti-IL-17A humanizado

Los anticuerpos que tienen las características identificadas en este documento que son deseables en un anticuerpo anti-IL-17A humanizado pueden cribarse para actividad biológica inhibidoras in vitro, in vivo, o midiendo la afinidad de unión. Para cribar anticuerpos que se unen al mismo epítope en IL-17A humana unida por un anticuerpo de interés (por ejemplo, aquellos que bloquean la unión de la citocina a su receptor) puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Alternativamente, el mapeo de epítopes puede realizarse para determinar si el anticuerpo se une a un epítope de interés, por ejemplo, como se describe en Champe y col. (1995) J Biol. Chem. 270:1388-1394. Las afinidades por anticuerpo (por ejemplo, por IL-17A humana) pueden determinarse usando procedimientos convencionales que incluyen aquellos descritos en el Ejemplo 7. Los anticuerpos humanizados preferidos son aquellos que se unen a IL-17A humana con un valor de Kd no superior a aproximadamente 100 nM (1x10-7 M); preferentemente no superior a aproximadamente 10 nM; más preferentemente no superior a aproximadamente ln M. Incluso más preferidas son las realizaciones en las que los anticuerpos tienen valores de Kd no superiores a aproximadamente 200 pM (2x10-10 M), 100 pM, 50 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM o incluso 2 pM.

Los anticuerpos, y fragmentos de los mismos, útiles en los presentes compuestos y procedimientos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos y fragmentos biológicamente activos. Como se usa en este documento, el término “biológicamente activo” se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que puede unirse al epítope antigénico deseado y ejercer directamente o indirectamente un efecto biológico. Normalmente, estos efectos resultan del fracaso de IL-17A para unirse a su receptor. Como se usa en este documento, el término “específico” se refiere a la unión selectiva del anticuerpo al epítope del antígeno diana. Los anticuerpos pueden probarse para especificidad de unión comparando la unión a IL-17A con la unión a antígeno irrelevante o mezcla de antígenos bajo un conjunto dado de condiciones. Se considera que un anticuerpo es específico si se une a IL-17A con una afinidad de al menos 10 veces, y preferentemente 50 veces, superior a su afinidad por un antígeno irrelevante o mezcla de antígenos. Un anticuerpo que “se une específicamente” a una proteína que comprende IL-17A (o un fragmento de la misma) no se une a proteínas que no comprenden las secuencias derivadas de IL-17A, es decir, “especificidad” como se usa en este documento se refiere a la especificidad por IL-17A, y no por cualquier otra secuencias que pueda estar presente en la proteína en cuestión. Por ejemplo, como se usa en este documento, un anticuerpo que “se une específicamente” a FLAG-hIL-17A, que es una proteína de fusión que comprende IL-17A y un marca de péptido FLAG®, no se une a la marca de péptido FLAG® sola o cuando está fusionada con una proteína distinta de IL-17A.

Los datos presentados en los ejemplos más adelante muestran (por ejemplo, Ejemplo 7) que el anticuerpo humanizado 16C10 (incluyendo las sustituciones N54Q y M96A con respecto a las CDR de la cadena pesada de rata parental) tiene una alta afinidad por la unión a IL-17A humana, con una Kd en el intervalo de 1-10 pM como se ha determinado por el análisis de KinExA. Los ensayos de actividad in vitro tales como el ensayo de proliferación celular de Ba/F3 hIL-17Rc-GCSFR (Ejemplo 11), el ensayo de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) (Ejemplo 9) y el ensayo de sinoviocitos de artritis reumatoide (AR) humana (Ejemplo 8) confirman que hu16C10 es un anticuerpo de alta afinidad ya que los valores de CI50 observados fueron normalmente inferiores o igual al 50% de la concentración de hIL-17A presente en el ensayo (100 pM, 1000 pM y 1000 pM en los tres ensayos, respectivamente). El carácter bivalente de los anticuerpos usados en los experimentos, y las posibilidades de la formación de dímeros de IL-17A, hace posible lograr el 50% de inhibición de una concentración dada de IL-17A con menos de 0,5 equivalentes molares de anticuerpo. Los ensayos de actividad in vivo tales como la administración a ratones que presentan artritis inducida por colágeno (Ejemplo 16) y el ensayo de reclutamiento de neutrófilos de BAL (Ejemplo 17) confirman la actividad de varios de los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención en animales. Los ensayos de actividad in vitro e in vivo también confirman que el anticuerpo humanizado 16C10 es un anticuerpo neutralizante, que no se conocía de los experimentos de unión solos.

La capacidad de varios de los anticuerpos descritos en este documento para unirse a IL-17A de cino, además de a IL-17A humana, es ventajosa debido a que un posible anticuerpo terapéutico tal puede usarse directamente en mono cinomolgo para estudios de toxicología en vez de que tener que desarrollar un anticuerpo específico para cino separado para tales estudios. La alta afinidad de varios de los anticuerpos descritos en este documento también es ventajosa porque puede reducir la dosificación requerida en sujetos humanos (y otros), que reduce la probabilidad de ciertas reacciones adversas. Además, la alta afinidad puede reducir el volumen que debe administrarse a un sujeto y reducir el coste de tratamiento.

La semivida en suero de hu16C10 se midió en ratón y en monos cinomolgos. En cino, la semivida después de la administración intravenosa (iv) se evaluó en un estudio de búsqueda de dosis con 0,4, 4,0 y 40 mg/kg de dosificación. Las concentraciones de fármaco en suero se midieron periódicamente durante 42 días. La semivida para la administración subcutánea (sc) en cino se determinó a 4 mg/kd de dosificación, que también se siguió durante 42 días. La semivida en monos cinomolgos fue 10-19 días iv y 28 días sc como se mide por la pendiente terminal de la concentración de fármaco frente al perfil de tiempo. Se excluyeron ciertos puntos de datos anómalos a mayores dosificaciones del análisis. Experimentos similares en ratones mostraron que el anticuerpo hu16C10 tenía una semivida de 13-25 días iv y 12-22 días sc.

El Ejemplo 19 describe procedimientos usados para determinar el epítope unido por un anticuerpo anti-IL-17A a modo de ejemplo de la presente invención (16C10), es decir, los residuos en la región de L74-Y85 de IL-17A humana (SEC ID Nº: 40). Como los datos del ensayo biológico presentados en este documento demuestran que el anticuerpo 16C10 es un anticuerpo neutralizante de alta afinidad, también puede esperarse que otros anticuerpos que se unen al mismo epítope sean anticuerpos neutralizantes, y quizás también tengan alta afinidad de unión. El epítope como se determina en este documento se obtiene por mediciones funcionales en vez de determinaciones de la estructura, y el epítope informado en este documento puede diferenciarse en detalle del epítope determinado por procedimientos estructurales. El epítope informado en este documento incluye al menos algunos de, pero no necesariamente todos, los residuos de aminoácidos que son importantes para la unión al anticuerpo 16C10. El epítope unido por anticuerpos de la presente invención también puede determinarse por otros procedimientos tales como experimentos de bloqueo cruzado (véase el Ejemplo 12), o por procedimientos estructurales tales como determinación de la estructura cristalina por rayos X. La unión de anticuerpos adicionales al mismo epítope como el anticuerpo 16C10 puede obtenerse, por ejemplo, por el cribado de anticuerpos producidos contra hIL-17A, o por inmunización de un animal con un péptido que comprende la secuencia del epítope.

V. Producción de anticuerpos

Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico que lo codifica se aísla y se inserta en un vector replicable para la clonación adicional (amplificación del ADN) o para la expresión. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que pueden unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. Los componentes de vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. Ambas cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo anti-IL-17A humanizado descrito en este documento se expresan a partir del mismo vector, por ejemplo, un plásmido o un vector adenovírico.

Los anticuerpos descritos en este documento pueden producirse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. En una realización, los anticuerpos se expresan en células de mamífero o de insecto en cultivo, tal como células de ovario de hámster chino (CHO), células 293 de riñón embrionario humano (HEK), células NSO de mieloma de ratón, células de riñón de hámster bebé (BHK), células de ovario de Spodoptera frugiperda (Sf9). En una realización, los anticuerpos secretados de células CHO se recuperan y se purifican por procedimientos cromatográficos convencionales tales como cromatografía con proteína A, de intercambio catiónico, de intercambio aniónico, de interacción hidrófoba y con hidroxiapatita. Los anticuerpos resultantes se concentran y se guardan en acetato sódico 20 mM, pH 5,5.

Los anticuerpos descritos en este documento se producen en levadura según los procedimientos descritos en el documento WO2005/040395. Brevemente, los vectores que codifican las cadenas ligeras o pesadas individuales de un anticuerpo de interés se introducen en diferentes células haploides de levadura, por ejemplo, diferentes tipos de apareamiento de la levadura Pichia pastoris, cuyas células haploides de levadura son auxótrofas opcionalmente complementarias. Las células de levadura haploides transformadas pueden entonces aparearse o fusionarse para dar una célula de levadura diploide que puede producir tanto las cadenas pesadas como las ligeras. Entonces, la cepa diploide puede secretar el anticuerpo completamente ensamblado y biológicamente activo. Los niveles de expresión relativos de las dos cadenas pueden optimizarse, por ejemplo, usando vectores con diferente número de copias, usando promotores de la transcripción de diferentes concentraciones o induciendo la expresión de promotores inducibles que accionan la transcripción de los genes que codifican una o ambas cadenas.

Las cadenas pesadas y ligeras respectivas de una pluralidad de anticuerpos anti-IL-17A diferentes (los anticuerpos “originales”) se introducen en células haploides de levadura para crear una biblioteca de cepas de levadura haploides de un tipo de apareamiento que expresa una pluralidad de cadenas ligeras, y una biblioteca de cepas de levadura haploides de un tipo de apareamiento diferente que expresa una pluralidad de cadenas pesadas. Estas bibliotecas de cepas haploides pueden aparearse (o fusionarse como esferoplastos) para producir una serie de células diploides de levadura que expresan una biblioteca combinatoria de anticuerpos que consiste en las diversas permutaciones posibles de cadenas ligeras y pesadas. Entonces, la biblioteca combinatoria de anticuerpos puede cribarse para determinar si alguno de los anticuerpos tiene propiedades que son superiores (por ejemplo, mayor afinidad por IL-17A) a las de los anticuerpos originales. Véase, por ejemplo, el documento WO2005/040395.

Los anticuerpos descritos en este documento son anticuerpos de dominio humano en los que las porciones de un dominio variable del anticuerpo están ligadas en un polipéptido de aproximadamente 13 kDa de peso molecular. Véase, por ejemplo, la publicación de patente de EE.UU. nº 2004/0110941. Tales agentes de un solo dominio de bajo peso molecular proporcionan numerosas ventajas en términos de facilidad de síntesis, estabilidad y vía de administración.

VI. Composiciones farmacéuticas y administración

Para preparar composiciones farmacéuticas o estériles de los anticuerpos anti-huIL-17A descritos en este documento, el anticuerpo se mezcla con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences y la farmacopea de los EE.UU.: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984).

Las formulaciones de agentes terapéuticos y de diagnóstico pueden prepararse mezclando con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables en forma de, por ejemplo, polvos liofilizados, suspensiones, disoluciones acuosas o suspensiones (véase, por ejemplo, Hardman y col. (2001) Goodman and Gilman 's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, y Wilkins, Nueva York, NY; Avis y col. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman y col. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman y col. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY). Los anticuerpos anti-IL-17A descritos en este documento se diluyen a una concentración apropiada en una disolución de acetato sódico a pH 5-6, y se añade NaCl o sacarosa para la tonicidad. Pueden añadirse agentes adicionales tales como polisorbato 20 o polisorbato 80 para potenciar la estabilidad.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de las composiciones de anticuerpo, administradas solas o en combinación con otro agente, pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico (DL50/DE50). Se prefieren los anticuerpos que presentan altos índices terapéuticos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animal pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en ser humano. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración.

El modo de administración no es particularmente importante. Vías de administración adecuadas incluyen administración oral, rectal, transmucosal o intestinal; administración parenteral que incluye inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, además de inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares. La administración puede llevarse a cabo en una variedad de formas convencionales tales como ingestión oral, inhalación, insuflación, administración tópica o cutánea, inyección transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, parenteral, intra-arterial o intravenosa. Se prefiere la administración intravenosa al paciente.

Alternativamente, el anticuerpo puede administrarse en un modo local en vez de sistémico, por ejemplo, mediante inyección del anticuerpo directamente en una articulación artrítica o lesión inducida por patógeno caracterizada por inmunopatología, frecuentemente en una formulación de liberación prolongada o de liberación sostenida. Además, el anticuerpo puede administrarse en un sistema de administración de fármaco elegido como diana, por ejemplo, en un liposoma recubierto de un anticuerpo específico de tejido, elección de diana, por ejemplo, articulación artrítica o lesión inducida por patógeno caracterizada por inmunopatología. Los liposomas serán elegidos como diana y absorbidos selectivamente por el tejido aquejado.

La pauta de administración depende de varios factores que incluyen la velocidad de reposición de suero o de tejido del anticuerpo terapéutico, el nivel de síntomas, la inmunogenicidad del anticuerpo terapéutico y la accesibilidad de las células diana en la matriz biológica. Preferentemente, la pauta de administración administra suficiente anticuerpo terapéutico para efectuar la mejora en el estado de enfermedad diana, mientras que simultáneamente minimiza efectos secundarios no deseados. Por consiguiente, la cantidad de agente biológico administrado depende en parte del anticuerpo terapéutico particular y la gravedad de la afección que está tratándose. Está disponible orientación en la selección de la dosis apropiada de anticuerpos terapéuticos (véase, por ejemplo, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, Nueva York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, Nueva York, NY; Baert y col. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom y col. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon y col. (2001) New Engl. J Med 344:783-792; Beniaminovitz y col. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh y col. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky y col. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602).

El médico hace la determinación de la dosis apropiada, por ejemplo, usando parámetros o factores conocidos o que se sospechan en la materia que afectan al tratamiento. Generalmente, la dosis empieza con una cantidad algo inferior a la dosis óptima y después se aumenta pequeños incrementos hasta que se logra el efecto deseado u óptimo con respecto a cualquier efecto secundario negativo. Medidas de diagnóstico importantes incluyen aquellas de síntomas de, por ejemplo, la inflamación o nivel de citocinas inflamatorias producidas. Preferentemente, un agente biológico que se usará se deriva de la misma especie que el animal elegido como diana para el tratamiento, minimizándose así una respuesta inflamatoria, autoinmunitaria o proliferativa al reactivo. En el caso de sujetos humanos, por ejemplo, se prefieren anticuerpos quiméricos, humanizados y completamente humanos. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y citocinas pueden proporcionarse por infusión continua, o por dosis administrada, por ejemplo, diariamente, 1-7 veces por semana, semanalmente, bi-semanalmente, mensualmente, bimensualmente, etc. Las dosis pueden proporcionarse intravenosamente, subcutáneamente, tópicamente, por vía oral, nasalmente, rectalmente intramuscularmente, intracerebralmente, intraespinalmente o por inhalación. Una dosis semanal total es generalmente al menos 0,05 !g/kg de peso corporal, más generalmente al menos 0,2 !g/kg, 0,5 !g/kg, 1 !g/kg, 10 !g/kg, 100 !g/kg, 0,25 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/ml, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg o más (véase, por ejemplo, Yang y col. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold y col. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu y col. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji y col. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144). La dosis también puede proporcionarse para lograr una concentración diana predeterminada de anticuerpo anti-IL-17A en el suero del sujeto tal como 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 !g/ml o más. En otras realizaciones, un anticuerpo anti-IL-17A humanizado de la presente invención se administra subcutáneamente o intravenosamente, semanalmente, bisemanalmente o “cada 4 semanas” a 10, 20, 50, 80, 100, 200, 500, 1000 ó 2500 mg/sujeto.

Como se usa en este documento, “inhibir” o “tratar” o “tratamiento” incluye un aplazamiento del desarrollo de los síntomas asociados a un trastorno y/o una reducción en la gravedad de los síntomas de tal trastorno. Los términos incluyen adicionalmente mejorar los síntomas existentes sin controlar o no deseados, prevenir síntomas adicionales y mejorar o prevenir la causa subyacente de tales síntomas. Por tanto, los términos denotan que se ha conferido un resultado beneficioso en un sujeto vertebrado con un trastorno, enfermedad o síntoma, o con la posibilidad de desarrollar un trastorno, enfermedad o síntoma tal.

Como se usa en este documento, las expresiones “cantidad terapéuticamente eficaz”, “dosis terapéuticamente eficaz” y “cantidad eficaz” se refieren a una cantidad de un compuesto de unión a IL-17A de la invención que, cuando se administra solo o en combinación con un agente terapéutico adicional a una célula, tejido o sujeto, es eficaz para prevenir o mejorar uno o más síntomas de una enfermedad o afección o la progresión de tal enfermedad

o afección. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere adicionalmente a esa cantidad del compuesto de unión suficiente para producir la mejora de síntomas, por ejemplo, tratamiento, curación, prevención o mejora de la afección médica relevante, o un aumento en la velocidad de tratamiento, curación, prevención o mejora de tales afecciones. Cuando se aplica a un principio activo individual administrado solo, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a ese componente solo. Cuando se administra una combinación, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a cantidades combinadas de los principios activos que producen el efecto terapéutico, si se administran en combinación, serialmente o simultáneamente. Una cantidad eficaz de un agente terapéutico producirá una mejora de una medida o parámetro de diagnóstico al menos el 10%; normalmente al menos el 20%; preferentemente al menos aproximadamente el 30%; más preferentemente al menos el 40%, y lo más preferentemente al menos el 50%.

Los procedimientos para la co-administración con un segundo agente terapéutico, por ejemplo, citocina, otro anticuerpo terapéutico, agente quimioterapéutico esteroideo o antibiótico son muy conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Hardman y col. (eds.) (2001) Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10ª ed., McGraw-Hill, Nueva York, NY; Poole y Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner y Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA. La composición farmacéutica descrita en este documento también puede contener agentes inmunosupresores o inmunomoduladores. Puede emplearse cualquier agente inmunosupresor adecuado que incluya, pero no se limite a, agentes antiinflamatorios, corticosteroides, ciclosporina, tacrolimus (es decir, FK-506), sirolimus, interferones, receptores de citocinas solubles (por ejemplo, sTNRF y sIL1R), agentes que neutralizan la actividad de citocinas (por ejemplo, inflixmab, etanercept), micofenolato mofetilo, 15desoxiespergualina, talidomida, glatiramer, azatioprina, leflunomida, ciclofosfamida, metotrexato y similares. La composición farmacéutica también puede emplearse con otras modalidades terapéuticas tales como fototerapia y radiación.

