ES2846623T3 - Anticuerpos biespecíficos y métodos de uso de los mismos - Google Patents

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Josephine M Cardarelli
Thomas D Kempe
Scott R Presnell
Mohan Srinivasan
Susan C Wong
Guodong Chen
Hui Wei
Stanley R Krystek
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Paul O Sheppard
Indrani Chakraborty
Mian Gao
Steven Sheriff
Noah Ditto
Nels B Hamacher
Thomas Edwards
Kateri Atkins
Tracy Arakaki
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Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado que se fija específicamente a IL-17A (SEQ ID NO: 2) e IL-17F (SEQ ID NO: 4) que comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, en donde el dominio variable de cadena pesada comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, y en donde el dominio variable de cadena ligera comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos biespecíficos y métodos de uso de los mismos
La divulgación técnica detallada que se expone a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá de la divulgación de la invención en sí misma, y también puede proporcionar antecedentes técnicos para desarrollos técnicos relacionados. Se apreciará que los antecedentes técnicos adicionales proporcionados no están destinados a definir la invención como tal (que está definida exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas), sino más bien a colocarla en un contexto técnico más amplio. Por consiguiente, se apreciará que las expresiones "realizaciones", "aspectos", "materia objeto" reflejan detalles específicos de la divulgación, pero en la medida en que se refieren a una parte de los antecedentes técnicos adicionales, no pretenden definir como parte de la invención materia objeto que no entra dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas
Las citocinas son pequeñas proteínas solubles que median diversos efectos biológicos, lo que incluye la inducción de la proliferación, el desarrollo, la diferenciación y/o la migración de células inmunitarias, y la regulación del crecimiento y de la diferenciación de muchos tipos de células (véase, por ejemplo, Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 59:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul et al., Cell, 76:241 (1994)). Las funciones inmunitarias inducidas por citocina también pueden incluir una reacción inflamatoria, caracterizada por una acumulación sistémica o local de células inmunitarias. Si bien tienen efectos de protección del huésped, estas respuestas inmunitarias pueden producir consecuencias patológicas cuando la respuesta involucra inflamación excesiva y/o crónica, como en trastornos autoinmunitarios (tales como esclerosis múltiple) y cáncer/enfermedades neoplásicas (Oppenheim et al., ed., Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, CA (2001); von Andrian et al., New Engl. J. Med., 343:1020 (2000); Davidson et al., New Engl. J. Med., 345:340 (2001); Lu et al., Mol. Cancer Res., 4:221 (2006); Dalgleish et al., Cancer Treat Res., 130:1 (2006)).
IL-17A, IL-17F e IL-23 son citocinas involucradas en la inflamación. IL-17A induce la producción de citocinas inflamatorias, tales como IL-1p, TNF-a, IL-6 e IL-23, por medio de fibroblastos, monocitos y macrófagos sinoviales, y todos ellos promueven la inflamación y el desarrollo de Th17. IL-17A también induce varias quimiocinas, que incluyen CXCL-1, c Xc L-2, CXCL-5, CXCL-8, CCL-2 y CCL-20, lo cual produce el reclutamiento de linfocitos T, linfocitos B, monocitos y neutrófilos. Lundy, S.K., Arthritis Res. Ther., 9:202 (2007). IL-17F comparte la mayor homología (55 %) con IL-17A y también es una citocina proinflamatoria. IL-17A e IL-17F son producidas por linfocitos Th17, mientras que los otros miembros de la familia IL-17, IL-17B, IL-17C e IL-17D, son producidos por fuentes que no son linfocitos T. IL-17A e IL-17F pueden existir como homodímeros de IL-17A y homodímeros de IL-17F, o como heterodímeros de IL-17A/F. Liang, S.C. et al., J. Immunol., 179:7791-7799 (2007). IL-17A aumenta en el líquido sinovial y suero de la artritis reumatoide, y está presente en las áreas ricas en linfocitos T de la membrana sinovial. Shahrara S, Arthritis Res. Ther., 10:R93 (2005). IL-17A también puede producir daño en los huesos y en los cartílagos. Será necesario un bloqueo eficaz de IL-17 para neutralizar los homodímeros de IL-17A, los homodímeros de IL-17F y los heterodímeros de IL-17A/F.
IL-23 es un heterodímero tipo 1, que comprende una subunidad a con núcleo helicoidal cuádruple de 19 kilodalton (kD) (IL-23p19), unido mediante un puente de disulfuro a una subunidad p distinta de 40 kD (IL-12p40). IL-23 es una citocina clave que conecta los brazos innatos y adaptativos de la respuesta inmunitaria; se produce en forma temprana en respuesta a la exposición a antígenos y es esencial para dirigir las respuestas inmunitarias locales tempranas. Asimismo, IL-23 cumple una función central en la activación de células NK, la mejora de la proliferación de linfocitos T y la regulación de la producción de anticuerpos. IL-23 también regula las citocinas proinflamatorias (por ejemplo, IFN-y), que son importantes para la inmunidad mediada por células contra patógenos intracelulares. Informes recientes indican que, en los seres humanos, el aumento de la cantidad de IL-23 estuvo asociado a varias enfermedades autoinmunitarias, que incluyen artritis reumatoide (RA), borreliosis de Lyme, enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), enfermedad de Crohn (CD), psoriasis y esclerosis múltiple (MS). Los ratones con IL-23p19 inactivada fueron resistentes a la encefalomielitis autoinmunitaria (EAE), la artritis inducida por colágeno (CIA) y la inducción autoinmunitaria del sistema nervioso central. IL-23 no es esencial para el desarrollo de linfocitos Th17 humanos, pero parece ser necesaria para su supervivencia y/o expansión. Paradowska-Gorycka, A., Scandinavian Journal o f Immunology, 71:134-145 (2010). Los estudios genéticos revelaron una asociación entre genes receptores de IL-23 y la susceptibilidad a varias enfermedades autoinmunitarias, que incluyen CD, RA y oftalmopatía de Graves. El eje de IL-23-Th17 es esencial para el desarrollo de las enfermedades autoinmunitarias. Leng et al., Archives o f Medical Research, 41:221-225 (2010). Mabry R. et al., Protein Engineering, Design and Selection, vol. 23 (3), marzo de 2010, páginas 115-127, describe la ingeniería de anticuerpos biespecíficos estables dirigidos a IL-17A e IL-23.
Las actividades demostradas de IL-17A, IL-17F e IL-23p19 en la mediación y promoción de diversas enfermedades autoinmunitarias indican el potencial clínico y la necesidad de obtener moléculas que puedan antagonizar estas dianas. Esta invención, como se indica en la presente en las reivindicaciones, satisface estas y otras necesidades.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una ilustración esquemática de un anticuerpo entero y sus componentes modulares.
La Figura 2 representa un modelo de un anticuerpo biespecífico denominado biAbFabL, que contiene un anticuerpo entero con una unidad Fab del terminal C del segundo brazo del anticuerpo biespecífico unido mediante un ligador, y que utiliza una cadena ligera común.
La Figura 3 representa un modelo de un anticuerpo biespecífico denominado taFab, que contiene un anticuerpo entero con una unidad Fab del terminal N del segundo brazo del anticuerpo biespecífico unido mediante un ligador. Como sucede con la porción de la cadena pesada, hay dos cadenas ligeras para cada brazo del anticuerpo biespecífico unido mediante un ligador.
La Figura 4 representa un modelo de un anticuerpo biespecífico denominado Fc heterodimérico, que se asemeja a un anticuerpo tradicional y, sin embargo, contiene dos cadenas pesadas diferentes que se asocian mediante de una asociación de complementariedad electroestática en la región Ch3. El Fc heterodimérico utiliza una cadena ligera común.
La Figura 5 representa un modelo de un anticuerpo biespecífico denominado VCVFc, que contiene un anticuerpo entero con una unidad Fv del segundo brazo del anticuerpo biespecífico insertado entre la región Fab y la bisagra mediante ligadores.
La Figura 6 representa un modelo de un anticuerpo biespecífico denominado VCDFc, que contiene un anticuerpo entero con un anticuerpo de dominio simple para el segundo brazo del anticuerpo biespecífico insertado entre la región Fab y la bisagra mediante ligadores.
La Figura 7 ilustra los resultados de ELISA que muestran una fijación fuerte del anticuerpo a IL-23p19 y la ausencia de reactividad cruzada con IL-12.
La Figura 8 ilustra la neutralización potente de la señalización de IL-23 observada en el ensayo kit225.
La Figura 9 muestra los resultados de Biacore de 7B7, STELARA® (ustekinumab, un anticuerpo anti-IL-23p40) y la capacidad del receptor de IL-23 humana de fijarse a los distintos mutantes múltiples (shaved) de alanina IL-23p19, L-23p19 de tipo silvestre y de tipo silvestre purificado (control positivo) y un control negativo. La fijación de 7B7 mAb se muestra en la columna izquierda, STELARA® se muestra en la columna central y la fijación de hIL-23R-Fc se muestra en la columna derecha. Los cuatro mutantes indicados con estrella se seleccionaron para el aumento, a fin de confirmar estos resultados.
La Figura 10 muestra un análisis de cinética Biacore de la fijación del anticuerpo IL-23p19 a los mutantes de alanina IL-23.
La Figura 11 ilustra esquemáticamente el proceso que se usa para identificar y seleccionar el anticuerpo 7B7 (anti-IL-23p19).
La Figura 12 ilustra esquemáticamente las calificaciones clínicas de la enfermedad con el tiempo en el modelo EAE de tití.
La Figura 13 ilustra esquemáticamente la calificación de la lesión según la IRM en el modelo EAE de tití.
La Figura 14 ilustra esquemáticamente la calificación del nervio óptico según la IRM en el modelo EAE de tití. La Figura 15 muestra el revestimiento de las cuatro estructuras de Fab con IL-17A o IL-17F, alineadas mediante la interleucina.
La Figura 16 muestra gráficamente la actividad funcional celular de los mutantes IL-17A.
La Figura 17 muestra gráficamente la actividad funcional celular de los mutantes IL-17F.
La Figura 18 es un revestimiento esquemático de los mutantes 9nM IL-17A que se fijan a BiAb3 y demuestran así la tasa de activación acelerada de los mutantes que contienen la mutación Y108A y combinaciones de esta La Figura 19 muestra el análisis energético computacional de los mutantes IL-17A que se fijan a BiAb3.
Descripción detallada
En una forma de realización, la presente invención provee anticuerpos biespecíficos como se define en las reivindicaciones que comprenden una entidad de fijación a IL-17A/F que se fija a IL-17A y a IL-17F, y una entidad de fijación a IL-23 que se fija a IL-23 mediante p19. La invención también incluye ácidos nucleicos aislados que codifican las cadenas pesadas y las cadenas ligeras de los anticuerpos biespecíficos de la invención, así como vectores que comprenden los ácidos nucleicos, células huésped que comprenden los vectores, métodos para fabricar los anticuerpos biespecíficos como se define en las reivindicaciones.
En otras formas de realización, la presente invención provee composiciones que comprenden los anticuerpos biespecíficos como se define en las reivindicaciones. La divulgación provee kits que comprenden los anticuerpos biespecíficos, así como artículos de fabricación que comprenden los anticuerpos biespecíficos.
Los anticuerpos biespecíficos de la presente invención son útiles para la inhibición de citocinas proinflamatorias, por ejemplo, IL-17A, IL-17F e IL-23p19. Los anticuerpos se pueden usar para reducir, limitar, neutralizar o bloquear los efectos proinflamatorios del homodímero de IL-17A, del homodímero de IL-17F o del heterodímero de IL-17A/F. Asimismo, los anticuerpos se pueden usar para reducir, limitar, neutralizar o bloquear los efectos procancerosos del homodímero de IL-17A, del homodímero de IL-17F o del heterodímero de IL-17A/F. En esos casos, la porción anti-IL-23p19 del anticuerpo se usa para reducir, limitar, neutralizar o bloquear la producción de nuevos linfocitos T que producirían IL-17A y/o IL-17F, incluidos los homodímeros y heterodímeros. Los anticuerpos biespecíficos descritos en la presente se pueden usar para tratar trastornos inflamatorios y enfermedades autoinmunitarias, tales como esclerosis múltiple, (por ejemplo, esclerosis múltiple con recidiva-remisión, esclerosis múltiple progresiva secundaria, esclerosis múltiple progresiva primaria y esclerosis múltiple progresiva con recidiva), enfermedad intestinal inflamatoria, psoriasis, esclerosis sistémica, lupus eritematoso sistémico, vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA, forma siglada de antineutrophil cytoplasmic antibodies) (AAV, forma siglada de (ANCA)-associated vasculitis) y arteritis de células gigantes. Los anticuerpos biespecíficos descritos en la presente también se pueden usar para tratar el cáncer, lo que incluye angiogénesis. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos que se describen en la presente se pueden usar para tratar la enfermedad osteolítica inducida por mieloma múltiple (Sotomayor, E.M., Blood, 116(18):3380-3382 (2010)).
En la siguiente descripción, se usan ampliamente varios términos. Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de la invención.
A menos que se especifique lo contrario, "un", "una", "el/la" y "al menos un/una" se usan de manera indistinta y significan uno o más de uno.
Los "anticuerpos" (Ab) y las "inmunoglobulinas" (Ig) son glucoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos exhiben especificidad de fijación a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen anticuerpos y otras moléculas de tipo anticuerpo que carecen de especificidad antigénica. Los polipéptidos de esta última clase son producidos, por ejemplo, en niveles bajos por el sistema linfático y en niveles más altos por mielomas. Por ello, como se usa en la presente, los términos "anticuerpo" o "péptido de anticuerpo" se refieren a un anticuerpo intacto o a un fragmento de fijación al antígeno de este que compite con el anticuerpo intacto por la fijación específica e incluye anticuerpos quiméricos, humanizados, totalmente humanos y biespecíficos. En ciertas formas de realización, los fragmentos de fijación al antígeno son producidos, por ejemplo, por técnicas de ADN recombinante. En formas de realización adicionales, los fragmentos de fijación al antígeno son producidos por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de fijación al antígeno incluyen, entre otros, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv y anticuerpos monocatenarios.
Como se usa en la presente, la expresión "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que fue identificado y separado, y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con usos terapéuticos o de diagnóstico para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En formas de realización preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta obtener más de 95 % en peso de anticuerpo según se determina mediante el método de Lowry y, con máxima preferencia, más de 99 % en peso, (2) en la medida suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos interna o del terminal N mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta alcanzar homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, en general, el anticuerpo aislado se puede preparar mediante al menos una etapa de purificación.
El término "agonista" se refiere a cualquier compuesto, lo que incluye proteína, polipéptido, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, molécula grande o molécula pequeña (de menos de 10 kD), que aumenta la actividad, la activación o la función de otra molécula.
El término "antagonista" se refiere a cualquier compuesto, lo que incluye proteína, polipéptido, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, molécula grande o molécula pequeña (de menos de 10 kD), que disminuye la actividad, la activación o la función de otra molécula.
La expresión "fijar (fijación de) un polipéptido" incluye, entre otras, fijación del polipéptido ligando de la presente divulgación a un receptor; la fijación de un polipéptido receptor de la presente divulgación a un ligando; la fijación de un anticuerpo de la presente divulgación a un antígeno o epítopo; la fijación de un antígeno o epítopo de la presente divulgación a un anticuerpo; la fijación de un anticuerpo de la presente divulgación a un anticuerpo antiidiotípico; la fijación de un anticuerpo antiidiotípico de la presente divulgación a un ligando; la fijación de un anticuerpo antiidiotípico de la presente divulgación a un receptor; la fijación de a un anticuerpo anti-antiidiotípico de la presente divulgación a un ligando, receptor o anticuerpo, etc.
Un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" es un anticuerpo híbrido que tiene dos pares de cadenas pesadas/livianas diferentes y dos sitios de fijación diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir por varios métodos que incluyen, entre otros, fusión de hibridomas o fijación de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992).
Como se usa en la presente, el término "epítopo" se refiere a la porción de un antígeno al cual se fija específicamente un anticuerpo. Por ello, el término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz de fijarse específicamente a un receptor de linfocitos T o inmunoglobulinas. En general, los determinantes epitópicos consisten en agrupaciones de superficies químicamente activas de moléculas, tales como cadenas laterales de azúcar o aminoácidos y, en general, tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Más específicamente, como se usan en la presente, las expresiones "epítopo de IL-17", "epítopo de IL-23" y/o "epítopo de IL-23/p19" se refieren a una porción del polipéptido correspondiente que tiene actividad antigénica o inmunogénica en un animal, preferentemente, en un mamífero y, con máxima preferencia, en un ratón o ser humano. Un epítopo que tiene actividad inmunogénica es una porción de, por ejemplo, un polipéptido IL-17A, IL-17F o IL-23/p19 que provoca la respuesta de un anticuerpo en un animal. Un epítopo que tiene actividad antigénica es una porción de, por ejemplo, un polipéptido IL-17A, IL-17F o IL-23/p19 al que se fija inmunoespecíficamente un anticuerpo, según se determina por cualquier método conocido en el estado de la técnica, por ejemplo, mediante inmunoensayos, digestión de proteasa, cristalografía o intercambio H/D. No es necesario que los epítopos antigénicos sean inmunogénicos. Estos epítopos pueden ser lineales por naturaleza o pueden ser un epítopo discontinuo. Por ello, como se usa en la presente, la expresión "epítopo conformacional" se refiere a un epítopo discontinuo formado por una relación espacial entre los aminoácidos de un antígeno distinto de una serie de aminoácidos continua.
Como se usa en la presente, el término "inmunoglobulina" se refiere a una proteína que consiste en uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina. Una forma de inmunoglobulina constituye la unidad estructural básica de un anticuerpo. Esta forma es un tetrámero y consiste en dos pares idénticos de cadenas de inmunoglobulina, donde cada par tiene una cadena ligera y una cadena pesada. En cada par, las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada son conjuntamente responsables de la fijación al antígeno, y las regiones constantes son responsables de las funciones efectoras del anticuerpo.
Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud completa (alrededor de 25 Kd o alrededor de 214 aminoácidos) son codificadas por un gen de la región variable en el terminal NH2 (alrededor de 110 aminoácidos) y un gen kappa o lambda de la región constante en el terminal COOH-. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (alrededor de 50 Kd o alrededor de 446 aminoácidos) son codificadas de manera similar mediante un gen de la región variable (alrededor de 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de la región constante antes mencionados (alrededor de 330 aminoácidos). Las cadenas pesadas se clasifican en gamma, mu, alfa, delta o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG (tal como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de alrededor de 12 aminoácidos o más, y la cadena pesada también incluye una región "D" de alrededor de 10 aminoácidos más. (Véase, en general, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2.a edición, Raven Press, N.Y., (1989)), capítulo 7 (que se incorpora por referencia en su totalidad para todos los fines).
Una región variable de la cadena ligera o pesada de inmunoglobulina consiste en una región "marco" interrumpida por tres regiones hipervariables. Por ello, la expresión "región hipervariable" se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la fijación al antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (Kabat et al., Sequences o f Proteins o f Immunological Interest, 5.a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917) (1987)). Los residuos de la "región marco" o "FR" son los residuos de dominios variables distintos de los residuos de la región hipervariable definidos en la presente. Las secuencias de las regiones marco de diferentes cadenas ligeras o pesadas son relativamente conservadas dentro de una especie. Por ello, una "región marco humana" es una región marco que es sustancialmente idéntica (alrededor de 85 % o más, generalmente 90-95 % o más) a la región marco de una inmunoglobulina humana natural. La región marco de un anticuerpo, que es la combinación de regiones marco de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDR. Las CDR son las principales responsables de la fijación de un antígeno al epítopo. En consecuencia, el término inmunoglobulina "humanizada" se refiere a una inmunoglobulina que comprende una región marco humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana (generalmente, de rata o ratón). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina "donante", y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco se denomina "aceptora". No es necesario que haya regiones constantes, pero si las hubiera, deben ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de la inmunoglobulina humana, es decir, al menos alrededor de 85-90 %, preferentemente, alrededor de 95 % o más idénticas. Por lo tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de las secuencias de inmunoglobulina humana natural. Asimismo, uno o más residuos en la región marco humana pueden retromutar a la secuencia parental para retener una afinidad y una especificidad de fijación al antígeno óptimas. De esta manera, ciertos residuos marco del anticuerpo parental no humano se retienen en el anticuerpo humanizado, a fin de retener las propiedades de fijación del anticuerpo parental a la vez que se minimiza su inmunogenicidad. Como se usa en la presente, la expresión "región marco humana" incluye regiones con esas retromutaciones. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulina de cadena ligera humanizada y de cadena pesada humanizada. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado no abarcaría un anticuerpo quimérico típico como se definió anteriormente, por ejemplo, porque la totalidad de la región variable de un anticuerpo quimérico es no humana.
El término inmunoglobulina "humanizada" se refiere a una inmunoglobulina que comprende una región marco humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana, por ejemplo, de ratón, rata o conejo. La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina "donante", y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco se denomina "aceptora". No es necesario que haya regiones constantes, pero si las hubiera, deben ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de la inmunoglobulina humana, es decir, al menos alrededor de 85-90 %, preferentemente, alrededor de 95 % o más idénticas. Por lo tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR y algunos residuos de aminoácidos retromutados en la región marco (por ejemplo, 1-15 residuos), son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de las secuencias de inmunoglobulina humana natural. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulina de cadena ligera humanizada y de cadena pesada humanizada. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado no abarcaría un anticuerpo quimérico típico como se definió anteriormente, por ejemplo, porque la totalidad de la región variable de un anticuerpo quimérico es no humana.
Como se usa en la presente, la expresión "anticuerpo humano" incluye un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluye anticuerpos aislados de colecciones de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como describen, por ejemplo, Kucherlapati et al. en la patente estadounidense N.° 5.939.598.
La expresión "anticuerpos genéticamente alterados" significa anticuerpos en donde la secuencia de aminoácidos varió de una secuencia de un anticuerpo nativo. Debido a la importancia de las técnicas de ADN recombinante en la generación de anticuerpos, no es necesario limitarse a las secuencias de aminoácidos encontradas en los anticuerpos naturales; los anticuerpos se pueden rediseñar para obtener las características deseadas. Las posibles variaciones son muchas y varían desde cambiar solo uno o pocos aminoácidos hasta rediseñar totalmente, por ejemplo, la región variable y/o constante. Los cambios en la región constante se realizarán, en general, a fin de mejorar o alterar las características, tal como la fijación al complemento, interacción con membranas y demás funciones efectoras. Los cambios en la región variable se realizarán a fin de mejorar las características de fijación al antígeno.
Un "fragmento Fab" está compuesto por una cadena ligera y las regiones variables y Ch1 de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un puente de disulfuro con otra molécula de la cadena pesada.
Un "fragmento Fab'" contiene una cadena ligera y una cadena pesada que contiene más de la región constante, entre los dominios Ch1 y Ch2, de modo que se puede formar un puente de disulfuro intercatenario entre dos cadenas pesadas para formar una molécula F(ab') 2.
Un "fragmento F(ab')2" contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región constante entre los dominios Ch1 y Ch2, de modo que se puede formar un puente de disulfuro intercatenario entre dos cadenas pesadas.
Un "fragmento Fv" contiene las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, pero carece de las regiones constantes.
Un "anticuerpo de dominio simple" es un fragmento de anticuerpo que consiste en una unidad Fv de dominio simple, por ejemplo, Vh o Vl. Como un anticuerpo entero, es capaz de fijarse selectivamente a un antígeno específico. Con un peso molecular de tan solo 12-15 kDa, los anticuerpos de dominio simple son mucho más pequeños que los anticuerpos comunes (150-160 kDa), que están compuestos por dos cadenas pesadas de proteínas y dos cadenas ligeras, e incluso más pequeños que los fragmentos Fab (~50 kDa, una cadena ligera y media cadena pesada) y fragmentos variables monocatenarios (~25 kDa, dos dominios variables, uno de una cadena ligera y uno de una cadena pesada). Los primeros anticuerpos de dominio simple fueron modificados por ingeniería genética de anticuerpos de cadena pesada hallados en camélidos. Aunque actualmente la mayoría de las investigaciones sobre anticuerpos de dominio simple se basan en dominios variables de la cadena pesada, también se ha demostrado que los dominios variables de la cadena ligera y los nanocuerpos derivados de las cadenas ligeras se fijan específicamente a epítopos diana.
Como se usa en la presente, la expresión "anticuerpo monoclonal", o los términos "mAb", "MAb", "Mab" o "mab", no se limitan a anticuerpos producidos mediante tecnología de hibridoma. La expresión "anticuerpo monoclonal", o los términos "mAb", "MAb", "Mab" o "mab", se refieren a un anticuerpo que deriva de un único clon, lo que incluye cualquier clon eucariótico, procariótico o de fago, y no al método mediante el cual se produce.
Como se usa en la presente, "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refieren a polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y fragmentos generados por cualquier ligadura, fragmentación, acción de endonucleasa y acción de exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas por monómeros que son nucleótidos naturales (tales como ADN y ARN), o análogos de nucleótidos naturales (por ejemplo, formas aenantioméricas de nucleótidos naturales), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en las porciones de azúcar y/o en las porciones básicas de pirimidina o purina. Las modificaciones de azúcares incluyen, por ejemplo, el reemplazo de uno o más grupos hidroxilo por halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los azúcares se pueden funcionalizar como éteres o ésteres. Asimismo, la porción entera de azúcar se puede reemplazar por estructuras estérica y electrónicamente similares, tales como análogos de azúcares carbocíclicos y aza-azúcares. Algunos ejemplos de modificaciones en una porción básica incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas u otros sustitutos heterocíclicos conocidos. Los monómeros de ácido nucleico pueden estar ligados mediante enlaces de fosfodiéster o análogos de esos enlaces. Los análogos de los enlaces de fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato y similares. La expresión "molécula de ácido nucleico" también incluye los denominados "ácidos nucleicos de péptidos", que comprenden bases de ácidos nucleicos naturales o modificados unidas a una estructura principal de poliamida. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios.
La expresión "complemento de una molécula de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria y una orientación inversa, en comparación con una secuencia de nucleótidos de referencia.
La expresión "secuencia de nucleótidos degenerada" indica una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados, en comparación con una molécula de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido. Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo residuo de aminoácido (es decir, cada uno de los tripletes GAU y GAC codifica Asp).
Una "molécula de ácido nucleico aislada" es una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica un factor de crecimiento que se separó del ADN genómico de una célula es una molécula de ADN aislada. Otro ejemplo de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico sintetizada químicamente, que no está integrada en el genoma de un organismo. Una molécula de ácido nucleico que se aisló de una especie particular es más pequeña que la molécula de ADN completa de un cromosoma de esa especie.
Un "constructo de molécula de ácido nucleico" es una molécula de ácido nucleico, ya sea monocatenaria o bicatenaria, que fue modificada mediante intervención humana para que contenga segmentos de ácido nucleico combinados y yuxtapuestos de una manera que no existe en la naturaleza.
"ADN complementario (ADNc)" es una molécula de ADN monocatenaria que se forma de un molde de ARNm mediante la enzima transcriptasa inversa. En general, se usa un cebador complementario de las porciones de ARNm para la iniciación de la transcripción inversa. Las personas del oficio de nivel medio también usan el término "ADNc" para referirse a una molécula de ADN bicatenaria que consiste en la molécula de ADN monocatenaria y su cadena de ADN complementaria. El término "ADNc" también se refiere a un clon de una molécula de ADNc sintetizada de un molde de ARN.
Un "promotor" es una secuencia de nucleótidos que dirige la transcripción de un gen estructural. En general, un promotor está ubicado en la región 5' no codificante de un gen, cerca del sitio de inicio de la transcripción de un gen estructural. En general, los elementos de la secuencia dentro de los promotores que participan en la iniciación de la transcripción se caracterizan por secuencias consenso de nucleótidos. Estos elementos promotores incluyen los sitios de fijación de la ARN polimerasa, secuencias TATA, secuencias CAAT, elementos específicos de la diferenciación (Ds E; McGehee et al., Mol. Endocrinol., 7:551 (1993)), elementos de respuesta a AMP cíclico (CRE), elementos de respuesta al suero (SRE; Treisman, Seminars in Cáncer Biol., 1:47 (1990)), elementos de respuesta a los glucocorticoides (GRE) y sitios de fijación de otros factores de transcripción, tales como CRE/ATF (O'Reilly et al., J. Biol. Chem, 267:19938 (1992)), AP2 (Ye et al., J. Biol. Chem, 269:25728 (1994)), SP1, proteína de fijación a los elementos de respuesta de cAMP (CREB; Loeken, Gene Expr., 3:253 (1993)) y factores de octámeros (véase, en general, Watson et al., ed., Molecular Biology o f the Gene, 4.a edición, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. (1987) y Lemaigre et al., Biochem. J., 303:1 (1994)). Si el promotor es un promotor inducible, la velocidad de transcripción aumenta en respuesta a un agente de inducción. Por el contrario, la velocidad de transcripción no es regulada por un agente de inducción si el promotor es un promotor constitutivo. También se conocen los promotores reprimibles.
Un "elemento regulador" es una secuencia de nucleótidos que modula la actividad de un promotor de núcleo. Por ejemplo, un elemento regulador puede contener una secuencia de nucleótidos que se fija a factores celulares, lo cual permite la transcripción exclusiva o preferentemente en células, tejidos u organelas particulares. Estos tipos de elementos reguladores se asocian normalmente a genes que se expresan de manera "específica de célula", "específica de tejido" o "específica de organela".
Un "potenciador" es un tipo de elemento regulador que puede aumentar la eficacia de la transcripción, independientemente de la distancia u orientación del potenciador con respecto al sitio de inicio de la transcripción.
"ADN heterólogo" se refiere a una molécula de ADN, o a una población de moléculas de ADN, que no existe naturalmente en una célula huésped determinada. Las moléculas de ADN heterólogas con respecto a una célula huésped particular pueden contener ADN derivado de la especie celular huésped (es decir, ADN endógeno) en la medida en que ese ADN huésped se combine con ADN no huésped (es decir, ADN exógeno). Por ejemplo, se considera que una molécula de ADN que contiene un segmento de a Dn no huésped que codifica un polipéptido ligado operativamente a un segmento de ADN huésped que comprende un promotor de la transcripción es una molécula de ADN heteróloga. Por el contrario, una molécula de ADN heteróloga puede comprender un gen endógeno ligado operativamente a un promotor exógeno. A modo de ejemplo, se considera que una molécula de ADN que comprende un gen derivado de una célula de tipo silvestre es una molécula de ADN heteróloga si esa molécula de ADN se introduce en una célula mutante que carece del gen de tipo silvestre.
Un "vector de expresión" es una molécula de ácido nucleico que codifica un gen que se expresa en una célula huésped. Generalmente, un vector de expresión comprende un promotor de la transcripción, un gen y un terminador de la transcripción. En general, la expresión del gen se coloca bajo el control de un promotor, y se dice que ese gen está "ligado operativamente" al promotor. De manera similar, un elemento regulador y un promotor de núcleo están ligados operativamente si el elemento regulador modula la actividad del promotor de núcleo.
Un "huésped recombinante" es una célula que contiene una molécula de ácido nucleico heteróloga, tal como un vector de clonación o un vector de expresión. En el presente contexto, un ejemplo de un huésped recombinante es una célula que produce un antagonista de la presente invención de un vector de expresión. Por el contrario, el antagonista puede ser producido por una célula que es una "fuente natural" del antagonista y que carece de un vector de expresión.
Las expresiones "terminal amino" y "terminal carboxilo" se usan para indicar posiciones dentro de los polipéptidos. En la medida en que lo permita el contexto, estos términos se usan con referencia a una secuencia o porción particulares de un polipéptido para indicar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia ubicada en el terminal carboxilo con respecto a una secuencia de referencia en un polipéptido se ubica cerca del terminal carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el terminal carboxilo del polipéptido completo.
Una "proteína de fusión" es una proteína híbrida expresada por una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos de al menos dos genes. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender al menos parte de un polipéptido IL-17RA fusionado con un polipéptido que se fija a una matriz de afinidad. Esa proteína de fusión provee un medio para aislar grandes cantidades de IL-17A usado cromatografía por afinidad.
El término "receptor" indica una proteína asociada a una célula, que se fija a una molécula bioactiva denominada "ligando". Esta interacción media el efecto del ligando en la célula. Los receptores pueden estar fijados a la membrana, pueden ser citosólicos o nucleares; monoméricos (por ejemplo, receptor de la hormona estimulante de la tiroides, receptor beta-adrenérgico) o multiméricos (por ejemplo, receptor de PDGF, receptor de la hormona del crecimiento, receptor de IL-3, receptor de GM-CSF, receptor de G-CSF, receptor de eritropoyetina y receptor de IL-6). Los receptores fijados a la membrana se caracterizan por una estructura multidominio que comprende un dominio de fijación al ligando extracelular y un dominio efector intracelular que generalmente participa en la transducción de la señal. En ciertos receptores fijados a la membrana, el dominio de fijación al ligando extracelular y el dominio efector intracelular se ubican en polipéptidos separados que comprenden el receptor funcional completo.
En general, la fijación del ligando al receptor da como resultado un cambio conformacional en el receptor, lo que causa una interacción entre el dominio efector y otras moléculas en la célula lo cual, a su vez, provoca la alteración del metabolismo de la célula. Los eventos metabólicos generalmente ligados a interacciones receptor-ligando incluyen transcripción génica, fosforilación, desfosforilación, aumento de la producción de AMP cíclico, movilización del calcio celular, movilización de lípidos de la membrana, adhesión celular, hidrólisis de lípidos de inositol e hidrólisis de fosfolípidos.
El término "expresión" se refiere a la biosíntesis de un producto génico. Por ejemplo, en el caso de un gen estructural, la expresión implica la transcripción del gen estructural en ARNm y la traducción de ARNm en uno o más polipéptidos.
La expresión "par complemento/anticomplemento" indica porciones no idénticas que forman un par estable asociado de manera no covalente en condiciones adecuadas. Por ejemplo, la biotina y la avidina (o estreptavidina) son miembros prototípicos de un par complemento/anticomplemento. Otros ejemplos de pares complemento/anticomplemento incluyen los pares receptor/ligando, pares anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítopo), pares de polinucleótidos sentido/antisentido y similares. En los casos en que es conveniente la posterior disociación del par complemento/anticomplemento, el par complemento/anticomplemento tiene, preferentemente, una afinidad de fijación menor de 109 M-1.
Como se usa en la presente, un "agente terapéutico" es una molécula o un átomo que se conjugan con una porción de anticuerpo para producir un conjugado útil para la terapia. Algunos ejemplos de agentes terapéuticos incluyen fármacos, toxinas, inmunomoduladores, quelantes, compuestos de boro, agentes fotoactivos o tinturas, y radioisótopos.
Una "etiqueta detectable" es una molécula o un átomo que se pueden conjugar con una porción de anticuerpo para producir una molécula útil para el diagnóstico. Algunos ejemplos de etiquetas detectables incluyen quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iones paramagnéticos u otras porciones de marcadores.
La expresión "etiqueta de afinidad" se usa en la presente para indicar un segmento polipeptídico que se puede unir a un segundo polipéptido para la purificación o detección del segundo polipéptido o proporcionar sitios para la unión del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, se puede usar como etiqueta de afinidad cualquier péptido o proteína para los cuales un anticuerpo u otro agente de fijación específico están disponibles. Las etiquetas de afinidad incluyen un tracto de polihistidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J., 4: 1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol., 198: 3 (1991)), glutatión S transferasa (Smith et al., Gene, 67:31 (1988)), etiqueta de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl Acad Sci. USA, 82: 7952 (1985)), sustancia P, péptido FLAG® (Hopp et al., Biotechnology, 6: 1204 (1988)), péptido de unión a estreptavidina u otro epítopo antigénico o dominio de unión. Véase, en general, Ford et al., Protein Expression and Purification, 2:95 (1991). Las moléculas de ADN que codifican etiquetas de afinidad están disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Una "entidad de fijación a IL-17A" es una entidad de fijación, tal como un anticuerpo, que se fija específicamente a IL-17A en su forma homodimérica (IL-17A/IL-17A) y en su forma heterodimérica (IL-17A/IL-17F).
Una "entidad de fijación a IL-17F" es una entidad de fijación, tal como un anticuerpo, que se fija específicamente a IL-17F en su forma homodimérica (IL-17F/IL-17F) y en su forma heterodimérica (IL-17A/IL-17F).
Una "entidad de fijación a IL-17A/F" es una entidad de fijación, tal como un anticuerpo, que se fija específicamente a IL-17A e IL-17F al reconocer y fijarse al mismo epítopo o a uno similar, por ejemplo, un epítopo continuo o discontinuo, compartido por IL-17A e IL-17F. La entidad de fijación a IL-17A/F se fija al homodímero de IL-17A, al homodímero de IL-17F y al heterodímero de IL-17A/IL-17F.
Un problema consiste en que IL-17A, IL-17F y IL-23p19 están sobreexpresados e implicados en la causa y/o la sostenibilidad de varios trastornos inflamatorios y/o autoinmunitarios. Una solución que se provee en varias formas de realización de la presente invención es inhibir o reducir la capacidad de estas citocinas para señalizar células, utilizando un anticuerpo biespecífico como se define en las reivindicaciones que se fija a cada citocina e inhibe o reduce cada citocina, por ejemplo, la forma homodimérica o heterodimérica, de la señalización a través de su receptor cognado.
Otro problema es que al crear una IL-17A/F biespecífica y un anticuerpo biespecífico IL-23p19, por ejemplo, biAb3, se encontraron diferencias para generar un anticuerpo biespecífico que tenía alta afinidad con IL-17A y que era un neutralizador eficaz, por ejemplo, CI50, de IL-17A. El anticuerpo de ratón parental (por ejemplo, quimérico 339.15, 339.15.3.5, 339.15.5.3 o 339.15.3.6), como se muestra en la Tabla 1, tuvo una CI50 de IL-17a /F de 0,30 nM y una CI50 de IL-17F de 0,26 nM, pero solo tuvo una CI50 de IL-17A de 11 nM. Era necesario mejorar la capacidad de los anticuerpos para inhibir o neutralizar IL-17A de la señalización. Como se muestra en la Tabla 3, 339.15 de ratón parental quimérico y 339.134 parental humanizado tuvieron una afinidad de fijación a IL-17A similar. Asimismo, como se muestra en la Tabla 8, la capacidad de 339.134 parental humanizado para inhibir IL-17A (CI50 de 1,3 nM) aún era significativamente reducida, en comparación con su capacidad para inhibir IL-17A/F (CI50 de 0,27 nM) e IL-17F (CI50 de 0,24 nM). Este problema se superó sorpresivamente utilizando la cadena ligera del anticuerpo IL-23p19 de biAb3 (SEQ ID NO:17). Cuando la cadena ligera de IL-23p19 se apareó con la cadena pesada humanizada de 339.134, el anticuerpo monoclonal resultante aumentó significativamente su capacidad para inhibir IL-17A de la señalización (véase la Tabla 9) y aumentó significativamente su afinidad con IL-17A (véase la Tabla 10). El residuo fundamental en la cadena ligera de IL-23p19/IL-17A/F ahora compartida de, por ejemplo, biAb3, que pudo haber proporcionado esta mejor capacidad de neutralización y afinidad puede ser Y108 o Tyr108 de SEQ ID NO:2, según lo demuestran la cristalografía de rayos X y los estudios de mutantes de alanina del Ejemplo 9.