Los compuestos de unión a IL-17A descritos en este documento también pueden usarse en combinación con uno o más antagonistas de otras citocinas (por ejemplo, anticuerpos) que incluyen, pero no se limitan a, IL-23, IL-1 �, IL-6 y TGF-�. Véase, por ejemplo, Veldhoen (2006) Immunity 24:179-189; Dong (2006) Nat. Rev. Immunol. 6(4):329-333. En diversas realizaciones, un compuesto de unión a IL-17A de la invención se administra antes, simultáneamente con o después de la administración del otro antagonista o antagonistas. En una realización, un compuesto de unión a IL-17A de la presente invención se usa en el tratamiento de la fase temprana aguda de una respuesta inmunitaria adversa (por ejemplo, EM, enfermedad de Crohn) solo o en combinación con un antagonista de IL-23. En el último caso, el compuesto de unión a IL-17A puede disminuirse gradualmente y el tratamiento con el antagonista de IL-23 solo se continúa para mantener la supresión de la respuesta adversa. Alternativamente, los antagonistas para IL-1 �, IL-6 y/o TGF-� pueden administrarse simultáneamente, antes o después de un compuesto de unión a IL-17A de la presente invención. Véase Cua y Kastelein (2006) Nat. Immunol. 7:557-559; Tato y O'Shea (2006) Nature 441:166168; Iwakura y Ishigame (2006) J. Clin. Invest. 116:1218-1222.

Sujetos veterinarios, experimentales o de investigación típicos incluyen monos, perros, gatos, ratas, ratones, conejos, cobayas, caballos y seres humanos.

VII. Usos.

En este documento también se describen composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-IL-17A modificados por ingeniería para su uso en el tratamiento y diagnóstico de trastornos y afecciones inflamatorias, además de trastornos autoinmunes y proliferativos. Las composiciones farmacéuticas se describen para el diagnóstico, prevención o tratamiento de enfermedad inflamatoria del intestino (EII); esclerosis múltiple (EM), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis quística (FQ), psoriasis, esclerodermia sistémica, rechazo de aloinjerto, miocarditis autoinmune y adhesiones peritoneales (véase, por ejemplo, Chung y col. (2002) J. Exp. Med. 195:1471-78).

Psoriasis

La piel sirve de un importante límite entre el medio interno y el entorno, previniendo el contacto con antígenos potencialmente perjudiciales. En el caso de la penetración de antígenos/patógenos, una respuesta inflamatoria se induce para eliminar el antígeno. Esta respuesta conduce a un infiltrado dérmico que consiste predominantemente en linfocitos T, células polimorfonucleares y macrófagos (véase, por ejemplo, Williams y Kupper (1996) Life Sci., 58:1485-1507.) Normalmente, esta respuesta inflamatoria, desencadenada por el patógeno, está bajo un estrecho control y se mantendrá tras la eliminación del patógeno.

En ciertos casos, esta respuesta inflamatoria se produce sin estímulos externos y sin controles apropiados, conduciendo a inflamación cutánea. Las composiciones farmacéuticas se describen en este documento para su uso en el tratamiento y diagnóstico de inflamación cutánea. La inflamación cutánea, el resultado del infiltrado celular observado anteriormente, además de las citocinas secretadas de estas células, engloba varios trastornos inflamatorios tales como penfigoide cicatricial, esclerodermia, hidradenitis supurativa, necrólisis epidérmica tóxica, acné, osteitis, enfermedad de injerto frente a huésped (GvHD), piodermia gangrenosa y síndrome de Behcet (véase, por ejemplo, Willams y Griffiths (2002) Clin. Exp. Dermatol., 27:585-590). La forma más común de inflamación cutánea es la psoriasis.

La psoriasis se caracteriza por hiperproliferación mediada por linfocitos T de queratinocitos acoplados a un infiltrado inflamatorio. La enfermedad tiene ciertos fenotipos clínicos distintos que se solapan que incluyen lesiones de placas crónicas, erupciones de la piel y lesiones pustulares (véase, por ejemplo, Gudjonsson y col. (2004) Clin Exp. Immunol. 135:1-8). Aproximadamente el 10% de los pacientes con psoriasis desarrolla artritis. La enfermedad tiene una fuerte, pero compleja, predisposición genética, con el 60% de concordancia en gemelos monocigóticos.

La lesión psoriásica típica es una placa eritematosa bien definida cubierta por gruesas escamas plateadas. La inflamación e hiperproliferación de tejido psoriásico está asociada a perfiles histológicos, antigénicos y de citocinas diferentes a los de la piel normal. Entre las citocinas asociadas a psoriasis están: TNFa, IL-19, IL-18, IL-15, IL-12, IL7, IFNy, IL-17A y IL-23 (véase Gudjonsson y col., arriba). La IL-17A se ha detectado en piel psoriásica.

Los anticuerpos anti-IL-17A descritos en este documento, tanto solos como en combinación con otros agentes, pueden usarse en la prevención, tratamiento, diagnóstico y predicción de brotes de psoriasis. El uso de anticuerpos anti-IL-17A en la predicción y el tratamiento de estallidos psoriásicos se describe en la publicación de solicitud patente de EE.UU. de cesión común 2005/0287593 y la publicación de patente PCT WO 2005/108616.

Artritis reumatoide (AR)

La AR es una enfermedad sistémica progresiva caracterizada por inflamación de las articulaciones sinoviales que afecta a aproximadamente el 0,5% de la población mundial. Emery (2006) BMJ 332:152-155. La inflamación de las articulaciones puede conducir a deformidad, dolor, rigidez e hinchazón, y por último lugar a deterioro irreversible de la articulación. Las articulaciones afectadas incluyen rodillas, codos, cuello y articulaciones de las manos y los pies. El tratamiento convencional implica el uso de AINE para aliviar síntomas, seguido de la administración de fármacos antirreumáticos que modifican la enfermedad (FAME) tales como oro, penicilamina, sulfasalazina y metotrexato. Los recientes avances incluyen tratamiento con inhibidores de TNF-a que incluyen anticuerpos monoclonales, tales como infliximab, adalumimab y golimumab, y proteínas de fusión receptoras tales como etanercept. El tratamiento con estos inhibidores de TNF-a reduce espectacularmente la lesión estructural de la enfermedad.

Los anticuerpos anti-IL-17A descritos en este documento pueden usarse para tratar AR en sujetos en necesidad de tal tratamiento. El Ejemplo 16 describe experimentos que implican el modelo de artritis inducida por colágeno (AIC) de AR, para el que los datos se presentan en las FIGS. 3A-3D y la Tabla 15. Los resultados muestran una reducción en la fracción de patas con altas puntuaciones de la gravedad de la enfermedad en animales tratados con un anticuerpo anti-IL-17A descrito en este documento en comparación con diluyente y controles de isotipo.

Los anticuerpos anti-IL-17A descritos en este documento también pueden combinarse con otros tratamientos para AR, por ejemplo, metotrexato, azatioprina, ciclofosfamida, esteroides, micofenolato mofetilo, AINE o inhibidores de TNF-a (anticuerpos o fragmentos de receptores).

Los anticuerpos anti-IL-17A descritos en este documento se usan para tratar sujetos humanos que no han respondido previamente adecuadamente a tratamiento con FAME solos. En otra realización, el tratamiento con los anticuerpos anti-IL-17A descritos en este documento se empieza pronto en el transcurso de la enfermedad, sin requerir el fracaso previo de la terapia con FAME. Tal intervención previa puede ser apropiada, por ejemplo, una vez se ha establecido firmemente la seguridad de la terapia con anticuerpos.

La mejora clínica se mide determinando la puntuación de ACR como se describe en más detalle en el Ejemplo 18. En diversas realizaciones, las puntuaciones de ACR de 20, 50 y 70 son el criterio de valoración deseado, y estos criterios de valoración pueden evaluarse en cualquier momento apropiado en el transcurso del tratamiento, tal como 5, 10, 15, 24, 40, 50 o más semanas.

Esclerosis múltiple (EM)

Se cree que la EM es una enfermedad autoinmune del sistema nervioso central (CNS) que implica la pérdida de mielina de las fibras nerviosas, produciendo placas o lesiones. La forma más común es EM recidivante/remitente en la que se producen brotes sintomáticos bien definidos, seguidos de periodos de remisión parcial o completa. Las opciones de tratamiento convencional incluyen interferón �-1a y -1b, mitoxantrona, el tetrapéptido acetato de glatiramer, los anticuerpos terapéuticos específicos de alfa-4-integrina (natalizumab) o antagonistas de moléculas pequeñas de alfa-4-integrina (por ejemplo, los desvelados en el documento WO2003/084984).

Los anticuerpos anti-IL-17A descritos en este documento pueden usarse para tratar EM en sujetos en necesidad de tal tratamiento. Los anticuerpos anti-IL-17A también pueden combinarse con otros tratamientos para EM, por ejemplo, interferón �, interferón a, esteroides o anticuerpos específicos de alfa-4-integrina.

Enfermedad inflamatoria del intestino (EII)

La EII es el nombre de un grupo de trastornos (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa) en el que los intestinos se inflaman, produciendo cólicos y dolor, diarrea, pérdida de peso y hemorragia intestinal. La EII afecta a más de 600.000 americanos. Las opciones de tratamiento convencional incluyen sulfasalazina, corticosteroides (por ejemplo, prednisona), supresores del sistema inmunitario tales como azatioprina y mercaptoporina, o un antibiótico (por ejemplo, metronidazol) para enfermedad de Crohn. Los tratamientos con anticuerpos monoclonales terapéuticos incluyen etanercept, natalizumab e infliximab.

Los anticuerpos anti-IL-17A descritos en este documento pueden usarse para tratar EII en sujetos en necesidad de tal tratamiento. Yen y col. (2006) J. Clin. Invest. 116:1310-1316; Fujimo y col. (2003) Gut 52:65-70. Los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención también pueden combinarse con otros tratamientos para EII, por ejemplo, IL-10 (véanse las patentes de EE.UU. nº 5.368.854, 7.052.686), esteroides y sulfasalazina.

Los anticuerpos descritos en este documento que no bloquean la unión de IL-17A a su receptor (por ejemplo, anticuerpo no neutralizante 12E6) se usan terapéuticamente para estabilizar IL-17A en sujetos en necesitad de actividad de IL-17A prolongada. Tales sujetos incluyen pacientes que padecen infecciones o cánceres.

Ejemplo 1

Procedimientos generales

Se han descrito procedimientos convencionales en biología molecular (Maniatis y col. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). Procedimientos convencionales también aparecen en Ausbel y col. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. Nueva York, NY, que describe la clonación en células bacterianas y mutagénesis de ADN (vol. 1), clonación en células de mamífero y levadura (vol. 2), glicoconjugados y expresión de proteínas (vol. 3) y bioinformática (vol. 4).

Se han descrito procedimientos para la purificación de proteínas que incluyen inmunoprecipitación, cromatografía, electroforesis, centrifugación y cristalización (Coligan y col. (2000) Current Protocols in Protein Science, vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York). Se ha descrito el análisis químico, modificación química, modificación postraducción, producción de proteínas de fusión, glicosilación de proteínas (véanse, por ejemplo, Coligan y col. (2000) Current Protocols in Protein Science, vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; Ausubel y col. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pág. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pág. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pág. 384-391). Se ha descrito la producción, purificación y fragmentación de anticuerpos policlonales y monoclonales (Coligan y col. (2001) Current Protocols in Immunology, vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; Harlow y Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow y Lane, arriba). Están disponibles técnicas convencionales para caracterizar interacciones ligando/receptor (véase, por ejemplo, Coligan y col. (2001) Current Protocols in Immunology, vol. 4, John Wiley, Inc., Nueva York).

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales, policlonales y humanizados (véanse, por ejemplo, Sheperd y Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, Nueva York, NY; Kontermann y Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, Nueva York; Harlow y Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pág. 139-243; Carpenter y col. (2000) J. Immunol. 165:6205; He y col. (1998) J. Immunol. 160:1029; Tang y col. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378; Baca y col. (1997) J Biol. Chem. 272:10678-10684; Chothia y col. (1989) Nature 342:877-883; Foote y Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499; patente de EE.UU. nº 6.329.511). Una alternativa a la humanización es usar bibliotecas de anticuerpos humanos expuestos sobre fago o bibliotecas de anticuerpos humanos en ratones transgénicos (Vaughan y col. (1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839; Mendez y col. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Hoogenboom y Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377; Barbas y col. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Kay y col. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruin y col. (1999) Nature Biotechnol. 17:397-399).

Se han descritos anticuerpos monocatenarios y diacuerpos (véanse, por ejemplo, Malecki y col. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:213-218; Conrath y col. (2001) J. Biol. Chem. 276:7346-7350; Desmyter y col. (2001) J. Biol. Chem. 276:26285-26290; Hudson y Kortt (1999) J. Immunol Methods 231:177-189; y la patente de EE.UU. nº 4.946.778). Se proporcionan anticuerpos bifuncionales (véanse, por ejemplo, Mack y col. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025; Carter (2001) J. Immunol Methods 248:7-15; Volkel y col. (2001) Protein Engineering 14:815-823; Segal y col. (2001) J. Immunol Methods 248:1-6; Brennan y col. (1985) Science 229:81-83; Raso y col. (1997) J. Biol. Chem. 272:27623; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Traunecker y col. (1991) EMBO J. 10:3655-3659; y las patentes de EE.UU. nº 5.932.448, 5.532.210 y 6.129.914).

También se proporcionan anticuerpos biespecíficos (véanse, por ejemplo, Azzoni y col. (1998) J. Immunol. 161:3493; Kita y col. (1999) J. Immunol. 162:6901; Merchant y col. (2000) J. Biol. Chem. 74:9115; Pandey y col. (2000) J. Biol. Chem. 275:38633; Zheng y col. (2001) J. Biol Chem. 276:12999; Propst y col. (2000) J. Immunol. 165:2214; Long (1999) Ann. Rev. Immunol. 17:875).

La purificación de antígeno no es necesaria para la generación de anticuerpos. Los animales pueden inmunizarse con células que llevan el antígeno de interés. Entonces, los esplenocitos pueden aislarse de los animales inmunizados, y los esplenocitos pueden fusionarse con una línea de células de mieloma para producir un hibridoma (véase, por ejemplo, Meyaard y col. (1997) Immunity 7:283-290; Wright y col. (2000) Immunity 13:233-242; Preston y col., arriba; Kaithamana y col. (1999) J. Immunol. 163:5157-5164). Los anticuerpos se unirán normalmente con al menos una Kd de aproximadamente 10-6 M, normalmente de al menos 10-7 M, más normalmente de al menos 10-8 M, preferentemente de al menos aproximadamente 10-9 M, y más preferentemente de al menos 10-10 M, y lo más preferentemente de al menos 10-11 M (véase, por ejemplo, Presta y col. (2001) Thromb. Haemost. 85:379-389; Yang y col. (2001) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 38:17-23; Carnahan y col. (2003) Clin. Cancer Res. (Suppl.) 9:3982s-3990s).

Los anticuerpos pueden conjugarse, por ejemplo, a pequeñas moléculas de fármaco, enzimas, liposomas, polietilenglicol (PEG). Los anticuerpos son útiles para fines terapéuticos, de diagnóstico, de kits u otros fines, e incluyen anticuerpos acoplados, por ejemplo, a colorantes, radioisótopos, enzimas o metales, por ejemplo, oro coloidal (véase, por ejemplo, Le Doussal y col. (1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibellini y col. (1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing y Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Everts y col. (2002) J. Immunol. 168:883-889).

Están disponibles procedimientos para citometría de flujo, que incluyen citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS) (véase, por ejemplo, Owens y col. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2ª ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ). Están disponibles reactivos fluorescentes adecuados para modificar ácidos nucleicos, que incluyen cebadores y sondas de ácidos nucleicos, polipéptidos y anticuerpos para su uso, por ejemplo, como reactivos de diagnóstico (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).

Se han descrito procedimientos convencionales de histología del sistema inmunitario (véase, por ejemplo, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, Nueva York, NY; Hiatt y col. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, y Wilkins, Phila, PA; Louis y col. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, Nueva York, NY).

Están disponibles paquetes de software y bases de datos para determinar, por ejemplo, fragmentos antigénicos, secuencias conductoras, plegamiento de proteínas, dominios funcionales, sitios de glicosilación y alineamientos de secuencias (véase, por ejemplo, GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); paquete GCG Wisconsin (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne y col. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne y col. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren y col. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690).

Ejemplo 2

Anticuerpos monoclonales de rata anti-IL-17A humana

Se obtuvieron anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-17A humana del siguiente modo. A ratas Lewis hembra de ocho semanas de edad (Harlan Sprague Dawley, Indianápolis, Indiana, EE.UU.) se les administró una serie de inyecciones de IL-17A humana recombinante (rhIL-17A) que se había expresado de vectores adenovíricos en células HEK 293. Las inyecciones se administraron en los días 0, 14, 32, 46 y 83.

La inyección del día 0 fue una inyección subcutánea (sc) de 50 !g de rhIL-17A, acompañada de la inyección intraperitoneal (ip) de adyuvante completo de Freund. Las inyecciones sc del día 14, 32 y 46 de 25 !g de rhIL-17A fueron acompañadas de la inyección ip de adyuvante incompleto de Freund. La inyección del día 83 fue una combinación de una inyección ip de 20 !g de rhIL-17A en adyuvante incompleto de Freund y una inyección intravenosa (iv) en la vena de la cola de rhIL-17A en solución salina.

Se realizó una prueba de sangrado en el día 53. La fusión de esplenocitos de rata se realizó en el día 87 usando 1,6 x 108 esplenocitos y 1,8 x 108 células de mieloma divididas en treinta placas de 96 pocillos, dando un total de 1,13 x 105 células totales por pocillo.

El cribado primario de los anticuerpos monoclonales resultantes (miles) se realizó por ELISA indirecto de rhIL-17A (véase el Ejemplo 5). Los cribados secundarios en los anticuerpos resultantes incluyeron la neutralización de la expresión inducida por rhIL-17A de IL-6 murina por células de ST2 (estroma de ratón) y la neutralización de la proliferación inducida por rhIL-17A de células hIL-17Rc:mGCSFR de Ba/F3 (véase el Ejemplo 11). Se estudiaron adicionalmente aproximadamente once de los anticuerpos monoclonales después del primer y segundo cribados. Los experimentos posteriores se realizaron para confirmar que los anticuerpos candidatos podían unirse a huIL-17A nativa para garantizar que serían útiles en diversos fines terapéuticos, de diagnóstico y/o de investigación. Tal cribado puede hacerse usando ensayos de unión (tal como ELISA indirecto o ELISA de tipo sándwich); por ensayo de actividad in vitro, o por ensayo de actividad in vivo, ejemplos que se proporcionan en este documento.

Ejemplo 3

Humanización de anticuerpos de rata anti-IL-17A humana

La humanización del anticuerpo monoclonal de rata anti-IL-17A humana 16C10 se realizó esencialmente como se describe en los documentos WO 2005/047324 y WO 2005/047326.

Brevemente, se usaron dominios constantes humanos para sustituir los dominios constantes parentales (rata) y se seleccionaron las secuencias de la línea germinal humana homólogas a las secuencias del dominio variable de rata y se usaron para proporcionar una región estructural humana para las CDR de rata, como se describe en más detalle más adelante.

Procedimiento para la selección de secuencias de la región estructural de la línea germinal humana

Las siguientes etapas se usan en la selección de las secuencias de la región estructural de la línea germinal apropiadas en la humanización de los anticuerpos anti-IL-17A humana de la presente invención. 1) Clonar y secuenciar dominios VL y VH no humanos y determinar la secuencia de aminoácidos.

Cadena pesada

2) Comparar la secuencia de VH no humana con un grupo de cinco secuencias de aminoácidos de la línea germinal de VH humana; una representativa de los subgrupos IGHV1 y IGHV4 y tres representativas del subgrupo IGHV3. Los subgrupos VH se enumeran en M.-P. Lefranc (2001) “Nomenclature of the Human Immunoglobulin Heavy (IGH) Genes”, Experimental and Clinical Immunogenetics, 18:100-116. La comparación con las cinco secuencias de la línea germinal se realiza del siguiente modo:

5 A) Asignar los números de residuos de la secuencia de VH no humana según Kabat y col. (1991).

B) Alinear la secuencia de VH no humana con cada una de las cinco secuencias de la línea germinal humana. Como los genes de V sólo comprenden los residuos de VH 1-94, sólo estos residuos se consideran en el alineamiento.

C) Delinear las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y estructurales (FR) en la secuencia. CDR y FR se definen como una combinación de las definiciones proporcionadas en Kabat y col. (1991) (ídem) y Chothia y

10 Lesk (1987) “Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins”, Journal of Molecular Biology, 196:901-917. Por tanto, la definición es: VH CDR1 = 26-35, CDR2 = 50-65, CDR3 = 95-102.

D) Para cada posición de residuo enumerada a continuación (Tabla 1), asignar la puntuación numérica en cada posición de residuo para la que las secuencias no humanas y humanas son idénticas:

Tabla 1 (continuación)

Nº de residuo: Puntuación Motivo

2: 4 Afecta a CDR-H1,3*

4: 3 Afecta a CDR-H1,3

24: 3 Afecta a CDR-H1

26: 4 Afecta a CDR-H1*

27: 4 Afecta a CDR-H1,3*

29: 4 Afecta a CDR-H1*

34: 4 Afecta a CDR-H1*

35: 2 Superficie de contacto VH/VL

37: 2 Superficie de contacto VH/VL

39: 2 Superficie de contacto VH/VL

44: 2 Superficie de contacto VH/VL

45: 2 Superficie de contacto VH/VL

47: 4 Superficie de contacto VH/VL, CDRL3

48: 3 Afecta a CDR-H2

49: 3 Afecta a CDR-H2

50: 2 Superficie de contacto VH/VL

51: 3 Afecta a CDR-H2

58: 2 Superficie de contacto VH/VL

59: 3 Afecta a CDR-H2

60: 2 Superficie de contacto VH/VL

63: 3 Afecta a CDR-H2

67: 3 Afecta a CDR-H2

69: 3 Afecta a CDR-H2

71: 4 Afecta a CDR-H2*

Nº de residuo: Puntuación Motivo

73: 3 Afecta a CDR-H1

76: 3 Afecta a CDR-H1

78: 3 Afecta a CDR-H1

91: 2 Superficie de contacto VH/VL

93: 3 Afecta a CDR-H3

94: 4 Afecta a CDR-H3*

máx 89

* Observado como que afecta a la conformación de CDR en C. Chothia y col. (1989) “Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions”, Nature 342:877-883.

E) Sumar todas las puntuaciones de posiciones de residuos. La secuencia de la línea germinal del aceptor es la que tiene la mayor puntuación total. En el caso en el que dos o más secuencias de la línea germinal tengan 5 puntuaciones idénticas, entonces:

1) Entre las siguientes posiciones de residuos sumar 1 a la total para cada posición en la que las secuencias no humanas y humanas sean idénticas: 1, 3, 5-23, 25, 36, 38, 40-43, 46, 66, 68, 70, 72, 74, 75, 77, 79-90, 92 (máx 49). 2) La secuencia de la línea germinal del aceptor es la que tiene la mayor puntuación total. Si dos o más

10 secuencias de la línea germinal todavía tienen puntuaciones idénticas, cualquiera es aceptable como aceptor.

Cadena ligera

III) Si la secuencia de VL es un miembro de la subclase kappa de VL, comparar la secuencia de VL no humana con un grupo de cuatro secuencias de aminoácidos de la línea germinal kappa de VL humanas. El grupo de cuatro 15 consiste en un representante de cada uno de los cuatro subgrupos de VL humanos establecidos enumerados en Barbie y Lefranc (1998) “The Human Immunoglobulin Kappa Variable (IGKV) Genes and Joining (IGKJ) Segments”, Experimental and Clinical Immunogenetics, 15:171-183, y M.-P. Lefranc (2001) “Nomenclature of the Human Immunoglobulin Kappa (IGK) Genes”, Experimental and Clinical Immunogenetics, 18:161-174. Los cuatro subgrupos también se corresponden con los cuatro subgrupos enumerados en Kabat y col. (1991) en la pág. 103-130. La

20 comparación con las cuatro secuencias de la línea germinal se realiza del siguiente modo:

A) Asignar los números de residuos de la secuencia de VL no humana según Kabat y col. (1991).

B) Alinear la secuencia de VL no humana con cada una de las cuatro secuencias de la línea germinal humana. Como los genes de V sólo comprenden los residuos de VL 1-95, sólo estos residuos se consideran en el alineamiento.

C) Delinear las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y estructurales (FR) en la secuencia. CDR y

25 FR se definen como una combinación de las definiciones proporcionadas en Kabat y col. (1991) (ídem) y Chothia y Lesk (1987) “Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins”, Journal of Molecular Biology, 196:901-917. Por tanto, la definición es: VL CDR1 = 24-34, CDR2 = 50-56, CDR3 = 89-97.

D) Para cada posición de residuo enumerada a continuación (Tabla 2), asignar la puntuación numérica en cada posición de residuo para la que las secuencias no humanas y humanas son idénticas:

Tabla 2

Nº de residuo: Puntuación Motivo

2: 4 Afecta a CDR-L1,3*

4: 3 Afecta a CDR-L1,3

25: 4 Afecta a CDR-L1*

29: 4 Afecta a CDR-L1,3*

33: 4 Afecta a CDR-L1,3*

34: 2 Superficie de contacto VL/VH

36: 2 Superficie de contacto VL/VH

38: 2 Superficie de contacto VL/VH

43: 2 Superficie de contacto VL/VH

44: 2 Superficie de contacto VL/VH

46: 4 Superficie de contacto VL/VH, CDR-H3

47: 3 Afecta a CDR-L2

48: 4 Afecta a CDR-L2*

49: 2 Superficie de contacto VL/VH

55: 2 Superficie de contacto VL/VH

58: 3 Afecta a CDR-L2

62: 3 Afecta a CDR-L2

64: 4 Afecta a CDR-L2*

71: 4 Afecta a CDR-L1*

87: 2 Superficie de contacto VL/VH

89: 2 Superficie de contacto VL/VH

90: 4 Afecta a CDR-L3*

91: 2 Superficie de contacto VL/VH

94: 2 Superficie de contacto VL/VH

95: 4 Afecta a CDR-L3*

1) Entre las siguientes posiciones de residuos sumar 1 a la total para cada posición en la que las secuencias no humanas y humanas sean idénticas: 1, 3, 5-23, 35, 37, 39-42, 57, 59-61, 63, 65-70, 72-86,

88. 2) La secuencia de la línea germinal del aceptor es la que tiene la mayor puntuación total. Si dos o más

10 secuencias de la línea germinal todavía tienen puntuaciones idénticas, cualquiera es aceptable como aceptor. Si la secuencia de VL es un miembro de la subclase lamba de VL se realiza un procedimiento análogo usando secuencias de aminoácidos de la línea germinal lambda de VL humanas de las fuentes bibliográficas citadas anteriormente.

Humanización de anticuerpos anti-IL-17A humana

Con respecto a la modificación de los dominios constantes, los dominios ligeros y pesados variables del anticuerpo 16C10 (IgG1 de rata dirigida contra IL-17A humana) se clonaron y se fusionaron con una cadena ligera kappa humana (dominio CL) y cadena pesada de IgG1 humana (CH1-bisagra-CH2-CH3), respectivamente. Esta combinación de los dominios variables de rata y dominios constantes humanos comprende una versión quimérica del anticuerpo 16C10. Las secuencias de las cadenas ligeras y pesadas de este 16C10 quimérico se proporcionan en SEC ID Nº: 9 y 10, respectivamente.

Con respecto a la modificación de las regiones estructurales de los dominios variables, la secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo 16C10 se comparó con un grupo de cinco secuencias de aminoácidos de la línea germinal de VH humanas; un representante de los subgrupos IGHV1 y IGHV4 y tres representantes del subgrupo IGHV3. Los subgrupos de VH se enumeran en M.-P. Lefranc, “Nomenclature of the Human Immunoglobulin Heavy (IGH) Genes”, Experimental and Clinical Immunogenetics, 18:100-116,2001. El anticuerpo 16C10 se puntuó con la mayor puntuación contra la línea germinal de la cadena pesada humana DP-71 en el subgrupo IV.

La secuencia de VL de 16C10 era de la subclase kappa. Esta secuencia se comparó con un grupo de cuatro secuencias de aminoácidos de la línea germinal kappa de VL humanas. El grupo de cuatro consiste en un representante de cada uno de los cuatro subgrupos de VL humanos establecidos enumerados en V. Barbie & M.-P. Lefranc, “The Human Immunoglobulin Kappa Variable (IGKV) Genes and Joining (IGKJ) Segments”, Experimental and Clinical Immunogenetics, 15:171-183, 1998 y M.-P. Lefranc, “Nomenclature of the Human Immunoglobulin Kappa (IGK) Genes”, Experimental and Clinical Immunogenetics, 18:161-174, 2001. Los cuatro subgrupos también se corresponden con los cuatro subgrupos enumerados en Kabat y col. (1991) en la pág. 103-130. El anticuerpo 16C10 se puntuó con la mayor puntuación contra la línea germinal de la cadena ligera humana Z-A19 en el subgrupo II.

Una vez se determinaron las secuencias de la región estructural de la línea germinal deseadas se generó un plásmido que codificaba las cadenas pesadas y ligeras variables humanizadas de longitud completa. La sustitución de residuos de la región estructural humana en lugar de los residuos de la región estructural del anticuerpo 16C10 de rata parental puede visualizarse equivalentemente como el injerto de las CDR de 16C10 de rata en las secuencias de la región estructural humana. El anticuerpo resultante se denomina en este documento “16C10wt”, designando “wt” la presencia de las mismas CDR como el 16C10 de rata parental, como se distingue de las CDR optimizadas (que tienen dos alteraciones de un único aminoácido) tratadas más adelante. Tanto los dominios variables de la cadena ligera como pesada se optimizaron por codones, se sintetizaron y se insertaron en dominios constantes para proporcionar la expresión potencialmente óptima. La optimización por codones, que puede mejorar la expresión de anticuerpos clonados, es puramente opcional.

Además de la sustitución de secuencias del dominio constante y de la región estructural humanas, el anticuerpo 16C10 wt humanizado también se modificó en dos residuos de CDR para proporcionar mayor estabilidad química del anticuerpo humanizado final. Los dos cambios se representan por residuos de aminoácidos en negrita en la secuencia VH de “hu16C10” mostrada en la FIG. 1B. Con referencia a la numeración de Kabat usada en la FIG. 1B, el residuo 54 de CDR2 se cambió de N (asparagina) en el anticuerpo de rata a Q (glutamina) en el anticuerpo humanizado para reducir las posibilidades de formación de isoaspartato en la secuencia NG en los residuos 54-55. La formación de isoaspartato puede debilitar o suprimir completamente la unión de un anticuerpo a su antígeno diana. Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 a 734. Además, el residuo 96 de CDR3 se cambió de M (metionina) en el anticuerpo de rata a A (alanina) en el anticuerpo humanizado para reducir la posibilidad de que se oxidara el azufre de la metionina, que podría reducir la afinidad de unión a antígeno y también contribuiría a laheterogeneidad molecular en la preparación final de anticuerpo. Ídem. Estas modificaciones de un único residuo pueden representarse como N54Q y M96A. El anticuerpo 16C10 humanizado final desvelado en este documento comprende estas dos sustituciones con respecto a las CDR de 16C10 de rata parentales.

En otra realización de la presente invención, el anticuerpo 16C10 quimérico (no humanizado) se altera para incorporar las dos modificaciones de un único residuo descritas anteriormente para la forma humanizada, es decir, N54Q y M96A.

Las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo humanizado 16C10 (hu 16C10) se proporcionan en las FIGS. 2A y 2B, respectivamente, y en SEC ID Nº: 2 y 4 (que incluyen secuencias señal). Una realización de secuencias de nucleótidos que codifica las cadenas ligeras y pesadas de hu 16C10 se muestra en SEC ID Nº: 1 y 3. Otra realización de secuencias de nucleótidos que codifica las cadenas ligeras y pesadas de hu 16C10 se muestra en la Figura 5A (SEC ID Nº: 62) y la Figura 5B (SEC ID Nº: 63).

Por motivos de claridad con respecto a la nomenclatura es importante reconocer que el sistema de numeración de Kabat no incluye designaciones numéricas de residuos de aminoácidos (por ejemplo, los residuos de VH 83a, 83b, 83c) para acomodar variaciones en las longitudes de CDR y regiones estructurales entre diversos anticuerpos.

Aunque este sistema de numeración es ventajoso para permitir la fácil referencia a residuos de aminoácidos correspondientes entre diversos anticuerpos con CDR de diferentes longitudes, puede producir designaciones conflictivas para residuos de aminoácidos específicos cuando se comparan con la numeración de secuencias numéricas secuenciales estrictas (por ejemplo, listas de secuencias). Las designaciones de residuos de aminoácidos en este documento se hacen con referencia a la lista de secuencias relevantes, a menos que se observe de otro modo, por ejemplo, por referencia a la “numeración de Kabat”.

Como punto adicional de aclaración con respecto a la nomenclatura, las SEC ID Nº: 2 y 4 (16C10 humanizado) incluyen las secuencias de péptidos señal del extremo N (los 19 primeros residuos de cada una), cuyos aminoácidos se eliminan en la forma madura del anticuerpo. Las SEC ID Nº: 1, 3, 62 y 63 incluyen 57 nucleótidos que codifican las secuencias señal. Como se usa en este documento, una forma “madura” de una proteína se refiere a la proteína sin la secuencia señal.

El anticuerpo humanizado 4C3 se crea mediante procedimientos análogos a aquellos descritos anteriormente para el anticuerpo 16C10. Debido a que el anticuerpo 4C3 de rata parental se diferenció sólo en un único residuo de aminoácido en la región estructural de la cadena ligera, y tales regiones estructurales se reemplazan por secuencias de la región estructural de la línea germinal humana durante la humanización, la secuencia del anticuerpo 4C3 humanizado final es idéntica a la secuencia del anticuerpo 16C10 humanizado.

El anticuerpo humanizado 30C10 también se crea mediante procedimientos análogos a aquellos descritos anteriormente para el anticuerpo 16C10. En la determinación de las secuencias de la región estructural humana apropiadas que van a usarse, los anticuerpos 30C10 de rata parentales dan la mayor puntuación contra la línea germinal de cadena pesada humana DP-46 en el subgrupo III y la línea germinal de cadena ligera humana Z-A19 en el subgrupo II, de manera que aquellas secuencias de la región estructural están sustituidas para las secuencias de la región estructural de rata. Las secuencias de VL y VH de 30C10 humanizado se proporcionan en SEC ID Nº: 22 y 23, respectivamente. En otras realizaciones, uno o más residuos de metionina en las CDR de 30C10 de rata se mutan para evitar la posibilidad de oxidación del azufre de la metionina en el anticuerpo 30C10 humanizado. Específicamente, el residuo 34 de la cadena pesada (en CDRH1) y/o el residuo el 30f de la cadena ligera (numeración de Kabat, véase la FIG. 1A) están cambiados de metionina a otro aminoácido, por ejemplo, alanina. Tales anticuerpos se criban posteriormente para garantizar que la sustitución de metionina no disminuya la afinidad de unión a IL-17A a niveles inaceptables.

Las versiones que contienen secuencias quiméricas, humanizadas y señal del anticuerpo 12E6 se crean usando los procedimientos descritos en este documento por analogía con la preparación de tales anticuerpos basándose en el anticuerpo de rata parental 16C10. Las CDR de cadena ligera y pesada para el anticuerpo de rata parental 12E6 se proporcionan en SEC ID Nº: 34-36 y 37-39. Las secuencias de la región estructural de dominio constante y dominio variable humanas se introducen como se ha descrito anteriormente. En una realización, el residuo 34 de la cadena pesada (en CDRH1) se cambia de una metionina a otro aminoácido, por ejemplo, alanina, para evitar la posibilidad de oxidación del azufre de la metionina en el anticuerpo 12E6 humanizado. Los anticuerpos resultantes se criban posteriormente para garantizar que la sustitución de la metionina no disminuya la afinidad de unión a IL-17A a niveles inaceptables.