En una forma de realización, la presente invención provee anticuerpos biespecíficos como se define en las reivindicaciones. Los anticuerpos biespecíficos de la divulgación comprenden una entidad de fijación a IL-17A que se fija a IL-17A y una entidad de fijación a IL-23 que se fija a IL-23 mediante p19. Los anticuerpos biespecíficos de la divulgación comprenden una entidad de fijación a IL-17F que se fija a IL-17F y a una entidad de fijación a IL-23 que se fija a IL-23 mediante p19. En otro aspecto, los anticuerpos biespecíficos de la divulgación comprenden una entidad de fijación a IL-17A/F que se fija a IL-17A e IL-17F y una entidad de fijación a IL-23 que se fija a IL-23 mediante p19, como se define en las reivindicaciones. La entidad de fijación que se fija a IL-23 mediante p19 se denomina, en adelante, entidad de fijación que se fija a IL-23 o "entidad de fijación a IL-23". La secuencia de polinucleótidos de la IL-17A humana se muestra en SEQ ID NO:1, y la secuencia de polipéptidos correspondiente se muestra en SEQ ID NO:2. La secuencia de señales del polipéptido IL-17A son los residuos de aminoácidos 1-23 de SEQ ID NO:2. Por eso, los residuos de aminoácidos 24-155 de SEQ ID NO:2 constituyen el polipéptido IL-17A maduro. Los anticuerpos (y los fragmentos de fijación al antígeno de estos) y los anticuerpos biespecíficos descritos en la presente que se fijan a IL-17A se fijan al polipéptido IL-17A maduro (residuos de aminoácidos 24-155 de SEQ ID NO:2). La secuencia de polinucleótidos de la IL-17F humana se muestra en SEQ ID NO:3, y la secuencia de polipéptidos correspondiente se muestra en SEQ ID NO:4. La secuencia de señales del polipéptido IL-17F son los residuos de aminoácidos 1-30 de SEQ ID NO:4. Por eso, los residuos de aminoácidos 31-163 de SEQ ID NO:4 constituyen el polipéptido IL-17F maduro. Los anticuerpos (y los fragmentos de fijación al antígeno de estos) y los anticuerpos biespecíficos descritos en la presente que se fijan a IL-17F se fijan al polipéptido IL-17F maduro (residuos de aminoácidos 31-163 de SEQ ID NO:4). La secuencia de polinucleótidos de la subunidad p19 humana de IL-23 se muestra en SEQ ID NO:5, y la secuencia de polipéptidos correspondiente se muestra en s Eq ID NO:6. La secuencia de señales del polipéptido IL-23p19 son los residuos de aminoácidos 1-19 de SEQ ID NO:6. Por eso, los residuos de aminoácidos 20-189 de SEQ ID NO:6 constituyen el polipéptido IL-23p19 maduro. Los anticuerpos (y los fragmentos de fijación al antígeno de estos) y los anticuerpos biespecíficos descritos en la presente que se fijan a IL-23p19 se fijan al polipéptido IL-23p19 maduro (residuos de aminoácidos 20-189 de SEQ ID NO:6). Los anticuerpos (y fragmentos de unión a antígeno de los mismos) y los anticuerpos biespecíficos divulgados en el presente documento que se unen a IL-23p19 se unen al polipéptido IL-23p19 maduro (restos de aminoácidos 20-289 de la SEQ ID NO:6).
En un aspecto de la divulgación, la entidad de fijación a IL-17A/F comprende un anticuerpo, es decir, dos pares de cadenas de inmunoglobulina, en donde cada par tiene una cadena ligera y una cadena pesada, y la entidad de fijación a IL-23 comprende dos fragmentos Fab, cada uno de los cuales comprende una cadena ligera y las regiones Ch1 y variables de una cadena pesada, y los fragmentos Fab de la entidad de fijación a IL-23 se unen al terminal C de las cadenas pesadas (Fc) de la entidad de fijación a IL-17A/F. En la presente invención, el formato de este anticuerpo biespecífico se denomina biAbFabL (véase la Figura 2). En otra forma de realización, cada una de la cadena ligera y las regiones Ch1 y variables de la cadena pesada que comprenden los fragmentos Fab de la entidad de fijación a IL-23 se unen al terminal N de las cadenas ligeras y las cadenas pesadas, respectivamente, de la entidad de fijación a IL-17A/F. En la presente, el formato de este anticuerpo biespecífico se denomina taFab (véase la Figura 3).
En otro aspecto de la divulgación, la entidad de fijación a IL-23 comprende un anticuerpo, es decir, dos pares de cadenas de inmunoglobulina, en donde cada par tiene una cadena ligera y una cadena pesada, y la entidad de fijación a IL-17A/F comprende dos fragmentos Fab, cada uno de los cuales comprende una cadena ligera y las regiones Ch1 y variables de una cadena pesada, y los fragmentos Fab de la entidad de fijación a IL-17A/F se unen al terminal C de las cadenas pesadas (Fc) de la entidad de fijación a IL-23. Este formato de anticuerpo biespecífico se denomina biAbFabL (véase la Figura 2). En otra forma de realización, cada una de la cadena ligera y las regiones Ch1 y variables de la cadena pesada que comprenden los fragmentos Fab de la entidad de fijación a IL-17A/F se unen al terminal N de la cadena ligera y la cadena pesada, respectivamente, de la entidad de fijación a IL-23. En la presente, el formato de este anticuerpo biespecífico se denomina taFab (véase la Figura 3).
En otro aspecto de la divulgación, la entidad de fijación a IL-23 comprende una cadena ligera y una cadena pesada de IL-23, y la entidad de fijación a IL-17A/F comprende una cadena ligera y una cadena pesada de IL-17A/F. Este anticuerpo biespecífico se asemeja a un anticuerpo tradicional, excepto porque comprende dos cadenas pesadas diferentes que se asocian mediante una asociación de complementariedad electroestática en las regiones Ch3. Utiliza una cadena ligera común. Este formato de anticuerpo biespecífico se denomina Fc heterodimérico (véase la Figura 4).
En otra forma de realización, la presente divulgación provee anticuerpos biespecíficos que comprenden una primera entidad de fijación que comprende un anticuerpo, es decir, dos pares de cadenas de inmunoglobulina, en donde cada par tiene una cadena ligera y una cadena pesada, y una segunda entidad de fijación que comprende una unidad Fv, es decir, los dominios variables de una cadena pesada y una cadena ligera, y en donde la segunda entidad de fijación que comprende la unidad Fv se ubica entre la región Fab y la bisagra de la primera entidad de fijación, como se muestra en la Figura 5. La unidad Fv se liga a la región Fab de la primera entidad de fijación mediante moléculas ligadoras. Más específicamente, la unidad Fv comprende un dominio liviano variable que se liga a la región constante de la cadena ligera del fragmento Fab y un dominio pesado variable que se liga a la región Ch1 del fragmento Fab. En la presente, el formato de este anticuerpo biespecífico se denomina VCVFc. La primera entidad de fijación y la segunda entidad de fijación de un VCVFc no tienen que compartir una cadena ligera común, mientras que la primera entidad de fijación y la segunda entidad de fijación de un biAbFabL no tienen que compartir una cadena ligera común. En un aspecto de esta forma de realización de la invención, la primera entidad de fijación se fija específicamente a un antígeno linfocitario, citocina, receptor de citocina, factor de crecimiento, receptor del factor de crecimiento, interleucina (por ejemplo, IL-17A, IL-17F, IL-17A/F e IL-23) o receptor de interleucina, y la segunda entidad de fijación se fija específicamente a un antígeno linfocitario, citocina, receptor de citocina, factor de crecimiento, receptor del factor de crecimiento, interleucina (por ejemplo, IL-17A, IL-17F, IL-17A/F e IL-23) o receptor de interleucina. En otro aspecto de esta forma de realización de la invención, la primera entidad de fijación es una entidad de fijación a IL-17A/F, y la segunda entidad de fijación es una entidad de fijación a IL-23. En otro aspecto de esta forma de realización de la invención, la primera entidad de fijación es una entidad de fijación a IL-23, y la segunda entidad de fijación es una entidad de fijación a IL-17A/F.
En otra forma de realización, la presente divulgación provee anticuerpos biespecíficos que comprenden una primera entidad de fijación que comprende un anticuerpo, es decir, dos pares de cadenas de inmunoglobulina, en donde cada par tiene una cadena ligera y una cadena pesada, y una segunda entidad de fijación que comprende un anticuerpo de dominio simple. En la presente, el formato de este anticuerpo biespecífico se denomina VCDFc. Un ejemplo de un anticuerpo biespecífico VCDFc se muestra en la Figura 6. La segunda entidad de fijación que comprende el anticuerpo de dominio simple se ubica entre la región Fab, más específicamente, la región Ch1 del fragmento Fab, y la bisagra de la primera entidad de fijación. El anticuerpo de dominio simple se liga a la región Ch1 de Fab de la primera entidad de fijación mediante moléculas ligadoras (por ejemplo, 10mer G4S, representada por la ecuación (G4S)2 o SSASTKGPS (SEQ ID NO:8 6 )). En un aspecto de esta forma de realización de la invención, la primera entidad de fijación se fija específicamente a un antígeno linfocitario, citocina, receptor de citocina, factor de crecimiento, receptor del factor de crecimiento, interleucina (por ejemplo, IL-17A, IL-17F, IL-17A/F e IL-23) o receptor de interleucina, y la segunda entidad de fijación se fija específicamente a un antígeno linfocitario, citocina, receptor de citocina, factor de crecimiento, receptor del factor de crecimiento, interleucina (por ejemplo, IL-17A, IL-17F, IL-17A/F e IL-23) o receptor de interleucina. En un aspecto de esta forma de realización de la invención, la primera entidad de fijación es una entidad de fijación a IL-23, y la segunda entidad de fijación es una entidad de fijación a IL-17A/F. En otro aspecto de esta forma de realización de la invención, la primera entidad de fijación es una entidad de fijación a IL-17A/F, y la segunda entidad de fijación es una entidad de fijación a IL-23.
Las secuencias de aminoácidos de las entidades de fijación se basan, preferentemente, en las secuencias de anticuerpos monoclonales humanos y/o humanizados contra un antígeno linfocitario, citocina, receptor de citocina, factor de crecimiento, receptor del factor de crecimiento, interleucina (por ejemplo, IL-17A, IL-17F, IL-17A/F e IL-23) o receptor de interleucina.
En la invención, cada una de las cadenas ligeras de la entidad de fijación a IL-17A/F y la entidad de fijación a IL-23 del anticuerpo biespecífico comprende un dominio variable que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:23 y una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO:24. En una forma de realización, cada una de las cadenas ligeras de la entidad de fijación a IL-17A/F y la entidad de fijación a IL-23 comprende un dominio variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9. En otra forma de realización, cada una de las cadenas ligeras de la entidad de fijación a IL-17A/F y la entidad de fijación a IL-23 comprende un dominio constante que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10. En otra forma de realización, cada una de las cadenas ligeras de la entidad de fijación a IL-17A/F y la entidad de fijación a IL-23 comprende un dominio variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 y un dominio constante que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10.
En la invención, la cadena pesada de la entidad de fijación a IL-17A/F del anticuerpo biespecífico comprende un dominio variable que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26 y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27. En una forma de realización, la cadena pesada de la entidad de fijación a IL-17A/F comprende un dominio variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13. En otra forma de realización, cuando la entidad de fijación a IL-17A/F comprende un anticuerpo, el dominio constante de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:127 o SEQ ID NO:128. En otra forma de realización, cuando la entidad de fijación a IL-17A/F comprende un fragmento Fab, la región Ch1 de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:15.
En otra forma de realización de los aspectos anteriores de la invención, la entidad de fijación a IL-17A/F del anticuerpo biespecífico como se define en las reivindicaciones comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13. Opcionalmente, todas las sustituciones, adiciones o eliminaciones están dentro de la región marco del dominio variable de la cadena pesada. Opcionalmente, la entidad de fijación a IL-17A/F del anticuerpo biespecífico comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13, en donde el dominio variable comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26 y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27. En una forma de realización de la divulgación, el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. Opcionalmente, las tres CDR de dominio variable de cadena pesada de IL-17A/F incluyen una región CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; una región CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos al menos 98 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 y una región CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. En la invención, la CDR1 del dominio variable de la cadena pesada de IL-17A/F tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; la CDR2 del dominio variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 y la CDR3 del dominio variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. La entidad de fijación de a IL-17A/F y/o IL-23p19 como se define en las reivindicaciones puede comprender un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Opcionalmente, todas las sustituciones, adiciones o eliminaciones se encuentran dentro de la región marco del dominio variable de la cadena ligera. Opcionalmente, la entidad de fijación a IL-17A/F y/o IL-23p19 del anticuerpo biespecífico como se define en las reivindicaciones comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, en donde el dominio variable comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. Opcionalmente, el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. En una forma de realización de la divulgación, las tres CDR de dominio variable de cadena ligera de IL-17A/F y/o IL-23p19 incluyen una región CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; una región CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos al menos 98 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; y una región CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. En la invención, la CDR1 de dominio variable de cadena ligera de IL-17A/F y/o IL-23p19 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; la CDR2 de dominio variable de cadena ligera de IL-17A/F y/o IL-23p19 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y la CDR3 de dominio variable de cadena ligera de IL-17A/F y/o IL-23p19 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. En una forma de realización de la divulgación, la entidad de fijación a IL-23p19 comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Opcionalmente, todas las sustituciones, adiciones o eliminaciones están dentro de la región marco del dominio variable de la cadena pesada de IL-23p19. Opcionalmente, la entidad de fijación a IL-23p19 del anticuerpo biespecífico de la divulgación comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, en donde el dominio variable comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. Opcionalmente, el dominio variable de cadena pesada de IL-23p19 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Opcionalmente, las tres CDR de dominio variable de cadena pesada de IL-23p19 incluyen una región CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; una región CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos al menos 98 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y una región CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. Opcionalmente, la CDR1 de dominio variable de la cadena pesada de IL-23p19 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; la CDR2 de dominio variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y la CDR3 de dominio variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
En otra forma de realización de los aspectos anteriores de la divulgación, la cadena pesada de la entidad de fijación a IL-23 del anticuerpo biespecífico comprende un dominio variable que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20 y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21. En otra forma de realización, la cadena pesada de la entidad de fijación a IL-23 comprende un dominio variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7. En otra forma de realización, cuando la entidad de fijación a IL-23 comprende un anticuerpo, el dominio constante de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:127 o SEQ ID NO:128. En algunas formas de realización, se escindió la lisina del terminal C de SEQ ID NO:8, y por eso, el dominio constante de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 1-326 de SEQ ID NO:8. En otra forma de realización, cuando la entidad de fijación a IL-23 comprende un fragmento Fab, la región Ch1 de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:15.
En otra forma de realización de los aspectos anteriores de la invención, cuando la entidad de fijación a IL-23 o la entidad de fijación a IL-17A/F del anticuerpo biespecífico es una unidad Fv, el dominio variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:23 y una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO:24. En otra forma de realización, cada una de las cadenas ligeras de la entidad de fijación a IL-17A/F y la entidad de fijación a IL-23 comprende un dominio variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9.
En otra forma de realización de los aspectos anteriores de la invención, cuando la entidad de fijación a IL-17A/F del anticuerpo biespecífico es una unidad Fv, el dominio variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26 y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27. En otra forma de realización, la cadena pesada de la entidad de fijación a IL-17A/F comprende un dominio variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:13.
En otra forma de realización de los aspectos anteriores de la divulgación, cuando la entidad de fijación a IL-23 del anticuerpo biespecífico es una unidad Fv, el dominio variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:19, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20 y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:21. En otra forma de realización, la cadena pesada de la entidad de fijación a IL-23 comprende un dominio variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7.
En otra forma de realización de los aspectos anteriores de la invención, los fragmentos Fab de la entidad de fijación a IL-23 del anticuerpo biespecífico se ligan al terminal C de las cadenas pesadas (Fc) de la entidad de fijación a IL-17A/F, o los fragmentos Fab de la entidad de fijación a IL-17A/F se ligan, por ejemplo, al terminal C de las cadenas pesadas (Fc) de la entidad de fijación a IL-23 mediante una molécula ligadora (véase, por ejemplo, la Figura 2). En otra forma de realización, cada una de la cadena ligera y las regiones CH1 y variables de la cadena pesada que comprende los fragmentos Fab de la entidad de fijación a iL-23 se liga al terminal N de la cadena ligera y de la cadena pesada, respectivamente, de la entidad de fijación a IL-17A/F, o cada una de la cadena ligera y las regiones CH1 y variables de la cadena pesada que comprende los fragmentos Fab de la entidad de fijación a IL-17A/F se liga al terminal N de la cadena ligera y de la cadena pesada, respectivamente, de la entidad de fijación a IL-23 mediante una molécula ligadora (véase, por ejemplo, la Figura 3). En otra forma de realización del anticuerpo biespecífico VCVFc, cada una de la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada de la unidad Fv que comprende la segunda entidad de fijación se liga a cada una de la región constante de la cadena ligera y la región Ch1, respectivamente, del fragmento Fab de la primera entidad de fijación mediante una molécula ligadora (véase la Figura 5). Las moléculas ligadoras adecuadas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, polipéptidos cortos. Un ligador adecuado puede incluir un polipéptido corto, que contiene glicina, que confiere flexibilidad, y serina o treonina, que confieren solubilidad. Un ligador adecuado puede comprender unidades Gly4Seri. Por ejemplo, el ligador puede ser (Gly4Seri)x, en donde x es i, 2 o 3. Opcionalmente, el polipéptido ligador tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O:12. En otra forma de realización de los anticuerpos biespecíficos VCVFc, el ligador de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:85, y el ligador de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:86.
En otra forma de realización de los aspectos anteriores de la divulgación, el anticuerpo biespecífico comprende un par de cadenas pesadas que comprenden cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 74 o SEQ ID NO: 84, y un par de cadenas ligeras que comprenden cada una la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. En una forma de realización preferida de la invención, el anticuerpo biespecífico comprende un par de cadenas pesadas, que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:74, y un par de cadenas ligeras, cada una de las cuales comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17.
En otra forma de realización divulgada en el presente documento, un anticuerpo para IL-17A/F (o un fragmento de fijación al antígeno del mismo) o la entidad de unión a IL-17A/F del anticuerpo biespecífico, tal como biAbFabL (véase la Figura 2), un taFab (véase la Fig. 3), un Fc heterodimérico (véase la Fig, 4) o un VCDFc (véase la Fig. 5) se unen a (a) un homodímero de IL-17A con una afinidad de fijación (Kd i) de al menos i x 109 M, al menos 5 x 109 M, al menos i x 1010 M, al menos 5 x 1010 M, al menos 8 x 1010 M o al menos i x 1011 M; (b) un homodímero de IL-17F con una afinidad de fijación (Kdi) de al menos i x 109 M, al menos 5 x 109 M, al menos i x 1010 M, al menos 2 x 1010 M, al menos 3 x l010 M, al menos 4 x 1010 M, al menos 5 x 1010 M o al menos i x 1011 M; y/o (c) un heterodímero de IL-17A/F con una afinidad de fijación (Kdi) de al menos i x 108 M, al menos 5 x 108 M, al menos i x 109 M, al menos 2 x 109 M, al menos 3 x 109 M, al menos 4 x 109 M, al menos 5 x 109 M, al menos 6 x 109 M, al menos 7 x 109 M, al menos 9 x 109 M, al menos i x 1010 M o al menos 5 x 1010 M, en donde la afinidad de fijación se mide mediante resonancia de plasmones superficiales, tal como Biacore.
En otra forma de realización divulgada en el presente documento, un anticuerpo para IL-23p19 (o un fragmento de fijación al antígeno del mismo) o la entidad de fijación a IL-23p19 del anticuerpo biespecífico, tal como biAbFabL (véase la Figura 2), un taFab (véase la Fig. 3), un Fc heterodimérico (véase la Fig. 4), un VCVFc (véase la Fig. 5) o un VCDFc (véase la Fig. 6) se une a IL-23p19 con una afinidad de fijación (Kdi) de al menos i x 10-9 M, al menos 5 x 10-9 M, al menos i x 10-10 M, al menos 2 x 10-10 M, al menos 3 x 10-10 M, al menos 4 x 10-10 M, al menos 5 x 10-10, al menos 6 x 10-10, al menos 7 x 10-10, al menos 8 x 10-10 o al menos 9 x 10-10, al menos i x 10'11, en donde la afinidad de fijación se mide mediante resonancia de plasmones superficiales, tal como Biacore.
En otra forma de realización divulgada en el presente documento, la entidad de fijación a IL-17A/F del anticuerpo biespecífico, tal como biAbFabL (véase la Figura 2), un taFab (véase la Fig. 3), un Fc heterodimérico (véase la Fig. 4), un VCVFc (véase la Fig. 5) o un VCDFc (véase la Fig. 6) se fija a (a) un homodímero de IL-17A con una afinidad de fijación (Kdi) de al menos i x 10-9 M, al menos 5 x 10-9 M, al menos i x 10-10 M, al menos 5 x 10-10 M, al menos 8 x 10-10 M o al menos al menos i x 10'11 M; (b) un homodímero de IL-17F con una afinidad de fijación (Kdi) de al menos i x 10-9 M, al menos 5 x 10-9 M, al menos i x 10-10 M, al menos 2 x 10-10 M, al menos 3 x 10-10 M, al menos 4 x 10-10 M, al menos 5 x 10-10 M o al menos i x 10'11 M; y/o (c) un heterodímero de IL-17A/F con una afinidad de fijación (Kdi) de al menos i x 10-8 M, al menos 5 x 10-8 M, al menos i x 10-9 M, al menos 2 x 10-9 M, al menos 3 x 10-9 M, al menos 4 x 10-9 M, al menos 5 x 10-9 M, al menos 6 x 10-9 M, al menos 7 x 10-9 M, al menos 9 x 10-9 M, al menos i x 10-10 M o al menos 5 x 10-10 M; y la entidad de fijación a IL-23p19 del anticuerpo biespecífico se fija a IL-23p19 con una afinidad de fijación (Kdi) de al menos i x 10-9 M, al menos 5 x 10-9 M, al menos i x 10-10 M, al menos 2 x 10-10 M, al menos 3 x 10-10 M, al menos 4 x 10-10 M, al menos 5 x 10-10, al menos 6 x 10-10, al menos 7 x 10-10, al menos 8 x 10-10 o al menos 9 x 10-10, al menos i x 10'11, en donde la afinidad de fijación se mide mediante resonancia de plasmones superficiales, tales como Biacore.
En otra forma de realización divulgada en el presente documento, un anticuerpo para IL-17A/F (o un fragmento de fijación al antígeno del mismo) o la entidad de fijación a IL-17A/F del anticuerpo biespecífico neutraliza o inhibe (a) la inducción de G-CSF mediante IL-17A en las células epiteliales de las vías aéreas pequeñas (SAEC) humanas primarias con un CI50 de 0,5 pm o menos; (b) la inducción de G-CSF mediante IL-17F en las células epiteliales de las vías aéreas pequeñas (SAEC) humanas primarias con un CI50 de 2,0 nM o menos, 1,5 nM o menos, 1,4 nMo menos, 1,3 nM o menos, 1,2 nM o menos, 1,1 nM o menos, o 1,0 nM o menos; y/o (c) la inducción de G-CSF mediante IL17A/F en las células epiteliales de las vías aéreas pequeñas (SAEC) humanas primarias con un CI50 de 1,3 nM o menos, 1,2 nM o menos, 1,1 nM o menos, 1,0 nM o menos, 0,9 nM o menos, 0,8 nM o menos, 0,7 nM o menos, 0,6 nM o menos, o 0,5 nM o menos.
En otra forma de realización divulgada en el presente documento, un anticuerpo para IL-17A/F (o un fragmento de fijación al antígeno del mismo) o la entidad de fijación a IL-17A/F del anticuerpo biespecífico neutraliza o inhibe (a) la inducción de IL-6 mediante IL-17A en las células de fibroblastos primarios humanos (HFFF) con un CI50 de 0,5 nM o menos, 0,4 nM o menos, 0,3 nM o menos, 0,2 nM o menos, 0,1 nM o menos, 0,09 nM o menos, 0,08 nM o menos, 0,07 nM o menos, 0,06 nM o menos, 0,05 nM o menos, 0,04 nM o menos, 0,03 nM o menos, 0,02 nM o menos, o 0,01 nM o menos; (b) la inducción de IL-6 mediante IL-17F en las células de fibroblastos primarios humanos (HFFF) con un CI50 de 30 nM o menos, 28 nM o menos, 26 nM o menos, 25 nM o menos, 22 nM o menos, 20 nM o menos, 19 nM o menos, 18 nM o menos, 17 nM o menos, 16 nM o menos, 15 nM o menos, 14 nM o menos, 13 nM o menos, 12 nM o menos, 11 nM o menos, o 10 nM o menos; y/o (c) la inducción de IL-6 mediante IL-17A/F en las células de fibroblastos primarios humanos (HFFF) con un CI50 de 30 nM o menos, 28 nM o menos, 26 nM o menos, 22 nM o menos, 20 nM o menos, 18 nM o menos, 17 nM o menos, 16 nM o menos, 15 nM o menos, 14 nM o menos, 13 nM o menos, 12 nM o menos, 11 nM o menos, 10 nM o menos, 9,5 nM o menos, 9,4 nM o menos, 9,3 nM o menos, 9,2 nM 0 menos, 9,1 nM o menos, o 9,0 nM o menos.
En otra forma de realización divulgada en el presente documento, un anticuerpo para IL-23p19 (o un fragmento de fijación al antígeno del mismo) o la entidad de fijación a IL-23p19 del anticuerpo biespecífico neutraliza o inhibe (a) la producción de IL-17A e IL-17F inducida por IL-23 en esplenocitos murinos con un CI50 de 0,5 nM o menos, 0,4 nM o menos, 0,3 nM o menos, 0,2 nM o menos, 0,1 nM o menos, 0,09 nM o menos, 0,08 nM o menos, 0,07 nM o menos, o 0,06 nM o menos.
En otra forma de realización divulgada en el presente documento, un anticuerpo para IL-23p19 (o un fragmento de fijación al antígeno del mismo) o la entidad de fijación a IL-23p19 del anticuerpo biespecífico neutraliza o inhibe la fosforilación de STAT3 inducida por IL-23 en los linfocitos T humanos primarios activados con un CI50 de 0,1 nM o menos, 0,2 nM o menos, 0,3 nM o menos, 0,4 nM o menos, 0,5 nM o menos, 0,8 nM o menos, 0,9 nM o menos, 0,01 nM o menos, 0,02 nM o menos, 0,03 nM o menos, 0,04 nM o menos, o 0,05 nM o menos.
En otra forma de realización divulgada en el presente documento, la entidad de fijación a IL-17A/F del anticuerpo biespecífico, tal como un biAbFabL (véase la Figura 2), un taFab (véase la Fig. 3), un Fc heterodimérico (véase la Fig. 4), un VCVFc (véase la Fig. 5) o un VCDFc (véase la Fig. 6) se fija a (a) un homodímero de IL-17A con una afinidad de fijación (Kdi) de al menos 1 x 10'9 M, al menos 5 x 10'9 M, al menos 1 x 10'1° M, al menos 5 x 10'1° M, al menos 8 x 10'10 M o al menos al menos 1 x 10'11 M; (b) un homodímero de IL-17F con una afinidad de fijación (Kdi) de al menos 1 x 10'9 M, al menos 5 x 10'9 M, al menos 1 x 10'10 M, al menos 2 x 10'10 M, al menos 3 x 10'10 M, al menos 4 x 10'10 M, al menos 5 x 10'10 M o al menos 1 x 10'11 M; y/o (c) un heterodímero de IL-17A/F con una afinidad de fijación (Kdi) de al menos 1 x 10'8 M, al menos 5 x 10'8 M, al menos 1 x 10'9 M, al menos 2 x 10'9 M, al menos 3 x 10'9 M, al menos 4 x 10'9 M, al menos 5 x 10'9 M, al menos 6 x 10'9 M, al menos 7 x 10'9 M, al menos 9 x 10'9 M, al menos 1 x 10'10 M o al menos 5 x 10'10 M. Opcionalmente, la entidad de fijación a IL-23p19 del anticuerpo biespecífico se fija a IL-23p19 con una afinidad de fijación (Kdi) de al menos 1 x 10'9 M, al menos 5 x 10'9 M, al menos 1 x 10'10 M, al menos 2 x 10'10 M, al menos 3 x 10'10 M, al menos 4 x 10'10 M, al menos 5 x 10'1° al menos 6 x 10'1° al menos 7 x 10'1° al menos 8 x 10'10 o al menos 9 x 10'1° al menos 1 x 10-11, en donde la afinidad de fijación se mide mediante resonancia de plasmones superficiales, tales como Biacore. Opcionalmente, la entidad de fijación a IL-17A/F del anticuerpo biespecífico neutraliza o inhibe (a) la inducción de G-CSF mediante IL-17A en las células epiteliales de las vías aéreas pequeñas (SAEC) humanas primarias con un CI50 de 0,5 pm o menos; (b) la inducción de G-CSF mediante IL-17F en las células epiteliales de las vías aéreas pequeñas (SAEC) humanas primarias con un CI50 de 2,0 nM o menos, 1,5 nM o menos, 1,4 nM o menos, 1,3 nM o menos, 1,2 nM o menos, 1,1 nM o menos, o 1,0 nM o menos; y/o (c) la inducción de G-CSF mediante IL-17A/F en las células epiteliales de las vías aéreas pequeñas (SAEC) humanas primarias con un CI50 de 1,3 nM o menos, 1,2 nM o menos, 1,1 nM o menos, 1,0 nM o menos, 0,9 nM o menos, 0,8 nM o menos, 0,7 nM o menos, 0,6 nM o menos, o 0,5 nM o menos. Opcionalmente, la entidad de fijación a IL-17A/F del anticuerpo biespecífico neutraliza o inhibe (a) la inducción de IL-6 mediante IL-17A en las células de fibroblastos primarios humanos (HFFF) con un CI50 de 0,5 nM o menos, 0,4 nM o menos, 0,3 nM o menos, 0,2 nM o menos, 0,1 nM o menos, 0,09 nM o menos, 0,08 nM o menos, 0,07 nM o menos, 0,06 nM o menos, 0,05 nM o menos, 0,04 nM o menos, 0,03 nM o menos, 0,02 nM o menos, o 0,01 nM o menos; (b) la inducción de IL-6 mediante IL-17F en las células de fibroblastos primarios humanos (HFFF) con un CI50 de 30 nM o menos, 28 nM o menos, 26 nM o menos, 25 nM o menos, 22 nM o menos, 20 nM o menos, 19 nM o menos, 18 nM o menos, 17 nM o menos, 16 nM o menos, 15 nM o menos, 14 nM o menos, 13 nM o menos, 12 nM o menos, 11 nM o menos, o 10 nM o menos; y/o (c) la inducción de IL-6 mediante IL-17A/F en las células de fibroblastos primarios humanos (HFFF) con un CI50 de 30 nM o menos, 28 nM o menos, 26 nM o menos, 22 nM o menos, 20 nM o menos, 18 nM o menos, 17 nM o menos, 16 nM o menos, 15 nM o menos, 14 nM o menos, 13 nM o menos, 12 nM o menos, 11 nM o menos, 10 nM o menos, 9,5 nM o menos, 9,4 nM o menos, 9,3 nM o menos, 9,2 nM o menos, 9,1 nM o menos, o 9,0 nM o menos. Opcionalmente, la entidad de fijación a IL-23p19 del anticuerpo biespecífico neutraliza o inhibe la fosforilación de STAT3 inducida por IL-23 en los linfocitos T humanos primarios activados con un CI50 de 0,1 nM o menos, 0,2 nM o menos, 0,3 nM o menos, 0,4 nM o menos, 0,5 nM o menos, 0,8 nM o menos, 0,9 nM o menos, 0,01 nM o menos, 0,02 nM o menos, 0,03 nM o menos, 0,04 nM o menos, o 0,05 nM o menos.
En otra forma de realización divulgada en el presente documento, el anticuerpo biespecífico comprende un par de cadenas pesadas que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28 y un par de cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17 en la presente se denomina "biAb1", ""bAb1" o "23/17bAb1". Un anticuerpo biespecífico que comprende un par de cadenas pesadas, cada una de las cuales comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18, y un par de cadenas ligeras, cada una de las cuales comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17, en la presente se denomina "biAb2", "bAb2" o "23/17bAb2". Un anticuerpo biespecífico que comprende un par de cadenas pesadas, cada una de las cuales comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:74, y un par de cadenas ligeras, cada una de las cuales comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17, en la presente se denomina "biAb3", "bAb3" o "23/17bAb3". Un anticuerpo biespecífico que comprende un par de cadenas pesadas, cada una de las cuales comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29, y un par de cadenas ligeras, cada una de las cuales comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17, en la presente se denomina "biAb3", "bAb3" o "23/17bAb3".
En otra forma de realización divulgada en el presente documento, el anticuerpo biespecífico comprende un par de cadenas pesadas, cada una de las cuales comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:77, y un par de cadenas ligeras, cada una de las cuales comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:79, en la presente se denomina "taFab1".
En otra forma de realización divulgada en el presente documento, el anticuerpo biespecífico que comprende una cadena pesada de IL-23 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:63, una cadena pesada de IL-17A/F que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:65 y un par de cadenas ligeras, cada una de las cuales comprende la secuencia de SEQ ID NO:17, en la presente se denomina "hetero1". En otra forma de realización, el anticuerpo biespecífico que comprende una cadena pesada de IL-23 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:61, una cadena pesada de IL-17A/F que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:81 y un par de cadenas ligeras, cada una de las cuales comprende la secuencia de SEQ ID NO:17, en la presente se denomina "hetero2".
En otra forma de realización divulgada en el presente documento, el anticuerpo biespecífico en el formato VCVFc (véase la Figura 5) tiene un par de cadenas pesadas, en donde cada una comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:88 y un par de cadenas ligeras, en donde cada una comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:90, o un par de cadenas pesadas, en donde cada una comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:92 y un par de cadenas ligeras, en donde cada una comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:94, o un par de cadenas pesadas, en donde cada una comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:96 y un par de cadenas ligeras, en donde cada una comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:90, o un par de cadenas pesadas, en donde cada una comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:98 y un par de cadenas ligeras, en donde cada una comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:94, o un par de cadenas pesadas, en donde cada una comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:100 y un par de cadenas ligeras, en donde cada una comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:102, o un par de cadenas pesadas, en donde cada una comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:104 y un par de cadenas ligeras, en donde cada una comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:106, o un par de cadenas pesadas, en donde cada una comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:112 y un par de cadenas ligeras, en donde cada una comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:114, o un par de cadenas pesadas, en donde cada una comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:116 y un par de cadenas ligeras, en donde cada una comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:118.
En otra forma de realización de los aspectos anteriores de la invención, un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de fijación al antígeno de este que se fija específicamente a IL-17A (SEQ ID NO:2) e IL-17F (SEQ ID NO:4) comprende un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO:13 y un dominio variable de la cadena ligera comprende los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO:9. Opcionalmente, el anticuerpo monoclonal comprende una región constante humana, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La región constante humana IgG4 puede tener una mutación serina a prolina en la posición 241 de acuerdo con Kabat. Opcionalmente, la cadena pesada comprende los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO:16, 18, 28, 29 o 74. Opcionalmente, la cadena ligera comprende los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO:17. Opcionalmente, la cadena pesada comprende los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO:16, 18, 28, 29 o 74, y la cadena ligera comprende los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO:17. Opcionalmente, un anticuerpo biespecífico comprende el anticuerpo monoclonal.
Las regiones constantes de la cadena pesada y de la cadena ligera incluyen IgG1.1 (SEQ ID NO:11, que puede ser codificada por SEQ ID NO:82), IgG1.1f sin lisina del terminal C (SEQ ID NO:127), IgG1.1f con una lisina del terminal C (SEQ ID NO:128), región constante kappa humana (SEQ ID No :10, que puede ser codificada por SEQ ID NO:83), o IgG4.1 (SEQ ID NO:8). El dominio constante de la cadena pesada de IgG4 puede incluir una variante de IgG4 de tipo silvestre que tiene una mutación en la región bisagra, S228P (sistema de numeración del índice de la UE) o S241P (sistema de numeración Kabat). El cambio de serina en 241 (Kabat) a prolina (que se encuentra en esa posición en IgG1 e IgG2) en una cadena pesada quimérica de ratón/humana genera la producción de un anticuerpo homogéneo y elimina la heterogeneidad. Además, la variante de IgG4 tiene una vida media sérica considerablemente extendida y muestra una mejor distribución del tejido en comparación con la IgG4 quimérica original. Angal et al., Molecular Immunology, 30(1):105-108 (1993); Schuurman et al., Molecular Immunology, 38:1-8 (2001); Lewis et al., Molecular Immunology, 46:3488-3494 (2009).
En otra forma de realización divulgada en el presente documento, un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de fijación al antígeno de este que se fija específicamente a IL-23p19 (SEQ ID NO:6) comprende un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO:7, y en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO:9. Opcionalmente, el anticuerpo monoclonal comprende una región constante humana, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Opcionalmente, la región constante humana IgG4 tiene una mutación serina a prolina en la posición 241 de acuerdo con Kabat. Opcionalmente, la cadena pesada comprende los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO:16, 18, 28, 29 o 74. Opcionalmente, la cadena ligera comprende los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO:17. Opcionalmente, la cadena pesada comprende los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO:16, 18, 28, 29 o 74, y la cadena ligera comprende los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO:17. Opcionalmente, un anticuerpo biespecífico comprende el anticuerpo monoclonal.
En otra forma de realización divulgada en el presente documento, el anticuerpo, el anticuerpo biespecífico o el fragmento de fijación al antígeno de este se fijan específicamente a IL-23p19, en donde el anticuerpo o el fragmento de fijación al antígeno de este se fijan a un epítopo discontinuo en IL-23p19 que comprende un primer epítopo y un segundo epítopo, en donde el primer epítopo consiste en al menos un aminoácido de los residuos de aminoácidos 33­ 59 de SEQ ID NO:6 y el segundo epítopo consiste en al menos un aminoácido de los residuos de aminoácidos 89-125 de SEQ ID NO:6. Opcionalmente, el anticuerpo, el anticuerpo biespecífico o un fragmento de fijación al antígeno de este se fijan al menos al residuo de aminoácido 54 de SEQ ID NO:6 del primer epítopo. Opcionalmente, el anticuerpo, el anticuerpo biespecífico o un fragmento de fijación al antígeno de este se fijan al menos al residuo de aminoácido 55 de SEQ ID NO:6 del primer epítopo. Opcionalmente, el anticuerpo, el anticuerpo biespecífico o un fragmento de fijación al antígeno de este se fijan al menos a los residuos de aminoácidos 54 y 55 de SEQ ID NO:6 del primer epítopo. Opcionalmente, el anticuerpo, el anticuerpo biespecífico o un fragmento de fijación al antígeno de este se fijan al menos al residuo de aminoácido 116 de SEQ ID NO:6 del segundo epítopo. Opcionalmente, el anticuerpo, el anticuerpo biespecífico o un fragmento de fijación al antígeno de este se fijan al menos a los residuos de aminoácidos 54 y 55 de SEQ ID NO:6 del primer epítopo, y al menos al residuo de aminoácido 116 de SEQ ID NO:6 del segundo epítopo.
En otra forma de realización divulgada en el presente documento, el anticuerpo, el anticuerpo biespecífico o un fragmento de fijación al antígeno de este se fijan específicamente a IL-23p19, en donde el anticuerpo o el fragmento de fijación al antígeno se fijan a un epítopo discontinuo en IL-23p19 que comprende un primer epítopo y un segundo epítopo, en donde el anticuerpo o el fragmento de fijación al antígeno se fijan al menos a los residuos de aminoácidos 54 y 55 de SEQ ID NO:6 del primer epítopo, y al menos al residuo de aminoácido 116 de SEQ ID NO:6 del segundo epítopo.
En otra forma de realización divulgada en el presente documento, una entidad de fijación a IL-17A/F se fija específicamente a IL-17A (homodímero de IL-17A/IL-17A y heterodímero de IL-17A/IL-17F) en el epítopo que comprende al menos el residuo de aminoácido 108 (Tyr) de SEQ ID NO:2, en donde la entidad de fijación a IL-17A/F es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de fijación al antígeno de este. Opcionalmente, el epítopo en IL-17A se determina mediante mutagénesis de alanina y/o cristalografía de rayos X. El epítopo en el cual la entidad de fijación a IL-17A/F se fija a IL-17A puede ser un epítopo continuo o discontinuo.