Las versiones que contienen secuencias quiméricas, humanizadas y señal del anticuerpo 23E12 se crean usando los procedimientos descritos en este documento por analogía con la preparación de tales anticuerpos basándose en el anticuerpo de rata parental 16C10. Las secuencias de dominio variable de la cadena ligera y pesada para el anticuerpo de rata parental 23E12 se proporcionan en SEC ID Nº: 44 y 46 (ADN) y 45 y 47 (aminoácido). Las CDR para el anticuerpo de rata parental 23E12 se proporcionan en SEC ID Nº: 48-50 (cadena ligera) y 51-53 (cadena pesada). Las secuencias de la región estructural del dominio constante y dominio variable humanas se introducen en los anticuerpos de rata parentales como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 4

Anticuerpos anti-IL-17A completamente humanos

Los anticuerpos monoclonales anti-IL-17A completamente humanos se generan usando ratones transgénicos que llevan partes del sistema inmunitario humano en vez del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos, denominados en este documento ratones “HuMAb”, contienen miniloci de genes de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulinas de la cadena pesada (! y y) y ligera K humana sin reordenar, junto con mutaciones elegidas como diana que inactivan los loci de cadenas ! y K endógenos (Lonberg y col. (1994) Nature 368(6474):856-859). Por consiguiente, los ratones presentan expresión reducida de IgM o K de ratón, y en respuesta a inmunización, los transgenes de la cadena pesada y ligera humanos introducidos experimentan cambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales K IgG humanos de alta afinidad (Lonberg y col. (1994), arriba; revisado en Lonberg (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg y col. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, y Harding y col. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación de ratones HuMab es comúnmente conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Taylor y col. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen y col. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon y col. (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi y col. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen y col. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon y col. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor y col. (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg y col. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93; y Fishwild y col. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851.

Véanse también las patentes de EE.UU. nº 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; 5.770.429 y 5.545.807; y las publicaciones de solicitud de patente internacional nº WO 98/24884; WO 94/25585; WO 93/1227; WO 92/22645 y WO 92/03918.

Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos dirigidos contra IL-17A, ratones HuMab se inmunizan con un polipéptido de IL-17A antigénico como se describe por Lonberg y col. (1994); Fishwild y col. (1996) y el documento WO 98/24884. Preferentemente, los ratones tienen 6-16 semanas de edad tras la primera inmunización. Por ejemplo, puede usarse una preparación purificada de IL-17A para inmunizar los ratones HuMab intraperitonealmente. Los ratones también pueden inmunizarse con células HEK293 completas que se transforman o se transfectan establemente con un gen de IL-17A. Un “polipéptido de IL-17A antigénico” puede referirse a un polipéptido de IL-17A de cualquier fragmento del mismo que provoca una respuesta inmunitaria anti-IL-17A en ratones HuMab.

En general, los ratones transgénicos HuMAb respondieron mejor cuando se inmunizaron inicialmente intraperitonealmente (IP) con antígeno en adyuvante completo de Freund, seguido de inmunizaciones IP cada dos semanas (normalmente hasta un total de 6) con antígeno en adyuvante incompleto de Freund. Los ratones se inmunizan primero con células que expresan IL-17A (por ejemplo, células HEK293 establemente transformadas), luego con un fragmento de IL-17A soluble, seguido de inmunizaciones alternas con los dos antígenos. La respuesta inmunitaria se monitoriza durante la evolución del protocolo de inmunización con muestras de plasma que se obtienen por sangrados retroorbitales. Los plasmas se criban para la presencia de anticuerpos anti-IL-17A, por ejemplo, por ELISA, y los ratones con suficientes títulos de inmunoglobulina se usan para las fusiones. Los ratones se refuerzan intravenosamente con antígeno tres días antes del sacrificio y extirpación del bazo. Pueden ser necesarias de dos a tres fusiones para cada antígeno. Se inmunizan varios ratones para cada antígeno. Por ejemplo, puede inmunizarse un total de doce ratones HuMAb de las cepas HCO7 y HCO12.

Las células de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales anti-IL-17A completamente humanos se producen mediante procedimientos comúnmente conocidos en la técnica tales como la técnica con hibridomas originalmente desarrollada por Kohler y col. (1975) (Nature 256:495-497); la técnica de triomas (Hering y col. (1988) Biomed. Biochim. Acta. 47:211-216 y Hagiwara y col. (1993) Hum. Antibod. Hybridomas 4:15); la técnicas de hibridomas de linfocitos B humanos (Kozbor y col. (1983) Immunology Today 4:72 y Cote y col. (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030); y la técnica de hibridomas de EBV (Cole y col. (1985) en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pág. 77-96). Preferentemente, los esplenocitos de ratón se aíslan y se fusionan con PEG dando una línea de células de mieloma de ratón basándose en protocolos convencionales. Los hibridomas resultantes pueden entonces cribarse para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. En una realización, suspensiones de células individuales de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados se fusionan con un sexto del número de células de mieloma de ratón no secretante P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con 50% de PEG. Las células se siembran a aproximadamente 2 x 105 células/ml en un placa de microtitulación de fondo plano, seguido de una incubación de dos semanas en medio selectivo que contiene 20% de suero de clon fetal, 18% de medio acondicionado “653”, 5% de origen, L-glutamina 4 mM, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 5 mM, 2mercaptoetanol 0,055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y 1X HAT (Sigma; el HAT se añade 24 horas después de la fusión). Después de dos semanas se cultivan en medio en el que el HAT se reemplaza por HT. Entonces, los pocillos individuales se criban por ELISA para anticuerpos monoclonales humanos IgG dirigidos contra IL-17A. Una vez se produce el amplio crecimiento de hibridomas, el medio se observa normalmente después de 10-14 días. Los hibridomas que secretan anticuerpos se vuelven a sembrar, se criban de nuevo y, si todavía son positivos para IgG humana, los anticuerpos monoclonales anti-IL-17A se subclonan al menos dos veces por dilución limitante. Entonces, los subclones estables se cultivan in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para la caracterización.

En otra realización, las moléculas de anticuerpo anti-IL-17A descritas en este documento se producen recombinantemente (por ejemplo, en un sistema de expresión de E. coli/T7). En esta realización, los ácidos nucleicos que codifican las moléculas de anticuerpo de la invención (por ejemplo, VH o VL) se insertan en un plásmido basado en pET y se expresan en el sistema de E. coli/T7. Hay varios procedimientos para producir anticuerpos recombinantes conocidos en la técnica, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.816.567 que se incorpora por este documento por referencia. Las moléculas de anticuerpo también pueden producirse recombinantemente en células CHO o NSO.

Ejemplo 5

ELISA indirecto de anticuerpos monoclonales anti-IL-17A

La unión de anticuerpos monoclonales anti-IL-17A humana dirigidos contra rhIL-17A se evalúa usando un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) indirecto. Brevemente, una concentración fija de rhIL-17A se une directamente a los pocillos de una placa de microtitulación. Entonces, el monoclonal anti-IL-17A que va a ensayarse se añade a la placa recubierta de rhIL-17A, en la que el anticuerpo se captura y se cuantifica. A continuación sigue un protocolo más detallado.

Una placa MaxiSorp de fondo en U de 96 pocillos se recubre con 50 !l/pocillo de rhIL-17A (0,5 !g/ml) en tampón de recubrimiento de carbonato (la “placa de ensayo”). El tampón de recubrimiento de carbonato es 2,9 g/l de NaHCO3, 5 1,6 g/l de Na2CO3, pH 9,4. Las placas se incuban cubiertas a 4ºC durante la noche. Los anticuerpos monoclonales que van a cribarse se diluyen seriadamente por duplicado a lo largo de las filas de una placa de fondo en V de forma que el volumen final sea 60 !l/pocillo (la “placa de dilución seriada”). La placa de ensayo se lava tres veces con PBS-Tween en un lavador de placas (SkanWasher, Molecular Devices, Sunnyvale, California, USA) y se seca por transferencia. Se obtiene PBS-Tween añadiendo 0,5 ml/l de Tween 20 a 1X PBS. Cincuenta !l de cada pocillo de la 10 placa de dilución seriada se transfieren a la placa de ensayo y se incuban a 25ºC durante una hora. Los anticuerpos secundarios se diluyen 1/2000 en diluyente (PBS-BSA-Tween, que es PBS-Tween con 1 g/l de BSA). El anticuerpo secundario para anticuerpos monoclonales de rata es anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de rata (H+L) - HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, Pensilvania, USA). El anticuerpo secundario para anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados es F(ab')2 de cabra dirigido contra IgG humana Fcy - HRP 15 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). La placa de ensayo se lava como antes. Los anticuerpos secundarios diluidos (100 !l/pocillo) se añaden a los pocillos apropiados en la placa de ensayo, y la placa se incuba a 25ºC durante 45 minutos. La placa de ensayo se lava como antes. Se añade ABTS (100 !l/pocillo) (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Mariland, EE.UU.) y la placa se incuba a 25ºC durante 5-10 minutos, después de lo cual la absorbancia se lee a 405 nm en un lector de placas (Versamax, Molecular Devices, Sunnyvale, California,

20 EE.UU.) con una agitación de 5 segundos antes de la lectura.

Los resultados del ELISA indirecto para diversas formas del anticuerpo 16C10 de la presente invención se muestran en la Tabla 5. La unión se informa como una CE50 (la concentración de anticuerpo necesaria para obtener la señal al 50%). Los resultados muestran que la unión se detecta con todas las formas de 16C10. Aunque tales ensayos de ELISA indirectos son útiles en la rápida determinación de la presencia o ausencia de anticuerpos anti-IL-17A, los

25 números de CE50 obtenidos pueden depender del ensayo, y normalmente no se usan para evaluar la afinidad de unión absoluta para cualquier anticuerpo dado.

TABLA 5

ELISA indirecto de anticuerpo anti-IL-17A

mAb: rhIL-17A (!g) CE50 (pM)

16C10 de rata: 0,025 274

16C10 quimérico: 0,025 157

16C10 wt humanizado: 0,025 212

Ejemplo 6

30 ELISA de anticuerpos monoclonales anti-IL-17A

La unión de anticuerpos monoclonales anti-IL-17A humana dirigidos contra rhIL-17A se evalúa usando un ELISA del siguiente modo. Brevemente, un anticuerpo de captura se une a los pocillos de una placa de microtitulación, después de lo cual se añade una concentración fija de rhIL-17A. Entonces, el monoclonal anti-IL-17A que va a ensayarse se valora frente al rhIL-17A unido a la placa para determinar la concentración de anticuerpo necesaria

35 para lograr la unión al 50%. Sigue un protocolo más detallado.

Una placa de microtitulación de 96 pocillos se recubre con 100 !l/pocillo del anticuerpo de captura (12E6 de rata anti-hIL-17A, 0,5 !g/ml) en tampón de recubrimiento de carbonato a pH 9,5 (la “placa de ensayo”). Las placas se incuban cubiertas a 4ºC durante 24 a 48 horas. La placa de ensayo se lava tres veces en un lavador de placas (SkanWasher, Molecular Devices, Sunnyvale, California, EE.UU.) y se seca por transferencia. Entonces, la placa se 40 bloquea con 200 !l/pocillo de tampón de ensayo de ELISA (Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,15 M, pH7,4, 0,5% de BSA, 0,05% de Tween-20, EDTA 2 mM) durante una hora a 25ºC en un agitador orbital. La placa se lava, y se añaden 100 !l/pocillo de tanto rhIL-17A derivada de adenovirus como IL-17 humana derivada de E. coli (IL-17A) (R&D Systems, Mineápolis, Minnesota, EE.UU.) (0,1 !g/ml) en tampón de ensayo de ELISA y se incuba durante 2 horas a 25ºC en un agitador orbital. La placa se lava y los anticuerpos monoclonales que van a cribarse se diluyen seriadamente a lo 45 largo de una fila de siete pocillos en el intervalo de 1000 ng/ml a 0,0813 ng/ml usando diluciones cuádruples seriadas. Las placas se incuban durante 1,5 horas a 25ºC en un agitador orbital. Las placas se lavan y se añaden 100 !l/pocillo de anticuerpo secundario (F(ab')2 de cabra anti-cadena ligera kappa humana - HRP, dilución 1:20.000, BioSource, Carlsbad, California, EE.UU.), excepto los pocillos de blanco del ensayo. Las placas se lavan dos veces (es decir, dos ciclos de 3 lavados por ciclo) con rotación de placas entre ciclos. El sustrato TMB (Kirkegaard & Perry

Laboratories, Gaithersburg, Mariland, EE.UU.) se añade a 100 !l/pocillo y se incuba 3-5 minutos en un agitador orbital. Se añade disolución de parada (100 !l/pocillo) y la placa se lee para la absorbancia a 450-570 nm en un lector de placas (Versamax, Molecular Devices, Sunnyvale, California, EE.UU.).

Los resultados de ELISA para diversas formas del anticuerpo 16C10 de la presente invención se muestran en la Tabla 6. La unión se informa como una CE50 (la concentración de anticuerpo necesaria para obtener la señal al 50%). Los resultados muestran que la unión se detecta con todas las formas de 16C10. Los valores presentados con intervalos de error representan la media de múltiples determinaciones con la desviación estándar.

TABLA 6

ELISA de anticuerpos anti-IL-17A

mAb: IL-17A humana CE50 (pM)

hu 16C10 wt: rhIL-17A 66 ± 14

hu 16C10 wt: R&D Systems 130 ± 19

hu 16C10 VH N54A: rhIL-17A 75

hu 16C10 VH N54Q: rhIL-17A 65

hu 16C10 VH N60A: rhIL-17A 63

hu 16C10 VH N60Q: rhIL-17A 74

hu 16C10 VH M96L: rhIL-17A 66

hu 16C10 VH M96A: rhIL-17A 60

hu 16C10 VH M96K: rhIL-17A 68

hu 16C10 VH M96F: rhIL-17A 125

hu 16C10 VH M100hF: rhIL-17A 49

hu 16C10 VH M100hL: rhIL-17A 53

hu 16C10 (= VH N54Q/M96A): rhIL-17A 92

hu 16C10 (= VH N54Q/M96A): R&D Systems 136

hu 16C10 VH 54Q/M96A/M100hF: rhIL-17A 80

hu 16C10 VH 54Q/M96A/M100hF: R&D Systems 118

10 Ejemplo 7

Afinidad de unión de anticuerpos anti-IL-17A humana

Medición de la unión de anticuerpos anti-IL-17A humana de rata y quiméricos usando un ensayo de electroquimioluminiscencia (ECL)

La tecnología de electroquimioluminiscencia Origen se desarrolló por IGEN, Inc. (Gaithersburg, Mariland, EE.UU.) y

15 se empleó para medir la unión de anticuerpos anti-IL-17A humana de rata (y un anticuerpo quimérico) a FLAG-huIL17A. Véase el sistema de inmunoensayo Elecsys®, Roche Diagnostics (Indianápolis, Indiana, EE.UU.). La tecnología de electroquimioluminiscencia usa un quelato estable de metal rutenio (Ori-TAG) que, en presencia de tripropilamina (TPA), genera electroquimioluminiscencia tras la aplicación de voltaje. Las perlas paramagnéticas, de micrómetros de diámetro, actúan de fase sólida y facilitan la rápida cinética del ensayo. La perla/complejo es dirigida por una

20 celda de flujo y capturada en un electrodo por aplicación magnética. Se aplica voltaje y se mide la electroquimioluminiscencia resultante.

Los ensayos de ECL se realizaron del siguiente modo. Se prepararon diluciones triples seriadas de mAbs anti-IL17A humana en 50 !l de tampón de ensayo en un placa de microtitulación de 96 pocillos para dar 1-3 !g/ml de concentración final en el primer pocillo. A cada pocillo se añadieron cincuenta !l del tampón de ensayo y 50 !l de 25 FLAG-huIL-17A biotinilado a 50 ng/ml, seguido de la adición de tanto pAb de cabra dirigido contra IgG de rata

marcado con OriTag (H+L) (50 !l a 450 ng/ml) o un mAb anti-hIgG (50 !l a 500 ng/ml). Finalmente se añadieron 50 !l de perlas de estreptavidina-Dyna Origen a 0,1 mg/ml a cada pocillo. Después de 1 h de incubación a 25ºC, la placa se procesó por el analizador Origen M-series M8/384. El software GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, California, EE.UU.) se usó para representar los datos y calcular el área bajo la curva, que es una medida

5 aproximada de la unión.

Los resultados se presentan en la Tabla 7 (que incluye algunas determinaciones por duplicado). Las dos filas que muestran la unión de 16C10 de rata a FLAG-huIL-17A representan determinaciones por duplicado. Todos los anticuerpos de rata anti-IL-17A humana en la tabla (1D10, 16C10, 30C10, 23E12) se unieron a FLAG-huIL-17A, como lo hizo 16C10 quimérico. Los cuatro anticuerpos también se unieron a IL-17A de cino. Los anticuerpos 16C10

10 y 30C10 no se unieron a IL-17A de ratón en las condiciones de este ensayo, pero sí los anticuerpos 1D10 y 23E12.

TABLA 7

Unión de anticuerpo determinada por ECL

mAb: Antígeno Área bajo el pico

1D10 de rata: FLAG-hu-IL-17A 477474

16C10 de rata: FLAG-hu-IL-17A 285792

16C10 de rata: FLAG-hu-IL-17A 374445

30C10 de rata: FLAG-hu-IL-17A 311752

23E12 de rata: FLAG-hu-IL-17A 285145

16C10 quimérico: FLAG-hu-IL-17A 345982

1D10 de rata: cino IL-17 136497

16C10 de rata: cino IL-17 151543

30C10 de rata: cino IL-17 123916

23E12 de rata: cino IL-17 111242

1D10 de rata: mu IL-17 252121

1D10 de rata: mu IL-17 384999

16C10 de rata: mu IL-17 sin unión

16C10 de rata: mu IL-17 sin unión

30C10 de rata: mu IL-17 sin unión

30C10 de rata: mu IL-17 sin unión

23E12 de rata: mu IL-17 143206

23E12 de rata: mu IL-17 289185

Determinación de la constante de disociación de equilibrio (Kd) para anticuerpos anti-IL-17A humana de rata y humanizados usando la tecnología KinExA

15 Las constantes de disociación de equilibrio (Kd) para anticuerpos anti-IL-17A humana se determinaron usando el instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Instruments Inc., Boise, Idaho, EE.UU.). KinExA usa el principio del procedimiento del ensayo de exclusión cinética basado en medir la concentración de anticuerpo sin complejar en una mezcla de anticuerpo, antígeno y complejo anticuerpo-antígeno. Véase, por ejemplo, Darling y Brault (2004) Assay Drug Dev. Technol. 2(6):647-57. La concentración de anticuerpo libre se mide exponiendo la mezcla a un

20 antígeno inmovilizado sobre fase sólida durante un periodo de tiempo muy breve. En la práctica, esto se lleva a cabo haciendo circular la mezcla de antígeno-anticuerpo en fase de disolución por partículas recubiertas de antígeno atrapadas en una celda de flujo. Los datos generados por the instrumento se analizan usando un software propio. Las constantes de equilibrio se calculan usando una teoría matemática basándose en las siguientes suposiciones:

1. La unión sigue la ecuación de unión reversible para el equilibrio:

kas [Ab] [Ag] = kdis [AbAg]

en la que Kd = kdis / kas

2. El anticuerpo (Ab) y el antígeno (Ag) se unen 1:1 y el anticuerpo total es igual al complejo antígeno5 anticuerpo (AbAg) más el anticuerpo libre.

3. La señal del instrumento está linealmente relacionada con la concentración de anticuerpo libre.

El análisis KinExA se realizó en varios anticuerpos de rata anti-IL-17A humana, variantes humanizadas de los mismos y variantes de secuencias de estos anticuerpos humanizados. IL-17A se derivó de tanto ser humano (“hu”), mono cinomolgo (“cino”) como de ratón (“mu”). Se usó IL-17A de la misma especie en tanto las fases inmovilizadas

10 como en disolución para cada determinación de KinExA. Partículas de poli(metacrilato de metilo) (PMMA) (98 micrómetros) se recubrieron con IL-17A humana, de cino o de ratón según Sapidyne “Protocol for coating PMMA particles with biotinylated ligands having short or nonexistent linker arms”. Todos los procedimientos experimentales se hicieron según el manual de KinExA 3000. Todas las ejecuciones se hicieron por duplicado. Las condiciones para KinExA se proporcionan en la Tabla 8.

15 TABLA 8

Condiciones de KinExA

IL-17A:: humano, cino ratón

Volumen de muestra:: 2 ml 4 ml

Velocidad de flujo de la muestra:: 0,25 ml/min 0,25 ml/min

Volumen de la marca:: 1 ml 1 ml

Velocidad de flujo de la marca:: 0,25 ml/min 0,25 ml/min

Conc. de anticuerpo:: 0,02 - 0,1 nM 0,1 nM

Mayor conc. de antígeno:: 4 nM 64 nM (23E12) 4,0 nM (1D10)

Menor conc. de antígeno:: 1 pM 62 pM (23E12) 3,9 pM (1D10)

Se prepararon diluciones dobles seriadas del antígeno y se mezclaron con el anticuerpo a concentración constante. La mezcla se incubó durante 2 horas a 25ºC para equilibrarse.

La Tabla 9 muestra los resultados del análisis KinExA. Las concentraciones molares para el análisis KinexA se

20 calcularon basándose en un peso molecular de 75 kDa para anticuerpos y 15 kDa para IL-17A para explicar la presencia de dos sitios de unión en los anticuerpos y la naturaleza dimérica de IL-17A. Para algunos anticuerpos se realizaron experimentos por duplicado con diferentes lotes de anticuerpo y/o antígeno, en cuyos casos se proporcionan valores medios en la Tabla 9, junto con los errores estándar. Las constantes de unión para el anticuerpo 16C10 wt humanizado y el anticuerpo 16C10 de rata parental fueron similares a aproximadamente 5-10

25 pM, que muestra que la humanización no redujo significativamente la alta afinidad del 16C10 de rata parental por IL17A humana. También se ensayaron 16C10 humanizados que incorporan diversas sustituciones de aminoácidos (N54Q, M96A, M100hF), que incluyen el anticuerpo 16C10 humanizado final (que tiene sustituciones N54Q y M96A en comparación con 16C10 de rata), y se encontró que tenían altas constantes de unión similares en el intervalo de 1-10 pM. El fragmento Fab de hu16C10 unido retuvo la alta afinidad (16 pM) en comparación con el anticuerpo

30 completo. Otros anticuerpos de la presente invención (1D10 de rata, 23E12 de rata, 30C10 de rata) también se unieron con alta afinidad a FLAG-huIL-17A, y a IL-17A de cino. Aunque 1D10 de rata se unió a ratón con afinidad 10 pM, similar a su afinidad por IL-17A humana y de cino, 23E12 de rata tuvo una afinidad 200-2000 menor por IL-17A de ratón (7000 pM). Los anticuerpos 16C10 y 30C10 no ser unieron a IL-17A de ratón (datos no mostrados).

TABLA 9

Valores de kd determinados por KinExA

mAb: Antígeno kd (pM)

16C10 de rata: rhIL-17A 6,0

16C10 de rata: FLAG-huIL-17A 3,6

hu 16C10 wt: rhIL-17A 8,8 ± 3,0

hu 16C10 [= VH N54Q/M96A]: rhIL-17A 3,9 ± 2,7

hu 16C10 Fab: rhIL-17A 16,1

hu 16C10 VH N54A: rhIL-17A 10,8

hu 16C10 VH N54Q: rhIL-17A 7,0

hu 16C10 VH M96A: rhIL-17A 9,9

hu 16C10 VH N54Q/M96A/M100hF: rhIL-17A 10,0

1D10 de rata: FLAG-huIL-17A 1,7

23E12 de rata: FLAG-huIL-17A 2,8

30C10 de rata: FLAG-huIL-17A 11,0

1D10 de rata: IL-17A de cino 9,8

23E12 de rata: IL-17A de cino 28,0

30C10 de rata: IL-17A de cino 32,6

16C10 de rata: IL-17A de cino 1,7

hu 16C10: IL-17A de cino 16,3

1D10 de rata: mu IL-17A 10,3

23E12 de rata: mu IL-17A 7.000

Otros procedimientos conocidos en la técnica, tales como espectroscopía de resonancia de plasmones superficiales Biacore®, pueden usarse para medir la afinidad de anticuerpos de la presente invención. Aunque el análisis Biacore®

5 se realizó en varios de los anticuerpos de la presente invención, la afinidad de unión fue generalmente demasiado alta para medirse con exactitud, específicamente, la velocidad de disociación era demasiado lenta para medirse por este procedimiento. Sin embargo, tales análisis pueden ser de uso en el análisis de anticuerpos anti-IL-17A o anticuerpos anti-IL-17A de menor afinidad que tienen constantes de velocidad de disociación más rápidas.

Ejemplo 8

10 Ensayo de sinoviocitos para anticuerpos anti-IL-17A

La capacidad de los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención para bloquear la actividad biológica de IL-17A (tanto rhIL-17A como huIL-17A nativa) se mide monitorizando la expresión inducida por IL-17A de IL-6 y IL-8 en cultivo primario de sinoviocitos humanos del siguiente modo. Los sinoviocitos se aíslan por digestión con colagenasa de un sinovio de artritis reumatoide obtenido de un paciente con artroplastia de rodilla. Los sinoviocitos se 15 enriquecen por pase continuo en medio de crecimiento (DMEM, 10% de SBF, 1X Pen-Strep (50 UI/ml de penicilina, 55 !g/ml de estreptomicina), 1X beta-mercaptoetanol (50 !M), 1X glutamina (20 mM), 25 mM HEPES), se congelan en el pase número tres y se guardan en nitrógeno líquido. Cuando están listos para su uso en un ensayo, un vial de las células se descongela, se siembra y se deja que las células crezcan próximas a la confluencia. Entonces, las células se someten a pases 1:2 en matraces más grandes usando tripsina/EDTA. Cuando se han expandido

20 suficientes células se inicia un experimento tripsinando las células, sembrando en placas de 96 pocillos o 48 pocillos, y dejándolas que crezcan hasta total confluencia.

IL-17A se diluye a 120 ng/ml, es decir, 4X la concentración final de 30 ng/ml (1 nM). IL-17A es tanto humana (rhIL17A como huIL-17A nativa) o de un primate no humano, en este caso monos cinomolgos (cino). Alícuotas de 100 y 300 !l de las disoluciones madre 4X IL-17A se añaden a placas de 96 pocillos y 48 pocillos vacías, respectivamente.

Los anticuerpos anti-IL-17A que van a ensayarse se diluyen en medio de crecimiento a 4X la concentración máxima que va a probarse en un experimento. 4X disolución madre anti-IL-17A se diluye seriadamente 1:2 para cubrir el

5 intervalo de inhibición dinámica del ensayo. Cada una de las muestras de anticuerpo seriadamente diluidas (todas son 4X su concentración final) se mezclan 1:1 con 4X disoluciones de IL-17A en placas vacías para generar mezclas con 2X concentraciones de tanto IL-17A como anticuerpos anti-IL-17A. Se deja que estas mezclas se equilibren a 37ºC en una estufa de incubación de cultivo de tejido durante más de cuatro horas.

El medio se elimina de los sinoviocitos confluentes adherentes y se sustituye por 100 !l (placa de 96 pocillos) o 200

10 !l (placa de 48 pocillos) de medio de crecimiento. Un volumen igual de la disolución de 2X ligando/2X anticuerpo se añade a los sinoviocitos para dar 1X IL-17A (30 ng/ml finales) y 1X anticuerpo. Cada pocillo (punto de dato) se ejecuta por duplicado. Los sinoviocitos se activan (es decir, se exponen a la mezcla de IL-17A/anticuerpo) durante tres días, momento en el que los sobrenadantes se transfieren a placas de 96 pocillos, y opcionalmente se congelan, y se guardan a -80ºC hasta que se analicen. Las placas de microtitulación que contienen sobrenadantes se

15 descongelan y cada disolución se diluye 1:10 usando medio de crecimiento. Los sobrenadantes se analizan para IL6 y IL-8 usando pares de perlas Luminex (Upstate, Charlottesville, Virginia, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los resultados se proporcionan en las Tablas 10 (IL-6) y 11 (IL-8). Los valores presentados con intervalos de error representan la media de múltiples determinaciones con la desviación estándar. Se muestran los resultados para 20 diversas formas del anticuerpo 16C10, que incluyen una forma humanizada de 16C10 que tiene las CDR de rata originales (“hu16C10 (wt)”), además de varias variantes que tienen uno, dos o tres cambios en las CDR de la cadena pesada (generalmente “hu16C10 X##Z” en la que X es el aminoácido en el residuo ## en la cadena pesada de hu16C10 (wt) y Z es el nuevo aminoácido). “NHP IL-17A” es IL-17A derivada de primate no humano, en este caso IL-17A de mono cinomolgo. “huIL-17A nativa” se refiere a huIL-17A madura producida cuando la proteína precursora

25 se produce usando la secuencia señal natural, y se diferencia de rhIL-17A por la ausencia de dos aminoácidos del extremo N. Las concentraciones y valores de CI50 se expresan en ng/ml, pero también pueden expresarse en unidades de pM. Por ejemplo, 30 ng/ml de rhIL-17A se corresponden con 1000 pM (MW = 30 kDa) y 70 ng/ml de anticuerpo anti-IL-17A se corresponde con aproximadamente 470 pM (MW = 150 kDa).

TABLA 10 TABLA 11

CI50 (ng/ml) de anti-IL-17A medida por la producción de IL-6 de sinoviocitos

Anticuerpo: rhIL-17A (30 ng/ml) IL-17A de NHP (30 ng/ml) huIL-17A nativa (10 ng/ml)

1D10 de rata: 105 ± 28 65 ± 15 25

16C10 de rata: 63 ± 7 60 ± 10

hu16C10 (wt): 80 ± 10 -

hu16C10 (N54A): 60 -

hu16C10 (N54Q): 60 -

hu16C10 (M96A): 60 -

hu 16C10 (M96K): 60 -

hu16C10 (M100hF): 70 -

hu16C10 (N54Q/M96A): 70 ± 8 70 ± 0 25

hu16C10 (N54Q/M96A/M100hF): 70

CI50 (ng/ml) de anti-IL-17A medida por la producción de IL-8 de sinoviocitos

1D10: 59 ± 41 38 ± 13 40

16C10: 38 ± 14 33 ± 8

hu16C10 (wt): 42 ± 16 -

hu16C10 (N54A): 25 -

hu16C10 (N54Q): 25 -

hu16C10 (M96A): 25 -

hu16C10 (M96K): 25 -

hu16C10 (M100hF): 50 -

hu16C10 (N54Q/M96A): 38 ± 10 38 ± 13 50

hu16C10 (N54Q/M96A/M100hF): 40 -

Ejemplo 9

Ensayo de NHDF para anticuerpos anti-IL-17A

5 La capacidad de los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención para bloquear la actividad biológica de IL-17A se mide monitorizando la expresión inducida por rhIL-17A de IL-6 en una línea de células primarias de fibroblastos dérmicos (adultos) humanos normales (NHDF). Brevemente, diversas concentraciones de un anticuerpo anti-IL-17A que van a ensayarse se incuban con rhIL-17A, y entonces la mezcla resultante se añade a los cultivos de células NHDF. La producción de IL-6 se determina después como una medida de la capacidad del anticuerpo en cuestión

10 para inhibir la actividad de IL-17A. Sigue un protocolo más detallado.

Se prepara una serie de diluciones dobles de anticuerpos anti-IL-17A de interés (por duplicado) a partir de una disolución madre a 40 !g/ml. Una disolución madre de rhIL-17A se prepara a 120 ng/ml. Setenta !l de la disolución madre de rhIL-17A se mezclan con 70 !l de diluciones de anticuerpos anti-IL-17A en pocillos de una placa de microtitulación y se incuban a temperatura ambiente durante 20 minutos. Entonces, cien !l de cada una de estas

15 mezclas se añaden a los pocillos de una placa de microtitulación que se habría sembrado con 1 x 104 células de NHDF/pocillo (100 !l) la noche anterior y se dejó que se incubara a 37ºC. Las células NHDF (pase 4) se obtuvieron a partir de Cambrex Bio Science (Baltimore, Mariland, EE.UU.). La concentración final resultante de rhIL-17A es 30 ng/ml (1 nM), y los anticuerpos oscilan a la baja en intervalos dobles de 10 !g/ml. Las placas se incuban a 37ºC durante 24 horas, seguido de recogida del sobrenadante y eliminación de 50 !l para su uso en un ELISA de IL-6.

20 El ELISA para la detección de IL-6 humana se realiza del siguiente modo. Los reactivos son generalmente de R&D Systems (Mineápolis, Minnesota, EE.UU.). Un anticuerpo de captura hIL-6 (50 !l/pocillo a 4 !g/ml de disolución) se transfiere a pocillos de una placa de microtitulación, que se tapa y se incuba durante la noche a 4ºC. La placa se lava tres veces, y luego se bloquea con 100 !l/pocillo de tampón de bloqueo durante 1 hora o más. Entonces, la placa se lava de nuevo tres veces. Se añaden muestras experimentales (50 !l del sobrenadante de cultivo) y

25 controles (diluciones seriadas de proteína IL-6) a los pocillos en 50 !l y se incuban durante dos horas. Las placas se lavan tres veces, y se añaden 50 !l/pocillo de un anticuerpo de detección anti-IL-6 biotinilado (300 ng/ml). Las placas se incuban a temperatura ambiente durante dos horas, se lavan tres veces y se añaden 100 !l/pocillo de estreptavidina-HRP y se incuban durante 20 minutos. La placa se lava de nuevo, se añade ABTS (BioSource, Carlsbad, California, EE.UU.) (100 !l/pocillo) y se incuba durante 20 minutos. Se añade disolución de parada (100

30 !l/pocillo) y se mide la absorbancia a 405 nm.

La CI50 para un anticuerpo anti-IL-17A de interés es la concentración de anticuerpo requerida para reducir el nivel de producción de IL-6 inducida por rhIL-17A al 50% del nivel observado en ausencia de cualquier anticuerpo añadido anti-IL-17A.

Los resultados se proporcionan en la Tabla 12.

30 TABLA 12

Inhibición del anticuerpo anti-IL-17A de la producción de IL-6 en células NHDF

Anticuerpo: CI50 de rhIL-17A (nM) CI50 de IL-17A de cino (nM)

4C3 de rata: 0,5 0,2

16C10 de rata: 0,5 0,2

30C10 de rata: 0,5 0,2

6C3 de rata: 0,8 0,2

1D10 de rata: 1 0,4

8G9 de rata: 1 0,4

12B12 de rata: 1 0,4

18H6 de rata: 1 0,3

23E12: 1 0,3

29G3: 1,5 2

29H1: 1,5 0,5

12E6: >70 >70

Ejemplo 10

Ensayo de fibroblastos de prepucio para anticuerpos anti-IL-17A

La capacidad de los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención para bloquear la actividad biológica de IL-17A se mide monitorizando la expresión inducida por rhIL-17A de IL-6 en la línea celular de fibroblastos de prepucio HS68. La producción reducida de IL-6 en respuesta a rhIL-17A se usa como una medida de la actividad de bloqueo por anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención.

El análisis de la expresión de IL-17RC (un receptor de IL-17A) en un panel de líneas celulares de fibroblastos identificó la línea celular de fibroblastos de prepucio humano HS68 (ATCC CRL1635) como una posible línea celular sensible a IL-17A. Esto se confirmó por tinción por inmunofluorescencia indirecta con anticuerpo policlonal de cabra anti-IL-17R humana (R&D Systems, Gaithersburg, Mariland, EE.UU.) seguido de ficoeritrina (PE)-F(ab')2 de burro dirigido contra IgG de cabra (Jackson ImmunoResearch, Inc., West Grove, Pensilvania, EE.UU.), y analizando la señal de inmunofluorescencia de PE en un citómetro de flujo (FACScan, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.). Como validación adicional del modelo, la IL-17A (tanto rhIL-17A derivada de adenovirus como IL17A derivada de E. coli comercialmente disponible, R&D Systems) indujo una inducción sensible a la dosis de IL-6 en las células HS68 con un CE50 de 5-10 ng/ml, inducción que se bloqueó por la pre-incubación con anticuerpos anti-IL-17A policlonales y monoclonales comerciales (R&D Systems).

El ensayo de inhibición de IL-17A se realiza del siguiente modo. Un matraz T-75 confluente de células HS68 (aproximadamente 2 x 106 células) se lava con PBS de Dulbecco sin Ca++ ni Mg++ y luego se incuba con 5 ml de medio de disociación de células (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE.UU.) durante 2-5 minutos a 37ºC en una estufa de incubación al 5% de CO2. Entonces, las células se recogen con 5 ml de medio de cultivo de tejido (CT) y se centrifugan durante 5 minutos a 1000 rpm. El medio CT es medio Eagle modificado por Dulbecco (con glutamina), 10% de suero bovino fetal inactivado con calor (Hyclone), Hepes 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, penicilina y estreptomicina. Las células se resuspenden en 2 ml de medio CT, se diluyen 1:1 con azul de tripano y se cuentan. Las concentraciones de célula se ajustan a 1 x 105 células/ml en medio CT, y se echan alícuotas de 0,1 ml/pocillo en los pocillos de una placa de fondo plano que contienen 0,1 ml de medio CT. Las células se cultivan durante la noche y el sobrenadante se aspira y las células se lavan con 0,2 ml de medio CT fresco.