En otra forma de realización divulgada en el presente documento, el anticuerpo monoclonal de reacción cruzada con IL-17A/F o un fragmento de fijación al antígeno de este se fija a IL-17A en un epítopo que comprende al menos el residuo de aminoácido 108 (Tyr) de SEQ ID NO:2. Opcionalmente, el epítopo en IL-17A se determina mediante mutagénesis de alanina y/o cristalografía de rayos X. El epítopo en el cual el anticuerpo monoclonal de reacción cruzada con IL-17A/F o un fragmento de fijación al antígeno de este se fijan a IL-17A puede ser un epítopo continuo o discontinuo.
Los anticuerpos biespecíficos de la invención se pueden usar solos o como inmunoconjugados con un agente citotóxico. En algunas formas de realización, el agente es un agente quimioterapéutico. En algunas formas de realización, el agente es un radioisótopo, que incluye, entre otros, plomo-212, bismuto-212, astatina-211, yodo-131, escandio-47, renio-186, renio-188, itrio-90, yodo-123, yodo-125, bromo-77, indio-111 y núclidos que se pueden someter a fisión, tales como boro-10 o una actinida. En otras formas de realización, el agente es una toxina o un fármaco citotóxico, que incluye, entre otros, ricina, abrina, enterotoxina A de Pseudomonas modificada, exotoxina de Pseudomonas, calicheamicina, adriamicina, 5-fluorouracilo, toxina difteria y similares. En la literatura se conocen los métodos de conjugación de los anticuerpos con esos agentes e incluyen la conjugación directa e indirecta.
Las moléculas detectables adecuadas pueden unirse directa o indirectamente a los anticuerpos de la presente invención. moléculas detectables adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Para la unión indirecta de una molécula detectable o citotóxica, la molécula detectable o citotóxica se puede conjugar con un miembro de un par complementario/anticomplementario, en donde el otro miembro se fija a la porción de anticuerpo o polipéptido de fijación. Para estos fines, la biotina/estreptavidina es un ejemplo de un par complementario/anticomplementario.
Los anticuerpos biespecíficos, anticuerpos y fragmentos de fijación al antígeno de la invención también incluyen derivados que se modifican, por ejemplo, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo, de modo que esa unión covalente no evite que el anticuerpo se fije a su epítopo. Los ejemplos de derivados adecuados incluyen, entre otros, anticuerpos fucosilados, anticuerpos glucosilados, anticuerpos acetilados, anticuerpos pegilados, anticuerpos fosforilados y anticuerpos amidados. Los anticuerpos y sus derivados de la invención pueden derivatizarse por sí mismos mediante grupos de protección/bloqueo conocidos, escisión proteolítica, enlaces con un ligando celular u otras proteínas, y similares. En algunas formas de realización de la invención, al menos una cadena pesada del anticuerpo es fucosilada. En algunas formas de realización, la fucosilación está ligada a N. En algunas formas de realización preferidas, al menos una cadena pesada del anticuerpo comprende un oligosacárido fucosilado ligado a N.
Los anticuerpos biespecíficos anticuerpos y fragmentos de fijación al antígeno de la invención incluyen variantes dentro del alcance de las reivindicaciones que tienen sustituciones, eliminaciones, adiciones o reemplazos de aminoácidos simples o múltiples que conservan las propiedades biológicas (por ejemplo, bloquear la fijación de IL-17A o IL-17F y/o IL-23 a sus respectivos receptores, inhibir la actividad biológica de IL-17A, IL-17F e IL-23) de los anticuerpos de la invención. La persona del oficio de nivel medio puede producir variantes que tienen sustituciones, eliminaciones, adiciones o reemplazos de aminoácidos simples o múltiples. Estas variantes pueden incluir, entre otras: (a) variantes en las que uno o más residuos de aminoácidos se sustituyen con aminoácidos conservados o no conservados, (b) variantes en las que se agregan uno o más aminoácidos al polipéptido o se eliminan de él, (c) variantes en las que uno o más aminoácidos incluyen un grupo sustituyente, y (d) variantes en las que el polipéptido se fusiona con otro péptido o polipéptido, tal como un socio de fusión, una etiqueta de proteína u otra porción química, que pueden conferir al polipéptido propiedades útiles, tales como un epítopo para un anticuerpo, una secuencia de polihistidina, una porción de biotina y similares. Los anticuerpos de la invención como se define en las reivindicaciones pueden incluir variantes en las que los residuos de aminoácidos de una especie se sustituyen con el residuo correspondiente en otra especie, ya sea en las posiciones conservadas o no conservadas. En otra forma de realización, los residuos de aminoácidos en las posiciones no conservadas se sustituyen con residuos conservados o no conservados. La persona del oficio de nivel medio conoce las técnicas para obtener estas variantes, que incluyen técnicas genéticas (supresiones, eliminaciones, mutaciones, etc.), químicas y enzimáticas.
La invención también incluye ácidos nucleicos aislados como se define en las reivindicaciones que codifican los anticuerpos biespecíficos de la invención, que incluyen, por ejemplo, la cadena ligera, la región variable de la cadena ligera, la región constante de la cadena ligera, la cadena pesada, la región variable de la cadena pesada, la región constante de la cadena pesada, ligadores y todos los componentes y las combinaciones de estos de los anticuerpos biespecíficos descritos en la presente. Los ácidos nucleicos de la invención incluyen ácidos nucleicos que tienen al menos 80 %, con mayor preferencia, al menos alrededor de 90 %, con mayor preferencia, al menos alrededor de 95 % y, con máxima preferencia, al menos alrededor de 98 % de homología con los ácidos nucleicos de la invención. Las expresiones "porcentaje de similitud", "porcentaje de identidad" y "porcentaje de homología", cuando se refieren a una secuencia particular, se usan como lo indica el programa de software GCG® de la Universidad de Wisconsin. Los ácidos nucleicos de la invención también incluyen ácidos nucleicos complementarios. En algunos casos, las secuencias serán totalmente complementarias (sin errores de apareamiento) cuando estén alineadas. En otros casos, puede haber hasta alrededor de 20 % de errores de apareamiento en las secuencias. En algunas formas de realización de la invención se proveen ácidos nucleicos que codifican una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo de la invención.
Los ácidos nucleicos de la invención se pueden clonar en un vector, tal como un plásmido, cósmido, bácmido, fago, cromosoma artificial (BAC, YAC) o virus, en el cual se puede insertar otra secuencia genética o elemento (ADN o ARN), a fin de producir la replicación de la secuencia o del elemento unidos. En algunas formas de realización, el vector de expresión contiene un segmento promotor constitutivamente activo (tal como secuencias de CMV, SV40, factor de alargamiento o LTR) o una secuencia del promotor inducible, tal como el vector pIND inducible por esteroides (Invitrogen), en donde se puede regular la expresión del ácido nucleico. Los vectores de expresión de la invención también pueden comprender secuencias reguladoras, por ejemplo, un sitio interno de entrada al ribosoma. El vector de expresión se puede introducir en una célula, por ejemplo, mediante transfección.
Por eso, en otra forma de realización, la presente invención provee un vector de expresión como se define en las reivindicaciones que comprende los siguientes elementos ligados operativamente: un promotor de la transcripción; una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo biespecífico de la invención; y un terminador de la transcripción. En otra forma de realización, la presente invención provee un vector de expresión como se define en las reivindicaciones que comprende los siguientes elementos ligados operativamente: un promotor de la transcripción; una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo biespecífico de la invención y un terminador de la transcripción. También se proveen células huésped recombinantes que comprenden dichos vectores y expresan las cadenas pesadas y livianas.
En otra forma de realización, la presente invención provee un vector de expresión como se define en las reivindicaciones que comprende los siguientes elementos ligados operativamente: un promotor de la transcripción; una primera molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo biespecífico, anticuerpo o fragmento de fijación al antígeno de la invención ; una segunda molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo biespecífico, anticuerpo o fragmento de fijación al antígeno de la invención; y un terminador de la transcripción. En otra forma de realización, la presente invención provee un vector de expresión como se define en las reivindicaciones que comprende los siguientes elementos ligados operativamente: un primer promotor de la transcripción; una primera molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo biespecífico de la invención; un primer terminador de la transcripción; un segundo promotor de la transcripción; una segunda molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo biespecífico, de la invención; y un segundo terminador de la transcripción. También se proveen células huésped recombinantes que comprenden dichos vectores y expresan las cadenas pesadas y livianas.
Se pueden usar células productoras de anticuerpos que contienen un ácido nucleico que codifica la cadena pesada y un ácido nucleico que codifica la cadena ligera de los anticuerpos biespecíficos, los anticuerpos o los fragmentos de fijación al antígeno de la invención para producir los anticuerpos biespecíficos, los anticuerpos o los fragmentos de fijación al antígeno de acuerdo con las técnicas conocidas en el estado de la técnica. En una forma de realización, la presente invención provee un método para producir un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo o un fragmento de fijación al antígeno de la invención, que comprende cultivar una célula huésped recombinante que expresa las cadena pesada y ligera y aislar el anticuerpo biespecífico, anticuerpo o fragmento de fijación al antígeno producido por la célula como se define en las reivindicaciones.
La célula huésped recombinante puede ser una célula procariótica, por ejemplo, una célula de E. coli, o una célula eucariótica, por ejemplo, una célula de mamífero o una célula de levadura. Las células de levadura incluyen células de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y Pichia pastoris. Las células de mamíferos incluyen células VERO, células HeLa, células de ovario de hámster chino (CHO), células W138, células de riñón de hámster bebé (BHK), células COS-7, células MDCK, línea celular de riñón embrionario humano 293, líneas celulares de riñón de perro normal, líneas celulares de riñón de gato normal, células de riñón de mono, células de riñón de mono verde africano, células COS, células G8 de mioblastos de ratón no oncógenos, líneas celulares de fibroblastos, líneas celulares de mieloma, células NIH/3T3 de ratón, células LMTK31, células de Sertoli de ratón, células del carcinoma del cuello uterino humano, células de hígado de ratas búfalo, células de pulmón humano, células de hígado humano, células de tumores de mama de ratón, células TRI, células MRC 5 y células FS4. Las células productoras de anticuerpos de la invención también incluyen cualquier línea celular de expresión de insecto conocida, tal como las células de Spodoptera frugiperda. En una forma de realización preferida, las células son células de mamíferos. En otra forma de realización preferida, las células de mamíferos son células CHO.
Preferentemente, las células productoras de anticuerpos están sustancialmente libres de competidores de fijación a IL-17A, IL-17F e IL-23. En formas de realización preferidas, las células productoras de anticuerpos comprenden menos de alrededor de 10 %, preferentemente, menos de alrededor de 5 %, con mayor preferencia, menos de alrededor de 1 %, con mayor preferencia, menos de alrededor de 0,5 %, con mayor preferencia, menos de alrededor de 0,1 % y, con máxima preferencia, 0% en peso de competidores de fijación a IL-17A, IL-17F o IL-23. En algunas formas de realización, los anticuerpos producidos por las células productoras de anticuerpos están sustancialmente libres de competidores de IL-17A, IL-17F e IL-23. En formas de realización preferidas, los anticuerpos producidos por las células productoras de anticuerpos comprenden menos de alrededor de 10 %, preferentemente, menos de alrededor de 5 %, con mayor preferencia, menos de alrededor de 1 %, con mayor preferencia, menos de alrededor de 0,5 %, con mayor preferencia, menos de alrededor de 0,1 % y, con máxima preferencia, 0 % en peso de competidores de fijación a IL-17 e IL-23.
En el estado de la técnica se conocen métodos de purificación de anticuerpos. En algunas formas de realización divulgadas en el presente documento, los métodos para la purificación de anticuerpos incluyen filtración, cromatografía de columna de afinidad, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de intercambio aniónico y concentración. La etapa de filtración comprende, preferentemente, ultrafiltración y, con mayor preferencia, ultrafiltración y diafiltración. La filtración se realiza, preferentemente, al menos alrededor de 5-50 veces, con mayor preferencia, de 10 a 30 veces y, con máxima preferencia, de 14 a 27 veces. La cromatografía de columna de afinidad se puede realizar, por ejemplo, usando cromatografía de afinidad PROSEP® (Millipore, Billerica, Mass.). En una forma de realización preferida, la etapa de cromatografía de afinidad comprende cromatografía en columna PROSEP®-vA. El eluato se puede lavar en un detergente solvente. La cromatografía de intercambio catiónico puede incluir, por ejemplo, cromatografía de intercambio catiónico SP-Sepharose. La cromatografía de intercambio aniónico puede incluir, por ejemplo, intercambio aniónico de flujo rápido Q-Sepharose. Preferentemente, la etapa de intercambio aniónico no es de fijación, lo que permite la eliminación de contaminantes, que incluyen ADN y BSA. Preferentemente, el producto de anticuerpo se nanofiltra, por ejemplo, usando un nanofiltro Pall DV 20. El producto de anticuerpo se puede concentrar, por ejemplo, usando ultrafiltración y diafiltración. El método también puede comprender una etapa de cromatografía de exclusión por tamaño para retirar los agregados.
Los anticuerpos biespecíficos, los anticuerpos o los fragmentos de fijación al antígeno también se pueden producir mediante otros métodos conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo, mediante acoplamiento químico de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos.
Los anticuerpos biespecíficos, los anticuerpos o los fragmentos de fijación al antígeno de la presente invención son útiles, por ejemplo, para la inhibición de citocinas proinflamatorias, tales como IL-17A, IL-17F e IL-23/p19. Los anticuerpos se pueden usar para reducir, limitar, neutralizar o bloquear los efectos proinflamatorios del homodímero de IL-17A, el homodímero de IL-17F y/o el heterodímero de IL-17A/F. Asimismo, los anticuerpos se pueden usar para reducir, limitar, neutralizar o bloquear los efectos procancerosos del homodímero de IL-17A, del homodímero de IL-17F o del heterodímero de IL-17A/F. En esos casos, la porción anti-IL-23p19 del anticuerpo se usa para reducir, limitar, neutralizar o bloquear la producción de nuevos linfocitos T que producirían IL-17A y/o IL-17F, incluidos los homodímeros y heterodímeros. Los anticuerpos biespecíficos, los anticuerpos o los fragmentos de fijación al antígeno descritos en la presente se pueden usar para tratar trastornos inflamatorios y enfermedades autoinmunitarias, tales como esclerosis múltiple, (por ejemplo, esclerosis múltiple con recidiva-remisión, esclerosis múltiple progresiva secundaria, esclerosis múltiple progresiva primaria y esclerosis múltiple progresiva con recidiva), fibrosis quística, enfermedad intestinal inflamatoria, psoriasis, esclerosis sistémica, lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, nefropatía por IgA, enfermedad renal diabética, enfermedad por cambios mínimos (nefrosis lipoidea), glomerulosclerosis focal y segmentaria (GEFS), fibrosis sistémica nefrogénica (FSN), dermopatía fibrosante nefrogénica, hepatitis colestásica fibrosante, fascitis eosinofílica (síndrome de Shulman), escleromixedema (mucinosis popular), esclerodermia, liquen escleroso y atrófico, síndrome de POEM (síndrome de Crow-Fukase, enfermedad de Takatsuki o síndrome de PEP), síndrome nefrótico, enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD, forma siglada de graft-versus-host-disease), enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD) (de un trasplante, tal como de sangre, médula ósea, riñón, páncreas, hígado, hígado ortotópico, pulmón, corazón, intestino, intestino delgado, intestino grueso, timo, células madre de aloinjerto, aloinjerto de menor intensidad, hueso, tendón, córnea, piel, válvulas cardíacas, venas, arterias, vasos sanguíneos, estómago y testículo), vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA) (AAV), arteritis de células gigantes y enfermedad osteolítica inducida por mieloma múltiple. Los anticuerpos biespecíficos, los anticuerpos o los fragmentos de fijación al antígeno descritos en la presente también se pueden usar para tratar el cáncer, lo que incluye angiogénesis.
Los anticuerpos biespecíficos, los anticuerpos o los fragmentos de fijación al antígeno de la presente invención inhiben la actividad de IL-17A y/o IL-17F e IL-23 (mediante la subunidad p19) y, por lo tanto, inhiben la producción, el mantenimiento y la actividad de linfocitos T (Th17) productores de IL-17, IL-17A e IL-17F nuevos y existentes. La invención también se refiere al uso de los anticuerpos biespecíficos, los anticuerpos o los fragmentos de fijación al antígeno de la presente invención como se define en las reivindicaciones para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias caracterizadas por la presencia de niveles elevados de IL-17A, IL-17F y/o IL-23, y para el tratamiento de tipos de cáncer caracterizados por la presencia de niveles elevados de IL-17A, IL-17F y/o IL-23.
Los anticuerpos biespecíficos, los anticuerpos o los fragmentos de fijación al antígeno de la presente invención pueden bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de IL-17A, IL-17F (lo que incluye homodímeros y heterodímeros) e IL-23/p19 y, por eso, son más convenientes que otras terapias que solo se dirigen a una o dos de estas tres citocinas.
Por lo tanto, los anticuerpos son útiles para:
(1) Bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la señalización mediante IL-17A o IL-17F e IL-23 para el tratamiento de cáncer, inflamación aguda y enfermedades inflamatorias crónicas, tales como enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome del colon irritable (IBS), fibrosis quística, colitis crónica, síndrome de Sjogren, esplenomegalia, inflamación en enfermedad renal crónica (CKD), psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide y otras enfermedades asociadas a la inducción de la respuesta de fase aguda. (2) Bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la señalización mediante IL-17A, IL-17F o IL-23 para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, tales como diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM), esclerosis múltiple (MS) (por ejemplo, esclerosis múltiple con recidiva-remisión, esclerosis múltiple progresiva secundaria, esclerosis múltiple progresiva primaria y esclerosis múltiple progresiva con recidiva), lupus eritematoso sistémico (SLE), miastenia grave, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, IBS e IBD para prevenir o inhibir la señalización en las células inmunitarias (por ejemplo, linfocitos, monocitos, leucocitos) por medio de sus receptores (por ejemplo, IL-23Ra, IL-12Rp1, IL-17RA e IL-17RC). El bloqueo, la inhibición, la reducción o la antagonización de la señalización mediante IL-23Ra, IL-12Rp1, IL-17RA e IL-17RC, usando los anticuerpos de la presente invención, también son beneficiosos contra enfermedades del páncreas, del riñón y de las células pituitarias y neuronales y pueden ser útiles para tratar IDDM, diabetes mellitus no insulinodependiente (NIDDM), pancreatitis y carcinoma pancreático.
Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos, los anticuerpos o los fragmentos de fijación al antígeno de la presente invención son útiles para el tratamiento terapéutico de enfermedades inflamatorias, en particular, como antagonistas de IL-17A, IL-17F e IL-23/p19, y para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, tales como esclerosis múltiple (MS) (por ejemplo, esclerosis múltiple con recidiva-remisión, esclerosis múltiple progresiva secundaria, esclerosis múltiple progresiva primaria y esclerosis múltiple progresiva con recidiva), enfermedad intestinal inflamatoria (IBD) y cáncer. Estos antagonistas son capaces de fijar, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar IL-17A, IL-17F, sus homodímeros y heterodímeros, e IL-23 (mediante p19) (ya sea en forma individual o conjunta) para el tratamiento de dermatitis atópica y por contacto, esclerosis sistémica, lupus eritematoso sistémico (SLE), vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA) (AAV), arteritis de células gigantes, esclerosis múltiple (MS) (por ejemplo, esclerosis múltiple con recidiva-remisión, esclerosis múltiple progresiva secundaria, esclerosis múltiple progresiva primaria y esclerosis múltiple progresiva con recidiva), colitis, endotoxinemia, artritis, artritis reumatoide (RA), síndrome de Sjogren, artritis psoriásica, enfermedad respiratoria adulta (ARD, forma siglada de adult respiratory disease), choque séptico, insuficiencia multiorgánica, lesiones pulmonares inflamatorias, tales como fibrosis pulmonar idiopática, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), hiperreactividad de las vías aéreas, bronquitis crónica, asma alérgica, psoriasis, eccema, IBS y enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), tal como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, infección por Helicobacterpylori, nefritis lúpica, nefropatía por IgA, enfermedad renal diabética, enfermedad por cambios mínimos (nefrosis lipoidea), glomerulosclerosis focal y segmentaria (GEFS), fibrosis sistémica nefrogénica (FSN), dermopatía fibrosante nefrogénica, hepatitis colestásica fibrosante, fascitis eosinofílica (síndrome de Shulman), escleromixedema (mucinosis popular), esclerodermia, liquen escleroso y atrófico, síndrome de POEM (síndrome de Crow-Fukase, enfermedad de Takatsuki o síndrome de PEP), síndrome nefrótico, rechazo al trasplante, enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD), enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD) (de un trasplante, tal como de sangre, médula ósea, riñón, páncreas, hígado, hígado ortotópico, pulmón, corazón, intestino, intestino delgado, intestino grueso, timo, células madre de aloinjerto, aloinjerto de menor intensidad, hueso, tendón, córnea, piel, válvulas cardíacas, venas, arterias, vasos sanguíneos, estómago y testículo), adherencias y/o abscesos intraabdominales causados por inflamación peritoneal (por ejemplo, por infecciones, lesiones, etc.), síndrome nefrótico, fibrosis quística (Tan, H. L. et al., American Journal o f Respiratory and Critical Care Medicine, 184(2):252-258 (2011)), enfermedad osteolítica (por ejemplo, enfermedad osteolítica inducida por mieloma múltiple) (Sotomayor, E. M., Blood, 116(18):3380-3382 (2010)), rechazo al aloinjerto de órganos, artritis inducida por la pared celular estreptocócica (SCW, forma siglada de streptococcal cell wall), osteoartritis, gingivitis/periodontitis, queratitis herpética estromal, reestenosis, enfermedad de Kawasaki, degeneración macular relacionada con la edad (AMD, forma siglada de age-related macular degeneration; por ejemplo, AMD húmeda y AMD seca) (Wei, Lai et al., Cell Reports, 2:1151-1158 (29 de noviembre de 2012), enfermedades renales inmunitarias, fibrosis hepática (Meng, F. et al., Gastroenterology, 143:765-776 (2012), fibrosis pulmonar (Meng, Fanli et al., Gastroenterology, 143:765-776 (2012), enfermedades hepatobiliares, miocarditis (Ding, H. S., Mol. Biol. Rep., 39(7):7473-7478 (14 de febrero de 2012); Valente, A. J. et al., Cellular Signalling, 24:560-568 (2012)), fibrosis cardíaca (Valente, A. J. et al., Cellular Signalling, 24:560-568 (2012)), reestructuración cardíaca adversa (Valente, A. J. et al., Cellular Signalling, 24:560-568 (2012)), ateroesclerosis (Ding, H.S., Mol. Biol. Rep., 39(7):7473-7478 (Feb. 14, 2012), lesión cardíaca por isquemia/revascularización (Ding, H.-S., Mol. Biol. Rep., 39(7):7473-7478 (14 de febrero de 2012), insuficiencia cardíaca (Ding, H.-S., Mol. Biol. Rep., 39(7):7473-7478 (14 de febrero de 2012) y cáncer/enfermedades neoplásicas que se caracterizan por la expresión de IL-17 y/o IL-23, lo que incluye, entre otros, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de colon, cáncer de ovarios y cáncer de cuello uterino y leucemias (Tartour et al, 59:3698 (1999); Kato et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 282:735 (2001); Steiner et al., Prostate, 56:171 (2003); Langowksi et al., Nature, 10 de mayo [publicación electrónica antes de la impresión], (2006)).
Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos, los anticuerpos o los fragmentos de fijación al antígeno de la presente invención son útiles, por ejemplo, como antagonistas de IL-17A, IL-17F e IL-23/p19, para el tratamiento terapéutico de enfermedades inflamatorias, en particular, para el tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA, que es una enfermedad viral con un componente autoinmunitario), alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolipídico, enfermedad autoinmunitaria de Addison, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, enfermedad autoinmunitaria del oído interno (AIED), síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS), púrpura trombocitopénica autoinmunitaria (ATP), enfermedad de Behcet, miocardiopatía, dermatitis hepetiforme celíaca; síndrome de fatiga crónica y disfunción inmunitaria (CFIDS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIPD), penfigoide cicatricial, enfermedad de la aglutinina fría, síndrome de CREST, enfermedad de Degos, dermatomiositis juvenil, lupus discoide (por ejemplo, lupus eritematoso discoide en la infancia, lupus eritematoso discoide generalizado y lupus eritematoso discoide localizado), lupus eritematoso de sabañones, síndrome de superposición de liquen plano con lupus eritematoso, paniculitis lúpica asociada a lupus eritematoso, lupus eritematoso tumidus, lupus eritematoso cutáneo verrucoso, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso cutáneo subagudo, lupus eritematoso cutáneo agudo, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía por IgA, diabetes mellitus insulinodependiente, artritis crónica juvenil (enfermedad de Still), artritis reumatoide juvenil, artritis reumatoide (RA), enfermedad de Meniere, enfermedad del tejido conectivo mixto, esclerosis múltiple (MS) (por ejemplo, esclerosis múltiple con recidiva-remisión, esclerosis múltiple progresiva secundaria, esclerosis múltiple progresiva primaria y esclerosis múltiple progresiva con recidiva), miastenia grave, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirroris biliar primaria, eccema, psoriasis, artritis psoriásica, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, enfermedad respiratoria adulta (ARD), fiebre reumática, artritis, sarcoidosis, esclerodermia (por ejemplo, esclerosis sistémica progresiva (PSS), también conocida como esclerosis sistémica (SS)), síndrome de Sjogren, síndrome de la persona rígida, lupus eritematoso sistémico (SLE), vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA) (AAV), arteritis de células gigantes, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, endotoxia, sepsis o choque séptico, síndrome de choque tóxico, insuficiencia multiorgánica, lesión pulmonar inflamatoria, tal como fibrosis pulmonar idiopática, colitis, enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), tal como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, síndrome del colon irritable (IBS), uveítis, vitiligo, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Alzheimer, alergia atópica, alergia, asma, arma bronquial, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), hiperreactividad de las vías aéreas, asma alérgica, glomerulonefritis, anemias hemolíticas, infección por Helicobacterpylori, adherencias y/o abscesos intraabdominales causados por inflamación peritoneal (por ejemplo, por infecciones, lesiones, etc.), síndrome nefrótico, polineuropatía desmielinizante idiopática, síndrome de Guillain-Barré, rechazo al aloinjerto de órganos, nefritis lúpica, nefropatía por IgA, enfermedad renal diabética, enfermedad por cambios mínimos (nefrosis lipoideas), glomerulosclerosis focal y segmentaria (GEFS), fibrosis sistémica nefrogénica (FSN), dermopatía fibrosante nefrogénica, hepatitis colestásica fibrosante, fascitis eosinofílica (síndrome de Shulman), escleromixedema (mucinosis popular), esclerodermia, liquen escleroso y atrófico, síndrome de POEM (síndrome de Crow-Fukase, enfermedad de Takatsuki o síndrome de PEP), síndrome nefrótico, enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD), enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD) (de un trasplante, tal como de sangre, médula ósea, riñón, páncreas, hígado, hígado ortotópico, pulmón, corazón, intestino, intestino delgado, intestino grueso, timo, células madre de aloinjerto, aloinjerto de menor intensidad, hueso, tendón, córnea, piel, válvulas cardíacas, venas, arterias, vasos sanguíneos, estómago y testículo), enfermedad osteolítica (por ejemplo, enfermedad osteolítica inducida por mieloma múltiple), fibrosis quística, degeneración macular relacionada con la edad (AMD; por ejemplo, AMD húmeda y AMD seca), fibrosis hepática, fibrosis pulmonar, ateroesclerosis, lesión cardíaca por isquemia/revascularización, insuficiencia cardíaca, miocarditis, fibrosis cardíaca, reestructuración cardíaca adversa, retinopatía diabética y lesión pulmonar inducida por la ventilación mecánica.
En consecuencia, en una forma de realización, la presente divulgación provee un método para inhibir una o más citocinas proinflamatorias, por ejemplo, IL-17A, IL-17F e IL-23, en un mamífero que necesita dicho tratamiento, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo o un fragmento de fijación al antígeno a un mamífero que necesita el tratamiento. En una forma de realización preferida, el mamífero es un ser humano. El método se puede usar para tratar un trastorno caracterizado por la expresión elevada de IL-17A, IL-17F o IL-23. El anticuerpo biespecífico, el anticuerpo o el fragmento de fijación al antígeno se pueden administrar con otro agente farmacéutico, ya sea en la misma formulación o en forma separada.
En otra forma de realización, la presente invención provee un método para tratar un trastorno inmunitario en un mamífero que lo necesita, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido IL-17A/F, un agonista o un antagonista de este (tal como una entidad de fijación a IL-17A/F que incluye un anticuerpo de reactividad cruzada con IL-17A/F). En un aspecto preferido, el trastorno inmunitario se selecciona del grupo que consiste en: lupus eritematoso sistémico (SLE), artritis reumatoide (RA), osteoartritis, artritis crónica juvenil, espondiloartropatías, esclerosis sistémica, miopatías inflamatorias idiopáticas, síndrome de Sjogren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica autoinmunitaria, trombocitopenia autoinmunitaria, tiroiditis, diabetes mellitus, enfermedad renal inmunitaria, enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico, tales como esclerosis múltiple (MS) (por ejemplo, esclerosis múltiple con recidiva-remisión, esclerosis múltiple progresiva secundaria, esclerosis múltiple progresiva primaria y esclerosis múltiple progresiva con recidiva), polineuropatía desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barré, y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares, tales como hepatitis activa crónica autoinmunitaria infecciosa, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa y colangitis esclerosante, enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enteropatía sensible al gluten y enfermedad de Whipple, enfermedades autoinmunitarias o inmunitarias de la piel, que incluyen enfermedades ampoilosas de la piel, eritema multiforme y dermatitis por contacto, vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA) (AAV), arteritis de células gigantes, psoriasis, artritis psoriásica, enfermedades alérgicas, tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a los alimentos y urticaria, enfermedades inmunológicas del pulmón, tales como neumonía eosinofílica, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis por hipersensibilidad, nefritis lúpica, nefropatía por IgA, enfermedad renal diabética, enfermedad por cambios mínimos (nefrosis lipoidea), glomerulosclerosis focal y segmentaria (GEFS), fibrosis sistémica nefrogénica (FSN), dermopatía fibrosante nefrogénica, hepatitis colestásica fibrosante, fascitis eosinofílica (síndrome de Shulman), escleromixedema (mucinosis popular), esclerodermia, liquen escleroso y atrófico, síndrome de POEM (síndrome de Crow-Fukase, enfermedad de Takatsuki o síndrome de PEP), síndrome nefrótico, enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD), enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD) (de un trasplante, tal como de sangre, médula ósea, riñón, páncreas, hígado, hígado ortotópico, pulmón, corazón, intestino, intestino delgado, intestino grueso, timo, células madre de aloinjerto, aloinjerto de menor intensidad, hueso, tendón, córnea, piel, válvulas cardíacas, venas, arterias, vasos sanguíneos, estómago y testículo), enfermedad osteolítica (por ejemplo, enfermedad osteolítica inducida por mieloma múltiple), fibrosis quística, degeneración macular relacionada con la edad (AMD; por ejemplo, AMD húmeda y AMD seca), fibrosis hepática, fibrosis pulmonar, ateroesclerosis, lesión cardíaca por isquemia/revascularización, insuficiencia cardíaca, miocarditis, fibrosis cardíaca, reestructuración cardíaca adversa, enfermedades asociadas al trasplante, lo que incluye rechazo al injerto y enfermedad del injerto contra el huésped.
En otra forma de realización, la presente invención provee un método para inhibir la inflamación en un mamífero que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo o un fragmento de fijación al antígeno de la invención a un mamífero que necesita el tratamiento. En una forma de realización preferida, el mamífero es un ser humano. La inflamación puede asociarse a una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en esclerosis múltiple (MS) (por ejemplo, esclerosis múltiple con recidivaremisión, esclerosis múltiple progresiva secundaria, esclerosis múltiple progresiva primaria y esclerosis múltiple progresiva con recidiva), inflamación crónica, síndrome de Sjogren, diabetes autoinmunitaria, artritis reumatoide (Ra ) y otras afecciones artríticas, asma, esclerosis sistémica, dermatitis atópica, vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA) (AAV), arteritis de células gigantes, lupus eritematoso sistémico (SLE), enfermedad de Degos, dermatomiositis juvenil, lupus discoide (por ejemplo, lupus eritematoso discoide en la infancia, lupus eritematoso discoide generalizado y lupus eritematoso discoide localizado), lupus eritematoso de sabañones, síndrome de superposición de liquen plano con lupus eritematoso, paniculitis lúpica asociada a lupus eritematoso, lupus eritematoso tumidus, lupus eritematoso cutáneo verrucoso, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso cutáneo subagudo, lupus eritematoso cutáneo agudo, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, enfermedad de Graves, enfermedad osteolítica (por ejemplo, enfermedad osteolítica inducida por mieloma múltiple), fibrosis quística, degeneración macular relacionada con la edad (AMD; por ejemplo, AMD húmeda y AMD seca), fibrosis hepática, fibrosis pulmonar, ateroesclerosis, lesión cardíaca por isquemia/revascularización, insuficiencia cardíaca, miocarditis, fibrosis cardíaca, reestructuración cardíaca adversa, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, psoriasis, artritis psoriásica, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome del colon irritable (IBS), enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), nefritis lúpica, nefropatía por IgA, enfermedad renal diabética, enfermedad por cambios mínimos (nefrosis lipoidea), glomerulosclerosis focal y segmentaria (GEFS), fibrosis sistémica nefrogénica (FSN), dermopatía fibrosante nefrogénica, hepatitis colestásica fibrosante, fascitis eosinofílica (síndrome de Shulman), escleromixedema (mucinosis popular), esclerodermia, liquen escleroso y atrófico, síndrome de POEM (síndrome de Crow-Fukase, enfermedad de Takatsuki o síndrome de PEP), síndrome nefrótico, enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD), enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD) (de un trasplante, tal como de sangre, médula ósea, riñón, páncreas, hígado, hígado ortotópico, pulmón, corazón, intestino, intestino delgado, intestino grueso, timo, células madre de aloinjerto, aloinjerto de menor intensidad, hueso, tendón, córnea, piel, válvulas cardíacas, venas, arterias, vasos sanguíneos, estómago y testículo). El anticuerpo biespecífico, el anticuerpo o el fragmento de fijación al antígeno se pueden administrar con otro agente farmacéutico, por ejemplo, un agente antiinflamatorio, ya sea en la misma formulación o en forma separada.
En otra forma de realización, la presente invención provee una composición que comprende un anticuerpo como se define en las reivindicaciones y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Se puede formular una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico, de la invención de acuerdo con los métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, mediante los cuales las proteínas terapéuticas se combinan en una mezcla con un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Se considera que una composición es un "vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico" si el paciente receptor puede tolerar su administración. La solución salina amortiguada con fosfato estéril es un ejemplo de un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Otros vehículos adecuados son conocidos por las personas del oficio de nivel medio. Véase, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19.a edición (Mack Publishing Company 1995).
Para uso farmacéutico, se formula un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico, de la presente invención para la administración parenteral, en particular intravenosa o subcutánea, de acuerdo con los métodos convencionales. La administración intravenosa puede ser mediante inyección de bolo, liberación controlada, por ejemplo, usando minibombas u otra tecnología adecuada, o mediante infusión durante un período habitual de una a varias horas. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico, de la invención en combinación con un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico, tal como solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa al 5 % en agua o similares. Las formulaciones también pueden incluir uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes amortiguadores, albúmina para prevenir la pérdida de proteínas en las superficies del vial, etc. Cuando se usa esa terapia de combinación, los anticuerpos, que incluyen anticuerpos biespecíficos, se pueden combinar en una sola formulación o se pueden administrar en formulaciones separadas. Los métodos de formulación son conocidos en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton Pa , 1990, que se incorpora en la presente por referencia. En general, las dosis terapéuticas varían de 0,1 a 100 mg/kg en peso del paciente por día, preferentemente, de 0,5 a 20 mg/kg por día, y la dosis exacta la determina por el médico de acuerdo con los estándares aceptados, teniendo en cuenta la naturaleza y la gravedad de la afección que se desea tratar, las particularidades del paciente, etc. La determinación de la dosis se encuentra dentro del ámbito de la persona del oficio de nivel medio. Es más frecuente que los anticuerpos se administren durante una semana o menos, a menudo durante un período de 1 a 3 días. En general, la dosis de los anticuerpos administrados varía según determinados factores, como la edad, el peso, la altura, el sexo, la afección médica general y los antecedentes patológicos del paciente. Con frecuencia, es conveniente proporcionar al receptor una dosis de anticuerpos que se encuentre en el rango de alrededor de 1 pg/kg a 10 mg/kg (cantidad de agente/peso corporal del paciente), aunque se puede administrar una dosis más baja o más alta según las circunstancias.
La administración de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico, de la invención a un sujeto puede ser intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, por perfusión a través de un catéter regional o mediante inyección intralesional directa. Cuando se administran anticuerpos terapéuticos mediante inyección, la administración puede ser mediante infusión continua, o mediante un solo bolo o múltiples bolos.
Otras vías de administración incluyen oral, mucosa, pulmonar y transcutánea. El suministro oral es adecuado para las microesferas de poliéster, las microesferas de zeína, las microesferas proteinoides, las microesferas de policianoacrilato y los sistemas lipídicos (véase, por ejemplo, DiBase et al., "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins," en Protein Delivery: Physical Systems, pp. 255-288, Plenum Press (1997)). La viabilidad del suministro intranasal se ejemplifica mediante un modo de administración de la insulina (véase, por ejemplo, Hinchcliffe et al., Adv.
Drug Deliv. Rev., 35:199 (1999)). Los anticuerpos de la invención que comprenden partículas secas o líquidas se pueden preparar e inhalar con la ayuda de dispersadores de polvo seco, generadores de aerosol líquido o nebulizadores (por ejemplo, Pettit et al., TIBTECH 16:343 (1998); Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 35:235 (1999)). Este método se ilustra mediante el sistema de control de la diabetes AERX®, que es un inhalador electrónico manual que suministra insulina aerosolizada a los pulmones. Ciertos estudios han demostrado el suministro de proteínas que tienen un tamaño de 48.000 kDa a través de la piel en concentraciones terapéuticas con la ayuda de ultrasonido de baja frecuencia, lo que ilustra la viabilidad de la administración transcutánea (Mitragotri et al., Science 269:850 (1995)). El suministro transdérmico mediante electroporación provee otro medio para administrar una molécula que tiene actividad de fijación a IL-17 e IL-23/p19 (Potts et al., Pharm. Biotechnol., 10:213 (1997)).
Para fines terapéuticos, las composiciones que comprenden un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico de la invención y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico se administran al paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Se considera que la combinación de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico, de la presente invención y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico se administra en una "cantidad terapéuticamente eficaz" si la cantidad administrada es importante en términos fisiológicos. Un agente es importante en términos fisiológicos si su presencia genera un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor. Por ejemplo, un agente que se usa para tratar la inflamación es importante en términos fisiológicos si su presencia alivia la reacción inflamatoria. La eficacia del tratamiento se puede evaluar de varias maneras. En una forma de realización, la eficacia del tratamiento se determina mediante la reducción de la inflamación. En otras formas de realización, la eficacia del tratamiento se determina mediante la inhibición de la inflamación. Aún en otras formas de realización, la eficacia de la terapia se mide mediante una mejora del paciente, que incluye signos como aumento de peso, recuperación de la fuerza, disminución del dolor, progreso e indicaciones subjetivas del paciente de un mejor estado de salud.
Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico, de la invención se puede suministrar en forma líquida, en un aerosol o en forma sólida. Las formas líquidas se ilustran mediante soluciones inyectables y suspensiones orales. Las formas sólidas de ejemplo incluyen cápsulas, comprimidos y formas de liberación controlada. Esta última forma se ilustra mediante bombas miniosmóticas e implantes (Bremer et al., Pharm. Biotechnol., 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery", en Ranade et al., eds., Drug Delivery Systems, pp. 95-123, CRC Press (1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps", en Sanders et al., ed., Protein Delivery: Physical Systems, pp. 239-254, Plenum Press (1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant", en Sanders et al., ed., Protein Delivery: Physical Systems, pp. 93-117, Plenum Press (1997)).
Los liposomas proporcionan un medio para administrar polipéptidos terapéuticos a un sujeto por vía intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, subcutánea, oral, intranasal o por inhalación. Los liposomas son vesículas microscópicas que consisten en una o más bicapas lipídicas que rodean los compartimentos acuosos (véase, en general, Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 12(Suppl. 1):S61 (1993), Kim, Drugs, 46:618 (1993) y Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers", en Ranade et al., ed., Drug Delivery Systems, pp. 3-24, CRC Press (1995)). Los liposomas tienen una composición similar a las membranas celulares y, en consecuencia, se pueden administrar de manera segura y son biodegradables. En función del método de preparación, los liposomas pueden ser unilamelares o multilamelares, y el tamaño de los liposomas puede variar, con diámetros que miden de 0,02 pm a más de 10 pm. Se puede encapsular varios agentes en los liposomas: división de los agentes hidrófobos en las bicapas y división de los agentes hidrófilos en el espacio acuoso interno (véase, por ejemplo, Machy et al., Liposomes in Cell Biology and Pharmacology, John Libbey (1987), y Ostro et al., American J. Hosp. Pharm., 46:1576 (1989)). Además, es posible controlar la disponibilidad terapéutica del agente encapsulado cambiando el tamaño de los liposomas, la cantidad de bicapas, la composición lipídica y las características superficiales y de carga de los liposomas.
Los liposomas pueden absorber prácticamente cualquier tipo de célula y luego liberar lentamente el agente encapsulado. De manera alternativa, un liposoma absorbido puede ser incorporado en las células que son fagocíticas mediante endocitosis. Después de la endocitosis se produce la degradación intralisosómica de los lípidos liposómicos y la liberación de los agentes encapsulados (Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 446:368 (1985)). Después de la administración intravenosa, los liposomas pequeños (de 0,1 a 1,0 pm) son absorbidos por las células del sistema reticuloendotelial, ubicado principalmente en el hígado y en el bazo, mientras que los liposomas que superan los 3,0 m se depositan en los pulmones. La absorción preferencial de liposomas más pequeños por parte de las células del sistema reticuloendotelial se ha usado para suministrar quimioagentes terapéuticos a los macrófagos y a los tumores hepáticos.
El sistema reticuloendotelial puede ser eludido por varios métodos, que incluyen la saturación con grandes dosis de partículas liposómicas o la inactivación selectiva de macrófagos por medios farmacológicos (Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta, 802:428 (1984)). Además, se ha demostrado que la incorporación de fosfolípidos derivatizados de glucolípidos o polietilenglicol en las membranas liposómicas da como resultado una absorción considerablemente menor por parte del sistema reticuloendotelial (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1150:9 (1993)).
También se pueden preparar liposomas para dirigirlos a células u órganos particulares cambiando la composición fosfolipídica o insertando receptores o ligandos en los liposomas. Por ejemplo, se han usado liposomas, preparados con un alto contenido de un tensioactivo no iónico, para dirigirlos al hígado (Hayakawa et al., patente japonesa N.° 04­ 244,018; Kato et al., Biol. Pharm. Bull., 16:960 (1993). Estas formulaciones se prepararon mediante la mezcla de fosfatidilcolina de soja, a-tocoferol y aceite de ricino hidrogenado y etoxilado (HCO-60) en metanol, la concentración de la mezcla al vacío y la reconstitución de la mezcla con agua. También se ha demostrado el direccionamiento de una formulación liposómica de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) con una mezcla de esterilglucósido derivado de la soja (SG) y colesterol (Ch) al hígado (Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull, 20:881 (1997).
De manera alternativa, varios ligandos de direccionamiento se pueden fijar a la superficie del liposoma, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, hidratos de carbono, vitaminas y proteínas de transporte. Por ejemplo, los liposomas se pueden modificar con derivados galactolipídicos ramificados para dirigirlos a los receptores de asialoglucoproteína (galactosa), que se expresan exclusivamente en la superficie de las células hepáticas (Kato et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 14:287 (1997); Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull., 20:259 (1997). De modo similar, Wu et al., Hepatology 27:772 (1998), demostraron que la rotulación de liposomas con asialofetuin produjo una vida media más corta de los liposomas en plasma y mejoró considerablemente la absorción del liposoma rotulado con asialofetuin por parte de los hepatocitos. Por otra parte, la acumulación hepática de liposomas que comprenden derivados galactolipídicos ramificados se puede inhibir mediante la inyección previa de asialofetuin (Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull., 20:259 (1997). Los liposomas de albúmina de suero humano poliaconitilados proporcionan otro enfoque para dirigir los liposomas a las células hepáticas (Kamps et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 94:11681 (1997)). Además, Geho, et al. patente estadounidense N.° 4.603.044, describen un sistema de suministro de vesículas liposómicas dirigido a hepatocitos, que tiene especificidad para los receptores hepatobiliares asociados a las células metabólicas especializadas del hígado.
En un enfoque más general para el direccionamiento a los tejidos, se rotulan previamente células diana con anticuerpos biotinilados específicos de un ligando expresado por la célula diana (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 32:99 (1998)). Después de la eliminación de los anticuerpos libres en plasma, se administran liposomas conjugados con estreptavidina. En otro enfoque, los anticuerpos de direccionamiento se unen directamente a los liposomas (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 32:99 (1998)).
Los anticuerpos se pueden encapsular en el interior de los liposomas usando técnicas estándares de microencapsulación de proteínas (véase, por ejemplo, Anderson et al., Infect. Immun., 31:1099 (1981), Anderson et al., Cancer Res., 50:1853 (1990) y Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1063:95 (1991), Alving et al. "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies", en Gregoriadis, ed., Liposome Technology, 2.a edición, Vol. III, p. 317, CRC Press (1993), Wassef et al., Meth. Enzymol., 149:124 (1987)). Como se indicó anteriormente, los liposomas terapéuticamente útiles pueden contener varios componentes. Por ejemplo, los liposomas pueden comprender derivados lipídicos de poli(etilenglicol) (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1150:9 (1993)).
Se han diseñado microesferas de polímeros degradables para mantener niveles sistémicos elevados de proteínas terapéuticas. Las microesferas se preparan de polímeros degradables, tales como poli(láctido-co-glicólido) (PLG), polianhídridos, poli(orto ésteres), polímeros de acetato de etilvinilo no biodegradables, en los que las proteínas quedan atrapadas en el polímero (Gombotz et al., Bioconjugate Chem., 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery", en Ranade et al., eds., Drug Delivery Systems, pp. 51-93, CRC Press (1995); Roskos et al., "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery", en Sanders et al., eds., Protein Delivery: Physical Systems, pp. 45-92, Plenum Press (1997); Bartus et al., Science, 281:1161 (1998); Putney et al., Nature Biotechnology, 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:548 (1998)). Se pueden proporcionar también vehículos de nanoesferas recubiertas con polietilenglicol (PEG) para la administración intravenosa de proteínas terapéuticas (véase, por ejemplo, Gref et al., Pharm. Biotechnol., 10:167 (1996).
La formulación también puede contener más de un compuesto activo necesario para la afección particular que se trate, preferentemente, aquellos que tienen actividades complementarias que no se perjudican entre sí. De manera alternativa o adicional, la composición puede comprender un agente que mejora su función, por ejemplo, un agente citotóxico, una citocina, un quimioagente terapéutico o un agente inhibidor del crecimiento. Estas moléculas están presentes de manera combinada en cantidades que son eficaces para la finalidad prevista.
En una forma de realización, un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico, de la invención se administra en una terapia combinada, es decir, combinado con otros agentes, por ejemplo, agentes terapéuticos, que son útiles para tratar afecciones o trastornos patológicos, tales como trastornos autoinmunitarios y enfermedades inflamatorias. En este contexto, el término "combinado" significa que los agentes se administran prácticamente de manera contemporánea, ya sea en forma simultánea o secuencial. Si se administran de manera secuencial, cuando comienza la administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos aún es preferentemente detectable en concentraciones eficaces en el sitio de tratamiento.
Por ejemplo, la terapia combinada puede incluir uno o más anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, de la invención coformulados y/o coadministrados con uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, uno o más inhibidores de citocina y del factor de crecimiento, inmunosupresores, antiinflamatorios, inhibidores metabólicos, inhibidores enzimáticos y/o agentes citotóxicos o citostáticos, como se describe en mayor detalle más adelante. Además, se pueden usar uno o más anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, descritos en la presente combinados con dos o más de los agentes terapéuticos descritos en la presente. Ventajosamente, las terapias combinadas pueden utilizar dosis más bajas de los agentes terapéuticos administrados para así evitar las posibles toxicidades o complicaciones asociadas a las diversas monoterapias.
Los agentes terapéuticos preferidos que se usan en combinación con un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico, de la invención son los agentes que interfieren en las diferentes etapas de la reacción inflamatoria. En una forma de realización, uno o más anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, descritos en la presente se pueden coformular y/o coadministrar con uno o más agentes adicionales, tales como otros antagonistas de citocina o del factor del crecimiento (por ejemplo, receptores solubles, inhibidores peptídicos, moléculas pequeñas, fusiones de ligandos); o anticuerpos o fragmentos de fijación al antígeno de estos que se fijan a otras dianas (por ejemplo, anticuerpos que se fijan a otras citocinas o factores del crecimiento, sus receptores u otras moléculas de la superficie celular); y citocinas antiinflamatorias o agonistas de estas. Los ejemplos de los agentes que se pueden usar en combinación con los anticuerpos descritos en la presente incluyen, entre otros, antagonistas de una o más interleucinas (IL) o sus receptores, por ejemplo, antagonistas de IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22 e IL-31; antagonistas de citocinas o factores del crecimiento o sus receptores, tales como factor de necrosis tumoral (TNF), LT, EMAP-II, GM-CSF, FGF y PDGF. Los anticuerpos de la invención también se pueden combinar con inhibidores, por ejemplo, anticuerpos, de las moléculas de superficie celular, tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD20 (por ejemplo, el inhibidor de CD20 rituximab (RITUXAN®)), CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90 o sus ligandos, que incluyen CD154 (gp39 o CD40L) o LFA-1/ICAM-1 y VLA-4/VCAM-1 (Yusuf-Makagiansar et al. Med. Res. Rev., 22:146-167 (2002)). Los antagonistas preferidos que se pueden usar en combinación con uno o más anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, descritos en la presente incluyen antagonistas de IL-1, IL-6, IL-12, TNF-alfa, IL-15, IL-18, IL-20, IL-22 e IL-31.
Los ejemplos de esos agentes incluyen antagonistas de IL-12, tales como anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos o generados in vitro (o fragmentos de fijación al antígeno de estos) que se fijan a IL-12 (preferentemente, IL-12 humana), por ejemplo, los anticuerpos descritos en WO 00/56772; los inhibidores del receptor de IL-12, por ejemplo, anticuerpos del receptor de IL-12 humana; y fragmentos solubles del receptor de IL-12, por ejemplo, receptor de IL-12 humana. Los ejemplos de antagonistas de IL-15 incluyen anticuerpos (o fragmentos de fijación al antígeno de estos) de IL-15 o su receptor, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos o generados in vitro de la IL-15 humana o su receptor, fragmentos solubles del receptor de IL-15 y proteínas de fijación a IL-15. Los ejemplos de antagonistas de IL-18 incluyen anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos o generados in vitro (o fragmentos de fijación al antígeno de estos) de IL-18 humana, fragmentos solubles del receptor de IL-18 y proteínas de fijación a IL-18 (IL-18BP). Los ejemplos de antagonistas de IL-1 incluyen inhibidores de la enzima conversora de interleucina 1 (ICE), tales como Vx740, antagonistas de IL-1, por ejemplo, IL-1 RA (anikinra, KINERET®, Amgen), sIL1RII (Immunex) y anticuerpos del receptor anti-IL-1 (o fragmentos de fijación al antígeno de estos).
Los ejemplos de antagonistas de TNF incluyen anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos o generados in vitro (o fragmentos de fijación al antígeno de estos) de TNF (por ejemplo, TNF-alfa humano), tales como (HUMIRA®,, D2E7, anticuerpo de TNF-alfa humano), CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356 (anticuerpo anti-TNF-alfa humanizado; Celltech/Pharmacia), cA2 (anticuerpo anti-TNF-alfa quimérico; REMICADE®, Centocor); fragmentos de anticuerpos anti-TNF (por ejemplo, CPD870); fragmentos solubles de los receptores de TNF, por ejemplo, receptores de TNF humano p55 o p75 o derivados de estos, por ejemplo, TNFR-IgG de 75 kd (proteína de fusión del receptor de TNF-IgG de 75 kD, ENBREL®; Immunex), p55 kdTNFR-IgG (proteína de fusión del receptor de TNF-IgG de 55 kD ((Lenercept)); antagonistas enzimáticos, por ejemplo, inhibidores de la enzima conversora de TNF-alfa (TACE) (por ejemplo, un derivado de ácido alfa-sulfonilhidroxámico y un inhibidor TACE de N-hidroxiformamida GW 3333, -005 o -022); y TNF-bp/s-TNFR (proteína de fijación a TNF soluble). Los antagonistas de TNF preferidos son fragmentos solubles de los receptores de TNF, por ejemplo, receptores de TNF humano p55 o p75 o derivados de estos, por ejemplo, 75 kdTNFR-IgG, e inhibidores de la enzima conversora de TNF-alfa (TACE).
En otras formas de realización, uno o más anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, descritos en la presente se pueden administrar combinados con uno o más de los siguientes: antagonistas de IL-13, por ejemplo, receptores de IL-13 solubles (sIL-13) y/o anticuerpos contra IL-13; antagonistas de IL-2, por ejemplo, Da B 486-IL-2 y/o Da B 389-IL-2 (proteínas de fusión a IL-2, Seragen) y/o anticuerpos de IL-2R, por ejemplo, anti-Tac (anti-IL-2R humanizada, Protein Design Labs). Otra combinación más incluye uno o más anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, de la invención, moléculas pequeñas antagonistas y/o anticuerpos inhibidores combinados con inhibidores anti-CD4 no reductores (DEC-CE9.1/SB 210396; anticuerpo anti-CD4 primatizado no reductor; IDEC/SmithKline). Aún otras combinaciones preferidas incluyen antagonistas de la vía coestimuladora CD80 (B7.1) o CD86 (B7.2), que incluyen anticuerpos, receptores solubles o ligandos antagonistas, así como ligandos de glucoproteína p-selectina (PSGl ), citocinas antiinflamatorias, por ejemplo, IL-4 (DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; iL-10 recombinante DNAX/Schering); IL-13 y TGF-beta, y agonistas de estos (por ejemplo, anticuerpos agonistas).
En otras formas de realización, uno o más anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, de la invención se pueden coformular y/o coadministrar con uno o más fármacos antiinflamatorios, inmunosupresores, o inhibidores metabólicos o enzimáticos. Los ejemplos de fármacos o inhibidores que se pueden usar combinados con los anticuerpos descritos en la presente incluyen, entre otros, uno o más de los siguientes: fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID), por ejemplo, ibuprofeno, tenidap, naproxeno, meloxicam, piroxicam, diclofenac e indometacina; sulfasalazina; corticoesteroides, tales como prednisolona; fármacos antiinflamatorios supresores de citocina (CSAID); inhibidores de la biosíntesis de nucleótidos, por ejemplo, inhibidores de la biosíntesis de purina, antagonistas de folato (por ejemplo, metotrexato (ácido N-[4-[[(2,4-diamino-6-pteridinil)metil]metilamino] benzoil]-L-glutámico); e inhibidores de la biosíntesis de pirimidina, por ejemplo, inhibidores de dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH) . Los agentes terapéuticos preferidos para usar combinados con uno o más anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, de la invención incluyen NSAID, CSAID, inhibidores de DHODH (por ejemplo, leflunomida) y antagonistas de folato (por ejemplo, metotrexato).
Los ejemplos de inhibidores adicionales incluyen uno o más de los siguientes corticoesteroides (por vía oral, por inhalación o por inyección local); inmunosupresores, por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus (FK-506); e inhibidores de mTOR, por ejemplo, sirolimus (rapamicina --RAPAMUNE® o derivados de rapamicina, por ejemplo, derivados de rapamicina soluble (por ejemplo, derivados de éster de rapamicina, por ejemplo, CCI-779); agentes que interfieren en la señalización mediante las citocinas proinflamatorias, tales como TNF-alfa o IL-1 (por ejemplo, inhibidores de IRAK, NIK, IKK, p38 o MAP quinasa); inhibidores de COX2, por ejemplo, celecoxib, rofecoxib y variantes de estos; inhibidores de fosfodiesterasa, por ejemplo, R973401 (inhibidor de fosfodiesterasa tipo IV); inhibidores de fosfolipasa, por ejemplo, inhibidores de fosfolipasa citosólica 2 (cPLA2) (por ejemplo, análogos de trifluorometilcetona); inhibidores del factor de crecimiento celular del endotelio vascular o receptor del factor de crecimiento, por ejemplo, inhibidor de VEGF y/o inhibidor de VEGF-R; e inhibidores de la angiogénesis. Los agentes terapéuticos preferidos para usar combinados con los anticuerpos de la invención son inmunosupresores, por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus (FK-506); inhibidores de mTOR, por ejemplo, sirolimus (rapamicina) o derivados de rapamicina, por ejemplo, derivados de rapamicina soluble (por ejemplo, derivados de éster de rapamicina, por ejemplo, CCI-779); inhibidores de COX2, por ejemplo, celecoxib y sus variantes; e inhibidores de fosfolipasa, por ejemplo, inhibidores de fosfolipasa citosólica 2 (cPLA2), por ejemplo, análogos de trifluorometilcetona.
Otros ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden combinar con un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico, de la invención incluyen uno o más de los siguientes: 6 -mercaptopurinas (6 -MP); azatioprina sulfasalazina; mesalazina; olsalazina; cloroquina/hidroxicloroquina (PLAQUENIL®); pencilamina; aurotiomalato (intramuscular y oral); azatioprina; colchicina; agonistas del adrenorreceptor beta- 2 (salbutamol, terbutalina, salmeteral); xantinas (teofilina, aminofilina); cromoglicato; nedocromil; ketotifeno; ipratropio y oxitropio; micofenolato mofetil; agonistas de adenosina; agentes antitrombóticos; inhibidores del complemento; y agentes adrenérgicos.
Los ejemplos no limitantes de agentes para tratar o prevenir trastornos artríticos (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis inflamatoria, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis y artritis soriásica) con los que se puede combinar un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo biespecífico, de la invención incluyen uno o más de los siguientes: antagonistas de IL-12 como se describen en la presente; NSAID; CSAID; antagonistas de TNF, por ejemplo, TNF-alfa, como se describen en la presente; anticuerpos anti-CD4 no reductores, como se describen en la presente; antagonistas de IL-2, como se describen en la presente; citocinas antiinflamatorias, por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-13 y TGF-alfa, o agonistas de estos; IL-1 o antagonistas del receptor de IL-1, como se describen en la presente; inhibidores de fosfodiesterasa, como se describen en la presente; inhibidores de Cox-2, como se describen en la presente; iloprost: metotrexato; talidomida y fármacos relacionados con talidomida (por ejemplo, Celgen); leflunomida; inhibidor de la activación de plasminógeno, por ejemplo, ácido tranexámico; inhibidor de citocina, por ejemplo, T-614; prostaglandina E1; azatioprina; un inhibidor de la enzima conversora de interleucina 1 (ICE); inhibidor de zap-70 y/o 1ck (inhibidor de tirosina quinasa zap-70 o 1ck); un inhibidor del factor de crecimiento celular del endotelio vascular o receptor del factor de crecimiento celular del endotelio vascular, como se describe en la presente; un inhibidor de la angiogénesis, como se describe en la presente; fármacos antiinflamatorios corticoesteroides (por ejemplo, SB203580); inhibidores de TNF-convertasa; inhibidores de IL-11; IL-13; IL-17; oro; penicilamina; cloroquina; hidroxicloroquina; clorambucilo; ciclofosfamida; ciclosporina; irradiación linfoide total; globulina antitimocito; toxinas de CD5; colágeno y péptidos administrados por vía oral; lobenzarit disódico; agentes reguladores de la citocina (CRA) HP228 y HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); oligodesoxinucleótidos de fosforotioato antisentido ICAM-1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor del complemento soluble 1 (TP 10; T Cell Sciences, Inc.); prednisona; orgoteína; polisulfato de glucosaminoglucano; minociclina (MINOCIN®); anticuerpos anti-IL2R; lípidos marinos y botánicos (ácidos grasos de pescado y semillas de plantas); auranofin; fenilbutazona; ácido meclofenámico; ácido flufenámico; globulina inmunitaria intravenosa; cileutón; ácido micofenólico (RS-61443); tacrolimus (FK-506); sirolimus (rapamicina); amiprilosa (terafectina); cladribina (2-clorodseoxiadenosina); y azaribina. Las combinaciones preferidas incluyen uno o más anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, de la invención combinados con metotrexato o leflunomida, y en casos de artritis reumatoide moderada o grave, ciclosporina.
Los ejemplos preferidos de inhibidores para usar combinados con uno o más anticuerpos, por ejemplo anticuerpos biespecíficos, de la invención para tratar trastornos artríticos incluyen antagonistas de TNF (por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos o generados in vitro, o fragmentos de fijación al antígeno de estos, que se fijan a TNF; fragmentos solubles de un receptor de TNF, por ejemplo, receptor de TNF humano p55 o p75 o sus derivados, por ejemplo, TNFR-IgG de 75 kd (proteína de fusión del receptor de TNF-IgG de 75 kD, ENBREL®), proteína de fusión del receptor de TNF-IgG de p55 kD; antagonistas enzimáticos de TNF, por ejemplo, inhibidores de la enzima conversora de TNF-alfa (TACE); antagonistas de IL-12, IL-15, IL-18, IL-22; agentes reductores de linfocitos T y linfocitos B (por ejemplo, anticuerpos anti-CD4 o anti-CD22); inhibidores de molécula pequeña, por ejemplo, metotrexato y leflunomida; sirolimus (rapamicina) y sus análogos, por ejemplo, CCI-779; inhibidores de cox-2 y cPLA2; NSAID; inhibidores de p38, inhibidores de TPL-2, Mk-2 y NFkB; Ra g E o RAGE soluble; inhibidores de P-selectina o PSGL-1 (por ejemplo, inhibidores de molécula pequeña, anticuerpos de estos, por ejemplo, anticuerpos de P-selectina); agonistas del receptor de estrógeno beta (ERB) o antagonistas de ERB-NFkB. Otros agentes terapéuticos más preferidos que se pueden coadministrar y/o coformular con uno o más anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, de la invención incluyen uno o más de los siguientes: un fragmento soluble de un receptor de TNF, por ejemplo, receptor de TNF humano p55 o p75 o sus derivados, por ejemplo, TNFR-IgG de 75 kd (proteína de fusión del receptor TNF-IgG de 75 kD, ENBREL®); metotrexato, leflunomida, o sirolimus (rapamicina) o un análogo de este, por ejemplo, CCI-779.
Los ejemplos no limitantes de agentes para tratar o prevenir esclerosis múltiple (por ejemplo, esclerosis múltiple con recidiva-remisión, esclerosis múltiple progresiva secundaria, esclerosis múltiple progresiva primaria y esclerosis múltiple progresiva con recidiva), con uno o más anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, de la invención que se pueden combinar incluyen los siguientes: interferones, por ejemplo, interferón alfa 1a (por ejemplo, AVONEX®, Biogen) e interferón 1b (BETASERON® Chiron/Berlex); copolímero 1 (Cop-1; COPAXOn E® Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); dimetilfumarato (por ejemplo, BG-12; Biogen); oxígeno hiperbárico; inmunoglobulina intravenosa; cladribine; antagonistas de TNF, como se describen en la presente; corticoesteroides; prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; ciclosporina A, metotrexato; 4-aminopiridina; y tizanidina. Otros antagonistas que se pueden usar combinados con anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos o antagonistas de otras citocinas o factores del crecimiento humanos, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6 , EL-7, IL-8 , IL-12 IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-11, GM-CSF, FGF y PDGF. Los anticuerpos descritos en la presente se pueden combinar con los anticuerpos de las moléculas de superficie celular, tales como CD2, CD3, CD4, CD8 , CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD8 6 , CD90 o sus ligandos. También se pueden combinar uno o más anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, de la invención con agentes, tales como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetil, leflunomida, NSAID, por ejemplo, ibuprofeno, corticoesteroides, tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren en la señalización mediante las citocinas proinflamatorias, como se describe en la presente, inhibidores de la enzima conversora de IL-1b (por ejemplo, Vx740), anti-P7, PSGL, inhibidores de TACE, inhibidores de la señalización de linfocitos T, tales como inhibidores de quinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6 -mercaptopurinas, inhibidores enzimáticos conversores de angiotensina, receptores de citocina soluble y sus derivados, como se describen en la presente, y citocinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-13 y TGF).
Los ejemplos preferidos de agentes terapéuticos para esclerosis múltiple (por ejemplo, esclerosis múltiple con recidivaremisión, esclerosis múltiple progresiva secundaria, esclerosis múltiple progresiva primaria y esclerosis múltiple progresiva con recidiva) con los que se pueden combinar los anticuerpos de la invención incluyen dimetilfumarato (por ejemplo, BG-12; Biogen), interferón beta, por ejemplo, IFN-beta-1a e IFN-beta-1b; COPAXONE®, corticoesteroides, inhibidores de IL-1, inhibidores de TNF, anticuerpos del ligando CD40 y CD80, antagonistas de IL-12.
Los ejemplos no limitantes de agentes para tratar o prevenir una enfermedad intestinal inflamatoria (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa) con los que se puede combinar un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo biespecífico, de la invención incluyen los siguientes: budenósida; factor del crecimiento epidérmico; corticoesteroides; ciclosporina; sulfasalazina; aminosalicilatos; 6 -mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inhibidores de lipoxigenasa; mesalamina; olsalacina; balsalazida; antioxidantes; inhibidores de tromboxano; antagonistas del receptor de IL-1; anticuerpos monoclonales anti-IL-1; anticuerpos monoclonales anti-IL- 6 (por ejemplo, anticuerpos del receptor anti-IL-6 y anticuerpos anti-IL-6 ); factores del crecimiento; inhibidores de elastasa; compuestos de piridinil-imidazol; antagonistas de TNF, como se describen en la presente; citocinas IL-4, IL-10, IL-13 y/o TGF beta o sus agonistas (por ejemplo, anticuerpos agonistas); IL-11; profármacos de prednisolona, dexametasona o budesónida conjugados con glucuronida o dextrano; oligodesoxinucleótidos de fosforotioato antisentido ICAM-1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor del complemento soluble 1 (TP10; T Cell Sciences, Inc.); mesalazina de liberación lenta; metotrexato; antagonistas del factor activador de plaquetas (PAF); ciprofloxacina; y lignocaína.
Los ejemplos no limitantes de agentes para tratar o prevenir psoriasis con los que se puede combinar un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico, de la invención incluyen los siguientes: corticoesteroides; vitamina D3 y sus análogos; retinoides (por ejemplo, Soriatane); metotrexato; ciclosporina, 6 -tioguanina; Accutane; hidrea; hidroxiurea; sulfasalazina; micofenolato mofetil; azatioprina; tacrolimus; ésteres de ácido fumárico; compuestos biológicos, tales como AMEVIVE®, ENBREL®, HUMIRA®, Raptiva y REMICADE®, Ustekinmab y XP-828L; fototerapia; y fotoquimioterapia (por ejemplo, fototerapia con rayos UV y psoralen combinada).
Los ejemplos no limitantes de agentes para tratar o prevenir enfermedades respiratorias/de las vías aéreas inflamatorias (por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma) con los que se puede combinar un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico, de la invención incluyen los siguientes: agonistas del adrenoceptor beta2 (por ejemplo, salbutamol (albuterol USAN), levalbuterol, terbutalina, bitolterol); agonistas del adrenoceptor beta2 de acción prolongada (por ejemplo, salmeterol, formoterol, bambuterol); agonistas adrenérgicos (por ejemplo, epinefrina para inhalación y comprimidos de efedrina); medicaciones anticolinérgicas (por ejemplo, bromuro de ipratropio); combinaciones de esteroides para inhalación y broncodilatadores de acción prolongada (por ejemplo, fluticasona/salmeterol (Advair en los Estados Unidos y Seretide en el Reino Unido)) o budenósida/formoterol (Symbicort)); glucocorticoides para inhalación (por ejemplo, ciclesonida, beclometasona, budenósida, flunisólida, fluticasona, mometasona, triamcinolona); modificadores de leucotrieno (por ejemplo, montelukast, zafirlukast, pranlukast y zileuton); estabilizadores de mastocitos (por ejemplo, cromoglicato (cromolyn) y nedocromil); antimuscarínicos/anticolinérgicos (por ejemplo, ipratropium, oxitropium, tiotropium); metilxantinas (por ejemplo, teofilina, aminofilina); antihistamínicos; bloqueadores de IgE (por ejemplo, Omalizumab); antagonistas muscarínicos M3 (anticolinérgicos) (por ejemplo, ipratropium, tiotropium); cromonas (por ejemplo, cromoglicato, nedocromil); zantinas (por ejemplo, teofilina); y antagonistas de TNF (por ejemplo, infliximab, adalimumab y etanercept).
En una forma de realización, un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico, de la invención se puede usar en combinación con uno o más anticuerpos dirigidos a otras dianas que participan en la regulación de la respuesta inmunitaria, por ejemplo, en el rechazo al trasplante.
Los ejemplos no limitantes de agentes para tratar o prevenir las respuestas inmunitarias con los que se puede combinar un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico, de la invención incluyen los siguientes: anticuerpos de otras moléculas de la superficie celular, que incluyen, entre otras, CD25 (receptor a de interleucina 2), CD11a (LFA-1), CD54 (ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4 (CD80 (B7.1), por ejemplo, CTLA4 Ig -abatacept (ORENCIA®)), ICOSL, ICOS y/o CD86 (B7.2). Aún en otra forma de realización, un anticuerpo de la invención se usa en combinación con uno o más agentes inmunosupresores generales, tales como ciclosporina A o FK506.
En otras formas de realización, los anticuerpos se usan como adyuvantes de vacuna contra trastornos autoinmunitarios, enfermedades inflamatorias, etc. Los adyuvantes para el tratamiento de estos tipos de trastornos son adecuados para usar en combinación con una amplia variedad de antígenos de autoantígenos dirigidos, es decir, autoantígenos, que participan en la autoinmunidad, por ejemplo, proteína básica de mielina; autoantígenos inflamatorios, por ejemplo, proteína del péptido amiloide, o antígenos de trasplantes, por ejemplo, aloantígenos. El antígeno puede comprender péptidos o polipéptidos derivados de proteínas, así como fragmentos de cualquiera de los siguientes: sacáridos, proteínas, polinucleótidos u oligonucleótidos, autoantígenos, proteína del péptido amiloide, antígenos de trasplantes, alérgenos u otros componentes macromoleculares. En algunos casos, se incluye más de un antígeno en la composición antigénica.
Por ejemplo, las vacunas deseables para moderar las respuestas a los alérgenos en un huésped vertebrado, que contienen las combinaciones adyuvantes divulgadas en el presente documento, incluyen las que contienen un alérgeno o un fragmento de este. Algunos ejemplos de tales alérgenos se describen en la patente estadounidense N.° 5.830.877 y en la publicación PCT N.° WO 99/51259 e incluyen polen, venenos de insectos, caspa de animales, esporas fúngicas y fármacos (tales como penicilina). Las vacunas interfieren en la producción de anticuerpos IgE, una causa conocida de las reacciones alérgicas. En otro ejemplo, las vacunas deseables para prevenir o tratar enfermedades caracterizadas por la sedimentación de amiloides en un huésped vertebrado, que contienen las combinaciones adyuvantes de la divulgación, incluyen las que contienen porciones de la proteína del péptido amiloide (APP). Esta enfermedad se denomina de diversas maneras, como enfermedad de Alzheimer, amiloidosis o enfermedad amiloidogénica. Por ello, las vacunas divulgadas en el presente documento incluyen las combinaciones adyuvantes de la presente divulgación más el péptido Ap, así como fragmentos del péptido Ap y anticuerpos del péptido Ap o fragmentos de estos.
En otra forma de realización, las composiciones farmacéuticas se pueden suministrar como un kit que comprende un recipiente que contiene un anticuerpo, un anticuerpo biespecífico o un fragmento de fijación al antígeno de la invención. Los anticuerpos, por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos, de la invención se pueden proporcionar en forma de una solución inyectable para una sola dosis o para múltiples dosis, o como un polvo estéril que se reconstituirá antes de la inyección. Como alternativa, el kit puede incluir un dispersador de polvo seco, un generador de aerosol líquido o un nebulizador para la administración del anticuerpo, por ejemplo, de anticuerpo biespecífico. El kit también puede comprender información escrita con indicaciones de uso de la composición farmacéutica. Además, la información puede incluir una declaración de que la composición de anticuerpos está contraindicada en pacientes con hipersensibilidad a IL-17 e IL-23.
En otra forma de realización, la invención provee un artículo de fabricación, que comprende: (a) una composición de materia que comprende un anticuerpo, un anticuerpo biespecífico o un fragmento de fijación al antígeno, como se describen en la presente; (b) un recipiente que contiene esa composición; y (c) una etiqueta adherida al recipiente o un prospecto incluido en el recipiente que hace referencia al uso del anticuerpo para el tratamiento de una enfermedad inmunitaria.
En otro aspecto, la composición comprende otro ingrediente activo que puede ser, por ejemplo, otro anticuerpo o un agente antiinflamatorio, citotóxico o quimioterapéutico. Preferentemente, la composición es estéril.
Los anticuerpos, anticuerpos biespecíficos y fragmentos de fijación al antígeno, como se describen en la presente, son útiles para preparar medicinas y medicamentos para el tratamiento de enfermedades inmunitarias e inflamatorias que incluyen, por ejemplo, esclerosis múltiple (MS) (por ejemplo, esclerosis múltiple con recidiva-remisión, esclerosis múltiple progresiva secundaria, esclerosis múltiple progresiva primaria y esclerosis múltiple progresiva con recidiva), síndrome del colon irritable (IBS), enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), tal como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, dermatitis atópica, dermatitis por contacto, esclerosis sistémica, lupus eritematoso sistémico (SLE), vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA) (AAV), arteritis de células gigantes, esclerosis múltiple (MS), colitis, endotoxinemia, artritis, artritis reumatoide (RA), osteoartritis, síndrome de Sjogren, psoriasis, artritis psoriásica, enfermedad respiratoria adulta (ARD), choque séptico, insuficiencia multiorgánica, lesiones pulmonares inflamatorias, tales como fibrosis pulmonar idiopática, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), hiperreactividad de las vías respiratorias, bronquitis crónica, asma alérgica, eczema, infección por Helicobacter pylori, adherencias y/o abscesos intraabdominales causados por inflamación peritoneal (por ejemplo, por infecciones, lesiones, etc.), síndrome nefrótico, polineuropatía desmielinizante idiopática, síndrome de Guillain-Barré, rechazo al aloinjerto de órganos, enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD), nefritis lúpica, nefropatía por IgA, enfermedad renal diabética, enfermedad por cambios mínimos (nefrosis lipoidea), glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GEFS), fibrosis sistémica nefrogénica (FSN), dermopatía fibrosante nefrogénica, hepatitis colestásica fibrosante, fascitis eosinofílica (síndrome de Shulman), escleromixedema (mucinosis popular), esclerodermia, liquen escleroso y atrófico, síndrome de POEM (síndrome de Crow-Fukase, enfermedad de Takatsuki o síndrome de PEP), síndrome nefrótico, enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD), enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD) (de un trasplante, tal como de sangre, médula ósea, riñón, páncreas, hígado, hígado ortotópico, pulmón, corazón, intestino, intestino delgado, intestino grueso, timo, células madre de aloinjerto, aloinjerto de menor intensidad, hueso, tendón, córnea, piel, válvulas cardíacas, venas, arterias, vasos sanguíneos, estómago y testículo), enfermedad osteolítica (por ejemplo, enfermedad osteolítica inducida por mieloma múltiple), fibrosis quística, degeneración macular relacionada con la edad (AMD; por ejemplo, AMD húmeda y AMD seca), fibrosis hepática, fibrosis pulmonar, ateroesclerosis, lesión cardíaca por isquemia/revascularización, insuficiencia cardíaca, miocarditis, fibrosis cardíaca, reestructuración cardíaca adversa, rechazo al trasplante, artritis inducida por la pared celular estreptocócica (SCW), gingivitis/periodontitis, queratitis herpética estromal, reestenosis por enteropatía sensible al gluten, enfermedad de Kawasaki y enfermedades renales inmunitarias. En un aspecto específico, las medicinas y los medicamentos comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo biespecífico, anticuerpo o fragmento de fijación al antígeno de la invención con un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico. En una forma de realización, la mezcla es estéril.
La descripción detallada anterior y los ejemplos se han proporcionado por motivos de claridad de la comprensión únicamente. No debe interpretarse que surgen limitaciones innecesarias de ella. La invención es como se define en las reivindicaciones. Por lo tanto, la invención no se limita a los detalles exactos que se muestran y describen, ya que las variaciones evidentes para las personas del oficio de nivel medio estarán incluidas en la invención definida por las reivindicaciones.
Ejemplo 1
Humanización de un anticuerpo especifico dual IL-17A/F antihumano murino
Selección de clones de hibridoma e identificación de la región variable
Las proteínas humanas recombinantes IL-17A, IL-17A/F e IL-17F se produjeron usando un sistema de expresión transitorio HEK293 de ZymoGenetics Inc., a Bristol-Myers Squibb Company (Seattle, WA, EE. UU.). Los ratones BALB/c (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) se inmunizaron y recibieron una dosis de refuerzo con IL-17F humana recombinante conjugada con BSA, y luego se inmunizaron con IL-17A humana recombinante conjugada con BSA. Los ratones cuyos sueros contenían la más alta actividad de fijación a los anticuerpos anti-IL-17F y anti-IL-17A recibieron un refuerzo final de IL-17F previo a la fusión. Cuatro días más tarde, los esplenocitos y las células de los nódulos linfáticos se fusionaron con las células del mieloma Ag8.653 para generar hibridomas productores de anticuerpos. Los sobrenadantes del cultivo de hibridomas se barrieron para determinar la fijación de IL-17F e IL-17A mediante ELISA de placas y la neutralización de IL-17F e IL-17A en el ensayo celular IL-17A/F. Las células hibridomas correspondientes a la muestra de sobrenadante que se fijaron a IL-17F e IL-17A y las neutralizaron se clonaron a fin de aislar un hibridoma monoclonal, 339.15.3.5 (denominado 339.15) que producía el anticuerpo monoclonal neutralizante de interés. El hibridoma 339.15 se isotipificó con el kit de isotipificación de anticuerpos monoclonales de ratón ISOSTRIP® (Roche, Indianapolis, IN, EE. UU.), y el ARN se aisló con el kit QIAGEN® RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.). Las regiones variables se clonaron con el kit de amplificación de ADNc RACE de SMART (Clontech, Mountain View, CA, EE. UU.) que utiliza la tecnología 5' RACE y cebadores 3' específicos de genes diseñados para las secuencias de las regiones constantes de ratón. Las secuencias de la región variable pesada y liviana se clonaron con el kit de clonación para secuenciación TOPO® TA (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Las secuencias génicas se verificaron mediante la comparación de la secuencia con la secuenciación de los aminoácidos del terminal N realizada en un anticuerpo purificado del hibridoma 339.15.