Los anticuerpos anti-IL-17A que van a ensayarse se diluyen en serie en etapas dobles o triples para dar una serie de disoluciones madre que pueden usarse para crear concentraciones de anticuerpo finales de 1 a 0,001 !g/ml en el ensayo de inhibición de IL-17A. Un control de IgG de rata se usa en cada ensayo, además de muestra de sólo medio, como controles para medir la producción espontánea de IL-6 en células HS68. El medio CT se aspira de los pocillos de la placa que contiene las células HS68. Las alícuotas de las diversas concentraciones de anticuerpo antiIL-17A (0,1 ml de cada uno) se preincuban en los pocillos con las células HS68 a 37ºC durante 5 minutos antes de la adición de 0,1 ml de 20 ng/ml de rhIL-17A para dar una concentración final de rhIL-17A de 10 ng/ml (aproximadamente 330 pM del dímero de IL-17A). Las células se incuban 24 horas a 37ºC, y los sobrenadantes (50 100 !l) se recogen y se ensayan para IL-6, por ejemplo, usando un kit de ELISA de IL-6 humana de Pharmingen (OptEIA - BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.).

Los resultados para varios anticuerpos de rata anti-IL-17A humana de la presente invención en el ensayo de inhibición de IL-17A de fibroblastos de prepucio se proporcionan en la Tabla 13.

TABLA 13

Ensayo de fibroblastos de prepucio

Anticuerpo anti-IL-17A: CI50 (pM)

16C10 de rata: 67

1D10 de rata: 65

8G9 de rata: 29

29H1 de rata: 247

29G3 de rata: 63

23E12 de rata: 126

6C3 de rata: 192

4C2 de rata: 107

IgG1 de rata: sin unión

Ejemplo 11

10 Ensayo de proliferación de Ba/F3-hIL-17Rc-mGCSFR

La capacidad de los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención para bloquear la actividad biológica de IL-17A se mide monitorizando la proliferación inducida por rhIL-17A de una línea celular manipulada por ingeniería para proliferar en respuesta a estimulación por IL-17A. Específicamente, la línea celular Ba/F3 (pro-linfocitos B murinos dependientes de IL-3) se modificó para expresar una proteína de fusión que comprende el dominio extracelular de 15 un receptor de IL-17A humana (hIL-17RC) fusionado con el dominio transmembrana y la región citoplásmica del receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos de ratón (GCSFR). La línea celular resultante se denomina en este documento Ba/F3-hIL-17Rc-mGCSFR. La unión de la IL-17A homodimérica a los dominios de IL17RC extracelulares produce la dimerización del receptor de la proteína de fusión hIL-17Rc-mGCFR, que señaliza la proliferación de las células Ba/F3 por sus dominios citoplásmicos mGCSFR. Tales células proliferan en respuesta a

20 IL-17A, proporcionando un ensayo conveniente para inhibidores de IL-17A tales como anticuerpos anti-IL-17A.

La sensibilidad del ensayo de proliferación de Ba/F3-hIL-17Rc-mGCSFR para la estimulación de IL-17A hace posible realizar experimentos a concentraciones relativamente bajas de rhIL-17A (por ejemplo, 3 ng/ml, 100 pM) en comparación con otros ensayos, mientras que a la vez se mantiene una respuesta proliferativa robusta y fácilmente medible. Esto significa que se requieren menores concentraciones de anticuerpos anti-IL-17A para lograr un exceso

25 molar superior a rhIL-17A en el ensayo. Los experimentos realizados a menores concentraciones de anticuerpo hacen posible discriminar entre anticuerpos de alta afinidad que de otro modo podrían ser indistinguibles (es decir, pueden realizarse experimentos más próximos al intervalo lineal en la curva de unión a anticuerpo-IL-17A, en vez de en la meseta).

Los anticuerpos y IL-17A se filtraron a través de filtros de 0,22 !m después de dilución a concentraciones de

30 disolución madre de trabajo, pero antes de la adición a muestras experimentales. Se prepararon cuatro conjuntos de muestras, por duplicado, a lo largo de las filas de una placa de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pocillos. Como se usa en este ejemplo, el medio de crecimiento es RPMI 1640 w/Glutamax (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.), 2-mercaptoetanol 55 !M, 10% de suero bovino fetal alimentado con sustitutos lácteos (Irvine Scientific, Santa Ana, California, EE.UU.), 50 !g/ml de gentamicina, 2 !g/ml de puromicina y 10 ng/ml de medio mIL-3

35 BioAssay es el mismo que el medio de crecimiento pero sin puromicina y mIL-3. Todas las diluciones seriadas en este ejemplo se hicieron en medio BioAssay.

Se prepararon las siguientes muestras experimentales (75 !l): 1) una dilución seriada de medio de crecimiento (incluyendo 10 ng/ml de mIL-3); 2) una dilución seriada de rhIL-17A; 3) una dilución seriada de anticuerpos anti-IL17A de la presente invención mezclada con 3 ng/ml de IL-17A (concentración final después de añadirse las células), que incluye un control de “no anticuerpo”; y 4) un control de “sólo células” sin anticuerpos añadidos, IL-17A o mIL-3. Entonces, las células Ba/F3-hIL-17Rc-mGCSFR (7500 células/pocillo) se añadieron para llevar el volumen total a 100 !l/pocillo, y las placas se incubaron a 37ºC / 5% de CO2 durante aproximadamente 40 horas. Se añadió el colorante indicador AlamarBlue® (11 !l/pocillo) y las placas se incubaron a 37ºC / 5% de CO2 durante 6-8 horas. Entonces, las placas se leyeron para la diferencia en absorbancia a 570 nm y 600 nm. Los valores de CI50 se determinaron usando ajuste no lineal / respuesta a dosis sigmoide / pendiente variable.

Los resultados del ensayo de proliferación de Ba/F3-hIL-17Rc-mGCSFR se proporcionan en la Tabla 14.

TABLA 14

Ensayo de proliferación de Ba/F3-hIL-17Rc-mGCSFR

mAb: IL-17A [rhIL-17A] (pM) CI50 (pM)

16C10 de rata: humana 100 20 ± 8

16C10 de rata: humana 276 162

16C10 de rata: cino 100 27

16C10 quimérico: humana 100 29

hu 16C10: humana 100 15 ± 2

hu 16C10 VH N54Q/M96A: humana 100 13

hu 16C10: humana 100 27

hu 16C10: humana 276 149

hu 16C10: cino 100 17

hu 16C10 N54Q/M96A/M100hF: humana 100 11

1D10 de rata: humana 276 223

1D10 de rata: cino 100 19

29H1 de rata: humana 28 �30

4H12 de rata: humana 28 �400

29G3 de rata: humana 28 �400

Ejemplo 12

Bloqueo cruzado de anticuerpos anti-IL-17A

Los diferentes anticuerpos anti-IL-17A de la invención pueden unirse al mismo epítope, epítopes que solapan, o epítopes que no solapan, que incluyen epítopes que son suficientemente distintos de forma que dos o más

15 anticuerpos puedan unirse a un monómero de IL-17A simultáneamente. Los anticuerpos que se unen a partes de IL17A críticas para la unión a receptor bloquearán la actividad biológica de IL-17A mediada por receptor. Tales anticuerpos se denominan en este documento “anticuerpos neutralizantes”. Los anticuerpos que se unen, pero que no bloquean la unión al receptor, se denominan en lo sucesivo anticuerpos no neutralizantes.

Cuando se realizan experimentos en IL-17A y anticuerpos anti-IL-17A es útil poder determinar el nivel de IL-17A (o

20 anti-IL-17A) en una muestra tal como por un ELISA de tipo sándwich. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 6. En una forma, un ELISA de IL-17A implica el recubrimiento de los pocillos de una placa de microtitulación con un anticuerpo de captura, adición de una muestra experimental que posiblemente contiene IL-17A y unión de un anticuerpo de detección. El anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección deben poder unirse a IL-17A al mismo tiempo.

Puede usarse un ensayo similar para determinar el nivel de un anticuerpo anti-IL-17A, en el que una disolución de

25 IL-17A patrón está unida a los pocillos recubiertos con el anticuerpo de captura, seguido de adición de una muestra experimental que posiblemente contiene un anticuerpo anti-IL-17A, y unión de un anticuerpo de detección secundario (por ejemplo, un anticuerpo anti-IgG humana en el caso de anticuerpos humanizados de IgG de la presente invención). Como en el ELISA de tipo sándwich de IL-17A, el anticuerpo de captura no puede interferir con la unión del anticuerpo que va a ensayarse.

Pares preferidos de anticuerpos para su uso en los experimentos de ELISA explicados resumidamente en este ejemplo pueden determinarse realizando experimentos de bloqueo cruzado. En experimentos de bloqueo cruzado, un primer anticuerpo está recubierto sobre los pocillos de una placa de microtitulación. Entonces, un segundo anticuerpo biotinilado se mezcla con IL-17A y se deja que se una, después de lo cual la mezcla se añade al pocillo recubierto y se incuba. El segundo anticuerpo biotinilado puede añadirse a diversas concentraciones (es decir, valorarse) para garantizar que en al menos algunas muestras el anticuerpo está presente a un exceso molar de dos veces (o superior) con respecto a IL-17A homodimérica. Entonces, la placa se lava y la presencia o ausencia del segundo anticuerpo biotinilado unido en el pocillo se determina mediante procedimientos convencionales.

Si los dos anticuerpos se bloquean de forma cruzada habrá una reducción de señal (unión a IL-17A) para la placa en presencia del segundo anticuerpo anti-IL-17A en comparación con muestras de control que no contienen segundo anticuerpo anti-IL-17A (o que contienen un control de isotipo). Los pares de anticuerpos que no se bloquean de forma cruzada pueden usarse juntos en ensayos tales como ELISA de tipo sándwich. Aunque la naturaleza dimérica de IL-17A hace que sea posible usar pares de anticuerpos de bloqueo cruzado en ELISA en ciertas formas (por ejemplo, si IL-17A está unida al anticuerpo de captura en la placa antes de la adición del anticuerpo de detección), generalmente se prefieren pares de bloqueo no cruzado de los anticuerpos.

Se probaron varios anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención (clones 4C3, 6C3, 8G9, 12E6, 16C10, 18H6, 23E12, 29H1, 30C10, 1D10, 21B12, 29G3) por pares para el bloqueo cruzado. Todos los pares se bloquearon de forma cruzada con la excepción de 29G3 / 1D10 y 29G3 / 21B12, pares de anticuerpos que por tanto podrían usarse en ELISA. Además de identificar pares de anticuerpos anti-IL-17A que pueden usarse en un ELISA, estos resultados muestran que el epítope unido por el anticuerpo 29G3 es funcionalmente o físicamente distinto del epítope o epítopes unidos por los anticuerpos 1D10 y 21B12. Estos datos también demostraron que los epítopes para 1D10 y 21B12 se solapan con, pero no son idénticos a, el epítope para 16C10.

Tales pares de anticuerpos anti-IL-17A que se unen a epítopes funcionalmente distintos son útiles, por ejemplo, en la validación de inmunohistoquímica (IHC) de anti-IL-17A. Por ejemplo, si una muestra de tejido presenta el mismo patrón de expresión de IL-17A en la IHC realizada con dos anticuerpos anti-IL-17A diferentes que se unen a epítopes funcionalmente distintos, entonces es incluso más probable que el ensayo esté detectando IL-17A en vez de alguna otra proteína de reacción cruzada falsa en la muestra de tejido.

Tales pares de anticuerpos de bloqueo no cruzado también son útiles en el diseño de ELISA para la detección de IL17A en presencia de anticuerpos anti-IL-17A terapéuticos, por ejemplo, en muestras de pacientes que están recibiendo terapia de anticuerpos anti-IL-17A, en la que la presencia de un exceso del anticuerpo anti-IL-17A terapéutico bloquearía la detección por ELISA de anti-IL-17A, a menos que los anticuerpos de ELISA estuvieran bloqueándose de forma no cruzada con el anticuerpo terapéutico.

Ejemplo 13

Terapia génica con anticuerpos anti-IL-17A

Los anticuerpos anti-IL-17A de la invención también pueden administrarse a un sujeto por terapia génica. En un enfoque de terapia génica, las células de un sujeto se transforman con ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención. Los sujetos que comprenden los ácidos nucleicos producirán entonces las moléculas de anticuerpo (intracuerpos) endógenamente. Por ejemplo, Alvarez y col. introdujeron anticuerpos anti-ErbB2 monocatenarios a sujetos usando un enfoque de terapia génica. Alvarez y col. (2000) Clinical Cancer Research 6:3081-3087. Los procedimientos desvelados por Alvarez y col. pueden adaptarse fácilmente para la introducción de ácidos nucleicos que codifican una molécula de anticuerpo anti-IL-17A de la presente invención a un sujeto. En una realización, la molécula de anticuerpo introducida por terapia génica es un anticuerpo monocatenario completamente humano.

El enfoque de terapia génica descrito en este documento tiene la posible ventaja de que el tratamiento sólo necesita llevarse a cabo una vez, o como máximo un número limitado de veces, siempre que se logre la expresión génica a largo plazo. Esto contrasta con la administración de anticuerpos, que debe repetirse periódicamente para mantener niveles terapéuticos apropiados en el sujeto.

Los ácidos nucleicos pueden introducirse a las células de un sujeto mediante cualquier medio conocido en la técnica. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se introducen como parte de un vector vírico. Ejemplos de virus de los que pueden derivarse los vectores incluyen lentivirus, virus del herpes, adenovirus, virus adenoasociados (AAV), virus de la variolovacuna, baculovirus, alfavirus, virus de la gripe y otros virus recombinantes con tropismo celular deseable. Diversas empresas producen vectores víricos comercialmente, por ejemplo, Avigen, Inc. (Alameda, CA; vectores de AAV); Cell Genesys (Foster City, CA; vectores retrovíricos, adenovíricos, de AAV y vectores lentivíricos); Clontech (vectores retrovíricos y baculovíricos); Genovo, Inc. (Sharon Hill, PA; vectores adenovíricos y de AAV); Genvec (vectores adenovíricos); IntroGene (Leiden, Los Países Bajos; vectores adenovíricos); Molecular Medicine (vectores retrovíricos, adenovíricos, de AAV y víricos del herpes); Norgen (vectores adenovíricos); Oxford BioMedica (Oxford, Reino Unido; vectores lentivíricos); y Transgene (Estrasburgo, Francia; vectores adenovíricos, de la variolovacuna, retrovíricos y lentivíricos).

En la técnica se conocen procedimientos de construcción y de uso de vectores víricos (véase, por ejemplo, Miller y col. (1992) BioTechniques 7:980-990). Preferentemente, los vectores víricos son defectuosos en la replicación (no pueden replicarse autónomamente) y, por tanto, no son infecciosos en la célula diana. Preferentemente, el virus defectuoso en la replicación es un virus mínimo que sólo retiene las secuencias de su genoma que son necesarias para encapsidar el genoma para producir partículas víricas. Los virus defectuosos que carecen completamente o casi completamente de genes víricos son los más preferidos. El uso de vectores víricos defectuosos permite la administración a células en un área específica localizada sin preocupación de que el vector pueda infectar otras células, permitiendo la elección de diana específica de tejido. Véase, por ejemplo, Kanno y col. (1999) Cancer Gen. Ther. 6:147-154; Kaplitt y col. (1997) J. Neurosci. Meth. 71:125-132; y Kaplitt y col. (1994) J. Neuro-Onc. 19:137-142.

Los adenovirus son virus de ADN de eucariotas que pueden modificarse para liberar eficientemente un ácido nucleico de la invención a una variedad de tipos de células. Los vectores de adenovirus atenuados, tales como el vector descrito por Stratford-Perricaudet y col. (1992) (J. Clin. Invest. 90:626-630), son deseables en algunos casos. Se han descrito diversos adenovirus defectuosos en la replicación y vectores de adenovirus mínimos (publicaciones PCT nº WO94/26914, WO94/28938, WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697 y WO96/22378). Los adenovirus recombinantes defectuosos en la replicación de la presente invención pueden prepararse por cualquier técnica conocida para un experto en la materia (véase Levrero y col. (1991) Gene 101:195; EP 185573; Graham (1984) EMBO J. 3:2917; Graham y col. (1977) J. Gen. Virol. 36:59).

Los virus adeno-asociados (AAV) son virus de ADN de tamaño relativamente pequeño que pueden integrarse de un modo estable y específico de sitio en el genoma de las células que infectan. Pueden infectar un amplio espectro de células sin inducir ningún efecto sobre el crecimiento, morfología o diferenciación celular, y no parece que participen en patologías humanas. Se ha descrito el uso de vectores derivados de AAV para transferir genes in vitro e in vivo (véase Donsante y col. (2001) Gene Ther. 8:1343-1346; Larson y col. (2001) Adv. Exp. Med. Rio. 489:45-57; publicaciones PCT nº WO91/18088 y WO93/09239; patentes de EE.UU. nº 4.797.368 y 5.139.941; y el documento EP 488528B1).

En otra realización, el gen puede introducirse en un vector retrovírico, por ejemplo, como se describe en las patentes de EE.UU. nº 5.399.346, 4.650.764, 4.980.289 y 5.124.263; Mann y col. (1983) Cell 33:153; Markowitz y col. (1988)

J. Virol. 62:1120; documentos EP 453242 y EP 178220. Los retrovirus son virus integrantes que infectan células divisorias.

Los vectores lentivíricos pueden usarse como agentes para la liberación directa y la expresión sostenida de ácidos nucleicos que codifican una molécula de anticuerpo de la invención en varios tipos de tejido que incluyen cerebro, retina, músculo, hígado y sangre. Los vectores pueden transducir eficientemente células divisorias y no divisorias en estos tejidos, y mantener la expresión a largo plazo de la molécula de anticuerpo. Para una revisión véase Zufferey y col. (1998) J. Virol. 72:9873-80 y Kafri y col. (2001) Curr. Opin. Mol. Ther. 3:316-326. Están disponibles líneas celulares de encapsidación lentivírica y generalmente son conocidas en la materia, facilitando la producción de vectores de lentivirus de alto título para terapia génica. Un ejemplo es una línea celular de encapsidación de lentivirus pseudotipada VSV-G inducible con tetraciclina que puede generar partículas de virus a títulos superiores a 106 UI/ml durante al menos 3 a 4 días; véase Kafri y col. (1999) J. Virol. 73: 576-584. El vector producido por la línea celular inducible puede concentrarse según se necesite para transducir eficientemente células no divisorias in vitro e in vivo.