Las secuencias de la región variable se clonaron de 339.15.3.5, 339.15.5.3 y 339.15.3.6, y se demostró que contenían exactamente las mimas secuencias de la región variable. La secuencia de 339.15.3.5 se usó para la humanización posterior, y el clon de hibridoma 339.15.3.6 se depositó el 7 de noviembre de 2006 en la autoridad depositaria de patentes American Type Tissue Culture Collection (ATCC; 10801 University Blvd, Manassas, VA 20110-2209) como depósitos originales conforme al Tratado de Budapest, y se le otorgó la designación de depósito de patente ATCC® PTA-7988. El clon del hibridoma 339.15.3.6 (designación de depósito de patente ATCC® PTA-7988) y 339.15.5.3 (designación de depósito de patente ATCC® PTA-7987) también se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses N.° 7.790.163, 7.910.703 y 8.333.968.
Modelación molecular de secuencias de las regiones variables IL-17A/F antihumanas humanizadas y quiméricas
Todos los modelos de las regiones variables se construyeron y visualizaron con el software MOE, versión 2008 (Chemical Computing Group, Montreal, Canadá).
Diseño de anticuerpos humanizados IL-17A/F antihumanos
Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) murinas se injertaron en secuencias del marco de la línea germinal humana. Las secuencias se compararon con las secuencias de aminoácidos de la línea germinal en V-Base (MRC, Center for Protein Engineering, Reino Unido). Se seleccionó un gen de la línea germinal para la región pesada variable, VH1-03. Se seleccionaron varios genes de la línea germinal para la región liviana variable; VKVI A26, VKI A20, VKVI A14, VKIII L6 y VKI L14. La familia génica de la línea germinal VKVI mostró la más alta homología con la secuencia murina; sin embargo, al ser una familia de la línea germinal poco representativa en el repertorio de anticuerpos humanos, también se consideraron otras familias de la línea germinal con alta homología. Las regiones CDR murinas definidas por el método Kabat se injertaron en las regiones marco humanas definidas por el método Kabat para las cadenas pesadas y livianas.
Construcción, expresión y purificación de anticuerpos anti-IL-17A/F humanizados
Las secuencias de las regiones variables humanizadas se encargaron a GeneART, Inc. (GeneART, Inc. Burlingame, CA, EE. UU.). Las secuencias de las regiones variables humanizadas y murinas se fusionaron con la región constante humana kappa (SEQ ID NO:10) o IgG1.1 (SEQ ID NO:11), una variante sin células efectoras de la IgG1 de tipo silvestre con mutaciones que provocan la reducción de la fijación del receptor Fc y I y la capacidad de fijarse al complemento (Gross et al., Immunity, 15:289-302 (2001)), usando PCR de extensión superpuesta (Horton et al., Gene, 77:61-68 (1989)) y/o clonación de enzimas de restricción en pTT5, un vector de expresión transitoria HEK293-6E (NCR Biotechnology Research Institute, Ottawa, ON, CAN). Todos los constructos se expresaron usando la secuencia de señales mod2610 (ATGCGGCGGAGAGGCTGGTCCTGGATCTTCCTGTTTCTGCTGAGCGGAACAGCCGGCGTGCTGAGC, SEQ ID NO:30), aunque se puede usar cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifique la secuencia de aminoácidos MRRRGWSWIFLFLLSGTAGVLS (s Eq ID NO:31). Las células de suspensión HEK293-6E se transfectaron con los constructos de expresión usando un reactivo de polietilenimina y se cultivaron en un medio F17 (Invitrogen, Grand Island, NY, EE. u U.) con la adición de 5 nM de L-glutamina y 25 pg/ml de G418. Después de 24 horas, se agregó 1/40 volumen de Tryptone NI al 20 % (Organotechnie SAS, La Courneuve, FR). Aproximadamente 120 horas después de la transfección, se recolectó el medio condicionado y se hizo pasar a través de un filtro de 0,2 pm. La proteína se purificó del medio condicionado filtrado usando una combinación de cromatografía por afinidad Mab Select SuRe™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.) y cromatografía de exclusión por tamaño SUPERDEX® 200 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.). El contenido se calculó mediante la absorbancia a UV-A280 nm, y la calidad se evaluó mediante cromatografía de líquidos de alta resolución, de exclusión por tamaño y analítica, SDS PAGE y transferencia Western.
Actividad del bioensayo del panel de humanización IL-17A/F antihumano; ensayo del indicador de luciferasa NIH/3T3/KZ170 NF-kB para medir la actividad de IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas mediante la inducción de NF-kB
Una línea celular de fibroblastos murina (NIH/3T3, ATCC® #CRL-1658) se transfectó de manera estable con un indicador de luciferasa NF-kB denominado KZ170 y se clonó. Las células del clon 1 NIH/3T3/KZ170 se sembraron a razón de 10.000 células/cavidad en un medio de placas (DMEM más 3 % de FBS, 1 nM de piruvato de sodio, 2 nM de L-glutamina (HyClone Laboratories, South Logan, UT)) en placas de luciferasa de 96 cavidades de fondo sólido y color blanco opaco (Corning Incorporated, Corning, NY) y se incubaron durante la noche a 37 °c con 5 % de CO2. Al día siguiente, se realizaron diluciones en serie de IL-17A, IL-17A/F o IL-17F humanas recombinantes (ZymoGenetics, A Bristol-Myers Squibb Company, Seattle, WA, EE. UU.) se realizaron en un medio de ensayo (DMEM más 0,5 % de BSA, 1 nM de piruvato de sodio, 2 nM de L-glutamina, 10 nM de HEPES (HyClone Laboratories, South Logan, UT)), se agregaron a las placas que contenían las células y se incubaron juntas a 37 °C con 5 % de CO2 durante 4 horas. Además, el ensayo se usó para medir la neutralización de la actividad de IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas. Una concentración máxima media (CE50, concentración eficaz al 50 %) de IL-17A, IL-17A/F o IL-17F humanas se combinó con diluciones en serie de anticuerpos IL-17A/F antihumanos descritos en la presente en un medio de ensayo, se agregaron a las placas que contenían las células y se incubaron juntas a 37 °C con 5 % de CO2 durante 4 horas. Después de la incubación, se retiró el medio, y las células se lisaron antes de ser leídas en el luminómetro de Berthold Centro XS3 (Berthold Technologies, Wildbad, Alemania) usando sustrato flash (Promega Corporation, Madison, WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El aumento de la intensidad de fluorescencia media (mediante la activación del indicador de luciferasa NF-kB) fue un indicio de la interacción entre el receptor de IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas y el ligando. La disminución de la intensidad de la fluorescencia media fue un indicio de la neutralización de la interacción entre el receptor de IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas y el ligando. Los valores de CI50 (concentración inhibidora al 50 %) se calcularon con el software GraphPad Prism®4 (GraphPad Software, Inc., San Diego CA) para cada anticuerpo IL-17A/F antihumano.
Actividad del bioensayo del panel quimérico e injertado con CDR de humanización de IL-17A/F antihumana; resultados del ensayo del indicador de luciferasa NIH/3T3/KZ170 NF-kB
Las IL-17A, IL-17A/F e IL-17F inducen la activación del indicador de luciferasa NF-kB en una manera dependiente de la dosis con una concentración de CE50 que, según se determinó, fue 0,15 nM para IL-17A, 0,50 nM para IL-17A/F y 0,50 nM para IL-17F. Las Tablas 1 y 2 representan los datos CI50 de ejemplo para los anticuerpos anti-IL-17A/F descritos en la presente.
Tabla 1
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Tabla de la actividad del bioensayo del panel injertado con CDR de humanización de IL-17A/F antihumana con retromutación de marco: Resultados del ensayo del indicador de luciferasa NIH/3T3/KZ170 NF-kB
Tabla 2
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Actividad Biacore del panel de humanización IL-17A/F antihumana; medición de la afinidad de fijación a IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas mediante resonancia de plasmones superficiales (Biacore)
Los anticuerpos monoclonales IL-17A/F antihumanos humanizados se evaluaron para determinar su afinidad de fijación a IL-17A humana, IL-17A/F humana e IL-17F humana usando resonancia de plasmones superficiales.
Las constantes de velocidad cinética y las constantes de disociación en equilibrio se midieron para determinar la interacción entre los anticuerpos IL-17A/F antihumanos humanizados y las IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas mediante resonancia de plasmones superficiales. La constante de velocidad de asociación (ka (M 'V 1)) es un valor que refleja la velocidad de la formación del complejo antígeno-anticuerpo. La constante de velocidad de disociación (kd (s1)) es un valor que refleja la estabilidad de este complejo. Al dividir la constante de velocidad de disociación por la constante de velocidad de asociación (kd/ka), se obtiene la constante de disociación en equilibrio (Kd (M)). Este valor describe la afinidad de fijación de la interacción. Los anticuerpos con Kd similares pueden tener constantes de velocidades de asociación y disociación que varían ampliamente. En consecuencia, la medición de ka y kd de los anticuerpos ayuda a describir de manera más precisa la afinidad de la interacción entre el anticuerpo y el antígeno.
Los estudios de afinidad y cinética de fijación se realizaron en un sistema BIACORE® T100 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Los métodos para BIACORE® T100 se programaron con el software de control BIACORE® T100, v 2.0. Para estos experimentos, los anticuerpos IL-17A/F antihumanos humanizados se capturaron en un chip sensor CM4 mediante un anticuerpo Fc-gamma IgG antihumano de cabra (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) o un anticuerpo Fc-gamma IgG antirratón de cabra (Jackson ImmunoResearch). Los experimentos de fijación a las moléculas de IL-17 se realizaron a 25 °C en un amortiguador de 10 nM de HEPES, 150 nM de NaCl, 3 nM de EDTA, 0,05 % de tensioactivo P20 (GE Healthcare) y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino a pH 7,4.
El anticuerpo de captura, Fc-gamma IgG antihumano de cabra, se diluyó a una concentración de 20 pg/ml en 10 nM de acetato de sodio a pH 5,0 y luego se inmovilizó de manera covalente a las cuatro celdas de flujo de un chip sensor CM4 usando química de acoplamiento de amina (EDC:NHS). Después de la inmovilización del anticuerpo, los sitios activos restantes en la celda de flujo se bloquearon con etanolamina 1 M. La densidad obtenida del anticuerpo de captura fue de aproximadamente 5000 RU. Los anticuerpos IL-17A/F antihumanos humanizados se capturaron en las celdas de flujo 2, 3 o 4 del chip CM4 a una densidad en el rango de 60-150 RU. La captura de los anticuerpos de prueba en la superficie inmovilizada se realizó a una velocidad de flujo de 10 pl/min. El instrumento BIACORE® mide la masa de proteína unida a la superficie del chip sensor y, por ello, se verificó la captura del anticuerpo de prueba para cada ciclo. Las diluciones en serie de IL-17A, IL-17A/F o IL-17F humanas (ZymoGenetics, A Bristol-Myers, Squibb Company, Seattle, WA, EE. UU.) se prepararon de 100 nM - 0,032 nM (1:5 diluciones en serie). Las diluciones en serie se inyectaron sobre la superficie y se fijaron específicamente al anticuerpo de prueba capturado en el chip sensor. Las inyecciones por duplicado de cada concentración de antígeno se realizaron con un tiempo de asociación de 7 minutos y un tiempo de disociación de 15 minutos. Los estudios de fijación cinética se realizaron con una velocidad de flujo de 50 pl/min. Entre los ciclos, la celda de flujo se lavó con 20 nM de ácido clorhídrico para regenerar la superficie. Esta etapa de lavado removió tanto el anticuerpo de prueba capturado como cualquier antígeno fijado de la superficie del anticuerpo inmovilizado. El anticuerpo de prueba luego se capturó de nuevo en el siguiente ciclo.
Los datos se recopilaron usando el software de evaluación BIACORE® T100 (versión 2.0). Los datos se procesaron restando la celda de flujo de referencia y las inyecciones blanco. Se evaluó la estabilidad inicial para garantizar que la etapa de regeneración haya proporcionado una superficie de fijación consistente durante toda la secuencia de inyecciones. Las curvas de inyección por duplicado se verificaron para determinar su reproducibilidad. En función de la fijación de las moléculas IL-17 bivalentes a un anticuerpo bivalente, se determinó que el modelo de interacción de fijación del analito bivalente era adecuado para las interacciones con las moléculas IL-17. El modelo del analito bivalente se describió previamente en West, A.P., et al., Biochemistry, 39:9698-9708 (2000); y West, A.P., et al, J. Mol. Biol., 313:385-397 (2001). La constante de afinidad (Kdi) en el modelo del analito bivalente se puede calcular de la relación entre las constantes de velocidad (kdi/kai) determinadas por resonancia de plasmones superficiales. Las curvas de fijación restadas de referencia se ajustaron globalmente al modelo de fijación adecuado con un Rmax múltiple y con el RI configurado en cero. Los datos se ajustaron bien a los modelos de fijación con una buena concordancia entre las curvas de fijación experimentales y teóricas. Los errores estándares y chi2 asociados a los ajustes fueron pocos. No hubo tendencias en los errores residuales.
Actividad Biacore del panel de humanización de IL-17A/F antihumano
Los resultados de los experimentos de fijación con IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas se indican en las Tablas 3, 4 y 5, respectivamente.
Afinidad de fijación de anticuerpos humanizados IL-17A/F antihumanos para IL-17A
Tabla 3
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continuación
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Afinidad de fijación de anticuerpos humanizados anti-IL-17A/F para IL-17A/F
Tabla 4
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Afinidad de fijación de anticuerpos humanizados anti-IL-17A/F para IL-17F
Tabla 5
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Ejemplo 2
Selección de anticuerpos 7B7 y generación de hibridomas
Método de agrupamiento en intervalos (binning) de epítopos mediante tecnología de resonancia de plasmones superficiales (Biacore) a grupos de anticuerpos en función de sus propiedades de fijación y bloqueo, como se muestra en la Figura 11.
Los anticuerpos se agruparon y seleccionaron según su capacidad para:
1. Fijarse específicamente al subdominio p19 solo de IL-23;
2. Bloquear específicamente solo el receptor de IL-23 (IL-23R) y no bloquear el receptor de IL-12 (IL-12R); y 3. No competir con ningún anticuerpo que pudiera fijarse específicamente al subdominio p40 de IL-23
Se seleccionaron materiales, tales como anticuerpos con selectividad previamente conocida de los subdominios p19 o p40 de IL-23, IL-23R o IL-12R, para recubrirlos en un chip BIACORE® CM5. La densidad del recubrimiento varió entre 500 y 8000 unidades de resonancia (RU). Los anticuerpos agrupados en intervalos se titularon en serie (1:2 o 1:3) a 8 concentraciones, desde las concentraciones de inicio en un rango de 10 a 100 pg/ml en una placa ELISA de 96 cavidades. A cada cavidad, se agregaron 10 nM de antígeno IL-23. Los anticuerpos en la placa formaron un complejo con antígeno y alcanzaron el equilibrio durante la noche a 4 °C. Los complejos se inyectaron en el chip CM5 a una velocidad de flujo de 20 pL/min durante dos minutos. Se observó la señal, como unidad de resonancia (RU) de fijación, al finalizar los dos minutos. El complejo anticuerpo-antígeno pudo competir o no competir con el material recubierto en el chip. Si el anticuerpo en complejo con el antígeno compitió con el material en el chip, con una concentración creciente del anticuerpo, la RU de fijación disminuyó, y si no compitió, la RU de fijación aumentó. Sobre la base de esta observación, todos los anticuerpos anti-IL23 se agruparon en intervalos de acuerdo con su selectividad de fijación y capacidad de competir.
Los ratones transgénicos HCo12 J/K de HUMAB® de las colonias Medarex en Milpitas, CA se inmunizaron con IL-23-his humana recombinante en el adyuvante RIBI.
El suero de los ratones inmunizados se evaluó para determinar la expresión de anticuerpos específicos IL-23 mediante ELISA dual indirecto modificado. En síntesis, las placas de microtitulación (COSTAR®, fondo plano, 96 cavidades, #9018) se recubrieron con proteína anti-his de ratón a 2,5 pg/ml en PBS, 50 l/cavidad, se incubaron a 4 °C durante la noche y luego se bloquearon con 1 % de BSA en PBS. Se agregó HuIL-23 a 2,5 pg/ml o HuIL-12 a las placas para la captura a razón de 50 pl/cavidad y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron con PBS Tween, y se agregaron diluciones de suero y se incubaron durante 1 hora. Las placas se lavaron con PBS-Tween y se incubaron con cadena pesada gamma antihumana de cabra conjugada con HRP (Jackson ImmunoResearch Cat.
109-036-098) durante 1 hora. Después de 3x lavados, las placas se desarrollaron con sustrato ABTS (Moss, CAT #ABTS-1000), y el OD se analizó a 415 nm. Los datos se analizaron y expresaron como título de suero, que se define como la más alta dilución de suero que da como resultado una señal positiva de antígeno de al menos dos veces el fondo. Se seleccionó el ratón 215094 para la generación de hibridomas en función de los títulos relativamente altos en IL-23 con una menor reactividad cruzada con IL-12, en comparación con otros ratones de la cohorte (véase la Tabla 6 ).
Tabla . Títulos de suero
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El genotipo de ratón 215094 se proporciona a continuación en la Tabla 7.
Tabla 7 Genoti o de ratón 215094
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Se usó el bazo del ratón 215094 para generar hibridomas con células de mieloma de ratón (ATCC CRL-1580) mediante electrofusión en campo eléctrico usando un dispositivo de electroporación de fusión celular de cámara grande CytoPulse en un procedimiento denominado fusión 2378.
Los medios condicionados de los hibridomas resultantes primero se cribaron para determinar la expresión de IgG y/k humana en un ensayo automatizado estándar y luego se realizó ELISA para la fijación a IL-23 con un ELISA de cribado inverso en IL-12 para identificar clones específicos, como se describió previamente. Los criterios de selección de hibridomas para la evaluación fueron muestras con un OD mayor de 1,5 en placas huIL23 y menor de 0,15 en huIL12.
La fusión 2378 generó un total de 827 hibridomas positivos IgG humanos de los cuales 128 fueron específicos de IL-23. El hibridoma 7B7 se seleccionó para realizar más ensayos en función de su fuerte fijación a IL-23 y la ausencia de reactividad cruzada con IL-12, en comparación con los anticuerpos de control positivos anti-p19 y anti-p40; en la Figura 7, se indica un ejemplo de hibridomas que incluyen 7B7 seleccionados mediante ELISA. El isotipo del subclón 7B7.D4 se confirmó como IgG1 humana, kappa mediante ELISA.
El medio condicionado con hibridomas de todos los MAb específicos de IL-23p-19 se cribó para determinar la actividad neutralizante de IL-23 en un ensayo celular. Se demostró que Kit225, una línea de linfocitos T humanos establecida de un paciente con leucemia linfocítica crónica de linfocitos T, responde a IL-23 con una fosforilación de STAT3 dependiente de la dosis (pSTAT3). Se usó IL-23 humana a CE50 con y sin la adición de medio condicionado con hibridomas o un anticuerpo anti-p19 neutralizante de control para estimular células durante 15 minutos. Las células se lisaron, y la inhibición de la fosforilación de STAT3 dependiente de IL-23 se evaluó mediante ELISA (Cell Signaling Technology, PATHSCAN® Cat #7300), en donde un menor O.D. indica una reducción de los niveles de pSTAT3. El hibridoma 7B7 se seleccionó para la subclonación y caracterización adicional en función de la potente neutralización de la señalización de IL-23 observada en el ensayo Kit225, que se muestra en la Figura 8.
Mediante el uso de ensayos similares a los descritos con anterioridad, se demostró la fijación selectiva de IL-23 y la neutralización de la señalización de IL-23 para el subclón 7B7 1413.2378.7B7.D4.H2, que luego se utilizó para la secuenciación (el dominio variable de la cadena pesada IL-23p19 7B7 se muestra en SEQ ID NO:7, y el dominio variable de la cadena ligera se muestra en SEQ ID NO:9).
Ejemplo 3
Generación de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos
Construcción y expresión de moléculas biespecíficas IL-23/IL-17A/F antihumanas de mamífero
Se sintetizaron genes parciales o totales en GeneART, Inc (GeneART, Inc. Burlingame, CA, EE. UU.) o GenScript (GenScript, Piscataway, NJ, EE. UU.) y se insertaron en pTT5, un vector de expresión transitorio HEK293-6E (NCR Biotechnology Research Institute, Ottawa, ON, Canadá) mediante clonación de enzimas de restricción. MVC1059 (SEQ ID NO:62) y MVC1061 (SEQ ID NO:60) se encargaron como constructos completos de GenScript (GenScript, Piscataway, NJ, Ee . UU.). Todos los constructos se expresaron usando la secuencia de señales mod2610 (SEQ ID NO:30). biAbFabL es un anticuerpo biespecífico que contiene un anticuerpo completo con una unidad Fab del terminal C del segundo brazo del anticuerpo biespecífico unido mediante un ligador (por ejemplo, 10mer G4S) y utiliza una cadena ligera común (véase la Figura 2). taFab es un anticuerpo biespecífico que contiene un anticuerpo completo con una unidad Fab del terminal N del segundo brazo del anticuerpo biespecífico unido mediante un ligador, tal como (Gly4Ser-i)x, en donde x es 1, 2 o 3, y el ligador de SEQ ID NO:12. Al igual que sucede con la porción de la cadena pesada, hay dos cadenas ligeras para cada brazo del anticuerpo biespecífico unido mediante un ligador, tal como (Gly4Ser-i)x, en donde x es 1, 2 o 3, y el ligador de SEQ ID NO:12 (véase la Figura 3). El Fc heterodimérico es un anticuerpo biespecífico que se asemeja a un anticuerpo tradicional y, sin embargo, contiene dos cadenas pesadas diferentes que se asocian a través de una asociación de complementariedad electrostática en la región Ch3. El Fc heterodimérico utiliza una cadena ligera común (véase la Figura 4). Las regiones constantes de la cadena pesada y de la cadena ligera incluyen IgG1.1 (SEQ ID NO:11, que puede ser codificada por SEQ ID NO:82), IgG1.1f sin lisina del terminal C (SEQ ID NO:127), IgG1.1f con una lisina del terminal C (SEQ ID NO:128), región constante kappa humana (SEQ ID NO:10, que puede ser codificada por SEQ ID NO:83), o IgG4.1 (SEQ ID NO:8 ). El dominio constante de la cadena pesada de IgG4 puede ser una variante de IgG4 de tipo silvestre que tiene una mutación en la región bisagra, S228P (sistema de numeración del índice de la UE) o S241P (sistema de numeración Kabat). El cambio de serina en 241 (Kabat) a prolina (que se encuentra en esa posición en IgG1 e IgG2) en una cadena pesada quimérica de ratón/humana genera la producción de un anticuerpo homogéneo y elimina la heterogeneidad. Además, la variante de IgG4 tiene una vida media sérica considerablemente extendida y muestra una mejor distribución del tejido en comparación con la IgG4 quimérica original. Angal et al., Molecular Immunology, 30(1):105-108 (1993); Schuurman et al., Molecular Immunology, 38:1-8 (2 0 0 1 ); Lewis et al., Molecular Immunology, 46:3488-3494 (2009).
La transformación de las células huéspedes de E. coli electrocompetentes (DH10B) se realizó con 1 pl de la preparación de ADN de levadura y 20 pl de células de E. coli. Las células se electropulsaron a 2,0 kV, 25 pF y 400 ohm. Después de la electroporación, se agregaron 600 pl de SOC (2 % de BACTO® Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5 % de extracto de levadura (Difco), 10 nM de NaCl, 2,5 nM de KCl, 10 nM de MgCh, 10 nM de MgSO4, 20 nM de glucosa), y las células se colocaron en placas en 50 pl y 550 pl alícuotas en dos placas LB AMP (cultivo LB (Lennox), 1,8 % de BACTO® Agar (Difco), 100 mg/l de ampicilina).
Cinco colonias de cada constructo se sometieron a análisis de secuencia. Se seleccionó un clon que contenía la secuencia correcta. Se realizó secuenciación de ADN usando ABI PRISM® BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las reacciones de secuenciación se purificaron con cartuchos de filtración de gel Edge BioSystems Preforma Centriflex (Gaithersburg, MD) y se corrieron en un analizador de ADN de Applied Biosystems 3730 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los datos de las secuencias resultantes se agruparon y se editaron con el software SEQUENCHER® v4.6 (GeneCodes Corporation, Ann Arbor, MI.). Se seleccionó un clon que contenía la secuencia correcta, y se aisló ADN plasmídico a gran escala usando un kit disponible en el comercio (QIAGEN® Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Las células de suspensión HEK293-6E se transfectaron con los constructos de expresión usando un reactivo de polietilenimina y se cultivaron en un medio F17 (Invitrogen, Grand Island, NY, EE. u U.) con la adición de 5 nM de L-glutamina y 25 pg/ml de G418. Después de 24 horas, se agregó 1/40 volumen de Tryptone NI al 20 % (Organotechnie SAS, La Courneuve, FR). Aproximadamente 120 horas después de la transfección, se recolectó el medio condicionado y se hizo pasar a través de un filtro de 0,2 pm. La proteína se purificó del medio condicionado filtrado usando una combinación de cromatografía por afinidad Mab Select SuRe™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.) y cromatografía de exclusión por tamaño SUPERDEX® 200 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.). El contenido se calculó mediante la absorbancia a UV-A280 nm, y la calidad se evaluó mediante cromatografía de líquidos de alta resolución, de exclusión por tamaño y analítica, s Ds PAGE y transferencia Western.
Composición de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos
Un anticuerpo completo y sus componentes modulares se representan en la Figura 1. El formato de biAbFabL se representa en la Figura 2. El formato de taFab se representa en la Figura 3. El formato de Fc heterodimérico se representa en la Figura 4. El formato de VCVFc se representa en la Figura 5. El formato de VCDFc se representa en la Figura 6.
Actividad del bioensayo de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos; ensayo del indicador de luciferasa NIH/3T3/KZ170 NF-kB para medir la actividad de IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas mediante la inducción de NF-kB
El material y los métodos de este ensayo se describieron en el Ejemplo 1.
Actividad del bioensayo de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos; ensayo fosfo-STAT3 de transfectantes Baf3/huIL-23Ro/huIL-12R@1 para medir la actividad de IL-23 humana mediante la inducción de fosfo-STAT3
Una línea celular derivada de la médula ósea murina (Baf3) se transfectó de manera estable con IL-23Ra humana e IL-12Rp1 humana, y se clonó. Las células del clon 6 Baf3/huIL-23Ra/huIL-12Rp1 se lavaron tres veces con un medio de ensayo (RPMI 1640 más 10 % de suero bovino fetal, 2 nM de L-glutamina, 1 nM de piruvato de sodio (HyClone Laboratories, South Logan, UT), y 2 pM de p-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)) antes de colocarlas en placas a razón de 50.000 células/cavidad en placas de cultivo tisular de fondo redondo de 96 cavidades. Se realizaron diluciones en serie de IL-23 humana recombinante (ZymoGenetics, A Bristol-Myers Squibb Company, Seattle WA, EE. UU.) en un medio de ensayo, se agregaron a las placas que contenían las células y se incubaron juntas a 37 °C con 5 % de CO2 durante 15 minutos. El ensayo también se usó para medir la neutralización de la actividad de IL-23. Una concentración máxima media (CE50, concentración eficaz al 50 %) de IL-23 se combinó con diluciones en serie de anticuerpos IL-23/IL-17A/F antihumanos descritos en la presente y se incubaron juntos a 37 °C con 5% de CO2 durante 15 minutos en un medio de ensayo antes de agregarlos a las células. Después de la incubación previa, se agregaron los tratamientos a las placas que contenían las células y se incubaron juntas a 37 °C con 5 % de CO2 durante 15 minutos. Después de la incubación, las células se lavaron con un amortiguador de lavado helado y se colocaron sobre hielo para detener la reacción de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BIO-PLEX® Cell Lysis Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Luego las células se centrifugaron a 2000 rpm, a 4 °C durante 5 minutos antes de desechar el medio. Se agregaron 50 pl/cavidad de amortiguador de lisis a cada cavidad; los lisados se agitaron con la pipeta hacia arriba y hacia abajo cinco veces mientras estaban en hielo y se agitaron en un agitador de placas durante 20 minutos a 300 rpm y 4 °C. Las placas se centrifugaron a 3200 rpm, a 4 °C durante 20 minutos. Los sobrenadantes se recolectaron y se transfirieron a una nueva placa de microtitulación para el almacenamiento a -80 °C.
Las microesferas de captura (BIO-PLEX® Phospho-STAT3 Assay, Bio-Rad Laboratories) se combinaron con 50 pl de 1:1 de lisados diluidos y se agregaron a una placa de filtro de 96 cavidades de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BIO-PLEX® Phosphoprotein Detection Kit, Bio-Rad Laboratories). La placa recubierta con papel de aluminio se incubó durante la noche a temperatura ambiente mientras se agitaba a 300 rpm. La placa se transfirió a un aparato de microtitulación al vacío y se lavó tres veces con amortiguador de lavado. Después de la adición de 25 pl/cavidad de anticuerpo de detección, la placa recubierta con papel de aluminio se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos mientas se agitaba a 300 rpm. La placa se filtró y se lavó tres veces con amortiguador de lavado. Se agregó estreptavidina-PE (50 pl/cavidad), y la placa recubierta con papel de aluminio se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos mientas se agitaba a 300 rpm. La placa se filtró y se lavó tres veces con amortiguador de resuspensión de microesferas. Después del lavado final, las microesferas se volvieron a suspender en 125 pl/cavidad de amortiguador de suspensión de microesferas, se agitó durante 30 segundos y se leyó en un lector de matriz (BIO-PLEX® 100, Bio-Rad Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos se analizaron con el software analítico (BIO-PLEX® Manager 4.1, Bio-Rad Laboratories). El aumento del nivel del factor de transcripción STAT3 fosforilado presente en los lisados es un indicio de la interacción entre el receptor de IL-23 y el ligando. La disminución del nivel del factor de transcripción STAT3 fosforilado presente en los lisados es un indicio de la neutralización de la interacción entre el receptor de IL-23 y el ligando. Los valores de CI50 (concentración inhibidora al 50 %) se calcularon con el software GraphPad Prism®4 (GraphPad Software, Inc., San Diego CA) para cada anticuerpo IL-23/IL-17A/F antihumano.
Actividad del bioensayo de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos; resultados del ensayo del indicador de luciferasa NIH/3T3/KZ170 NF-kB y del ensayo fosfo-STAT3 de transfectantes Baf3/huIL-23Ro/huIL-12R@1
Las IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas inducen la activación del indicador de luciferasa NF-kB en una manera dependiente de la dosis con una concentración CE50 que, según se determinó, fue 0,33 nM para IL-17A, 1 nM para IL-17A/F y 1 nM para IL-17F, e IL-23 induce la fosforilación de STAT3 en una manera dependiente de la dosis con una concentración CE50 que, según se determinó, fue 0,02 nM. Los datos de CI50 para los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos se muestran a continuación en la Tabla 8.
Tabla de anticuerpos biespecíficos IL-23/17A/F antihumanos
Tabla
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Actividad del bioensayo de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos; ensayo de SAEC humanas primarias para medir la actividad de IL-17A, IL-17AF e IL-17F humanas mediante la inducción de G-CSF
Las células epiteliales de las vías aéreas pequeñas humanas primarias (SAEC) se sembraron a razón de 8.000 células/cavidad en un medio de desarrollo epitelial de las vías aéreas pequeñas (SAGM) (células y medios: Lonza, Walkersville, MD) en placas de cultivo tisular de fondo plano de 96 cavidades (Corning Incorporated, Corning, NY) y se incubaron durante la noche a 37 °C con 5 % de CO2. Al día siguiente, se realizaron diluciones en serie de IL-17A, IL-17A/F o IL-17F humanas (ZymoGenetics, A Bristol-Myers Squibb Company, Seattle WA, EE. UU.) en un medio SAGM, se agregaron a las placas que contenían las células y se incubaron juntas a 37 °C con 5 % de CO2 durante 24 horas. Además, el ensayo se usó para medir la neutralización de la actividad de IL-17A, IL-17A/F e IL-17F. Una concentración máxima media (CE50, concentración eficaz al 50%) de IL-17A, IL-17A/F o IL-17F se combinó con diluciones en serie de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos descritos en la presente en un medio SAGM, se agregaron a las placas que contenían las células y se incubaron juntas a 37 °C con 5 % de CO2 durante 24 horas. Después de la incubación, los sobrenadantes se centrifugaron, se recolectaron y se congelaron a 80 °C hasta que estuvieron listos para procesarlos. Los niveles proteicos del G-CSF humano en los sobrenadantes se midieron con un ensayo ELISA de citocina de G-CSF humano basado en microesferas disponible en el comercio de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Procarta/Affymetrix, Santa Clara, CA). El aumento de los niveles de G-CSF humano en el sobrenadante fue un indicio de la interacción entre el receptor de IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas y el ligando. La disminución de los niveles de G-CSF humano en el sobrenadante fue un indicio de la neutralización de la interacción entre el receptor de IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas y el ligando. Los valores de CI50 (concentración inhibidora al 50 %) se calcularon con el software GraphPad Prism®4 (GraphPad Software, Inc., San Diego CA) para cada anticuerpo biespecífico IL-23/IL-17A/F antihumano.
Actividad del bioensayo de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos; resultados del ensayo de SAEC humano primario
Las IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas inducen la producción de G-CSF humano en una manera dependiente de la dosis con una concentración CE50 que, según se determinó, fue 0,03 nM para IL-17A, 3 nM para IL-17A/F y 3 nM para IL-17F. Los anticuerpos biespecíficos evaluados incluyen 23/17bAb1 (SEQ ID NO:28 y s Eq ID NO:17), 23/17bAb2 (SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:17), 23/17bAb3 (SEQ ID NO:74 y SEQ ID NO:17), 23/17bAb4 (SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:17). También se evaluó el anticuerpo IL-17A/F antihumano humanizado 339-134 mAb (SEQ ID NO:65 y SEQ ID NO:67). Los datos de CI50 para los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos se muestran a continuación en la Tabla 9. Estos datos indican que los anticuerpos biespecíficos anti-IL-23/IL-17A/F que inhiben la producción de IL- 6 mediada por IL-17A, IL-17A/F, IL-17F humanas fueron igualmente potentes.
Actividad del bioensayo de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos; ensayo de fibroblastos humanos primarios para medir la actividad de IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas mediante la inducción de IL-6
Una línea celular de fibroblastos humanos primarios (HFFF2, Cat #86031405, Health Protection Agency Culture Collections, Porton Down Salisbury, Reino Unido) se sembró a razón de 5.000 células/cavidad en un medio de ensayo (DMEM más 10 % de FBS y 2 nM de L-glutamina (HyClone Laboratories, South Logan, UT)) en placas de fondo plano de 96 cavidades (Corning Incorporated, Corning, NY) y se incubaron durante la noche a 37 °C con 5 % de CO2. Al día siguiente, se realizaron diluciones en serie de IL-17A, IL-17AF o IL-17F humanas recombinantes (ZymoGenetics, A Bristol-Myers Squibb Company, Seattle WA, 98117) en un medio de ensayo, se agregaron a las placas que contenían las células y se incubaron juntas a 37 °C con 5 % de CO2 durante 24 horas. Además, el ensayo se usó para medir la neutralización de la actividad de IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas. Una concentración máxima media (CE50, concentración eficaz al 50 %) de IL-17A, IL-17A/F o IL-17F humanas se combinó con diluciones en serie de anticuerpos IL-23/IL-17A/F antihumanos descritos en la presente en un medio de ensayo, se agregaron a las placas que contenían las células y se incubaron juntas a 37 °C con 5 % de CO2 durante 24 horas. Después de la incubación, los sobrenadantes se centrifugaron, se recolectaron y se congelaron a 80 °C hasta que estuvieron listos para procesarlos. Los niveles proteicos del IL- 6 humana en los sobrenadantes se midieron con un ensayo ELISA de citocina de IL-6 humana basado en microesferas disponible en el comercio de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). El aumento de los niveles de IL- 6 humana en el sobrenadante fue un indicio de la interacción entre el receptor de IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas y el ligando. La disminución de los niveles de IL-6 humana en el sobrenadante fue un indicio de la neutralización de la interacción entre el receptor de IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas y el ligando. Los valores de CI50 (concentración inhibidora al 50 %) se calcularon con el software GraphPad Prism®4 (GraphPad Software, Inc., San Diego CA) para cada anticuerpo biespecífico IL-23/IL-17A/F antihumano.
Actividad del bioensayo de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos; resultados del ensayo de fibroblastos humanos primarios
Las IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas inducen la producción de IL- 6 humana en una manera dependiente de la dosis con una concentración CE50 que, según se determinó, fue 0,08 nM para IL-17A, 25 nM para IL-17AF y 25 nM para IL-17F. Los anticuerpos biespecíficos evaluados incluyen 23/17bAb1 (Se Q ID NO:28 y Se Q ID NO:17), 23/17bAb2 (SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:17), 23/17bAb3 (SEQ ID NO:74 y SEQ ID NO:17), 23/17bAb4 (SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:17). También se evaluó el anticuerpo IL-17A/F antihumano humanizado mAb 339-134 (SEQ ID NO:64 y SEQ ID NO:6 6 ). Los datos de CI50 para los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos se muestran a continuación en la Tabla 9. Estos datos indican que los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos que inhiben la producción de IL- 6 mediada por IL-17A, IL-17A/F, IL-17F humanas fueron igualmente potentes.
Actividad del bioensayo de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos; ensayo de esplenocitos murinos para medir la actividad de IL-23 humana mediante la inducción de IL-17A e IL-17F murinas
Se preparó una sola suspensión celular de esplenocitos murinos de bazos enteros recolectados de ratones BALB/c. Después de la lisis de los glóbulos rojos con amortiguador ACK (KHCO30,010 M, EDTA 0,0001 M, NH4Cl 0,150 M, pH 7,2), los esplenocitos se lavaron y se volvieron a suspender en un medio de ensayo (RPMI 1640 más 10 % de FBS, aminoácidos no esenciales, 1 nM de piruvato de sodio, 2 nM de L-glutamina, 10 nM de HEPES, 100 unidades/m de Pen/Strep (HyClone Laboratories, South Logan, UT), 50 uM de 2-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y 50 ng/ml de IL-2 humana (R&D Systems, Minneapolis, MN)). Los esplenocitos se sembraron a razón de 500.000 células por cavidad en placas de fondo redondo de 96 cavidades. Se realizaron diluciones en serie de IL-23 humana recombinante (material heterodimérico BDC 50220AN087) en un medio de ensayo, se agregaron a las placas que contenían las células y se incubaron juntas a 37 °C con 5 % de CO2 durante 24 horas. El ensayo también se usó para medir la neutralización de la actividad de IL-23 humana. Una concentración máxima media (CE50, concentración eficaz al 50%) de IL-23 se combinó con diluciones en serie de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos descritos en la presente y se incubaron juntos a 37 °C con 5 % de CO2 durante 15 minutos en un medio de ensayo antes de agregarlos a las células. Después de la incubación previa, se agregaron los tratamientos a las placas que contenían las células y se incubaron juntas a 37 °C con 5 % de CO2 durante 24 horas. Después de la incubación, los sobrenadantes se centrifugaron, se recolectaron y se congelaron a 80 °C hasta que estuvieron listos para procesarlos. Los niveles proteicos de IL-17A e IL-17F murinas en los sobrenadantes se midieron con un ensayo ELISA de IL-17A e IL-17F murinas basado en placas disponible en el comercio de acuerdo con las instrucciones del fabricante (eBiosciences, San Diego, CA). El aumento de los niveles de IL-17A e IL-17F murinas en el sobrenadante fue un indicio de la interacción entre el receptor de IL-23 y el ligando. La disminución de los niveles de IL-17A e IL-17F murinas en el sobrenadante fue un indicio de la neutralización de la interacción entre el receptor de IL-23 y el ligando. Los valores de CI50 (concentración inhibidora al 50 %) se calcularon con el software GraphPad Prism®4 (GraphPad Software, Inc., San Diego CA) para cada anticuerpo biespecífico IL-23/IL-17A/F antihumano.
Actividad del bioensayo de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos; resultados del ensayo de esplenocitos murinos
La IL-23 humana indujo las IL-17A e IL-17F murinas en una manera dependiente de la dosis con una concentración CE50 que, según se determinó, fue 0,01 nM. Los anticuerpos biespecíficos evaluados incluyen 23/17bAb1 (SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:17), 23/17bAb2 (SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:17), 23/17bAb3 (SEQ ID NO:74 y SEQ ID NO:17), 23/17bAb4 (SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:17). También se evaluó el mAb (7B7) IL-23.6 antihumano (SEQ ID NO:68 y SEQ ID NO:17). Los datos de CI50 para los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos se muestran a continuación en la Tabla 9. Estos datos indican que los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos inhiben la producción de IL-17A e IL-17F murinas inducida por IL-23 humana.
Actividad del bioensayo de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos; ensayo fosfo-STAT3 de linfocitos T humanos primarios para medir la actividad de IL-23 humana mediante la inducción de fosfo-STAT3
PBMC obtenidas mediante leucoféresis: Se seleccionaron al azar donantes humanos sanos (grupo de donantes sanos de ZymoGenetics) y se sometieron voluntariamente a la técnica de aféresis en el centro de investigación contra el cáncer FHCRC (Seattle, WA). Las PBMC obtenidas mediante leucoféresis se enviaron a ZymoGenetics en una bolsa estéril para la extracción sanguínea. Las células se vertieron en una botella de plástico estéril de 500 ml, se diluyeron hasta 400 ml con PBS a temperatura ambiente más 1 nM de EDTA (HyClone Laboratories, South Logan, UT) y se transfirieron a tubos cónicos de 250 ml. Los tubos de 250 ml se centrifugaron a 1500 rpm durante 10 minutos para convertir las células en pelets. Luego el sobrenadante celular se retiró y se desechó. Los pelets celulares se combinaron y se suspendieron en 400 ml de PBS más 1 nM de EDTA. La suspensión celular (25 ml/tubo) se revistió con FICOLL® (20 ml/tubo) en tubos cónicos de 50 ml (total de 16 tubos). Los tubos se centrifugaron a 2000 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente. La capa de la interfase ("capa leucocítica") que contenía los glóbulos blancos y las plaquetas residuales se recolectó, se agrupó y se lavó de manera reiterada con PBS más 1 nM de EDTA hasta que se retiraron la mayoría de las plaquetas. Luego los glóbulos blancos se suspendieron en 100 ml de medio de criopreservación helado (70% de RPMI 1640, 20% de FCS, 10% de DMSO (HyClone Laboratories)) y se distribuyeron en crioviales estériles (1 ml células/vial). Los crioviales se colocaron en un congelador a 80 °C durante 24 horas antes de transferirlos a un congelador de nitrógeno líquido. El rendimiento de los glóbulos blancos de una aféresis típica es de 0,5 - 1,0 x 1010 células. Las células de aféresis procesadas de esta manera contienen linfocitos T, linfocitos B, células NK, monocitos y células dendríticas.
Preparación de linfocitos T activados: Los linfocitos T deben ser activos para poder expresar el receptor de IL-12 y responder a IL-12 e IL-23. Las PBMC crioconservadas obtenidas mediante leucoféresis se descongelaron, se transfirieron a un tubo cónico estéril de 50 ml, se lavaron con 50 ml de un medio de ensayo caliente (RPMI 1640 más 10 % de FBS (HyClone Laboratories)) y se incubaron en un baño de agua a 37 °C durante 1 hora para que las células se recuperaran. Luego las células se centrifugaron, y el sobrenadante celular se desechó. El pelet celular se volvió a suspender en un medio de ensayo y se distribuyó en matraces de cultivo tisular estériles de 162 cm2 a razón de 2 x 107 células por matraz en 90 ml de un medio de ensayo que contenía 5 pg/ml de PHA-M (Roche, Basilea, Suiza). Las células se cultivaron a 37 °C en una incubadora húmeda durante un total de 5 días. Las células se dejaron "reposar" al cosecharlas a la tarde del día 4, al reemplazar el medio de cultivo por un medio de ensayo nuevo sin PHA y al regresarlas a la incubadora durante el resto del período de cultivo de 5 días.
Ensayo fosfo-STAT3: Los linfocitos T humanos activados se recolectaron el día 5 del cultivo, se volvieron a suspender en un medio de ensayo nuevo y se colocaron en placas a razón de 2 x 105 células/cavidad en placas de 96 cavidades con fondo en U. Se realizaron diluciones en serie de IL-23 humana recombinante (material heterodimérico BDC 50220AN087) en un medio de ensayo, se agregaron a las placas que contenían las células y se incubaron juntas a 37 °C con 5 % de CO2 durante 15 minutos. El ensayo también se usó para medir la neutralización de la actividad de IL-23. Una concentración máxima media (CE50, concentración eficaz al 50 %) de IL-23 se combinó con diluciones en serie de anticuerpos IL-23/IL-17AF antihumanos descritos en la presente y se incubaron juntos a 37 °C con 5 % de CO2 durante 15 minutos en un medio de ensayo antes de agregarlos a las células. Después de la incubación previa, se agregaron los tratamientos a las placas que contenían las células y se incubaron juntas a 37 °C con 5 % de CO2 durante 15 minutos. Después de la incubación, las células se lavaron con un amortiguador de lavado helado y se colocaron sobre hielo para detener la reacción de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BIO-PLEX® Cell Lysis Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Luego las células se centrifugaron a 2000 rpm, a 4 °C durante 5 minutos antes de desechar el medio. Se agregaron 50 pl/cavidad de amortiguador de lisis a cada cavidad; los lisados se agitaron con la pipeta hacia arriba y hacia abajo cinco veces mientras estaban en hielo y se agitaron en un agitador de placas durante 20 minutos a 300 rpm y 4 °C. Las placas se centrifugaron a 3200 rpm, a 4 °C durante 20 minutos. Los sobrenadantes se recolectaron y se transfirieron a una nueva placa de microtitulación para el almacenamiento a -80 °C.
Las microesferas de captura (BIO-PLEX® Phospho-STAT3 Assay, Bio-Rad Laboratories) se combinaron con 50 pl de 1:1 de lisados diluidos y se agregaron a una placa de filtro de 96 cavidades de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BIO-PLEX® Phosphoprotein Detection Kit, Bio-Rad Laboratories). La placa recubierta con papel de aluminio se incubó durante la noche a temperatura ambiente mientras se agitaba a 300 rpm. La placa se transfirió a un aparato de microtitulación al vacío y se lavó tres veces con amortiguador de lavado. Después de la adición de 25 pl/cavidad de anticuerpo de detección, la placa recubierta con papel de aluminio se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos mientas se agitaba a 300 rpm. La placa se filtró y se lavó tres veces con amortiguador de lavado. Se agregó estreptavidina-PE (50 pl/cavidad), y la placa recubierta con papel de aluminio se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos mientas se agitaba a 300 rpm. La placa se filtró y se lavó tres veces con amortiguador de resuspensión de microesferas. Después del lavado final, las microesferas se volvieron a suspender en 125 pl/cavidad de amortiguador de suspensión de microesferas, se agitó durante 30 segundos y se leyó en un lector de matriz (BIO-PLEX® 100, Bio-Rad Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos se analizaron con el software analítico (BIO-PLEX® Manager 4.1, Bio-Rad Laboratories). El aumento del nivel del factor de transcripción STAT3 fosforilado presente en los lisados es un indicio de la interacción entre el receptor de IL-23 y el ligando. La disminución del nivel del factor de transcripción STAT3 fosforilado presente en los lisados es un indicio de la neutralización de la interacción entre el receptor de IL-23 y el ligando. Los valores de CI50 (concentración inhibidora al 50 %) se calcularon con el software GraphPad Prism®4 (GraphPad Software, Inc., San Diego CA) para cada anticuerpo biespecífico IL-23/IL-17A/F antihumano.
Actividad del bioensayo de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos; resultados del ensayo fosfo-STAT3 de linfocitos T humanos primarios
La IL-23 humana induce la fosforilación de STAT3 en una manera dependiente de la dosis con una concentración CE50 que, según se determinó, fue 0,02 nM. Los anticuerpos biespecíficos evaluados incluyen 23/17bAb1 (SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:17), 23/17bAb2 (SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:17), 23/17bAb3 (SEQ ID NO:74 y SEQ ID NO:17), 23/17bAb4 (SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:17). También se evaluó el mAb (7B7) IL-23.6 antihumano (SEQ ID NO :68 y SEQ ID NO:17). Los datos de CI50 para los anticuerpos IL-23/IL-17A/F antihumanos se muestran a continuación en la Tabla 9.
Actividad del bioensayo de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos; resultados del ensayo de SAEC humanas primarias, ensayo de fibroblastos humanos primarios, ensayo de esplenocitos murinos y fosfo-STAT3 de linfocitos T humanos primarios
Tabla 9
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Actividad de cofijación de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos; ensayo de fibroblastos humanos primarios para medir la inhibición de IL-17A, IL-7A/F o IL-F humanas mientras se encuentran fijadas simultáneamente a IL-23 humana. Ensayo fosfo-STAT3 de linfocitos T humanos primarios para medir la inhibición de IL-23 humana mientras se encuentra fijada simultáneamente a IL-17A, IL-7A/F o IL-17F humanas.
El ensayo de fibroblastos humanos primarios se llevó a cabo en presencia de cantidades en exceso de IL-23 a 30 nM. El ensayo fosfo-STAT3 de linfocitos T humanos primarios se realizó en presencia de cantidades en exceso de IL-17A, IL-17A/F e IL-17F a 30 nM.
Resultados de la cofijación del bioensayo de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos
Los anticuerpos biespecíficos evaluados incluyen 23/17bAb1 (SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:17), 23/17bAb2 (SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:17), 23/17bAb3 (SEQ ID NO:74 y SEQ ID NO:17), 23/17bAb4 (SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:17) y 23/17taFab1 (SEQ ID NO:76 y SEQ ID NO:78). Los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos, cuando se examinaron en presencia de IL-23 humana, no interfirieron en la inhibición de IL-17A, IL-17A/F, IL-17F humanas. Los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos, cuando se examinaron en presencia de IL-17A, IL-17A/F, IL-17F humanas, no interfirieron en la inhibición de IL-23 humana.
Medición de las afinidades de fijación de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos a IL-17A, IL-17A/F, IL-17F humanas e IL-23 humana mediante resonancia de plasmones superficiales (Biacore)
Los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos se evaluaron para determinar su afinidad de fijación a IL-17A humana, IL-17A/F humana, IL-17F humana e IL-23 humana usando resonancia de plasmones superficiales.
La constante de velocidad cinética y la constante de disociación en equilibrio se midieron para determinar la interacción entre los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos y las IL-17A, IL-17A/F, IL-17F humanas e IL-23 humana mediante resonancia de plasmones superficiales. La constante de velocidad de asociación (ka (M-1s-1)) es un valor que refleja la velocidad de la formación del complejo antígeno-anticuerpo. La constante de velocidad de disociación (kd (s1)) es un valor que refleja la estabilidad de este complejo. Al dividir la constante de velocidad de disociación por la constante de velocidad de asociación (kd/ka), se obtiene la constante de disociación en equilibrio (Kd (M)). Este valor describe la afinidad de fijación de la interacción. Los anticuerpos con Kd similares pueden tener constantes de velocidades de asociación y disociación que varían ampliamente. En consecuencia, la medición de ka y kd de los anticuerpos ayuda a describir de manera más precisa la afinidad de la interacción entre el anticuerpo y el antígeno.
Los estudios de afinidad y cinética de fijación se realizaron en un sistema BIACORE® T100 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Los métodos para BIACORE® T100 se programaron con el software de control BIACORE® T100, v 2.0. Para estos experimentos, los anticuerpos monoclonales y biespecíficos se capturaron en un chip sensor CM4 mediante un anticuerpo Fc-gamma IgG antihumano de cabra (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Los experimentos de fijación a las moléculas de IL-17 humanas se realizaron a 25 °C en un amortiguador de 10 nM de h Ep ES, 150 nM de NaCl, 3 nM de EDTA, 0,05 % de tensioactivo P20 (GE Healthcare) y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino a pH 7,4. Los experimentos de fijación al heterodímero de IL-23/IL-12B se realizaron a 25 °C en un amortiguador de 10 nM de HEPES, 500 nM de NaCl, 3 nM de EDTA, 0,05 % de tensioactivo P20 (Biacore) y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino a pH 7,4.
El anticuerpo de captura, Fc-gamma IgG antihumano de cabra, se diluyó a una concentración de 20 pg/ml en 10 nM de acetato de sodio a pH 5,0 y luego se inmovilizó de manera covalente a las cuatro celdas de flujo de un chip sensor CM4 usando química de acoplamiento de amina (EDC:NHS). Después de la inmovilización del anticuerpo, los sitios activos restantes en la celda de flujo se bloquearon con etanolamina 1 M. La densidad obtenida del anticuerpo de captura fue de aproximadamente 5000 RU. Los anticuerpos IL-23/IL-17A/F antihumanos se capturaron en las celdas de flujo 2, 3 o 4 del chip CM4 a una densidad en el rango de 60-150 RU. La captura de los anticuerpos de prueba en la superficie inmovilizada se realizó a una velocidad de flujo de 10 pl/min. El instrumento BIACORE® mide la masa de proteína unida a la superficie del chip sensor y, por ello, se verificó la captura del anticuerpo de prueba para cada ciclo. Las diluciones en serie de IL-17A, IL-17A/F o IL-17F humanas recombinantes (ZymoGenetics, A Bristol-Myers Squibb Company, Seattle, WA, EE. UU.) se prepararon de 100 nM - 0,032 nM (1:5 diluciones en serie), mientras que las diluciones en serie de IL-23 humana recombinante (ZymoGenetics, A Bristol-Myers Squibb Company, Seattle, WA, EE. UU.) se prepararon de 200 nM - 0,064 nM (1:5 diluciones en serie). Las diluciones en serie se inyectaron sobre la superficie y se fijaron específicamente al anticuerpo de prueba capturado en el chip sensor. Las inyecciones por duplicado de cada concentración de antígeno se realizaron con un tiempo de asociación de 7 minutos y un tiempo de disociación de 15 minutos. Los estudios de fijación cinética se realizaron con una velocidad de flujo de 50 pl/min. Entre los ciclos, la celda de flujo se lavó con 20 nM de ácido clorhídrico para regenerar la superficie. Esta etapa de lavado removió tanto el anticuerpo de prueba capturado como cualquier antígeno fijado de la superficie del anticuerpo inmovilizado. El anticuerpo de prueba luego se capturó de nuevo en el siguiente ciclo.
Los datos se recopilaron usando el software de evaluación BIACORE® T100 (versión 2.0). Los datos se procesaron restando la celda de flujo de referencia y las inyecciones blanco. Se evaluó la estabilidad inicial para garantizar que la etapa de regeneración haya proporcionado una superficie de fijación consistente durante toda la secuencia de inyecciones. Las curvas de inyección por duplicado se verificaron para determinar su reproducibilidad. En función de la fijación de las moléculas IL-17 bivalentes a un anticuerpo bivalente, se determinó que el modelo de interacción de fijación del analito bivalente era adecuado para las interacciones con las moléculas IL-17. En función de la fijación del heterodímero de IL-23/IL-12B a un anticuerpo bivalente, se determinó que el modelo de interacción de fijación 1:1 era adecuado para las interacciones con la molécula IL-23. Las curvas de fijación restadas de referencia se ajustaron globalmente al modelo de fijación adecuado con un Rmax múltiple y con el RI configurado en cero. Los datos se ajustaron bien a los modelos de fijación con una buena concordancia entre las curvas de fijación experimentales y teóricas. Los errores estándares y chi2 asociados a los ajustes fueron pocos. No hubo tendencias en los errores residuales.
Actividad Biacore de anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos
Los resultados de los experimentos de fijación con IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas se muestran en las Tablas 10, 11 y 12, respectivamente. Los resultados de los experimentos de fijación con el heterodímero de IL-23/IL-12B humana se muestran en la Tabla 13.
Afinidad de fijación de los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos con IL-17A
Tabla 10
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Afinidad de fijación de los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos con IL-17A/F Tabla 11
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Afinidad de fijación de los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos con IL-17F Tabla 12
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continuación
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Afinidad de fijación de los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos con IL23/IL-12B
Tabla 13
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Cofijación simultánea de IL-17A/F e IL-23 a los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos mediante resonancia de plasmones superficiales (Biacore)
Los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos se evaluaron mediante resonancia de plasmones superficiales para determinar su capacidad de cofijarse de manera simultánea tanto a IL-23 como a IL-17A/F.
Para los experimentos de cofijación en la primera orientación, las moléculas IL-17 humanas se inmovilizaron de manera covalente en las celdas de flujo 2-4 de un chip sensor CM5 usando química de acoplamiento de aminas (EDC:NHS). Después de la inmovilización, los sitios activos restantes en las celdas de flujo se bloquearon con etanolamina 1 M. Las IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas (ZymoGenetics, A Bristol Myers Squibb Company, Seattle, WA, EE. UU.) se inmovilizaron en las celdas de flujo 2, 3 o 4, respectivamente. Los niveles de inmovilización de estas moléculas variaron de 4500 a 5200 RU. La celda de flujo 1 se usó como superficie de referencia. Los anticuerpos biespecíficos se diluyeron posteriormente a 25 o 50 pg/ml, fluyeron sobre la superficie y se capturaron en las celdas de flujo 2-4 del chip sensor. Después de la captura del anticuerpo biespecífico, el heterodímero de IL-23/IL-12B (ZymoGenetics, A Bristol Myers Squibb Company, Seattle, WA, EE. UU.) se diluyó a 500 nM y fluyó sobre la superficie para demostrar la cofijación. Los estudios de fijación se realizaron con una velocidad de flujo de 10 pl/min, un tiempo de asociación de 10 minutos y un tiempo de disociación de 5 minutos.
Para los experimentos de cofijación en la segunda orientación, se inmovilizó de manera covalente un anticuerpo monoclonal IL-12 antihumano de ratón (p40/p70) (BD Pharmingen, San Jose, CA) sobre las celdas de flujo 1-4 de un chip sensor CM5 usando química de acoplamiento de aminas (EDC:NHS). Después de la inmovilización, los sitios activos restantes en las celdas de flujo se bloquearon con etanolamina 1 M. El heterodímero de IL-23/IL-12B humanas (ZymoGenetics, A Bristol Myers Squibb Company, Seattle, WA, EE. UU.) se diluyó a 500 nM y se capturó sobre las celdas de flujo 1-4 mediante la subunidad IL-12B. El nivel de captura de IL-23/IL-12B fue de aproximadamente 4000 RU. Los anticuerpos biespecíficos se diluyeron posteriormente a 25 o 50 pg/ml, fluyeron sobre la superficie y se capturaron mediante la subunidad IL-23 humana en las celdas de flujo 2-4 del chip sensor. La celda de flujo 1 se usó como superficie de referencia. Después de la captura del anticuerpo biespecífico, las IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas (ZymoGenetics, A Bristol Myers Squibb Company, Seattle, WA, EE. UU.) se diluyeron a 500 nM y fluyeron sobre la superficie para demostrar la cofijación. Los estudios de fijación se realizaron con una velocidad de flujo de 10 pl/min, un tiempo de asociación de 10 minutos y un tiempo de disociación de 5 minutos.
Todos los experimentos de fijación se realizaron a 25 °C en un amortiguador de 10 nM de HEPES, 500 nM de NaCl, 3 nM de EDTA, 0,05 % de tensioactivo P20 (GE Healthcare) y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino a pH 7,4. Entre los ciclos, la celda de flujo se lavó con 20 nM de ácido clorhídrico para regenerar la superficie. Esta etapa de lavado removió tanto el anticuerpo de prueba capturado como cualquier antígeno fijado de la superficie del chip Los datos se recopilaron usando el software de evaluación Biacore® T 100 (versión 2.0 ). Los datos se procesaron restando la celda de flujo de referencia y las inyecciones blanco. Se evaluó la estabilidad inicial para garantizar que la etapa de regeneración haya proporcionado una superficie de fijación consistente durante toda la secuencia de inyecciones.
Resultados de la cofijación simultánea de IL-17A/F e IL-23 a los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos mediante resonancia de plasmones superficiales (Biacore)
Los anticuerpos biespecíficos evaluados incluyen 23/17bAb1 (SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:17), 23/17bAb2 (SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:17), 23/17bAb3 (SEQ ID NO:74 y SEQ ID NO:17), 23/17bAb4 (SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:17) y 23/17taFab1 (SEQ ID NO:76 y SEQ ID NO:78). Todos los anticuerpos biespecíficos se pudieron cofijar de manera simultánea a IL-23 humana y a IL-17A/F humana, lo cual demuestra que ambos brazos de los anticuerpos biespecíficos eran funcionales.
Demostración de la fijación específica de IL-17A/F a los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos mediante resonancia de plasmones superficiales (Biacore)
Los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos se evaluaron mediante resonancia de plasmones superficiales para determinar la falta de reactividad cruzada con IL-17B humana, IL-17C humana, IL-17D humana e IL-17E humana (ZymoGenetics, A Bristol Myers Squibb Company, Seattle, WA, EE. UU.).
Los estudios de fijación se realizaron en un Biacore® T100 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Los métodos se programaron con el software de control Biacore® T100, v 2.0. El anticuerpo específico Fc-gamma IgG antihumano de cabra (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) se inmovilizó de manera covalente en las celdas de flujo 1-3 de un chip sensor CM4 usando química de acoplamiento de aminas (EDC:NHS). Los anticuerpos biespecíficos purificados luego se capturaron en la celda de flujo 2 o en la celda de flujo 3 del chip sensor a una densidad de aproximadamente 150 Ru . La celda de flujo 1 se usó como superficie de referencia.
Las IL-17B, IL-17C, IL-17D e IL-17E humanas (ZymoGenetics, A Bristol Myers Squibb Company, Seattle, WA, EE. UU.) se inyectaron en la superficie del anticuerpo capturado (celda de flujo 2) y la celda de flujo de referencia (celda de flujo 1) a concentraciones de 500, 100, 20 y 4 nM. Como control positivo para este conjunto de experimentos, se inyectó IL-23 humana (ZymoGenetics, A Bristol Myers Squibb Company, Seattle, WA, EE. Uu .) a concentraciones de 100, 20, 4 y 0,8 nM. Los estudios de fijación se realizaron con una velocidad de flujo de 50 pl/min, un tiempo de asociación de 5 minutos y un tiempo de disociación de 5 minutos. Todos los experimentos de fijación se realizaron a 25 °C en un amortiguador de 10 nM de HEPES, 500 nM de NaCl, 3 nM de e DtA, 0,05 % de tensioactivo P20 (GE Healthcare) y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino a pH 7,4. Entre los ciclos, la celda de flujo se lavó con 20 nM de ácido clorhídrico para regenerar la superficie. Esta etapa de lavado removió tanto el anticuerpo de prueba capturado como cualquier antígeno fijado de la superficie del chip Los datos se recopilaron usando el software de evaluación Biacore® T100 (versión 2.0). Los datos se procesaron restando la celda de flujo de referencia y las inyecciones blanco. Se evaluó la estabilidad inicial para garantizar que la etapa de regeneración haya proporcionado una superficie de fijación consistente durante toda la secuencia de inyecciones.
Resultados de la demostración de la fijación específica de IL-17A/F a los anticuerpos biespecíficos IL-23/IL-17A/F antihumanos mediante resonancia de plasmones superficiales (Biacore)
No se observó fijación de las IL-17B, IL-17C, IL-17D o IL17E humanas a los anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos evaluados incluyen 23/17bAb1 (SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:17), 23/17bAb2 (SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:17), 23/17bAb3 (SEQ ID NO:74 y SEQ ID NO:17), 23/17bAb4 (SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:17). Por el contrario, el control positivo IL-23 demostró una fijación dependiente de la dosis que coincidió con los estudios previos.
Ejemplo 4
Los bAb IL-23/17A/F antihumanos evitan el aumento mediado por IL-17A, F y AF humanas en concentraciones séricas de KC (CXCL1) murino en ratones
IL-17A, F y AF pudieron inducir la producción de varios factores corriente abajo que, a su vez, cumplen una función en la defensa del huésped, pero también contribuyen a la patología de las enfermedades, en especial, cuando se producen en niveles anormalmente elevados o en condiciones crónicas. Uno de estos mediadores corriente abajo es CXCL1 (también conocido como GRO-a en seres humanos o KC en ratones), una quimiocina que tiene una importante actividad quimioatrayente para neutrófilos y cumple una función en la inflamación. Se evaluó la capacidad de los anticuerpos biespecíficos (bAb) IL23/17A/F antihumanos de reducir el aumento mediado por IL-17A, F y AF de GRO­ a en ratones, a fin de demostrar que los bAb serían eficaces contra las actividades inducidas por IL-17 en un entorno in vivo y, por ende, que los bAb serían útiles para tratar enfermedades humanas en donde IL-17A, F o AF cumplen una función. Sin embargo, debido a que estos bAb no tienen reactividad cruzada con IL-17A, F o AF de ratón, es necesario administrar IL-17A, F o AF humanas (h) a los ratones para inducir la producción de GRO-a (o, en el caso de ratones, inducir la producción de KC, que es el análogo de murina de GRO-a) que luego se podría neutralizar en presencia de los bAb IL23/17A/F antihumanos.
Para estos experimentos, se usaron ratones BALB/c hembra (7 - 9 semanas de edad). A las 18 h, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal (i.p.) del vehículo (PBS) o una dosis de uno de los bAb IL-23/17A/F antihumanos, como se muestra en las Tablas 14 y 15, en la columna izquierda. A las 0 h, recibieron una inyección subcutánea (s.c.) de una de las siguientes proteínas humanas recombinantes: 0,175 mg/kg de hIL-17A, 0,9 mg/kg de hIL-17F o 0,5 mg/kg de hIL-17AF. Los ratones de control recibieron una inyección s.c. del vehículo (PBS) en lugar de una de las proteínas hIL-17. Dos horas más tarde, se extrajo sangre de los ratones mediante el seno retroorbital con anestesia de gas isoflurano, se recolectó el suero después de la centrifugación de la sangre y se almacenó a 80 °C hasta que se analizó para determinar las concentraciones de KC séricas mediante ELISA comercial según las instrucciones del fabricante (Quantikine Mouse CXCL1/KC Immunoassay, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN).
Como se muestra en las Tablas 14 y 15, los ratones tratados con los bAb mostraron un aumento dependiente de la dosis de la inhibición de las concentraciones de KC (CXCL1) séricas inducidas por hIL-17A, F o AF, lo cual indica que los bAb eran eficaces para reducir las actividades mediadas por estos ligandos IL-17. CXCL1 es solo un ejemplo de una lectura biológica en respuesta a IL-17A, F o AF; existen muchas otras lecturas corriente abajo importantes que también cumplen una función en enfermedades en las que IL-17A, F o AF tienen una función que podría usarse como medición del criterio de valoración.
Tabla 14. Porcentaje de inhibición del aumento mediado por IL-17A o F humanas en concentraciones séricas de KC murino mediante bAb i. . con res ecto a las concentraciones de ratones tratados con vehículo n = 3-4 por grupo)
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Tabla 15. Porcentaje de inhibición del aumento mediado por IL-17AF humana en concentraciones séricas de KC murino (pg/ml) mediante bAb i.p., con respecto a las concentraciones de ratones tratados con vehículo (n = 4 por ru o
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Ejemplo 5
Los bAb IL-23/17A/F antihumanos evitan el aumento mediado por IL-23 humana en concentraciones séricas de IL-17AF y F murino en ratones
IL-23 puede inducir la diferenciación de los linfocitos Th17 que, a su vez, puede generar la producción de IL-17A, IL-17F e IL-17AF. Estas citocinas participan en varias enfermedades y terapias que pueden inhibir IL-23, e IL-17A, F y AF serían eficaces para el tratamiento de estas enfermedades. Se evaluó la capacidad de los anticuerpos biespecíficos (bAb) IL23/17A/F antihumanos de reducir el aumento mediado por IL-23 en IL-17A, F y AF en ratones, a fin de demostrar que los bAb serían eficaces contra las actividades inducidas por IL-23 en un entorno in vivo y, por ende, que los bAb serían útiles para tratar enfermedades humanas en donde IL-23 y los linfocitos Th17 cumplen una función. Sin embargo, debido a que estos bAb no tienen reactividad cruzada con IL-23 de ratón, fue necesario administrar IL-23 humana (h) a ratones para inducir la producción de IL-17 F y AF de ratón que luego se podría neutralizar en presencia de los bAb IL23/17A/F antihumanos. Las concentraciones de IL-17A de ratón fueron demasiado bajas para medir con precisión suero en el ratón, pero se previó que las tendencias eran similares en comparación con las tendencias observadas para las IL-17F y AF séricas.
Para estos experimentos, se usaron ratones C57BL/6 hembra (7 - 9 semanas de edad). A las 10:30 am del día 1, cada uno recibió 5 microgramos de IL-2 de ratón (m) mediante una inyección intraperitoneal (i.p.). A las 8:30 am del día 2, los ratones recibieron una inyección i.p. del vehículo (PBS) o una dosis de uno de los bAb IL-23/17A/F antihumanos, como se muestra en la Tabla 16, en la columna izquierda. A las 11:00 am del día 2, cada uno de los ratones recibió 5 microgramos de mIL-2 y 10 microgramos de hIL-23, y a las 5:20 pm del día 2, los ratones recibieron 10 microgramos de mIL-2 y de hIL-23 mediante inyecciones i.p. A las 9:30 am del día 3, cada uno de los ratones recibió otros 5 microgramos de mIL-2 y 10 microgramos de hIL-23 mediante inyección i.p. A las 4:30 pm del día 3, se extrajo sangre de los ratones mediante el seno retroorbital con anestesia de gas isoflurano, se recolectó el suero después de la centrifugación de la sangre y se almacenó a -80 °C hasta que se analizó para determinar las concentraciones séricas de IL-17F y AF de ratón usando ensayos ELISA y luminex que midieron específicamente estos componentes.
Como se muestra en la Tabla 16, los ratones tratados con los bAb mostraron un aumento dependiente de la dosis de la inhibición de las concentraciones séricas inducidas por hIL-23 de 17F o AF de ratón, lo cual indica que los bAb eran eficaces para reducir las actividades mediadas por hIL-23.
Tabla 16. Porcentaje de inhibición del aumento mediado por IL-23 humana en concentraciones séricas de IL-17F o AF de ratón mediante bAb i.p., con respecto a las concentraciones de ratones tratados con vehículo (n = 3 por r
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continuación
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Ejemplo 6
Anticuerpos biespecíficos VCVFc
Construcción y expresión de moléculas biespecíficas VCVFc de mamífero
Se sintetizaron genes completos en GenScript (GenScript, Piscataway, NJ, EE. UU.) y se insertaron en pTT5, un vector de expresión transitorio HEK293-6E (NCR Biotechnology Research Institute, Ottawa, ON, CAN) mediante clonación de enzimas de restricción. La mayoría de los constructos se expresaron usando la secuencia de señales mod2610 (SEQ ID NO:30). VCVFc es un anticuerpo biespecífico que contiene un anticuerpo completo con una unidad Fv del segundo brazo del anticuerpo biespecífico insertado entre la región Fab y la bisagra mediante un ligador (por ejemplo, 10mer G4S para cada cadena, o RTVAAPS (SEQ ID NO:85) para la cadena ligera y SSASTKGPS (Se Q ID NO:86) para la cadena pesada). En la Figura 5, se muestra una ilustración de un anticuerpo biespecífico VCVFc.
Las células de suspensión HEK293-6E se transfectaron con los constructos de expresión usando un reactivo de polietilenimina y se cultivaron en un medio F17 (Invitrogen, Grand Island, NY, EE. u U.) con la adición de 5 nM de L-glutamina y 25 pg/ml de G418. Después de 24 horas, se agregó 1/40 volumen de Tryptone NI al 20 % (Organotechnie SAS, La Courneuve, FR). Aproximadamente 120 horas después de la transfección, se recolectó el medio condicionado y se hizo pasar a través de un filtro de 0,2 pm. La proteína se purificó del medio condicionado filtrado usando una combinación de cromatografía por afinidad Mab Select SuRe (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.) y cromatografía de exclusión por tamaño Superdex® 200 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.). El contenido se calculó mediante la absorbancia a UV-A280 nm, y la calidad se evaluó mediante cromatografía de líquidos de alta resolución, de exclusión por tamaño y analítica, s Ds PAGE y transferencia Western.
Actividad del bioensayo de anticuerpos biespecíficos VCVFc IL-23/IL-17A/F; ensayo del indicador de luciferasa NIH/3T3/KZ170 NF-kB para medir la actividad de IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas mediante la inducción de NF-kB
El bioensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 1 anterior.
Actividad del bioensayo de anticuerpos biespecíficos VCVFc IL-23/IL-17A/F; ensayo fosfo-STAT3 de transfectantes Baf3/huIL-23Ro/huIL-12R@1 para medir la actividad de IL-23 humana mediante la inducción de fosfo-STAT3
El bioensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 3 anterior.
Actividad del bioensayo de anticuerpos biespecíficos VCVFc PDGF-C/PDGF-D; ensayo de proliferación de fibroblastos humanos normales de pulmón (NHLF) para medir la actividad mitogénica de PDGF-C y p Dg F-D humanos
Una línea celular de fibroblastos humanos normales primarios de pulmón (NHLF, CC-2512, Lonza, Walkersville, MD) se sembró a razón de 1.000 células/cavidad en un medio de crecimiento (FGM-2 Bulletkit, Lonza, Walkersville, MD) y se incubó durante la noche a 37 °C con 5 % de CO2. Al día siguiente, el medio se retiró, y se realizaron diluciones en serie de PDGF-C y PDGF-D humanos recombinantes (ZymoGenetics) en un medio de ensayo (FBM más 0,1 % de BSA, Lonza, Walkersville, MD), se agregaron a las placas que contenían las células y se incubaron juntas a 37 °C con 5 % de CO2 durante 48 horas. El ensayo también se usó para medir la neutralización de la actividad de PDGF-C y PDGF-D. Una concentración submáxima de PDGF-C o p Dg F-D se combinó con diluciones en serie de anticuerpos PDGF-C/D o PDGFRa/p VCVFc antihumanos descritos en la presente en un medio de ensayo, se agregaron a las placas que contenían las células y se incubaron juntas a 37 °C con 5 % de CO2 durante 48 horas. Las células se impulsaron con 1 pCi/cavidad de timidina [metil-3H] (PerkinElmer, Waltham, MA) y se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2 durante 24 horas más. Después de la incubación, se evaluó la actividad mitogénica midiendo la cantidad de 3H-timidina incorporada. El medio se retiró, y las células se tripsinizaron durante 10 minutos a 37 °C antes de cosecharlas en un cosechador FilterMate (Packard Instrument Co., Meriden, CT) y leerlas en un contador de centelleo de microplacas Topcount® (Packard Instrument Co., Meriden, CT) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El aumento de la incorporación de 3H-timidina fue un indicio de la interacción entre el receptor de PDGF-C o PDGF-D y el ligando. La disminución de la incorporación de 3H-timidina fue un indicio de la neutralización de la interacción entre el receptor de PDGF-C o PDGF-D y el ligando. Los valores de CI50 (concentración inhibidora al 50 %) se calcularon con el software GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, Inc., San Diego CA) para cada anticuerpo biespecífico PDGF-C/PDGF-D o PDGFRa/PDGFRp VCVFc.
Actividad del bioensayo de anticuerpos biespecíficos VCVFc IL-23/IL-17A/F; resultados del ensayo del indicador de luciferasa NIH/3T3/KZ170 NF-kB y del ensayo fosfo-STAT3 de transfectantes Baf3/huIL-23Ro/huIL-12Rp1
Las IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas inducen la activación del indicador de luciferasa NF-kB en una manera dependiente de la dosis con una concentración CE50 que, según se determinó, fue 0,15 nM para IL-17A, 0,5 nM para IL-17A/F y 0,5 nM para IL-17F, e IL-23 induce la fosforilación de STAT3 en una manera dependiente de la dosis con una concentración de CE50que, según se determinó, fue 0,02 nM. Los datos de CI50 para los anticuerpos biespecíficos VCVFc IL-23/IL-17A/F antihumanos se muestran a continuación en las Tablas 17, 18 y 19.
Tabla de anticuerpos biespecíficos VCVFc IL-23/17A/F
Tabla 17
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Tabla 18
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Tabla 19
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continuación
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Actividad del bioensayo de anticuerpos biespecíficos VCVFc PDGF-C/PDGF-D y PDGFRa/PDGFp; resultados del ensayo de proliferación de fibroblastos humanos normales de pulmón (NHLF)
PDGF-C y PDGF-D inducen la proliferación de las células NHLF en una manera dependiente de la dosis con una concentración submáxima que, según se determinó, fue 0,1 nM para PDGF-C y 6 nM para PDGF-D. La Tabla 20 y la Tabla 21 presentan datos de CI50 para los anticuerpos biespecíficos VCVFc PDGF-C/PDGF-D o PDGFRa/PDGFRp descritos en la presente.
Tabla de anticuerpos biespecíficos VCVFc PDGF-C/PDGF-D
Tabla 20
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Tabla de anticuerpos biespecíficos VCVFc PDGFRa/PDGFRp
Tabla 21
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Actividad del bioensayo de anticuerpos biespecíficos VCVFc IL-23/IL-17A/F; ensayo de fibroblastos humanos primarios para medir la actividad de IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas mediante la inducción de IL-6
El bioensayo se pertexturizó como se describe en el Ejemplo 3 anterior.
Actividad del bioensayo de anticuerpos biespecíficos VCVFc IL-23/IL-17A/F; resultados del ensayo de fibroblastos humanos primarios
Las IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas inducen la producción de IL-6 humana en una manera dependiente de la dosis con una concentración de CE50 que, según se determinó, fue 0,08 nM para IL-17A, 25 nM para IL-17A/F y 25 nM para IL-17F. Anticuerpo biespecífico VCVFc IL-23/IL-17A/F antihumano 23/17VCV2 (SEQ ID NO:91 y SEQ ID NO:93). La Tabla 22 presenta datos de CI50 de ejemplo para el anticuerpo biespecífico VCVFc IL-23/IL-17A/F descrito en la presente.
Tabla 22
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Actividad de cofijación de anticuerpos biespecíficos VCVFc IL-23/IL-17A/F; ensayo de fibroblastos humanos primarios para medir la inhibición de IL-17A, IL-7A/F o IL-F humanas mientras se encuentran fijadas simultáneamente a la IL-23 humana. Ensayo fosfo-STAT3 de linfocitos T humanos primarios para medir la inhibición de IL-23 humana mientras se encuentra fijada simultáneamente a IL-17A, IL-7A/F o IL-17F humanas.
El ensayo de fibroblastos humanos primarios se llevó a cabo en presencia de cantidades en exceso de IL-23 a 30 nM. El ensayo fosfo-STAT3 de linfocitos T humanos primarios se realizó en presencia de cantidades en exceso de IL-17A, IL-17A/F e IL-17F a 30 nM.
Resultados de la cofijación del bioensayo de anticuerpos biespecíficos VCVFc IL-23/IL-17A/F
El anticuerpo biespecífico 23/17VCV2 (SEQ ID NO:91 y SEQ ID NO:93), cuando se examinó en presencia de IL-23 humana, no interfirió con la inhibición de IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas. El anticuerpo biespecífico 23/17VCV2, cuando se examinó en presencia de IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas, no interfirió con la inhibición de IL-23 humana.
Medición de las afinidades de fijación de los anticuerpos biespecíficos VCVFc IL-23/IL-17A/F con IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas e IL-23 humana mediante resonancia de plasmones superficiales (Biacore)
Las actividades de fijación se determinaron como se describe en el Ejemplo 3 anterior.
Actividad Biacore de anticuerpos biespecíficos VCVFc IL-23/IL-17A/F
Los resultados de los experimentos de fijación con IL-17A, IL-17A/F e IL-17F humanas se muestran en las Tablas 23, 24 y 25, respectivamente. Los resultados de los experimentos de fijación con el heterodímero de IL-23/IL-12B humana se muestran en la Tabla 26.