El virus Sindbis es un miembro del género de los alfa-virus que se ha estudiado ampliamente desde su descubrimiento en diversas partes del mundo en 1953. La transducción de genes basada en alfavirus, particularmente el virus Sindbis, se ha estudiado bien in vitro (véase Straus y col. (1994) Microbiol. Rev. 58:491-562; Bredenbeek y col. (1993) J. Virol. 67; 6439-6446; Iijima y col. (1999) Int. J. Cancer 80:110-118; y Sawai y col. (1998) Biochim. Biophys. Res. Comm. 248:315-323). Muchas propiedades de los vectores de alfavirus hacen que sean una alternativa deseable a otros sistemas de vectores derivados de virus que se han desarrollado, incluyendo la rápida manipulación por ingeniería de construcciones de expresión, producción de disoluciones madre de alto título de partículas infecciosas, infección de células no divisorias y altos niveles de expresión (Strauss y col. (1994) Microbiol. Rev. 58:491-562). Se ha descrito el uso del virus Sindbis para terapia génica (Wahlfors y col. (2000) Gene. Ther. 7:472-480 y Lundstrom (1999) J. Recep. Sig. Transduct. Res. 19(1-4):673-686).

En otra realización, un vector puede introducirse en células por lipofección o con otros agentes que faciliten la transfección (péptidos, polímeros, etc.). Los lípidos catiónicos sintéticos pueden usarse para preparar liposomas para transfección in vivo e in vitro de un gen que codifica un marcador (Felgner y col. (1987) Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 84:7413-7417 y Wang y col. (1987) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 84:7851-7855). Compuestos y composiciones de lípidos útiles para la transferencia de ácidos nucleicos se describen en las publicaciones PCT nº WO 95/18863 y WO96/17823, y en la patente de EE.UU. nº 5.459.127.

También es posible introducir el vector in vivo como un plásmido de ADN desnudo. Los vectores de ADN desnudo para terapia génica pueden introducirse en las células huésped deseadas mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, electroporación, microinyección, fusión de células, DEAE-dextrano, precipitación con fosfato de calcio, uso de una pistola de genes, o uso de un transportador de vectores de ADN (véase, por ejemplo, Wilson y col. (1992) J. Biol. Chem. 267:963-967; Williams y col. (1991) Proc. Na.t'l. Acad Sci. USA 88:2726-2730). También pueden usarse enfoques de administración de ADN mediado por receptor (Wu y col. (1988) J. Biol. Chem. 263:14621-14624). Las patentes de EE.UU. nº 5.580.859 y 5.589.466 desvelan la administración de secuencias de ADN exógeno, libre de agentes que facilitan la transfección, en un mamífero. También se ha descrito una técnica de transferencia de ADN in vivo de alta eficiencia a voltaje relativamente bajo llamada electrotransferencia, (Vilquin y col. (2001) Gene Ther. 8:1097; Payen y col. (2001) Exp. Hematol. 29:295-300; Mir (2001) Bioelectrochemistry 53:110; publicaciones PCT nº WO99/01157, WO99/01158 y WO99/01175).

Los procedimientos de terapia génica explicados resumidamente en este documento pueden llevarse a cabo in vivo,

o pueden realizarse ex vivo, en el que se obtienen células de un sujeto, se transforman con un procedimiento de terapia génica in vitro y posteriormente se reintroducen en el sujeto. Véase, por ejemplo, Worgall (2005) Pediatr. Nephrol. 20(2):118-24.

Ejemplo 14

Mutagénesis por inserción de un casete de CDR de anticuerpos parentales

La optimización de las secuencias de CDR de anticuerpos anti-IL-17A humana de la presente invención (por ejemplo, 16C10) se realiza usando mutagénesis de barrido con pistola. La mutagénesis de barrido con alanina se usa para determinar qué residuos dentro de las CDR son los más críticos para la unión a IL-17A (véase el Ejemplo 19). El codón para uno o más residuos dentro de una o más CDR se reemplaza con un codón de alanina, o un codón de alanina se reemplaza con un codón de glicina, y el anticuerpo resultante se prueba para una actividad relevante (por ejemplo, afinidad de unión a IL-17A, CI50 para el bloqueo de receptores en un ensayo de competición, bioensayo, como se proporciona en diversos otros ejemplos en este documento). La sustitución de codones puede realizarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica que incluye, pero no se limita a, mutagénesis dirigida a sitio (por ejemplo, Kunkel, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA (1985) 82:488) y mutagénesis por PCR. Los residuos cruciales para la unión a IL-17A también pueden determinarse por inspección de la estructura de un complejo de IL-17A-anticuerpo, por ejemplo, una estructura cristalina por rayos X. Los residuos de las CDR del anticuerpo dentro de la distancia de contacto de IL-17A, o que se entierran sustancialmente en la formación del complejo de IL-17A-anticuerpo, son candidatos para la optimización adicional.

Entonces, aquellos residuos con la mayor sensibilidad a mutación se estudian más, por ejemplo, por mutagénesis de barrido con homólogos. En esta realización, las sustituciones de aminoácidos conservativas con aminoácidos homólogos se realizan en los residuos diana para buscar anticuerpos con más cualidades. También son posibles mutaciones no conservativas, aunque con el riesgo de perturbar totalmente la unión a IL-17A.

Alternativamente, las secuencias de anticuerpos mejoradas pueden generarse usando maduración por afinidad, en la que residuos seleccionados en una CDR se mutan para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en esa posición. En otra realización, menos de los 20 aminoácidos naturales posibles se usan como sustituciones para reducir el número de posibles secuencias a niveles más manejables, mientras que todavía se proporciona diversidad química en cada posición usando un número limitado de aminoácidos seleccionados para ser óptimamente diversos (por ejemplo, aminoácidos hidrófobos representativos, sin carga polares, básicos y ácidos), como en el documento WO2005/044853. Tal maduración por afinidad puede realizarse por sustitución con cualquier número de aminoácidos en una posición de interés que incluye 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o incluso más si no están incluidos aminoácidos convencionales o modificados.

Ejemplo 15

Reactividad cruzada con tejido humano

La propensión del anticuerpo anti-IL-17A humana humanizado hu16C10 para la reactividad de forma cruzada con tejidos no diana en sujetos humanos se evaluó del siguiente modo. hu16C10 se preincubó con un anticuerpo secundario biotinilado para formar un pre-complejo antes de la exposición a muestras de tejido. Entonces, los complejos de anticuerpo (con 20 !g/ml de anticuerpo) se mezclaron con un tejido u otra muestra y se incubaron para permitir la unión. Entonces, los anticuerpos secundarios unidos se detectaron usando detección con inmunoperoxidasa ABC (Vector Labs, Burlingame, California, EE.UU.). Tuson y col. (1990) J. Histochem Citochem,38(7):923-6. Como control negativo se incluyó una muestra con un anticuerpo IgGl humana sin relacionar.

La tinción inmunohistoquímica (IHC) se realizó con hu16C10 contra varios tejidos diana de control positivo que incluían manchas de proteína rhIL-17A en portaobjetos de resina UV (Adhesive Coated Slides, Instrumedics, Inc., St. Louis, Missouri, EE.UU.), células de hígado de ratón infectadas con una IL-17A que codifica adenovirus y tejido de artritis reumatoide humana. La IHC reveló unión (+++) en los tres controles positivos.

Entonces, la IHC se realizó contra un panel de tejidos humanos (32 en total) para evaluar la reactividad cruzada. Todas estas muestras de tejido humano se montaron sobre portaobjetos de resina UV. Las muestras se obtuvieron de tres donantes para cada tejido. Los tejidos humanos cribados fueron glándula suprarrenal, vejiga, cerebelo, corteza cerebral, colon, trompas de falopio, músculo cardíaco, riñón, hígado, pulmón, ganglio linfático, glándula mamaria, ovario, páncreas, glándula paratiroidea, glándula pituitaria, placenta, próstata, retina, músculo esquelético, piel, intestino delgado, médula espinal, bazo, estómago, testículos, timo, glándula tiroidea, uretra, útero y cuello del útero (útero). La IHC fue negativa en los 32 tejidos.

Esta falta de reactividad cruzada tiene varios posibles beneficios en los usos terapéuticos de los anticuerpos anti-IL17A de la presente invención, tal como la reducción de la pérdida de anticuerpo debido a unión no específica a otros tejidos (con la reducción consecuente en el efecto terapéutico), y reducción de la probabilidad de los efectos adversos asociados a unión a tejidos no deseados.

Ejemplo 16

Tratamiento de artritis inducida por colágeno usando anticuerpos anti-IL-17A

La artritis inducida por colágeno (AIC) es un modelo de ratón ampliamente aceptado para artritis reumatoide en seres humanos. El anticuerpo anti-IL-17A 1D10 de la presente invención (el anticuerpo de rata parental, en vez de una forma humanizada del mismo) se administra a ratones que expresan AIC para evaluar la capacidad de terapia anti-IL-17A para tratar artritis reumatoide.

El procedimiento fue del siguiente modo. En el día 0, ratones B 10.RIII macho se inmunizaron intradérmicamente en la base de la cola con colágeno de tipo II bovino emulsionado en adyuvante completo de Freund. En el día 21, los ratones se expusieron intradérmicamente a colágeno de tipo II bovino emulsionado en adyuvante incompleto de Freund administrado en la base de la cola. Cuando se produjeron los primeros signos de artritis grave en el grupo inmunizado (después del día 21), todos los ratones inmunizados restantes se aleatorizaron a los diversos grupos de tratamiento. Los animales se trataron con tanto 800 !g, 200 !g como 50 !g del anticuerpo anti-IL-17A 1D10; 200 !g de anticuerpo de control de isotipo; o diluyente. Los tratamientos se administraron subcutáneamente en el primer día de aparición de la enfermedad en los ratones inmunizados, y luego semanalmente cuatro veces más. Los ratones se sacrificaron en el día 35 y las patas se fijaron en 10% de formalina tamponada neutra para el procesamiento y el seccionamiento de tejido. Las patas fueron analizadas por un anatomopatólogo para los siguientes parámetros de histopatología: sinovio reactivo, inflamación, formación de paño sinovial, destrucción de cartílago, erosión ósea y formación ósea. Cada parámetro se clasificó usando la siguiente escala de enfermedad: 0 = sin enfermedad; 1 = mínima, 2 = leve, 3 = moderada, 4 = grave. Además, las patas se evaluaron usando la puntuación de la gravedad de la enfermedad (DSS) visual, que mide la hinchazón y la rojez en una escala de 0 a 3, siendo 0 una pata normal, siendo 1 inflamación de un dedo en la pata, siendo 2 inflamación de dos dedos o la palma de esa pata y siendo 3 inflamación de la palma y dedo(s) de la pata. Las puntuaciones de 2 y 3 se denominan en este documento patas gravemente o altamente inflamadas.

Los resultados se presentan en las Figs. 3A - 3C. Cada punto de datos representa una pata, en vez de un promedio para las cuatro patas para un animal o un promedio con respecto a todos los animales. La reducción en el número de patas que muestran puntuaciones de alta patología fue estadísticamente significativa para tres medidas de patología (DSS visual - hinchazón de las patas y rojez, lesión de cartílago y erosión ósea) con mayores concentraciones de anti-IL-17A 1D10 probadas (28 y 7 mg/kg). Los resultados con la menor concentración (2 mg/kg) fueron estadísticamente significativos para erosión ósea y reducidos para DSS visual y lesión de cartílago. Se observaron beneficios similares en la reducción de la producción de enzimas degradativas de cartílago dentro de patas inflamadas (metaloproteasas de la matriz MMP-2, MMP-3, MMP-13).

Sin embargo, la evaluación visual de la inflamación de las patas puede subestimar el beneficio terapéutico del tratamiento anti-IL-17A de ratones con ACI, por ejemplo, la disminución de la erosión ósea. En otros experimentos, las patas altamente inflamadas (puntuaciones DSS de 2 ó 3) de ratones con AIC se analizaron para erosión ósea usando histopatología o tomografía microcomputarizada (micro-CT). Este estudio fue posible debido a que aún cuando los animales tratados con anti-IL-17A tenían porcentajes drásticamente reducidos de patas altamente inflamadas (véase, por ejemplo, la FIG. 3A), continuó habiendo varias patas altamente inflamadas, y fue posible comparar patas altamente inflamadas (DSS = 2 ó 3) de todos los grupos de tratamiento, incluyendo los controles de no anticuerpo. La FIG. 3D muestra una representación de erosión ósea para patas altamente inflamadas de animales tratados con diluyente, tratados con control de isotipo (rIgG1) y tratados con anticuerpo anti-IL-17A. La erosión ósea, como se mide por histopatología, fue significativamente reducida en patas de animales tratados con anti-IL-17A cuando se comparó con controles de no anticuerpo, a pesar de sus puntuaciones DSS similares. Los resultados sugieren que el ahorro de erosión ósea puede lograrse con tratamiento con anti-IL-17A incluso en patas en las que no hay mejora aparente en la inflamación como se mide por la puntuación DSS.

Se obtuvieron resultados similares cuando la micro-TC se usó para medir la densidad mineral ósea (DMO) para articulaciones en patas altamente inflamadas en ratones con AIC. La Tabla 15 proporciona la DMO para patas con puntuaciones de la gravedad de la enfermedad de 0 ó 3 de animales con AIC tratados con tanto un anticuerpo antiIL-17A de la presente invención (1D10) como un control de isotipo (25D2). Incluso para articulaciones con la misma gravedad de enfermedad visual, el anticuerpo 1D10 tratado sólo tuvo aproximadamente la mitad de la disminución en la densidad mineral ósea observada con animales tratados con control de isotipo.

TABLA 15

Densidad ósea para articulaciones en ratones con AIC

Tratamiento: DSS DMO (mg/cm3)

25D2: 3 95

25D2: 3 108

1D10: 3 288

1D10: 3 299

1D10: 0 502

1D10: 0 480

Al igual que la erosión ósea, la destrucción de cartílago y la formación de paño sinovial (proliferación del revestimiento sinovial que forma excesivos pliegues de tejido inflamado) también se redujeron en ratones con AIC

5 tratados con anti-hIL-17A (1D10). La histopatología mostró que el tratamiento con anticuerpos anti-IL-17A no sólo redujo el número de patas que muestran patología grave, sino que también redujo la patología en patas que aparecieron igualmente inflamadas basándose en la inspección visual (puntuaciones DSS de 2 y 3) cuando se compararon con controles tratados con diluyente o isotipo.

La observación de que el tratamiento con anticuerpos anti-IL-17A redujo significativamente la erosión ósea en el

10 modelo de AIC de inflamación de articulaciones sugiere que tal terapia puede ser útil en la prevención de uno de los efectos más debilitantes e irreversibles de la AR en seres humanos. Además, la observación de que la erosión ósea se reduce incluso en patas altamente inflamadas sugiere que la evaluación visual simple de inflamación de articulaciones no puede medir con exactitud la eficacia terapéutica en el laboratorio, o en última instancia en la clínica. La medición de la erosión ósea puede ser necesaria para rastrear los efectos de tratamientos terapéuticos.

15 Tales procedimientos incluyen, pero no se limitan a, detección por rayos X 2-D convencional, tomografía computarizada (TC), resonancia magnética nuclear (RMN), ultrasonidos (US) y escintigrafía. Véase, por ejemplo, Guermazi y col. (2004) Semin. Musculoskelet. Radiol. 8(4):269-285.

Ejemplo 17

Ensayo de reclutamiento de neutrófilos de BAL de anticuerpos anti-IL-17A

20 La capacidad de los anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención para bloquear la actividad de IL-17A in vivo se evaluó en un ensayo de reclutamiento de neutrófilos de lavado broncoalveolar (BAL). Brevemente, en el día -4, ratones BALB/cAnN hembra de cinco semanas de edad (Taconic Farms, Germantown, Nueva York, EE.UU.) se trataron con anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención, o un control de isotipo, por inyección subcutánea de 0, 10, 30, 40, 60 ó 100 !g de anticuerpo por ratón. En el día -1, los ratones se estimularon por administración nasal de

25 1 !g de rhIL-17A en 50 !l de PBS (o un control de sólo PBS) bajo ligera anestesia con isoflurano.

En el día 0, el nivel de neutrófilos presentes en el fluido BAL se determinó del siguiente modo. Los ratones se sacrificaron con CO2 y se recogieron muestras de sangre, a partir de las cuales se determinó la concentración de anticuerpo anti-IL-17A. Se insertó una aguja en la tráquea cervical superior mediante una traqueotomía y se recogió fluido BAL por introducción y eliminación de 0,3 ml de PBS tres veces. EL fluido BAL se centrifugó (400 x g durante 30 10 minutos a 4ºC) y el sedimento de células se resuspendió en PBS. Las cifras totales de células se determinaron en un hemocitómetro usando disolución de azul tripano. Las cifras de células diferenciales se realizaron en preparaciones de citocentrifugación por tinción con Wright-Giemsa (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE.UU.) según criterios morfológicos convencionales usando microscopía de inmersión en aceite (aumento original x 1000). Las cifras de células se llevaron a cabo en 200 ó 300 células (linfocitos, monocitos, neutrófilos, eosinófilos) para

35 determinar el neutrófilo de BAL en porcentaje.

Los resultados se proporcionan en la FIG. 4. Los datos se proporcionan para tres anticuerpos anti-IL-17A de la presente invención (1D10, 16C10 y 4C3), además de controles. El porcentaje de neutrófilos en fluido BAL como porcentaje de todos los leucocitos para animales experimentales individuales se representa en función de la concentración de anticuerpo en suero, representando el segmento izquierdo de la abscisa (“0” a “1”) controles, como

40 se indica en la leyenda. Los controles muestran que el estímulo de rhIL-17A induce reclutamiento significativo de neutrófilos que no se reduce por la administración de un anticuerpo de control de isotipo (dosificado a los mismos niveles que los anticuerpos anti-IL-17A). A diferencia, los datos de anti-IL-17A muestran una reducción dependiente de la dosis en el reclutamiento de neutrófilos inducido por rhIL-17A, con reclutamiento de neutrófilos esencialmente bloqueado a concentraciones de anticuerpo en suero superiores a 40-60 !g/ml.