Afinidad de fijación de los anticuerpos biespecíficos VCVFc IL-23/IL-17A/F con IL-17A
Tabla 23
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continuación
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Afinidad de fijación de los anticuerpos biespecíficos VCVFc IL-23/IL-17A/F con IL-17A/F Tabla 24
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Afinidad de fijación de los anticuerpos biespecíficos VCVFc IL-23/IL-17A/F con IL-17F Tabla 25
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Afinidad de fijación de los anticuerpos biespecíficos VCVFc IL-23/IL-17A/F con IL23/IL-12B Tabla 26
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Cofijación simultánea de IL-17A/F e IL-23 a los anticuerpos biespecíficos VCVFc IL-23/IL-17A/F mediante resonancia de plasmones superficiales (Biacore)
Este ensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 3 anterior.
Resultados de la cofijación simultánea de IL-17A/F e IL-23 a los anticuerpos biespecíficos VCVFc IL-23/IL-17A/F mediante resonancia de plasmones superficiales (Biacore)
El anticuerpo biespecífico 23/17VCV2 (SEQ ID NO:91 y SEQ ID NO:93) se cofijó simultáneamente a IL-23 humana e IL-17A/F humana, lo que demostró que ambos brazos de los anticuerpos biespecíficos eran funcionales.
Ejemplo 7
Mapeo del epítopo IL-23p19
El análisis descrito en este Ejemplo 7 pretende identificar los residuos epitópicos en IL-23p19, para lo cual se fija el anticuerpo IL-23p19 (el anticuerpo 7B7 o Mab, 7B7 Fab y biAb, los que tienen un dominio variable de la cadena pesada, como se muestra en SEQ ID NO:7 y un dominio variable de la cadena ligera, como se muestra en SEQ ID NO:9). Se utilizaron Fab 7B7, el anticuerpo 7B7 y biAb3 en los estudios de fijación en varias etapas, debido a que son intercambiables en cuanto a su epítopo en IL-23p19.
Digestión proteolítica y datos de péptidos en los epítopos
El análisis de secuencia de epítopo mediante espectrometría de masa del anticuerpo IL-23p19 se basó en los métodos de extracción de epítopos y escisión de epítopos. (Parker et al., "MALDI/MS-based epitope mapping of antigens bound to immobilized antibodies", Mol. Biotechnol., 20(1):49-62 (enero de 2002)). En ambos casos, el anticuerpo IL-23p19 se inmovilizó directamente mediante aminas primarias del anticuerpo en microesferas de superficie activada a una densidad promedio de 2 mg de mAb por 1 ml de volumen de microesfera. Los péptidos del antígeno con la etiqueta his IL-23 se generaron con o sin reducción y alquilación. La reducción del antígeno IL-23 se llevó a cabo mediante la incubación con 50 nM de ditiotreitol en PBS y HCI de guanidina 4 M durante 1 hora a 37 °C. Luego, se llevó a cabo la alquilación con 100 nM de iodoacetamida durante 30 minutos a temperatura ambiente. La IL-23 reducida y alquilada se dializó contra PBS durante la noche antes de la fragmentación. Para la extracción del epítopo, se generaron péptidos antigénicos mediante digestión proteolítica con las endoproteinasas tripsina, quimiotripsina, lys-C, arg-C, asp-N y/o glu-C, con una relación enzima:antígeno de hasta 2% (p/p). Las incubaciones se llevaron a cabo a 37 °C, y los tiempos de incubación variaron de 2 horas a toda la noche. Los péptidos resultantes se mezclaron con una resina de anticuerpo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Esta resina luego se lavó tres veces para retirar cualquier péptido que no se encontraba específicamente fijado. Las etapas de digestión, incubación y lavado se llevaron a cabo en PBS pH 7. Se utilizó el mismo protocolo para la escisión del epítopo, excepto que se incubó el antígeno intacto con el anticuerpo durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de la digestión enzimática. En ambos métodos, los péptidos fijados al anticuerpo se eluyeron y se analizaron mediante ESI-MS.
Estos datos indicaron que el anticuerpo IL-23p19 tiene un epítopo discontinuo formado por tres regiones peptídicas en IL-23p19. Se generaron péptidos sintéticos continuar con el análisis de estas tres regiones peptídicas, y su fijación se evaluó y se analizó mediante ELISA y espectrometría de masa. En función de estas observaciones, se considera que los siguientes péptidos representan las secuencias del epítopo del anticuerpo IL-23p19:
Péptido 1: WQRLLLRFKILR (residuos 156-167 de SEQ ID NO:6)
Péptido 2: SAHPLVGHMDLR (residuos 46-57 de SEQ ID NO:6)
Péptido 3: IHQGLIFYEKLLGSDIFTGEPSLLP (residuos 93-117 de SEQ ID NO:6).
Mapeo del epítopo IL-23 mediante HDX-MS
El método de espectrometría de masa de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX-MS) estudia la conformación proteica y la dinámica conformacional en solución mediante el control de la velocidad y el alcance del intercambio de deuterio de los átomos de hidrógeno de la amida de la estructura principal. El nivel de HDX depende de la accesibilidad del solvente de los átomos de hidrógeno de la amida de la estructura principal y la conformación proteica. El aumento másico de la proteína en HDX se puede medir con precisión mediante MS. Cuando esta técnica se usa junto con la digestión enzimática, se pueden resolver las características estructurales en cuanto al péptido, lo que permite diferenciar los péptidos expuestos a la superficie de los plegados hacia adentro. Con frecuencia, se realiza la rotulación con deuterio y los experimentos de inactivación posteriores, y luego la digestión de pepsina en línea, la separación de los péptidos y el análisis MS. Antes del mapeo de epítopos de BMS-986113 en IL-23 mediante HDX-MS, se realizaron experimentos no deuterados para generar una lista de péptidos pépticos comunes para IL-23 (4,4 mg/ml) e IL-23/BMS-986113 (1:1 de relación molar, 4,4 mg/ml y 3,36 mg/ml), lo que permite lograr una cobertura de secuencia de 97 % para IL-23. En este experimento, se usaron 10 nM de amortiguador de fosfato (pH 7,0) durante la etapa de etiquetado, y luego se agregó un amortiguador de inactivación (200 nM de amortiguador de fosfato con GdnCl 1,5 M y TCEP 0,5 M, pH 2,5, 1:1, v/v). Para los experimentos de mapeo de epítopos, se mezclaron 5 pl de cada muestra (IL-23 o IL-23/BMS-986113 (1:1 de relación molar)) con 65 pl de amortiguador de etiquetado de HdX (10 nM de amortiguador de fosfato en D2O, pH 7,0) para iniciar las reacciones de etiquetado a temperatura ambiente (~25 °C). Las reacciones se llevaron a cabo para diferentes períodos: 20 s, 1 min, 10 min, 60 min y 240 min. Al final de cada período de reacción de etiquetado, la reacción se inactivó mediante la adición de amortiguador de inactivación (1:1, v/v), y la muestra inactivada se inyectó en el sistema Waters HDX-MS para su análisis. Los péptidos pépticos comunes observados se controlaron para determinar sus niveles de absorción de deuterio en ausencia/presencia de BMS-986113. Se usó el mismo protocolo para el mapeo de epítopos de anti-IL-23 7B7 Fab (4,91 mg/ml) en IL-23 mediante HDX-MS.
El mapeo de epítopos de anti-IL-237B7 Fab en complejo con IL-23 y biAb3 con IL-23 indica que biAb3 tiene un epítopo discontinuo compuesto por cinco regiones peptídicas en IL-23p19. En función de los niveles de absorción de deuterio relativos, se pueden clasificar cinco regiones peptídicas como las regiones 1 > 2 > 3 > 4 > 5, de las cuales la región 1 tiene los cambios más significativos de absorción de deuterio, y la región 5 tiene los cambios menos significativos de absorción de deuterio. Las cinco regiones peptídicas en IL-23p19, según se determinó mediante HDX-MS para el anticuerpo IL-23p19, fueron las siguientes:
Región 1: PDSPVGQL (residuos 117-124 de SEQ ID NO:6);
Región 2: IFTGEPSLL (residuos 108-116 de SEQ ID NO:6);
Región 3: KILRSLQAF (residuos 164-172 de SEQ ID NO:6);
Región 4: QQLSQKLCTLAWSAHPLVGHMD (residuos 34-55 de SEQ ID NO:6); y
Región 5: CLQRIHQGLIFYEKLLG (residuos 89-105 de SEQ ID NO:6).
Predicción computacional de epítopos y diseño de mutantes múltiples de alanina
La mutagénesis múltiple de alanina es una estrategia para mutar diversos residuos en el mismo constructo a alanina, a fin de eliminar las cadenas laterales de aminoácidos en el epítopo de fijación (Wells, J.A., "Systemic mutational analyses of protein-protein interfaces", Enzym., 202:390-411 (1991)). Se combinaron diversas fuentes de información sobre la participación de residuos en un posible epítopo con 7B7 Fab y biAb3, a fin de obtener una lista específica de mutantes múltiples de alanina regionales. Los residuos contenidos en las regiones superpuestas entre HDX (véase más arriba, en este Ejemplo 7) y el mapeo del péptido de digestión proteolítica (véase más arriba, en este Ejemplo 7) se mapearon en la secuencia del dominio IL-23p19, y las tres regiones lineales de residuos comunes se identificaron como regiones A, B y C. La región A corresponde a los residuos de aminoácidos 33-59 de SEQ ID NO:6. La región B corresponde a los residuos de aminoácidos 89-125 de SEQ ID NO:6. La región C corresponde a los residuos de aminoácidos 144-173 de SEQ ID NO:6. Con el objetivo de calcular los residuos cuyas cadenas laterales están expuestas (área de superficie accesible al solvente, SASA) y, por lo tanto, estarían ubicadas en la superficie proteica del dominio p19 de IL-23, se usó una estructura interna del heterodímero de IL-23. Para cada residuo en el dominio p19 de IL-23, se calculó la relación entre la superficie accesible y la superficie expuesta estándar para el tipo de aminoácido, y los residuos se agruparon en intervalos. Los residuos se colocaron en intervalos de accesibilidad de la siguiente manera: < 30 %, 30-40 %, 40-50 %, 50-60 %, 60-70 %, 70-80 %, > 90 % expuestas. Las accesibilidades de residuos estándares para cada tipo de aminoácido se calcularon en el tripéptido extendido Gly-X-Gly. El segundo cálculo que se realizó fue ODA (área de acoplamiento óptimo), que es útil para predecir las superficies de interacción entre proteínas. El método identifica parches de superficie óptima con la energía de desolvatación de acoplamiento más baja. El ODA se calculó para el dominio p19 de IL-23, y estos resultados se usaron para priorizar los residuos para mutagénesis.
Los residuos en estas tres regiones (A, B, C) se priorizaron en función de una calificación alta en los cálculos ODA y SASA, y también se ponderaron en función del alcance del intercambio de hidrógeno-deuterio con respecto a IL-23 sin complejo (péptido #1 >#2>#3>#4>#5). Las regiones sin identidad de ratón se clonaron como mutantes de intercambio de ratón, en lugar de mutantes múltiples de alanina, lo cual no demostró un impacto en la fijación en el análisis a pequeña escala. Con excepción de M7, que contiene una secuencia lineal de residuos en un bucle extendido, los residuos luego se combinaron en epítopos no lineales en función del mapeo en la estructura cristalográfica de rayos X de IL-23 (M5, M6, M8). Los mutantes de respaldo adicionales se generaron con subepítopos de residuos predominantemente lineales (M9, M10, M11). Los mutantes múltiples de alanina diseñados mediante este método se muestran a continuación en la Tabla 27.
Tabla 27: Mutantes múlti les de alanina de IL-23 19
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Clonación, expresión y purificación de los mutantes de alanina de mapeo de epítopos IL-23
El constructo de vector de entrada de la subunidad p40 de IL-23 de tipo silvestre no etiquetada se generó mediante PCR, y la fidelidad del fragmento PCR se confirmó mediante secuenciación. El constructo de expresión transitoria se generó mediante recombinación LR de Gateway, y se confirmó la secuencia. El constructo de la subunidad p19 de IL-23 de tipo silvestre etiquetada con His y todos los constructos mutantes se generaron mediante PCR y se clonaron en el vector de expresión transitoria directamente. La fidelidad de todos los fragmentos PCR se confirmó mediante secuenciación. Con el objetivo de generar el control de tipo silvestre, la subunidad P40 de IL-23 de tipo silvestre no etiquetada se coexpresó con la subunidad P19 de tipo silvestre etiquetada con His, de manera transitoria, en las células HEK293-6E en la escala de 4 l para la purificación del complejo IL-23. En pocas palabras, las células HEK293-6E a 1 x 106 células/ml se transfectaron con el complejo de plásmidos de expresión/PEI en una relación de 0,5 (p19)/0,5 (p40)/1,5 (PEI). Se agregó triptona N1 como alimento 24 horas después, y las células se cosecharon 120 horas después de la transfección. El medio condicionado se filtró con filtros de 0,2 pM. Se cotransfectaron siete constructos mutantes p19 de IL-23 etiquetados con His, con la subunidad p40 de IL-23 de tipo silvestre no etiquetada en la escala de 30 ml, de acuerdo con el mismo protocolo de transfección descrito anteriormente. El medio condicionado se transfirió para el análisis, y la expresión de todos los mutantes se confirmó mediante transferencia Western anti-His. En función de los resultados de fijación preliminares, se seleccionaron los mutantes M5, M7, M9 y M10, y se aumentaron en una escala de 2 l con el mismo protocolo de transfección. El tipo silvestre también se aumentó en una escala de 2 l. Los aumentos del tipo silvestre y de los mutantes de IL-23 a 2 litros de células HEK se cosecharon, los sobrenadantes se concentraron, y el amortiguador se intercambió con PBS mediante filtración de flujo tangencial con una membrana de 10 kDa. Luego, las proteínas se purificaron mediante cromatografía de afinidad de níquel inmovilizado. El tipo silvestre se eluyó con 40 nM de imidazol, y luego se intercambió el amortiguador mediante la desalinización de la cromatografía por filtración en gel a PBS (5,6 nM de Na2HPO4, 1,1 nM de KH2PO4, 154 nM de NaCl, pH 7,4). Mediante SDS-PAGE se determinó que la pureza del tipo silvestre era > 95 %. Los mutantes se lavaron con 40 nM de imidazol y luego se eluyeron con 500 nM de imidazol. A los agrupamientos de elución se les intercambió el amortiguador, mediante diálisis, a PBS (7 nM de Na2HPO4, 3 nM de NaH2PO4, 130 nM de NaCl, pH 7,1). Mediante SDS-PAGE se determinó que la pureza de los mutantes era > 95 %. Los mutantes de alanina simples de IL-23p19 etiquetada con his en los residuos clave identificados mediante mutagénesis múltiple de alanina se generaron mediante síntesis génica y luego se clonaron en el vector de transfección transitoria. La expresión y la purificación fueron similares a los mutantes múltiples de alanina, con la excepción de M35A que se purificó mediante afinidad.
Análisis de fijación Biacore de mutantes de IL-23 al anticuerpo IL-23p19
La fijación de la expresión a pequeña escala de 30 ml de los siete (7) mutantes de alanina (véase la Tabla 27) se midió mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR, Biacore)) en un Biacore® T100 en PBST (7 nM de Na2HPO4, 3 nM de NaH2PO4, 130 nM de NaCl, 0,05 % de Tween 20, pH 7,4) a 25 °C. Los receptores y los anticuerpos relevantes se capturaron a un nivel de alrededor de 60 RU mediante la proteína A inmovilizada a 2000 RU en un chip sensor CM5. Además de biAb3, se usaron IL-23 p19 mAb (7G10) de Merck e (IL-12/IL-23 p40 mAb) de STELArA® como controles para la fijación al dominio. Además, como controles, se usaron los receptores comerciales de IL-23: hIL-23R-Fc y hIL-12RD1-Fc (ambos de R&D Systems). Los sobrenadantes se diluyeron 1:5 en PBST y se inyectaron a razón de 30 pl/min sobre mAb o la superficie del receptor durante 3 minutos y, después de un tiempo de disociación, se regeneraron con 10 nM de glicina, pH 2,0. La fijación a una superficie de referencia de la Proteína A sin ningún anticuerpo capturado se sustrajo de todas las curvas de fijación específicas antes del análisis. Los resultados que se indican en la Figura 9 muestran la respuesta 10 segundos antes del final de la inyección.
Los resultados Biacore muestran que los mutantes múltiples de alanina IL-23 mantienen la fijación al anticuerpo específico p40 y al receptor de IL-23 específico p19 (excepto por M8 que describe potencialmente el sitio de fijación al receptor). También se realizó la fijación de otro IL-23p19 mAb e IL-12Rp1-Fc, lo cual coincidió con los resultados de la Figura 9. El mutante M5 muestra una pérdida considerable de fijación a 7B7 Mab, mientras que M9 y M10 muestran una pérdida parcial de la fijación a 7B7 Mab (véase la Figura 10). M7 no muestra ningún impacto en la fijación al anticuerpo o a los controles. Por lo tanto, estos cuatro mutantes se eligieron para el aumento y la purificación, los tres mutantes que pierden fijación al anticuerpo IL-23p19 (anticuerpo 7B7 o Mab, 7B7 Fab y biAb3, los que tienen un dominio variable de la cadena pesada, como se muestra en SEQ ID NO:7, y un dominio variable de la cadena ligera, como se muestra en SEQ ID NO:9) y M7 como control.
Para el análisis Biacore de los mutantes purificados se usó el mismo formato de ensayo que los sobrenadantes, excepto que la IL-23 mutante y de tipo silvestre se diluyó a 25 nM y se tituló en serie 1:2 hasta 1,5 nM. Todos los resultados obtenidos con la purificación de las IL-23 mutantes confirmaron los datos obtenidos con los sobrenadantes de expresión. Los datos se ajustaron a un modelo de fijación de Langmuir 1:1, a fin de determinar los valores Kd que se muestran en la Figura 10 y en la Tabla 28. Las 1-2 RU de la fijación sustraída de referencia observada para la fijación de M5 al anticuerpo IL-23p19 (anticuerpo 7B7 o Mab, 7B7 Fab y biAb3, los que tienen un dominio variable de la cadena pesada, como se muestra en SEQ ID NO:7, y un dominio variable de la cadena ligera, como se muestra en SEQ ID n O:9) se simularon usando el software BIAsimulation 2.1 mediante el Rmax promedio determinado del análisis cinético de M9 y M10. Se calculó que la afinidad fue de >330 pM con un Kd 1500 veces más débil que el tipo silvestre, como se muestra en la Tabla 28.
T l 2 An li i in i Bi r l fi i n l n i r IL-2 1 l m n l nin IL-2
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Se llevó a cabo el análisis Biacore de mutantes de alanina simples, a fin de confirmar el epítopo no lineal demostrado por los mutantes múltiples de alanina M5, M9 y M10. La mayoría de los mutantes de alanina simples en las tres regiones lineales A, B y C no mostraron cambios en la fijación a 7B7 Mab o biAb3. Solo tres de los catorce mutantes de alanina simples de IL-23 analizados mostraron una disminución considerable de la afinidad de fijación mayor de 1 kcal/mol. La afinidad y los valores AAG de los residuos clave superpuestos entre los mutantes múltiples de alanina M5, M9 y M10 que se muestran en la Tabla 29 demuestran que un residuo principal en la región lineal B y dos residuos en la región lineal A contribuyen en forma predominante a la energía de fijación del complejo de IL-23p19 y anticuerpo IL-23.
T l 2 An li i in i Bi r l fi i n l n i r IL-2 1 l m n l nin im l IL-2
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Fosforilación de STAT3 inducida por IL-23 en los transfectantes BaF3/huIL-23Ro/huIL-12R@1
Una línea celular derivada de la médula ósea murina_(BaF3) se transfectó de manera estable con los receptores de longitud completa de IL-23Ra humana y de IL-12Rp1 humana, y se clonó. La inducción de la fosforilación de STAT3 mediante IL-23 se controló por medio de ELISA para los mutantes múltiples de alanina IL-23. Las células BaF3/huIL-23Ra/huIL-12Rp1 (clon 6 ) se lavaron tres veces con el medio del ensayo antes de colocarlas en placas a 50.000 células por cavidad en placas de cultivo tisular de fondo redondo de 96 cavidades. Las células BaF3/huIL-23Ra/huIL-12Rp1 respondieron a IL-23 en una forma dependiente de la dosis mediante la fosforilación de STAT3. Con el objetivo de evaluar la inhibición de anticuerpos de la señalización de IL-23, se premezcló una concentración CE50 de 20 pM de IL-23 con diluciones en serie de tres veces de cada anticuerpo de 33 nM a 0,56 pM, y se incubó a 37 °C durante 15 minutos en el medio del ensayo antes de la adición a las células. Después de la preincubación, se agregaron los tratamientos en duplicado a placas que contenían células y se incubaron a 37 °C durante 15 minutos, a fin de estimular la fosforilación de STAT3. La estimulación se interrumpió con la adición de amortiguador de lavado helado, y las células se lisaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (kit de lisis celular de Bio-Rad Laboratories, N.° de cat. 171­ 304012). Los niveles de STAT3 fosforilado se determinaron mediante ELISA (kit fosfo-STAT3(Tyr705) de Bio-Rad Laboratories, N.° de cat. 171-V22552), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos se analizaron, y los valores CI50 se calcularon usando el software GraphPad Prism 4. Todos los mutantes múltiples de alanina IL-23 y los mutantes simples de alanina IL-23 se encuentran activos y con la misma potencia que wt (forma siglada de wild type: de tipo silvestre) IL-23 (sin etiquetar y etiquetado) al inducir la actividad de pSTAT3 en los transfectantes BaF3/huIL-23Ra/huIL-12Rp1 (Tabla 30). Los resultados de la inhibición de los anticuerpos biAb3, STELARA® (IL-12/IL-23 p40 mAb) e IL-23p19 (7G10) de Merck de pSTAT3 inducido por el mutante múltiple de alanina IL-23 se muestran en la Tabla 31. biAb3 neutraliza la actividad biológica de wt IL-23 y el mutante múltiple de alanina IL-23 M7 con igual potencia, M9 y M10 con potencia reducida, y no neutraliza la actividad biológica de M5 en los transfectantes BaF3/huIL-23Ra/huIL-12Rp1. IL-12 P40 MAB DE Stelara® neutraliza la actividad biológica de wt IL-23 y todos los mutantes múltiples de alanina IL-23 con igual potencia en los transfectantes BaF3/huIL-23Ra/huIL-12Rp1. IL-23 p19 mAb (7G10) de Merck de control positivo neutraliza la actividad biológica de los mutantes múltiples de alanina wt IL-23, M7, M9 y M10 con igual potencia y no neutraliza la actividad biológica de M5 en los transfectantes BaF3/huIL-23Ra/huIL-12Rp1.
Tabla 30. Valores CE50 para mutantes múltiples de alanina IL-23 y valores CI50 para la inhibición de anticuerpos biAb3, STELARA® (IL-12/IL-23 p40 mAb) e IL-23p19 (7G10) de Merck de pSTAT3 inducido por los mutantes múlti les de alanina IL-23 en los transfectantes BaF3/huIL-23Ra/huIL-12R 1
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Se construyeron mutaciones IL-23p19 simples (H53A, M54A y D55A), y se determinaron los valores CI50 para 7B7, Stelara® (IL-12 /IL-23p40 mAb) y el anticuerpo IL-23p19 (7G10) de Merck (Tabla 31) para inhibir los polipéptidos mutados IL-23p19 simples, a fin de inducir pSTAT3 en los transfectantes BaF3/huIL-23Ra/huIL-12Rp1. El 7b 7 Mab neutraliza la actividad biológica de los mutantes simples de alanina IL-23 H53A, E112A y D118A con la misma potencia, los mutantes M54A y D55A con una potencia considerablemente reducida, y no neutraliza la actividad biológica del mutante L116A en comparación con wt IL-23 en los transfectantes BaF3/huIL-23Ra/huIL-12Rp1 (Tabla 31). IL-12 p40 mAb de Stelara® neutraliza la actividad biológica de todos los mutantes simples de alanina IL-23 con igual potencia, en comparación con wt IL-23 en los transfectantes BaF3/huIL-23Ra/huIL-12Rp1. IL-23 p19 mAb de Merck neutraliza la actividad biológica de todos los mutantes simples de alanina IL-23 con igual potencia en comparación con wt IL-23 en los transfectantes BaF3/huIL-23Ra/huIL-12Rp1, excepto para el mutante IL-23 E112A que no neutraliza.
Tabla 31: Valores CI50 para anticuerpos 7B7, Stelara® (IL-12 /IL-23p40 mAb) e IL-23p19 (7G10) para inhibir las mutaciones simples IL-23p19 (H53A, M54A y D55A) para inducir pSTAT3 en los transfectantes BaF3/huIL-23Ra/huIL-12R 1.
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Tomando todos estos resultados juntos, la inhibición de 7B7 mAb de IL-23 requiere los residuos de aminoácidos M54, D55 y L116, pero no requiere los residuos de aminoácidos H53, E112 o D118. Los anticuerpos Stelara® y Merck pudieron inhibir los mutantes simples de alanina IL-23 M54A, D55A y L116A sin pérdida de actividad, lo que sugiere que la pérdida de actividad que se ve en mutantes de alanina IL-23 M54, D55 y L116 es específica de 7B7 mAb y biAb3.
Análisis de estado oligomérico de mutantes de IL-23 y complejos 7B7 Fab
Con el objetivo de confirmar el estado oligomérico de los mutantes de IL-23 heterodiméricos y su capacidad de formar un complejo con 7B7 Fab, se estudiaron las proteínas mediante la separación con cromatografía por exclusión de tamaño (SEC-MALS) analítica usando un HPLC serie Agilent® 1100 con un detector de absorbancia de haz de diodos, en una columna Shodex Protein KW-803 en amortiguador (0,1 um filtrado) que contenía 200 nM de K2PO4 (pH 6 ,8 con HCl), 150 nM de NaCl y 0,02 % de solución de azida, a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Un instrumento de dispersión de luz láser MiniDawn™ Treos® de Wyatt Technology se aplomó corriente abajo de la HPLC, y después mediante un refractómero diferencial de Wyatt Optilab® T-rEX™. Se inyectaron sesenta (60) |jg de cada muestra de IL-23 después de la filtración, a una concentración de 10,3 jM . Para la formación de complejos, se premezclaron 60 jg de 7B7 Fab con 6 % de exceso molar y se incubaron con la proteína IL-23 a una concentración de 10,9 jM a temperatura ambiente durante 3-6 horas antes de la separación cromatográfica. Se retiraron los particulados de las muestras de proteínas con un filtro rotativo (Nanosep® MF, 0,2 jm , Pall Corporation) antes de la inyección. Los datos se analizaron con Astra® 6 (Wyatt) y Chemstation (Agilent). Todos los mutantes eran, en su mayoría, monoméricos, similares a los de tipo silvestre. El mutante M5 mostró una formación del complejo considerable después de la preincubación con el Fab y se eluyó cerca de donde el M5 IL-23 solo se eluye, lo que demuestra que se formó un pequeño complejo, si es que se formó, en el rango de concentración de 10 jM de este experimento. Se formó el complejo de M7, y este se eluyó de manera similar al de tipo silvestre. Los mutantes M9 y M10 formaron complejos en estas concentraciones, pero la masa fue menor que la de tipo silvestre, y el tiempo de retención era levemente menor que el de tipo silvestre y M7, lo que sugirió que su afinidad para 7B7 era más débil que la de tipo silvestre y M7. El análisis SEC-MALS de los 14 mutantes de alanina simples mostró que todos fueron, en su mayoría, monoméricos, similares al de tipo silvestre, y solo el mutante L116A mostró un tiempo de elución de desplazamiento tardío y una leve reducción en la masa prevista del complejo, lo que sugiere una reducción de la afinidad de IL-23 para 7B7 Fab. Estos resultados son coherentes con el desplazamiento Biacore en Kd para estos L116A. El efecto de la afinidad reducida del complejo de D54A y M55A con Fab no se pudo volver a disolver en las condiciones de este ensayo.
Calorimetría de barrido diferencial de mutantes de IL-23
El perfil de estabilidad térmica para el tipo silvestres y los heterodímeros de IL-23 mutantes se midió mediante calorimetría de barrido diferencial (DSC) usando un instrumento de DSC VP-capilar de MicroCal®. Se analizaron 0,7 mg/ml de muestras proteicas en PbS (7 nM de Na2HPO4, 3 nM de NaH2PO4, 130 nM de NaCl, pH 7,1) de 10­ 100 °C a 90 o/h, y los termogramas resultantes se sometieron a una sustracción de vacío del amortiguador y a un procedimiento de ajuste. La desnaturalización de cada molécula se caracterizó por dos transiciones de despliegue, y los valores del punto medio de transición ajustado (Tm) de cada transición se encontraban entre 1-4 °C del tipo silvestre. Los resultados muestran que ninguno de los mutantes múltiples de alanina ni los 14 mutantes de alanina simples muestran una desestabilización térmica considerable con respecto al tipo silvestre.
Análisis mediante espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR) de mutantes de IL-23
La comparación de la estructura secundaria de los mutantes múltiples de alanina y de tipo silvestre de IL-23 se llevó a cabo usando una espectroscopia FT-IR en un instrumento FT-IR Prota de Biotools con ventanas CaF2 con una longitud de trayectoria de ~7 jm y un láser Ne-He a 632,8 nm. Los datos se recolectaron con una resolución de 2 cirr 1 y se analizaron con el software Prota/Bomem-GRAMS/31 AI. Para cada muestra, se realizaron mediciones por duplicado, y la variabilidad del método es de alrededor de 3 %. El contenido de la estructura secundaria se calculó usando el pico de amida I como su estructura sensible. Se observó aproximadamente una cantidad igual de hélice a y lámina p en todas las muestras de IL-23, como se indicó mediante los picos a 1637 cm-1 para a-hélice y el pico a 1637 cm-1, así como el hombro a 1687 cm-1 para lámina p. En general, no se observó ninguna diferencia considerable en el resultado del espectro de FT-IR y de la estructura secundaria calculada en los mutantes múltiples de alanina en comparación con IL-23 de tipo silvestre.
Análisis de dicroísmo circular (CD) de mutantes de IL-23
La comparación de la estructura secundaria de los mutantes múltiples de alanina y el tipo silvestre de IL-23 usando la espectroscopia CD se realizó usando un espectrofotómetro J-815 de Jasco. Los espectros se recolectaron a una concentración proteica de IL-23 de 0,25 mg/ml en PBS pH 7,1, usando celdas de 1 mm de longitud de trayectoria a 25 °C de 300-190 nm con un intervalo de datos de 0,1 nm, una velocidad de barrido de 50 nm/min, un ancho de banda de 1 nm y 2 acumulaciones. En general, no se observó ninguna diferencia considerable en el perfil de la estructura secundaria en los mutantes múltiples de alanina, en comparación con IL-23 de tipo silvestre usando el dicroísmo circular.
Análisis de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR) de mutantes de IL-23
La NMR protónica es una técnica altamente sensible que permite el acceso al estado conformacional con detalle atómico. Los espectros 1D 1H NMR se adquirieron para cuatro proteínas de IL23 mutantes (M5, M7, M9, M10) y de tipo silvestre. Todas las proteínas se dializaron simultáneamente contra el amortiguador de NMR (PBS en 8 % de D2O/ 9 2 % de H2O) para eliminar las posibles diferencias que resultan de la preparación de la muestra. Además, se corrigieron las intensidades de señal 1H con respecto a las diferencias en la concentración proteica mediante la normalización del espectro de tipo silvestre. Todos los datos de NMR se recolectaron a 32 °C en un espectrómetro Avance 3 de Bruker que opera a 600 MHz. Los espectros 1D NMR se adquirieron usando la secuencia de pulso de Bruker estándar (ZG) optimizada por la supresión de solvente y excipiente usando los esquemas de pulso de excitación selectivos flipback de Watergate, WET y Water. Se determinó el promedio de señal de dos mil cuarenta y ocho (2048) barridos para cada espectro. Se aplicó la apodización de coseno al cuadrado antes de la transformación de Fourier, y se usó una corrección inicial polinómica de primer orden para aplanar la apariencia del inicio. El examen de cada uno de los espectros con respecto a las proteínas individuales reveló que cada proteína mutante se plegó de manera adecuada, como lo demuestran las resonancias bien disipadas en las regiones de campo alto (< 0,5 ppm) y de campo bajo (>6,5 ppM) de los espectros. Las resonancias de metilo de campo alto indicaron la presencia de un núcleo hidrófobo intacto; los protones de amida desapantallados (downfield) reflejaron la existencia de una estructura secundaria bien formada (hélices alfa y láminas beta). La comparación de los espectros con los de IL23 de tipo silvestre indicaron una coincidencia muy cercana, lo que implica la exclusión de la existencia de grandes cambios conformacionales en la estructura proteica inducida por las sustituciones de aminoácidos. Además, los resultados de NMR también indicaron que es poco probable una pérdida extra de actividad en M5 debido a una gran alteración de la integridad estructural en los sitios de mutación de M5. El hecho de que M5 estaba considerablemente más cerca de la proteína de tipo silvestre mediante el análisis de componentes principales de lo que sugiere M9, produce que las siguientes mutaciones M5 que están ausentes en M9, es decir, H53A, M54A y E112A, no provoquen una gran alteración en la estructura de M5. También se observó que los mutantes M7 y M9 que contienen la eliminación de un residuo aromático parecieron sumamente similares entre sí en el análisis de componentes principales. Todos los mutantes simples parecen ser similares a los de tipo silvestre, excepto por D118A y M54A; sin embargo, otros controles demuestran que estos mutantes mantienen una estabilidad y actividad similares a las del tipo silvestre.
Resumen del análisis de epítopos IL-23
Se utilizaron los métodos de mutagénesis simple y múltiple de alanina para mapear el epítopo de hIL-23 para 7B7 Fab contenido en los anticuerpos 7B7 Fab, 7B7 y biAb3. Se realizó la estrategia de mutagénesis dirigida usando información de epítopos generada mediante análisis LCMS de digestión proteolítica, fijación al péptido, espectroscopia de masa de intercambio de hidrógeno/deuterio, cálculos de superficie accesible al solvente y cálculos de algoritmo de acoplamiento. La detección a baja escala mediante SPR y el aumento de mutantes purificados selectivos demostraron un epítopo específico para hIL-23 fijado a 7B7/biAb3. El mutante M5 muestra una disminución considerable en la fijación a 7B7/biAb3, mientras mantiene actividad funcional, fijación a reactivos específicos p40 y p19, estado oligomérico monomérico, estabilidad térmica y características estructurales secundarias similares al tipo silvestre. El mutante M5 mostró una pérdida drástica de fijación a 7B7/biAb3, mientras que M9 y M10, cada uno de los cuales contenía dos de los mismos residuos mutados que M5, mostraron una pérdida parcial de fijación a 7B7/biAb3. La afinidad del mutante de IL-23, M5, era > 300 nM para 7B7/biAb3, lo que implica que es 1500 veces más débil que IL-23 de tipo silvestre y demuestra que los residuos en el mutante M5 definen el epítopo para la fijación de 7B7/biAb3 a IL-23. Por ello, los datos sugieren que el anticuerpo 7B7/biAb3 se fija a un epítopo discontinuo en la subunidad p19 de IL-23. Este epítopo discontinuo en IL-23p19 comprende al menos dos regiones de epítopos (región A (residuos de aminoácidos 33-59 de SEQ ID NO:6) y región B (residuos de aminoácidos 89-125 de SEQ ID NO:6)). Específicamente, con respecto al primer epítopo o región A de IL-23p19, los residuos de aminoácidos 54 (Met) y 55 (Asp) de SEQ ID NO:6 aportan una cantidad considerable de energía de fijación a la capacidad de 7B7/biAb3 de fijarse a IL-23p19. Con respecto al segundo epítopo o región B de IL-23p19, el residuo de aminoácidos 116 (Leu) es el residuo primario en la región B, que contribuye enérgicamente a la capacidad de 7B7/biAb3 de fijarse a IL-23p19.
Ejemplo 8
Modelo EAE de tití
Antecedentes y fundamentos
La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad crónica, autoinmunitaria, inflamatoria y neurodegenerativa del sistema nervioso central (SNC) que se caracteriza por la pérdida de mielina en el cerebro y en la médula espinal. Si bien los mecanismos que dan origen a esta enfermedad no se comprenden totalmente, los procesos que contribuyen a la progresión clínica de la esclerosis múltiple son inflamación, desmielinización y pérdida axonal, o neurodegeneración. Los macrófagos y las microglías son las células inmunitarias principales del SNC. Estas células, al igual que los linfocitos T, neutrófilos, astrocitos y microglías, pueden contribuir a la patología inmunitaria de, por ejemplo, la esclerosis múltiple. Además, la reactividad/autoinmunidad de los linfocitos T a varias proteínas de la mielina, que incluyen la proteína básica de la mielina (MBP), la proteína proteolipídica (PLP), la proteína oligodendrocítica de la mielina (MOG) y quizás otras proteínas de la mielina, está implicada en la inducción y continuidad de las condiciones patológicas de la esclerosis múltiple. Esta interacción entre los linfocitos T autorreactivos y las proteínas de la mielina puede generar la liberación de citocinas proinflamatorias, que incluyen TNF-alfa, IFN-gamma e IL-17, entre otras. Otras consecuencias son la proliferación de linfocitos T, la activación de linfocitos B y de macrófagos, la regulación ascendente de quimiocinas y moléculas de adhesión, y la alteración de la barrera hematoencefálica. La patología consiguiente es la pérdida de oligodendrocitos y axones, y la formación de una "placa" desmielinizada. La placa consiste en una lesión en la que la vaina de mielina está ausente y los axones desmielinizados están incrustados en la cicatriz del tejido glial. La desmielinización también se puede producir como resultado del reconocimiento y la opsonización específicos de antígenos de mielina por parte de los autoanticuerpos, seguido de la destrucción mediada por el macrófago activado y/o por el complemento. Se cree que esta pérdida axonal y neurodegeneración son las principales responsables del deterioro neurológico irreversible que se observa en la esclerosis múltiple progresiva.
La esclerosis múltiple (MS) se clasifica en cuatro tipos que se caracterizan por la progresión de la enfermedad.
(1) MS con recidiva-remisión (RRMS). La RRMS se caracteriza por recidiva (ataques de exacerbación de los síntomas) seguido de remisión (períodos de recuperación). Los síntomas pueden variar de moderado a grave, y las recidivas y las remisiones pueden durar días o meses. Más del 80 % de las personas que padecen MS comienzan a experimentar ciclos de recidiva-remisión.
(2) MS progresiva secundaria (SPMS). Con frecuencia, la SPMS se produce en personas que tienen MS de recidiva-remisión. En la SPMS, se producen recidivas y remisiones parciales, pero el deterioro no desaparece entre los ciclos. Por el contrario, empeora progresivamente hasta que la progresión constante del deterioro reemplaza los ciclos de ataques.
(3) MS progresiva primaria (PPMS). La PPMS progresa de manera lenta y constante desde el inicio. No hay períodos de remisión, y la intensidad de los síntomas generalmente no disminuye. Alrededor del 15% de las personas con MS padecen PPMS.
(4) MS con recidiva progresiva (PRMS). En este tipo relativamente inusual de MS, las personas experimentan tanto síntomas de empeoramiento constante como ataques durante los períodos de remisión.
Mayo Clinic (en el sitio web mayoclinic.org/multiple-sclerosis/types).
La heterogeneidad clínica y patológica en el curso de la esclerosis múltiple humana es amplia. En general, los síntomas comienzan entre los 18 y 50 años, pero pueden comenzar a cualquier edad. Los síntomas clínicos de la esclerosis múltiple pueden variar desde leves trastornos visuales y cefaleas hasta ceguera, ataxia grave y parálisis. La mayoría de los pacientes (aproximadamente el 70 - 75 %) tienen esclerosis múltiple con recidiva-remisión, en donde los síntomas de la enfermedad pueden reaparecer en cuestión de horas o días, seguido de una recuperación mucho más lenta; la ausencia de síntomas durante las etapas de remisión no es poco común. La incidencia y frecuencia de las recidivas y remisiones puede variar ampliamente, pero a medida que transcurre el tiempo, las fases de recuperación pueden volverse incompletas o producirse con mayor lentitud. El empeoramiento de la enfermedad en estos casos se clasifica como esclerosis múltiple progresiva secundaria y se produce en aproximadamente el 10 - 15% de los pacientes con esclerosis múltiple. A otro 10 - 15 % de los pacientes se les diagnostica esclerosis múltiple progresiva primaria, en donde los síntomas de la enfermedad y el deterioro físico progresan de manera constante durante todo el proceso de la enfermedad.