Ejemplo 18

Tratamiento de artritis reumatoide (AR) usando anticuerpos anti-IL-17A

Los sujetos humanos diagnosticados con AR que tuvieron una respuesta inadecuada a uno o más FARME se seleccionan para el tratamiento con un anticuerpo anti-IL-17A humanizado de la presente invención. Los sujetos se mantienen en metotrexato (10 mg/semana), y opcionalmente se tratan con prednisona durante dos semanas. A los sujetos también se les dosifica mensualmente 50 ó 100 mg de anticuerpo anti-IL-17A, administrado subcutáneamente. Las dosis se ajustan para sujetos específicos según criterios clínicos convencionales y basándose en la respuesta clínica.

La respuesta al tratamiento se evalúa determinando la puntuación ACR, que se basa en criterios desarrollados por el Colegio americano de reumatología. La puntuación ACR es una puntuación compuesta que integra múltiples parámetros clínicos y puntuaciones radiográficas tales como reducción en el número de articulaciones hinchadas y doloridas, evaluación global del paciente, evaluación global del médico, escala de dolor, discapacidad autoevaluada y reactivos de fase aguda (velocidad de sedimentación de eritrocitos o proteína reactiva C). Véase Felson y col. (1995) Arthritis & Rheumatology 38; 727-735. Se considera que un sujeto ha mejorado si presenta una puntuación de ACR20 o superior en la semana 24 de tratamiento. Además, la proporción de sujetos que alcanzan diversas puntuaciones de ACR (por ejemplo ACR20, ACR50 y ACR70) puede usarse para comparar grupos de tratamiento y placebo en ensayos clínicos para evaluar la eficacia clínica del anticuerpo anti-IL-17A humanizado de la presente invención

Ejemplo 19

Determinación de epítopes

Los residuos de aminoácidos críticos para la unión de los anticuerpos de la presente invención, por ejemplo, 16C10 de rata, se determinaron del siguiente modo.

Un primer conjunto de experimentos se basó en la observación de que el anticuerpo de rata 16C10 podía unirse a IL-17A humana (hIL-17A), pero no podía unirse a IL-17A de ratón (mIL-17A) o IL-17F humana de citocina relacionada. Cada una de estas tres proteínas se ligó a una marca de péptido FLAG® del extremo N (véanse los residuos 1 a 9 de SEC ID Nº: 42). Con el fin de identificar residuos de aminoácidos críticos durante la unión a 16C10, diversas subsecuencias de péptidos de hIL-17A, mIL-17A y IL-17F marcadas con FLAG se combinaron mezclando fragmentos de restricción de los genes relevantes para formar polipéptidos híbridos. La unión de estos polipéptidos híbridos al anticuerpo 16C10 se determinó en un ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificada (AlphaScreen, Packard BloScience, Wellesley, Massachusetts, EE.UU.) para determinar qué segmentos de hIL-17A eran críticos para la unión. El anticuerpo biotinilado 16C10 se unió a perlas de donante de estreptavidina, y los polipéptidos híbridos se unieron a perlas de aceptor que tenían anticuerpos anti-FLAG® (Packard BioScience). Las perlas del donante y de aceptor se mezclaron, se iluminaron a 680 nm y emisión se midió a 520-620 nm. La unión se midió como fluorescencia potenciada en muestras que contenían polipéptidos híbridos que se unieron a anticuerpo 16C10 debido a que las perlas del aceptor se mantuvieron en estrecha proximidad con las perlas del donante y emitieron luz cuando el oxígeno singlete de la perla del donante de salida difundió a la perla del aceptor.

Los resultados mostraron que el anticuerpo 16C10 se une a polipéptidos híbridos que comprenden los residuos de aminoácidos 50-132, 63-132, 1-87, 1-112 y 63-87 de hIL-17A, demostrando que los residuos críticos para la unión a 16C10 están presentes en los residuos 63-87 de hIL-17A (PSVIVVEAKCR HLGCINADG NVDYHM). Toda la numeración de residuos en este ejemplo es con referencia a la secuencia de hIL-17A (SEC ID Nº: 40). Por ejemplo, los polipéptidos de mIL-17A y IL-17F sustituidos con los residuos 63-87 de hIL-17A pudieron unirse al anticuerpo 16C10, pero no los de mIL-17A y IL-17F intacta.

También se introdujeron mutaciones puntuales en hIL-17A para determinar qué residuos de aminoácidos eran críticos para la unión al anticuerpo 16C10. En un experimento se realizó la mutagénesis de cribado con alanina en la que un codón de alanina se introdujo en lugar del aminoácido nativo en varios residuos (45, 46, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 61, 62, 67, 68, 70, 72, 73, 78, 80, 82, 84, 85, 86, 88, 93, 94, 95, 100, 101, 102, 105, 108, 110, 111, 113, 114). Los plásmidos de expresión de mamífero con genes que codifican las formas mutantes de hIL-17A se transfectaron transitoriamente en células 293T de riñón embrionario humano (HEK). Los sobrenadantes se analizaron para la cuantificación de la marca de péptido FLAG® y para la unión de anticuerpo 16C10 por AlphaScreen, como se describe arriba. Ninguna de las sustituciones con alanina de un único aminoácido redujo significativamente la unión al anticuerpo 16C10. Se hicieron otras mutaciones puntuales en las que los residuos de IL-17F humana o IL-17A de ratón se sustituyeron en diversas posiciones dentro del fragmento 63-87, es decir, L74Q, G75R, V83E, Y85H. Aunque ninguna de estas mutaciones puntuales individuales inhibió la unión al anticuerpo 16C10, una hIL-17A que tiene cuatro cambios presentó una unión sustancialmente disminuida, confirmando que los residuos en el fragmento 63-87 de hIL-17A, y más específicamente los residuos en el fragmento 74-85 (LGCINADGNVDY), son importantes para la unión a 16C10.

TABLA 16 (continuación)

Identificadores de secuencia

SEC ID Nº:: Descripción

1: ADN de la cadena ligera de 16C10 humano con secuencia señal

2: Aminoácido de la cadena ligera de 16C10 humano con secuencia señal

3: ADN de la cadena pesada de 16C10 humano con secuencia señal

4: Aminoácido de la cadena pesada de 16C10 humano con secuencia señal

Dominio variable de la cadena ligera de 16C10/4C3 humano

6: Dominio variable de la cadena pesada de 16C10/4C3 humano

7: Dominio variable de la cadena ligera de 16C10 de rata

8: Dominio variable de la cadena pesada de 16C10/4C3 de rata

9: Cadena ligera de 16C10 quimérico

Cadena pesada de 16C10 quimérico

11: CDRL1 de 16C10/4C3 de rata/humano

12: CDRL2 de 16C10/4C3 de rata/humano

13: CDRL3 de 16C10/4C3 de rata/humano

14: CDRH1 de 16C10/4C3 de rata/humano

CDRH2 de 16C10/4C3 de rata

16: CDRH2 de 16C10/4C3 humano (N54Q)

17: CDRH2 de 16C10 de rata (N54N/Q/A)

18: CDRH3 de 16C10/4C3 de rata

19: CDRH3 de 16C10/4C3 humano (M96A)

CDRH3 de 16C10 de rata (M96M/A/K, M100hM/F)

21: Dominio variable de la cadena ligera de 4C3 de rata

22: Dominio variable de la cadena ligera de 30C10 humano

23: Dominio variable de la cadena pesada de 30C10 humano

24: Dominio variable de la cadena ligera de 30C10 de rata

Dominio variable de la cadena pesada de 30C10 de rata

26: CDRL1 de 30C10 de rata/humano

27: CDRL2 de 30C10 de rata/humano

28: CDRL3 de 30C10 de rata/humano

29: CDRH1 de 30C10 de rata/humano

CDRH2 de 30C10 de rata/humano

31: CDRH3 de 30C10 de rata/humano

32: Dominio variable de la cadena ligera de 12E6 de rata

Identificadores de secuencia

SEC ID Nº:: Descripción

33: Dominio variable de la cadena pesada de 12E6 de rata

34: CDRL1 de 12E6 de rata/humano

35: CDRL2 de 12E6 de rata/humano

36: CDRL3 de 12E6 de rata/humano

37: CDRH1 de 12E6 de rata/humano

38: CDRH2 de 12E6 de rata/humano

39: CDRH3 de 12E6 de rata/humano

40: huIL-17A (nativa)

41: rhIL-17A

42: FLAG-IL-17A

43: IL-17A R&D

44: ADN del dominio variable de la cadena ligera de 23E12 de rata con secuencia señal

45: Aminoácido del dominio variable de la cadena ligera de 23E12 de rata con secuencia señal

46: ADN del dominio variable de la cadena pesada de 23E12 de rata con secuencia señal

47: Aminoácido del dominio variable de la cadena pesada de 23E12 de rata con secuencia señal

48: CDRL1 de 23E12 de rata/humano

49: CDRL2 de 23E12 de rata/humano

50: CDRL3 de 23E12 de rata/humano

51: CDRH1 de 23E12 de rata/humano

52: CDRH2 de 23E12 de rata/humano

53: CDRH3 de 23E12 de rata/humano

54: Dominio variable de la cadena ligera de 1D10 de rata

55: Dominio variable de la cadena pesada de 1D10 de rata

56: CDRL1 de 1D10 de rata

57: CDRL2 de 1D10 de rata

58: CDRL3 de 1D10 de rata

59: CDRH1 de 1D10 de rata

60: CDRH2 de 1D10 de rata

61: CDRH3 de 1D10 de rata

62: ADN de la cadena ligera de 16C10 humano con secuencia señal

63: ADN de la cadena pesada de 16C10 humano con secuencia señal

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Presta, Leonard G.

Bowman, Edward P. 5

<120> ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA IL-17A

<130> BP06474

10 <150> US 60/837.197

<151>

<160> 63 15

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 720 20 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cadena ligera de anticuerpo 16C10 humanizado con secuencia señal 25

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(717)

30 <220>

<221> sig_peptide

<222> (1)..(57)

<220> 35 <221> mat_peptide

<222> (58)..(717)

<400> 1 <210> 2

<211> 239 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 2 <210> 3

<211> 1422 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cadena pesada de anticuerpo 16C10 humanizado con secuencia señal 10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1419)

<220> 5 <221> sig_peptide

<222> (1)..(57)

<220>

<221> mat_peptide 10 <222> (58)..(1419)

<400> 3

<210> 4

<211> 473 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 4

<210> 5

<211> 114 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Dominio variable de cadena ligera de 16C10 y 4C3 humanizado 10

<400> 5 <210> 6

<211> 124 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Dominio variable de cadena pesada de 16C10 y 4C3 humanizado 10

<400> 6

15 <210> 7

<211> 114

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

20 <400> 7

<210> 8

<211> 124

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 8

<210> 9

<211> 220 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Cadena ligera de 16C10 quimérico 10

<400> 9 <210> 10

<211> 454 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Cadena pesada de 16C10 quimérico 10

<400> 10

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 11

<210> 12

<211> 7

<212> PRT 15 <213> Rattus norvegicus

<400> 12

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus 25

<400> 13

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 14

<210> 15

<211> 16

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 15

<210> 16

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 de 16C10 humanizada (N54Q)

<400> 16

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 de 16C10 de rata (N54N/Q/A)

<220>

<221> VARIANTE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa puede ser Ala, Asn o Gln

<400> 17

<210> 18

<211> 16

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 18

<210> 19

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 de 16C10 humanizada (M96A)

<400> 19

<210> 20

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 de 16C10 de rata (M96M/L/A/K/F, M100hM/L/F)

<220>

<221> VARIANTE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa puede ser Met, Leu, Ala, Lys o Phe

<220>

<221> VARIANTE

<222> (14)..(14)

<223> Xaa puede ser Met, Leu o Phe

<400> 20

<210> 21

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Dominio variable de cadena ligera de 4C3 de rata

<400> 21

<210> 22

<211> 113 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Dominio variable de cadena ligera de 30C10 humanizado 10

<400> 22 <210> 23

<211> 117 5 <212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Dominio variable de cadena pesada de 30C10 humanizado 10

<400> 23

<210> 24

<211> 113

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 24

<210> 25

<211> 117

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus 15

<400> 25

<210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 26

<210> 27

<211> 7

<212> PRT 15 <213> Rattus norvegicus

<400> 27

20 <210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

25 <400> 28

<210> 29 30 <211> 10

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 29

<210> 30

<211> 17 10 <212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 30

<210> 31

<211> 8

<212> PRT 20 <213> Rattus norvegicus

<400> 31

<210> 32

<211> 108

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus 30

<400> 32

<210> 33

<211> 117

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 33

<210> 34

<211> 11

<212> PRT 15 <213> Rattus norvegicus

<400> 34

<210> 35

<211> 7

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 35

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 36

<210> 37

<211> 10

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 37

<210> 38

<211> 17

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> CDRH2 de 12E6 de rata/humanizada

<400> 38

<210> 39

<211> 8

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 39

<210> 40

<211> 132

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

5 <210> 41

<211> 134

<212> PRT

<213> Artificial

10 <220>

<223> IL-17A humana recombinante

<400> 41

<210> 42

<211> 141 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> IL-17A humana marcada con FLAG 10

<400> 42

<210> 43

<211> 137

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

<210> 44

<211> 384 5 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(384)

<220>

<221> sig_peptide

<222> (1)..(60) 15

<220>

<221> mat_peptide

<222> (61)..(384)

20 <400> 44

<210> 45

<211> 128

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 45

10 <210> 46

<211> 411

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus

15 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(411)

<220> 20 <221> sig_peptide

<222> (1) .. (57)

<220>

<221> mat_peptide 25 <222> (58)..(411)

<400> 46

<210> 47

<211> 137

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 47

<210> 48

<211> 11

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 48

<210> 49

<211> 7

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 49

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 50

<210> 51

<211> 10

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 51

<210> 52

<211> 16

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 52

<210> 53

<211> 10

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus 15

<400> 53

20 <210> 54

<211> 108

<212> PRT

<213> Rattus sp.

25 <400> 54

30 <210> 55

<211> 122

<212> PRT

<213> Rattus sp.

<400> 55

<210> 56

<211> 11

<212> PRT

<213> Rattus sp.

<400> 56

<210> 57

<211> 7

<212> PRT

<213> Rattus sp.

<400> 57

<210> 58

<211> 9

<212> PRT

<213> Rattus sp.

<400> 58 <210> 59

<211> 10

<212> PRT

<213> Rattus sp.

<400> 59

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> Rattus sp.

<400> 60

<210> 61

<211> 14

<212> PRT

<213> Rattus sp.

<400> 61

<210> 62

<211> 720

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera de anticuerpo 16C10 humanizado con secuencia señal

<400> 62

<210> 63

<211> 1422 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada de anticuerpo 16C10 humanizado con secuencia señal 10

<400> 63

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un compuesto de unión que se une a IL-17A humana que comprende al menos un región variable de la cadena ligera de anticuerpo, o fragmento de unión de la misma, que tiene las secuencias de CDR CDRL1 a CDRL3 de SEC ID Nº: 11-13; y al menos una región variable de la cadena pesada de anticuerpo, o fragmento de unión de la misma, que tiene las secuencias de CDR CDRH1 a CDRH3 de SEC ID Nº: 14, 17 y 20 o SEC ID Nº: 14, 16 y 19.
2.

El compuesto de unión de la reivindicación 1, en el que la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de SEC ID Nº: 5 que tiene hasta diez sustituciones conservativas y en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de SEC ID Nº: 6 que tiene hasta diez sustituciones de aminoácidos conservativas.
3.

El compuesto de unión de la reivindicación 2, en el que el compuesto de unión es un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena ligera que comprende SEC ID Nº: 5; y una región variable de la cadena pesada que comprende SEC ID Nº: 6.
4.

El compuesto de unión de la reivindicación 1, en el que la cadena ligera consiste en los aminoácidos 1-220 de SEC ID Nº: 2 que tiene hasta diez sustituciones conservativas y la cadena pesada consiste en los aminoácidos 1454 de SEC ID Nº: 4 que tiene hasta diez sustituciones conservativas.
5.

El compuesto de unión de la reivindicación 4, en el que la cadena ligera consiste en los aminoácidos 1-220 de SEC ID Nº: 2 y la cadena pesada consiste en los aminoácidos 1-454 de SEC ID Nº: 4.
6.

El compuesto de unión de la reivindicación 1, en el que el compuesto de unión comprende una región variable de la cadena ligera que tiene al menos el 90% de homología con SEC ID Nº: 5 y una región variable de la cadena pesada que tiene al menos el 90% de homología con SEC ID Nº: 6.
7.

El compuesto de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el compuesto de unión es un anticuerpo monoclonal humanizado o completamente humano.
8.

El compuesto de unión de la reivindicación 1, que comprende además una región constante de la cadena pesada, en el que la región constante de la cadena pesada comprende una región constante humana de la cadena pesada y1, y2, y3 o y4 o una variante de la misma.
9.

El compuesto de unión de la reivindicación 1, que comprende además una región constante de la cadena ligera, en el que la región constante de la cadena ligera comprende una región constante de la cadena ligera humana kappa.
10.

El compuesto de unión de la reivindicación 1 ó 2, en el que el compuesto de unión es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2 y un diacuerpo.
11.

El compuesto de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el compuesto de unión inhibe actividad de IL-17A humana.
12.

Un ácido nucleico aislado que codifica el compuesto de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13.

Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 12 operativamente ligado para controlar secuencias que son reconocidas por una célula huésped cuando la célula huésped se transfecta con el vector.
14.

El vector de expresión de la reivindicación 13, en el que el vector de expresión tiene el nº de acceso de ATCC PTA-7675.
15.

Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 14.
16.

Un procedimiento de producción de un polipéptido que comprende:

(a)

cultivar la célula huésped de la reivindicación 15 en medio de cultivo en condiciones en las que la secuencia de ácidos nucleicos se expresa, produciéndose así polipéptidos que comprenden las regiones variables de la cadena ligera y pesada; y

(b)

recuperar los polipéptidos de la célula huésped o medio de cultivo.
17.

El anticuerpo anti-IL-17A humana hu16C10, en el que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo está codificada por el vector de expresión de la reivindicación 14.
18.

Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que neutraliza la actividad de IL-17A humana y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
19.

Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de unión de una cualquiera de las reivindicaciones

1 a 11 que neutraliza la actividad de IL-17A humana para su uso en el tratamiento de artritis reumatoide.
20.

Uso de un compuesto de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que neutraliza la actividad de IL17A humana para la preparación de una composición farmacéutica para tratar artritis reumatoide.
21.

La composición farmacéutica de la reivindicación 18 ó 19, o el uso de la reivindicación 20, en la que el compuesto de unión es un anticuerpo monoclonal.
22.

La composición farmacéutica de la reivindicación 18 ó 19, o el uso de la reivindicación 20, que comprende además otro agente inmunosupresor o antiinflamatorio.