Tanto IL-23 como IL-17 se sobreexpresan en el sistema nervioso central de seres humanos con esclerosis múltiple y en ratones que experimentan un modelo animal de esclerosis múltiple, la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE). La sobreexpresión se observa en ratones cuando la EAE es inducida mediante el péptido de la glucoproteína oligodendrocitaria de la mielina (MOG) (35-55) o el péptido proteolipídico (PLP). Además, la neutralización de IL-23/p19 o IL-17 produce la mejora de síntomas de EAE en los ratones (Park et al, Nat Immunol. 6:1133 (2005); y Chen et al, J Clin Invest. 116:1317 (2006)).
Métodos
La encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) es un modelo animal reproducible y bien caracterizado que replica ciertos aspectos de la MS. La EAE es inducible en roedores y en primates no humanos, tales como el tití común. Genain, C. P. and Hauser, S. L., "Creation of a model for multiple sclerosis in Callithrix jacchus marmosets," J. Mol. Med., 75:187-197 (1997). En la EAE de tití, los animales son inmunizados con una glucoproteína oligodendrocitaria de la mielina humana recombinante (rHuMOG) para inducir el desarrollo de una enfermedad que se asemeja a la esclerosis múltiple humana. En los estudios publicados sobre este modelo se han utilizado MOG emulsionado en adyuvante de Freund completo (CFA) como inmunógeno, en una sola inoculación. Nuestros primeros intentos por inducir EAE en el tití usando la metodología publicada conllevó al inicio de síntomas clínicos entre los días 23 a 142 después de la inyección de MOG (no se muestran los datos). Debido a que se consideró que la línea temporal era muy larga para los estudios de eficacia preclínica, se utilizó un protocolo modificado con una dosis de cebado inicial y la posterior inmunización de refuerzo para inducir la enfermedad. Mediante el uso del protocolo de cebado/refuerzo descrito en este estudio, se evaluó la actividad de un anticuerpo biespecífico sustituto que tenía una entidad de fijación a IL-17A/F y una entidad de fijación a IL-23 en este modelo de primate no humano de EAE. El anticuerpo biespecífico sustituto era un biAbFabL (véase la Figura 2) que tenía la misma entidad de fijación a IL-17 A/F que biAb-1, biAb-2, biAb-3 y biAb-4, mientras que una entidad de fijación a IL-23 sustituta como la entidad de fijación a IL-23 de biAb-3, por ejemplo, tenía menor afinidad con IL-23p19 de tití. En consecuencia, se usó una entidad de fijación a IL-23 alternativa en el anticuerpo biespecífico sustituto. La entidad de fijación a IL-23 alternativa que se utilizó en el anticuerpo biespecífico sustituto fue la misma entidad de fijación a IL-23 identificada como IL-23 mAb en las Figuras 13 y 14.
Para la inducción de EAE, se diluyó rHuMOG (BlueSky Biotech, Worcester, MA) en PBS estéril a 0,66 mg/ml y luego se emulsionó con el mismo volumen de adyuvante de Freund incompleto (IFA, Sigma #F5506) que contenía 5 mg/ml de M. tuberculosis H37 RA (Difco # 231 l4 l). Se inyectaron 300 pl de la mezcla de CFA/m OG final (que contenía 0,33 mg/ml de MOG y 2,5 mg/ml de H37RA) en dos lugares del área del hombro afeitado de cada animal (150 pl x 2 sitios de inyección). Todos los tití se inmunizaron con CFA/MOG el mismo día (Día 0).
El Día 21, los animales recibieron una inmunización de refuerzo de IFA/MOG (preparada como se indicó anteriormente, pero sin H37 RA) inyectada en dos sitios de inyección sobre el área lumbar/de la cadera afeitada. Los tití se anestesiaron con Ketamina (15 mg/kg) mediante inyección IM para las inoculaciones de cebado y refuerzo.
La IL-23/17 AF bAb sustituta (IgG4.1k) se formuló en 20 nM de ácido succínico y 150 nM de amortiguador de arginina (pH 5,6). La administración de la dosis comenzó un día antes de la inoculación de cebado con CFA/MOG. A los animales se les administró placebo (PBS, SC, 2 x/semana) o IL-23/17 AF bAb (7 mg/kg, SC, 2 x/semana). Otros grupos de tratamiento incluían BMS-938790 (IL-23 adnectina; 3 mg/kg, SC, 2 x/semana), ADX_PRD1651 (IL-23/17 binectina, 10 mg/kg, SC, 2 x/semana) y una IL-23 mAb sustituta IgG4.1 (IL-23.15-g4P, 9 mg/kg, SC, 2 x/semana). Las dosis se administraron los martes y viernes durante todo el período de estudio. Los pesos corporales individuales se registraron por semana, y los animales recibieron dosis en función de su peso corporal. Todas las dosis SC se administraron en el área del flanco después del hisopado tópico con alcohol. Los sitios de las dosis se alternaron (lado izquierdo o derecho) para cada administración de la dosis. Los grupos de tratamiento al inicio del estudio consistieron en 8 animales por grupo (machos y hembras mezclados). Los animales estaban conscientes y se les sostuvieron las patas delanteras al momento de la inyección del fármaco.
Las evaluaciones visuales de las condiciones patológicas se realizaron a diario a partir del Día 12. Las evaluaciones se realizaron y registraron mediante el consenso de dos investigadores. Las calificaciones clínicas se basaron en una modificación de la calificación de las enfermedades publicada, como se describe en la siguiente Tabla 32.
____________________ Tabla 32 - Sistema de puntuación clínica de EAE en tití____________________ 0 = sin signos clínicos_____________________________________________________________________ 0,5 = reducción del estado de alerta/movimientos lentos, o pérdida del apetito_____________________ 1.0 = pérdida de peso >10 % (peso inicial al inicio del estudio Día 0)_____________________________ 1.5 = defectos visuales unilaterales o bilaterales, anomalías de la mirada disociada________________ 2.0 = trastornos visuales y/o equilibrio débil, ataxia o marcha anormal____________________________ 2.5 = monoparesia o paraparesia de los miembros inferiores o superiores y/o hipoestesia y/o
síndrome del tronco encefálico_____________________________________________________________ 3.0 = hemiplejía o paraplejía (parálisis de la mitad posterior de un lateral) (también puede incluir la parálisis de una pierna y una mano al mismo tiempo)__________________________________________ 4.0 = cuadriplejía_________________________________________________________________________ 5.0 = moribundo o muerte espontánea_______________________________________________________
Resultados
La cantidad de animales con signos/síntomas de la enfermedad EAE por grupos fue la siguiente:
Grupo A (PBS): 5 de 7 tití (71 %) mostraron una enfermedad tipo EAE y/o disfunción neurológica en algún momento durante el estudio. Los síntomas de la enfermedad consistieron en ceguera y parálisis.
Grupo B (IL-23 adnectina, BMS-938790): 1 de 6 tití (17 %) mostraron una enfermedad tipo EAE. Los síntomas de la enfermedad consistieron en ceguera progresiva y parálisis.
Grupo C (IL-23/17 binectina, ADX_PRd 1651): 6 de 7 tití (86 %) mostraron una enfermedad tipo EAE. Sin embargo, 3 de los animales mostraron signos/síntomas de EAE solo en un único día de observación.
Grupo D (IL-23 mAb): 3 de 6 tití (50 %) mostraron una enfermedad tipo EAE. El síntoma que prevaleció fue la ceguera.
Grupo E (IL-23/17 AF bAb): 4 de 8 tití (50 %) mostraron una enfermedad tipo EAE; de estos 4 animales tuvieron síntomas transitorios con una calificación "positiva" solo en un único día de observación. La enfermedad consistió mayormente en síntomas leves, tales como movimientos lentos o reducción del estado de alerta.
En comparación con la incidencia de la enfermedad en el Grupo A (PBS), la diferencia en la incidencia de la enfermedad en cada uno de los otros grupos de tratamiento no fue importante en términos estadísticos (p>0,05, prueba exacta de Fisher).
Un pequeño subconjunto de animales en el estudio presentó signos/síntomas más graves de EAE, y fue necesario someter a eutanasia a varios tití para cumplir con los criterios de valoración humanitarios preestablecidos. La cantidad de animales en cada grupo que debieron ser sometidos a eutanasia fue la siguiente: Grupo A (2); Grupo B (1); Grupo C (1); Grupo D (0); Grupo E (0).
A los animales que se sometieron a eutanasia para razones humanitarias como resultado de síntomas de EAE se les asignó una calificación de gravedad clínica de "4" al momento de la eutanasia, lo cual se utilizó durante el resto del estudio a fin de calcular la calificación de la gravedad clínica media. La Figura 12 representa la calificación de la gravedad clínica media para cada grupo de tratamiento durante el curso del estudio. El Grupo A (PBS) alcanzó una calificación máxima de aproximadamente 1,6 al final del estudio. Todos los otros grupos mostraron calificaciones clínicas medias más bajas; el Grupo E (IL-23/17 AF bAb) mostró solo un período corto (~1 semana) durante el que los signos de la enfermedad EAE fueron evidentes. Debido a la cantidad limitada de animales en cada grupo y la variabilidad entre los animales en las calificaciones de la enfermedad EAE entre los animales de un grupo, ninguna de las diferencias entre el Grupo A (PBS) y los otros grupos de tratamiento fue importante en términos estadísticos (prueba U de Mann-Whitney).
En síntesis, este estudio mostró una tendencia hacia la reducción de la gravedad de la enfermedad y la reducción de la incidencia de la enfermedad en el modelo EAE de tití con varios de los compuestos evaluados. En general, los animales tratados con IL-23/17 AF bAb (IgG4.1k) parecieron experimentar el resultado más beneficioso (Figura 12), aunque las diferencias entre los grupos no fueron importantes en términos estadísticos. El descubrimiento de que los animales tratados con IL-23/17 AF bAb tuvieron una mejor protección que los animales tratados solo con IL-23 mAb sugiere que el direccionamiento dual de las vías de IL-23 e IL-17AF dará como resultado una mayor eficacia en el tratamiento de enfermedades en seres humanos en las que estas vías de citocinas tienen una función, las que incluyen, entre otras, esclerosis múltiple.
IRM post mórtem
Al final del estudio, los tití que sobrevivieron se sometieron a necropsia. Se retiró la bóveda craneal, y el cerebro se fijó in situ en formalina durante 3 semanas. Pare evaluar las lesiones en la materia blanca y los rastros ópticos, se realizaron exploraciones de IRM de densidad protónica y T2W con el sistema Bruker Biospec 7t con una bobina Quad RF de 72 mm, usando los siguientes parámetros: Tiempo de exploración total ~ 15 -20 min por muestra; 23 imágenes axiales recolectadas; TR/TE = 5000/20 ms; grosor de corte = 1,2 mm; FOV = 4 cm; matriz = 256 x 256; resolución en plano = 156 mm2.
Se revisaron las exploraciones, y se realizaron interpretaciones semicuantitativas mediante la lectura consensual de 3 radiólogos después de la revisión de todas las imágenes de IRM para cada grupo de animales. La puntuación de las lesiones se basó en el conteo de lesiones en la materia blanca que cubre todo el cerebro. La puntuación del nervio óptico se basó en la hinchazón y aumento de la intensidad de señal que refleja inflamación en el nervio y tracto óptico.
En general, se observó una reducción considerable (p < 0,05) de la cantidad de lesiones para el grupo IL-23/17 AF bAb en comparación con el grupo vehículo (Figura 13). La calificación del tracto óptico también fue considerablemente más baja en el grupo IL-23/17 A f bAb que en el vehículo (Figura 14). Ninguno de los otros grupos de tratamiento fue considerablemente diferente del grupo tratado con vehículo para ninguna de estas mediciones de IRM. Por ello, de acuerdo con las calificaciones de las enfermedades clínicas, el grupo de animales tratado con IL-23/17 AF bAb presentó los valores de IRM medios más bajos, lo cual sugiere que el direccionamiento dual de las vías de IL-23 e IL-17AF dará como resultado una mayor eficacia en el tratamiento de enfermedades en seres humanos.
Ejemplo 9
Mapeo del epítopo IL-17A e IL-17F
El análisis descrito en este Ejemplo 9 pretende identificar los residuos epitópicos en IL-17A e IL-17F, para lo cual se fija la entidad de fijación a IL-17A/F de biAb3 (el dominio variable de la cadena pesada, como se muestra en SEQ ID NO:13 y los dominios variables de la cadena ligera, como se muestra en SEQ ID NO:9).
En la estrategia para identificar las diferencias clave entre el epítopo de biAb3 y el ratón parental (339.15.5.3) se utilizó cristalografía de rayos X, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis in-silico y ensayos de fijación y funcionales para analizar los mutantes. El dominio variable de la cadena pesada de la entidad de fijación a IL-17A/F de biAb3 es una versión humanizada del dominio variable de la cadena pesada del clon 339.15.5.3, clon 339.15.3.6 o clon 339.15.5.3. Los residuos CDR de la cadena pesada de la entidad de fijación a IL-17A/F de biAb3 y el clon 339.15.5.3, clon 339.15.3.6 o clon 339.15.5.3 son idénticos. Sin embargo, los dos mAb difieren en la región marco de sus dominios variables de la cadena pesada. Los dos mAb tienen diferentes cadenas ligeras; por lo tanto, los residuos de IL-17 en contacto con la cadena ligera de cada mAb fueron el centro de este estudio.
Cristalografía de rayos X
Se realizó la cristalografía del complejo IL17A Fab y del complejo IL17F Fab para determinar los residuos de la interfase de contacto del modelo de superficie de contacto para las predicciones de residuos de paratopos/epítopos y la determinación de la superficie enterrada. También se usaron las estructuras tridimensionales para los cálculos energéticos del mutante proteico en función de los complejos de la estructura de cristal modelada.
Los Fab de cada anticuerpo se clonaron y expresaron de manera periplasmática en la cepa BL21 de E.coli (339-134 humanizado) o BL21 Star (BiAb). La purificación de ambos incluyó IMAC y luego SEC. IL-17A e IL-17F se expresaron en la cepa W3110 de E. coli como cuerpos de inclusión y se volvieron a plegar; luego se realizó una purificación de varias etapas.
El Fab derivado de los brazos de IL-17 de biAb3 (dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:13 y dominio CH1 de la cadena pesada de SEQ ID NO:15; y una cadena ligera de SEQ ID NO:17) y el Fab derivado de la molécula inicial humanizada del progenitor (anticuerpo IL-17A/F antihumano humanizado 339-134 mAb (SEQ ID NO:65 y SEQ ID NO:67) formaron un complejo con IL-17A o IL-17F humanas. La formación de complejos de IL-17A o IL-17F con BiAb3 y el anticuerpo IL-17A/F antihumano humanizado 339-134 mAb se controlaron mediante SEC.
Los cocristales de cada uno de los cuatro complejos se generaron mediante cribado amplio, seguido de la optimización de las condiciones de cristalización. Se recolectó un conjunto de datos de cada muestra en las líneas de haz de APS LS-CAT.
T l - R m n l r l i n l n n ri l r fí r X
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Cada estructura se determinó mediante reemplazo molecular usando Phaser MR del software CCP4. El modelo de búsqueda de IL-17A se derivó de PDB ID 2VXS. El modelo de búsqueda de IL-17F se obtuvo de PDB ID 1JPY. Para cada Fab, los modelos de búsqueda se generaron para los dominios constantes y variables usando el Fab humanizado de PDB ID 3IDX con eliminación de los bucles hipervariables. Los modelos finales se obtuvieron después de rondas reiterativas de refinamiento en REFMAC5 y construcción del modelo manual en Coot. Además, se realizaron rondas adicionales de refinamiento y generación de mapas en Autobuster para la construcción y el refinamiento del modelo de todas las estructuras de menor resolución. La estadística cristalográfica de la recolección y el refinamiento de datos se muestra para las estructuras Fab parentales humanizadas en la Tabla 34 y las estructuras Fab iniciales humanizadas en la Tabla 35. Se evaluó cada estructura para determinar la geometría, usando MolProbity que se había descargado para ejecutarse en un servidor interno.
T l 4 - E í i ri l r fi F A 2F r n l h m niz n m l n IL-1 A IL-1 F
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continuación
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Tabla 35 - Estadística cristalo ráfica de Fab A3185F inicial humanizado solo o en com leo con IL-17A o IL-17F
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continuación
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Cada Fab se fijó fundamentalmente a la mitad del sitio del homodímero de IL-17 principalmente mediante su cadena pesada, y en menor medida mediante la cadena ligera. Las diferencias en la fijación del Fab parental humanizado y el Fab inicial humanizado parecieron ser consistentes con una mayor afinidad del Fab inicial humanizado.
En general, cada uno de los complejos de Fab IL-17/BMS inhibió la misma estructura general, en donde un Fab reconoció la mitad del sitio del homodímero de IL-17 (Figura 15). Por ello, mediante cristalografía se demostró que la estequiometria de fijación es dos (2) Fab contra un (1) homodímero de IL-17 (o dos (2) Fab contra dos (2) promotores de iL-17). La mayoría de las interacciones con la interleucina se forman con la cadena pesada con el bucle hipervariable 3 (o la región determinante de la complementariedad CDR3) que forma el centro de la interacción entre el anticuerpo y el antígeno. Además, varios residuos de la CRD2 de la cadena pesada interactúan con la interleucina. La CDR1 de la cadena pesada no pareciera interactuar considerablemente con la interleucina. Para la cadena ligera, la CDR3 participa en el reconocimiento de IL-17. La CDR1 de la cadena ligera también parece proporcionar una interacción de fijación débil de rango más largo.
Las coordenadas de la estructura de cristal se usaron para definir la interfase de contacto descrita previamente (S. Sheriff., "Some Methods for Examining the Interaction between Two Molecules," Immunomethods, 3:191-196 (1993)), en donde una definición mínima, definida como residuos en contacto, se derivó del programa CONTACSYM (Sheriff, S., Hendrickson, W.A., and Smith, J.L. (1987). Structure of Myohemerythrin in the Azidomet State at 1.7/1.3 A Resolution. J. Mol. Biol. 197, 273-296.). Una definición máxima de la interfase, definida como residuos enterrados al menos parcialmente por la interacción, se derivó del programa MS (Connolly, M.L. (1983). Analytical Molecular Surface Calculation. J. Appl. Crystallogr. 16, 548-558).
Tabla 36 - Residuos de interfase de contacto enterrada de los com leos
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Los residuos con un asterisco (*) están en contacto en la interfase del complejo.
Los residuos que carecen de asterisco están totalmente enterrados en la interfase de contacto del complejo.
La interacción principal de Fab con IL-17A (SEQ ID NO:2) pareciera ser los residuos L97 y una porción de residuos de H109-N111 (Figura 15). I100, G98, N111, S112, V113 y P114 están conservados entre IL-17A e IL-17F (los residuos de aminoácidos I100, G98, N111, S112, V113 y P114 de SEQ ID NO:2 o IL-17A corresponden a los residuos de aminoácidos I108, G106, N119, S120, V121 y P122 de SEQ ID NO:4 o IL-17F). Por ello, después de obtener esta estructura inicial, se previó que el Fab A3052F parental humanizado se fijaría a IL-17F esencialmente de manera idéntica a la que se observó con IL-17A. Sin embargo, cerca de estos residuos hay varios residuos que difieren entre IL-17A (SEQ ID NO:2) e IL-17F (SEQ ID NO:4), tales como K93 en IL-17A (Q101 en 17F), H95 en IL-17A (N104 en 17F), Y108 en IL-17A (I116 en 17F) y H109 en IL-17A (S117 en 17F). El terminal C de IL-17A (SEQ ID NO:2) también pareciera interactuar de manera débil con Fab mediante los residuos P149 y I150, que corresponden a los residuos P157 y V158 de IL-17F (SEQ ID NO:4). Sin embargo, no se esperaría que las diferencias entre IL-17A e IL-17F alterasen en gran medida la interacción global entre el anticuerpo y el antígeno. En comparación con la resolución 2,85 A del Fab parental humanizado, la resolución 3,4 A del Fab inicial humanizado exhibe interacciones muy similares entre la cadena pesada y la interleucina como se previó, con la misma secuencia para la cadena pesada. Por el contrario, las cadenas ligeras entre estos dos Fab son totalmente diferentes y, como se previó, estos residuos están coordinados en la interleucina de manera diferente. El biAb Fab tiene un residuo menos en CDR3, lo que permite que el bucle se extienda sobre la interleucina y que el oxígeno de la estructura principal de G93 (G93 de SEQ ID NO:9 o G4 de SEQ ID NO:27) de biAb Fab forme un puente de hidrógeno directo con el nitrógeno de la estructura principal de Y108 de SEQ ID NO:2 (IL-17A). El mismo átomo (oxígeno de la estructura principal de N91 de SEQ ID NO:67 en el Fab parental humanizado) estaba a 2,3 A de distancia de la ubicación en el Fab parental y no pudo formar un puente de hidrógeno con la interleucina. Además, el cambio de WN a YG permite que y 33 de CDR1 (Y33 de SEQ ID NO:9) se acerque a la interleucina en 5,1 A con respecto a su posición en el Fab parental de menor afinidad; esto permite obtener más interacciones de envasado con H l09 de IL-17A (SEQ ID NO:2). Por último, Y96 (Y96 de SEQ iD NO:9) del biAb Fab puede formar un puente de hidrógeno con N106 (N106 de SEQ ID NO:13) de la cadena pesada, lo cual ayuda a alinearlo en un puente de hidrógeno con el oxígeno de la estructura principal de Y108 (Y108 de SEQ ID NO:2) de la interleucina (IL-17A). En general, estos cambios en la interfase de c DR3 del biAb Fab parecen concordar con su mayor afinidad y se han evaluado mediante mutagénesis dirigida al sitio, como se muestra más adelante. Desafortunadamente, no se obtuvieron estructuras de cristal para un complejo que consiste en el Fab parental de ratón con IL-17A o IL-17F. Esto sugiere que las condiciones para optimizar las interacciones de estos complejos son diferentes de las que se usan para la cristalización exitosa de los Fab iniciales y parentales humanizados.
Además de la interpretación de los contactos de residuos individuales, otra medición de las diferencias en el Fab parental humanizado en comparación con el biAb fijado a la interleucina se puede capturar calculando el área de superficie total enterrada por las regiones de interacción de los complejo IL17/Fab. Este análisis se realizó usando el algoritmo MS para los complejos IL-17A Fab, ya que fueron la más alta resolución, y deben proporcionar la comparación más confiable. Las dos estructuras con IL-17F fueron superiores a 3,5 A y no se consideraron confiables para este análisis. El Fab parental se enterró 720 A2 en IL-17A, mientras que el biAb Fab se enterró 820 A2 (véase la Tabla 37). Esta diferencia (100 A2) en el área de superficie es respaldada por la mayor afinidad de fijación medida del Ab inicial para IL-17A. Es interesante destacar que el área de superficie debido a una conformación de la cadena lateral extendida para muchos aminoácidos es menor de 100 A2 (A, N, D, C, G, L, P, S, T, V); véase Atlas o f Protein Side-Chain Interactions V1. Singh and Thornton 1992, 6-11). Por ende, mediante esta medición, la diferencia del epítopo de fijación en IL-17A para las estructuras iniciales v. las estructuras parentales se pueden describir como de aproximadamente un (1) equivalente de residuo.
Tabla 37 - Área de su erficie
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Predicción computacional de epítopos y diseño de mutantes múltiples de alanina
Para proporcionar una caracterización detallada de las diferentes contribuciones de los residuos del epítopo IL-17A e IL-17F a la cinética de fijación de los Fab parentales e iniciales, se seleccionaron residuos en las interfases de fijación identificadas mediante cristalografía de rayos X para las mutaciones específicas de sitio, a fin de distinguir aún más las diferencias entre la fijación del mAb parental humano y biAb.
Se usaron varios criterios para la selección de mutaciones individuales y múltiple en una sola molécula, a fin de seleccionar un conjunto de mutantes representativos e indicativos para evaluar. Las estructuras de cristal de IL-17A/Fab parental y IL-17F/Fab inicial descritos anteriormente se usaron para informar la selección de residuos que mutaban. Se seleccionaron residuos en la interfase de interacción entre el ligando y Fab, mientras se hacía hincapié en los residuos en contacto con los residuos de la cadena ligera de Fab. También se seleccionaron regiones de poca definición en la estructura de cristal para un Fab, pero no para el otro, porque esto puede sugerir que hay una diferencia en la movilidad del residuo en el complejo de parental v. biAb. Además, también se seleccionaron las posiciones de los residuos en donde difieren los residuos de IL-17 A/F homólogos porque esto puede indicar la tolerancia al cambio para la fijación de Fab o puede contribuir a las diferentes afinidades de fijación con respecto a los Fab parentales y biAb. La interfase se modeló con los mutantes propuestos para buscar diferencias energéticas en el complejo con Fab parental v. biAb. Se combinaron las agrupaciones de residuos de contacto (mutantes múltiples de alanina) para generar mutantes con cambios aditivos o sinérgicos en la afinidad de fijación. Los mutantes de cada interleucina que se generaron para los análisis experimentales se muestran en las Tablas 38 y 39.
Tabla 38: mutantes IL-17A
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Tabla 39: mutantes IL-17F
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Clonación y expresión de mutantes de alanina de mapeo de epítopos IL-17A y F
Los constructos de mutantes de IL-17A e IL-17F se generaron mediante síntesis génica y luego se clonaron en el vector de transfección transitoria para la expresión en las células HEK293-6E. Se transfectaron cultivos de 30 ml de células HEK293-6E a razón de 1 * 106 células/ml con el complejo de plásmidos de expresión/PEI, y las células se recolectaron 120 horas después de la transfección.
Análisis de concentración Biacore de mutantes IL-17A y F
La concentración de cada mutante de alanina de IL-17A e IL-17F en los sobrenadantes de cosecha de HEK se cuantificó mediante el nivel de captura en una superficie de sensor de Fab anti-his de Biacore. Las superficies de proteína A y hulgG también se inmovilizaron como controles para evaluar la fijación no específica de los sobrenadantes (no se observó fijación no específica). La concentración en cada sobrenadante se cuantificó usando una curva estándar de IL-17A-his purificado o IL-17F-his en el rango de 80 ug/ml a 0,039 ug/ml. La curva de calibración se ajustó a una curva lineal para los datos de 0,3125 a 0,0039 ug/ml. Los sobrenadantes se corrieron a diluciones 1:20, 1:60 y 1:180 para permitir mediciones múltiples en el rango lineal de la curva estándar.
El mutante 8 de IL-17A tenía una expresión considerablemente reducida (solo alrededor del 10% del nivel de expresión del tipo silvestre). Los mutantes M2, M3, M7 y M9 de IL-17F tenían una expresión considerablemente reducida. El mutante M9 de IL-17F fue prácticamente indetectable, mientras que los mutantes M2 y M7 de IL-17F tuvieron menos del 5 % del nivel de expresión del tipo silvestre.
Tabla 40: Niveles de ex resión de los constructos IL-17A IL-17F en los sobrenadantes HEK
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Bioensayo IL-17 (Ensayo del indicador de luciferasa NIH/3T3/KZ170 NF-kB)
Una línea celular de fibroblastos murina (NIH/3T3, ATCC# CRL-1658) se transfectó de manera estable con un indicador de luciferasa NF-kB denominado KZ170 y se clonó. Las células del clon 1 NIH/3T3/KZ170 se sembraron a razón de 10.000 células/cavidad en placas de luciferasa opaca blancas de 96 cavidades y se incubaron durante la noche a 37 oC. Al día siguiente, se realizaron diluciones en serie de IL-17A, IL-17F, mutantes de alanina IL-17A y mutantes de alanina IL-17F humanos recombinantes, usando las concentraciones determinadas mediante Biacore, en un medio de ensayo, se agregaron a las placas que contenían las células y se incubaron a 37 °C durante 4 horas. Después de la incubación, se retiró el medio, y las células se lisaron antes de ser leídas en el luminómetro de Berthold Centro XS3 usando sustrato flash de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El aumento de la intensidad de fluorescencia media (mediante la activación del indicador de luciferasa NF-kB) fue un indicio de la interacción entre el receptor de IL-17A o IL-17A/F y el ligando. Los valores CE50 (concentración eficaz al 50 %) se calcularon usando el software GraphPad Prism®4 para cada mutante de alanina IL-17A e IL-17F.
Todos los mutantes de IL-17A mostraron actividad funcional celular, aunque algunos perdieron parte de la actividad con respecto al tipo silvestre (Figura 16). Todos los mutantes de IL-17F, excepto M3, mostraron actividad funcional celular, aunque 3 de los mutantes (M2, M5, M10) mostraron una actividad considerablemente reducida (Figura 17).
Análisis de fijación Biacore de mutantes de IL-17A y F para la fijación a BiAb3 y otros anticuerpos relacionados
Los anticuerpos que se usaron para el ensayo de fijación Biacore fueron biAb3 (dominio variable de la cadena pesada, como se muestra en SEQ ID NO:7 y dominio variable de la cadena ligera, como se muestra en SEQ ID n O:9) y el anticuerpo parental de ratón 339.15.5.3 (que contiene las mismas secuencias de la región variable que 339.15.3.5 y 339.15.3.6). La isotipificación realizada con el kit de isotipificación de anticuerpos monoclonales de ratón IsoStrip (Roche, Indianapolis, IN, EE. UU) demuestra que el anticuerpo 339.15.5.3 es IgG2a/kappa tal como el 339.15.3.5 que se usó para la humanización. No se determinaron diferencias de secuencias o isotipos entre 339.15.3.5 y 339.15.5.3.
La fijación de los sobrenadantes de la expresión de 30 ml de los 12 mutantes de alanina 12 IL-17A y 10 IL-17F y un sobrenadante de control de tipo silvestre para cada uno (véase la Tabla 41 y la Tabla 42) se midió mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR, Biacore)) en un Biacore T100 en HBS-EP (10 nM de HEPES, 3 nM de EDTA, 150 nM de NaCl, 0,05 % de Tween 20, pH 7,4) a 25 °C. Los receptores y los anticuerpos relevantes se capturaron a un nivel de alrededor de 150-250 RU mediante la proteína A inmovilizada a 3000 RU en un chip sensor CM5. Además de biAb3 y el mAb parental (339.15.3.5), se usaron otros mAb anti-IL-17 como as controles para la fijación al dominio. Asimismo, se usó el receptor comercial de IL-17A como control: hIL-17RA-Fc (de R&D Systems), aunque no se identificó un reactivo de IL-17RC adecuado para este ensayo. Los sobrenadantes se diluyeron en función de la concentración determinada de cuantificación de anti-his en HBS-EP en una concentración de 9 nM, se diluyeron en serie 1:3, se inyectaron a 30 ul/min en la superficie del receptor o el mAb durante 90 segundos y, después de un tiempo de disociación, se regeneraron con 10 nM de glicina, pH 1.5. IL-17A M2 y IL-17F M1 también se hicieron correr a una mayor concentración (en el rango de 400-500 nM en el nivel de expresión del sobrenadante), porque se observó poca o ninguna señal para la superficie capturada de biAb. La fijación a una superficie de referencia de la Proteína A sin ningún anticuerpo capturado se sustrajo de todas las curvas de fijación específicas antes del análisis. Todas las curvas de titulación se ajustaron a un modelo de fijación de Langmuir 1:1, a fin de determinar los valores Kd que se muestran en la Figura 18 y en las Tablas 41 y 42.
Los resultados de Biacore demuestran que los mutantes IL-17A M1, M2, M6, M10 y M11 indican una reducción en la afinidad de fijación para el BiAb y contienen residuos que contribuyen a las diferencias de los epítopos de fijación en comparación con el anticuerpo parental. La mayoría de estos mutantes muestran una reducción de 3-15 veces (45 veces para M1) en la fijación al IL-17RA-Fc probablemente porque se ha alterado el sitio de fijación al receptor. Sin embargo, se mantuvo una parte de la potencia celular para todos los mutantes que tuvieron un impacto en la interacción con BiAb3, lo cual sugiere que estas alteraciones en los receptores no son significativas para la función.
Los mutantes IL-17F M1, M2, M7 y M8 muestran una reducción en la afinidad de fijación para el biAb; sin embargo, estos mutantes muestran una reducción en la afinidad de fijación similar a la del anticuerpo parental, lo cual indica que el cambio de epítopo entre el parental y el biAb en IL-17A no se traduce a IL-17F. Estos cuatro mutantes mantienen la potencia en el ensayo funcional celular, de manera similar a lo que sucede con la IL-17F de tipo silvestre; sin embargo, muchos de los otros mutantes no la mantienen, lo cual limita nuestra interpretación de la mutagénesis de IL-17F.
Tabla 41: Análisis cinético Biacore de mutantes de alanina IL-17A que se fijan a anticuerpos biAb3 y parentales de ratón
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continuación
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Tabla 42: Análisis cinético Biacore de mutantes de alanina IL-17F que se fijan a anticuerpos biAb3 y parentales de ratón
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Mutagénesis in silico
Se realizaron análisis energéticos para el Fab parental IL-17A, el Fab inicial IL-17A y el Fab inicial IL-17F. Debido a que las estructuras de rayos X de los complejos eran proteínas incompletas, se usó el modelado para completar los modelos estructurales construyendo las cadenas de aminoácidos faltantes mediante protocolos estándares (asistente para la preparación de proteínas Maestro y modelado de la cadena lateral Prime). Luego se usaron los modelos estructurales para calcular las energías de interacción para la proteína de tipo silvestre (IL-17A o IL-17F) o las moléculas de IL-17 mutantes con las Fab. Las energías de interacción son una medida de la afinidad calculada de las Fab hacia la IL-17 (tratada como ligando). A fin de calcular la estabilidad y la estabilidad delta de las proteínas mutantes, se usó el software MOE (versión 2012.10, Chemical Computing Group). Se utilizó el protocolo de barrido de residuos para llevar a cabo la mutagénesis dirigida al sitio computacional para generar mutaciones y realizar los cálculos de afinidad y estabilidad.
En la Figura 19, se muestra una comparación de las energías de fijación computacionales previstas con los valores calculados de AAG determinados de las afinidades de Biacore para los mutantes IL-17A. Los mutantes IL-17A identificados en la Figura 19 se etiquetaron de manera errónea. En la numeración de SEQ ID NO:2 de los mutantes IL-17A identificados en la Figura 19, hay uno menos de los que debería haber. Los mutantes son como se identifican en la Tabla 38. Por ejemplo, N104A, y 107A y H108A deberían ser N105A, Y108A y H109A, y sucesivamente, en la Figura. Esta comparación muestra que la tendencia en el panel de mutantes para los energéticos Biacore concuerdan con la predicción energética computacional de la interfase de fijación. El análisis de la fijación de IL-17A al anticuerpo parental de ratón no fue posible, porque dicho complejo no se cristalizó, y no se pude generar un modelo aceptable. Un intento por generar resultados para los mutantes IL-17F que se fijan a BiAb3 produjo resultados inconsistentes, probablemente debido a que las estructuras utilizadas para estos tenían una resolución deficiente y carecían de la información de residuos necesaria.
Resumen del mapeo de epítopos IL-17A&F
En la estrategia para identificar las diferencias clave entre el epítopo de BiAb3 y el ratón parental (339.15.5.3) se utilizó cristalografía de rayos X, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis in-silico y ensayos de fijación y funcionales para analizar los mutantes. Los dos mAb difieren en su cadena ligera; por lo tanto, los residuos en contacto con la cadena

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal aislado que se fija específicamente a IL-17A (SEQ ID NO: 2) e IL-17F (SEQ ID NO: 4) que comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, en donde el dominio variable de cadena pesada comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, y en donde el dominio variable de cadena ligera comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
4. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el anticuerpo comprende una región constante humana.
5. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el isotipo de la cadena pesada es IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4; tal como en donde el isotipo de la cadena pesada es IgG4, y donde la cadena pesada de IgG4 tiene una mutación de Serina a Prolina en la posición 241 de acuerdo con Kabat.
6. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.
7. Un ácido nucleico aislado que codifica la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
8. Un vector de expresión que comprende los siguientes elementos ligados operativamente:
(a) un promotor de la transcripción;
un polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6; y un terminador de la transcripción;
(b) un promotor de la transcripción;
un polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6; y un terminador de la transcripción;
(c) un promotor de la transcripción;
un primer polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1­ 6;
un segundo polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6; y
un terminador de la transcripción;
o
(d) un primer promotor de la transcripción;
un primer polinucleótido que codifica la cadena pesada del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1­ 6; y
un primer terminador de la transcripción; y
un segundo promotor de la transcripción;
un segundo polinucleótido que codifica la cadena ligera del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6; y
un segundo terminador de transcripción.
9. Una célula huésped recombinante, que comprende:
los vectores de expresión de la reivindicación 8 (a) y (b), en donde la célula expresa la cadena pesada y la cadena ligera; o
el vector de expresión de la reivindicación 8 (c) o (d), en donde la célula expresa la cadena pesada y la cadena ligera.
10. Un método para producir el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, comprendiendo el método:
cultivar la célula de acuerdo con la reivindicación 9; y
aislar el anticuerpo producido por la célula.
11. Una composición que comprende el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
12. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o la composición de acuerdo con la reivindicación 11, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad caracterizada por una expresión elevada de una o más de IL-17A, IL-17F e IL-23 en un mamífero que necesite tal tratamiento.
13. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o la composición de acuerdo con la reivindicación 11 para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la enfermedad es esclerosis múltiple (EM), síndrome del intestino irritable (SII), enfermedad inflamatoria del intestino (EII), tal como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, dermatitis atópica, dermatitis de contacto, esclerosis sistémica, lupus eritematoso sistémico (LES), vasculitis asociada a anticuerpos antineutrófilos citoplásmicos (ANCA) (AAV), arteritis de células gigantes, esclerosis múltiple (EM) (por ejemplo, esclerosis múltiple con recidiva-remisión, esclerosis múltiple secundaria-progresiva, esclerosis múltiple primaria progresiva y/o esclerosis múltiple progresiva con recidiva), colitis, endotoxemia, artritis, artritis reumatoide (AR), osteoartritis, síndrome de Sjogren, psoriasis, artritis psoriásica, enfermedad respiratoria del adulto (ARD), choque séptico, insuficiencia multiorgánica, lesiones pulmonares inflamatorias tales como fibrosis pulmonar idiopática, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), hipersensibilidad de las vías respiratorias, bronquitis crónica, asma alérgica, eczema, infección por Helicobacter pylori, adherencias y/o abscesos intraabdominales como resultado de inflamación peritoneal (por ejemplo, por infecciones, lesiones, etc.), síndrome nefrótico, polineuropatía desmielinizante idiopática, síndrome de Guillain-Barre, rechazo al aloinjerto de órganos, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), nefritis lúpica, nefropatía por IgA, enfermedad renal diabética, enfermedad por cambios mínimos (nefrosis lipoidea), glomeruloesclerosis focal segmentaria (GEFS), fibrosis sistémica nefrogénica (FSN), dermopatía nefrogénica fibrosante, hepatitis colestásica fibrosante, fascitis eosinofílica (síndrome de Shulman), escleromixedema (mucinosis popular), esclerodermia, liquen escleroatrófico, síndrome de POEM (síndrome de Crow-Fukase, enfermedad de Takatsuki o síndrome de PEP), síndrome nefrótico, enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD), enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD) (de un trasplante, tal como de sangre, médula ósea, riñón, páncreas, hígado, hígado ortotópico, pulmón, corazón, intestino, intestino delgado, intestino grueso, timo, células madre de aloinjerto, aloinjerto de menor intensidad, hueso, tendón, córnea, piel, válvulas cardíacas, venas, arterias, vasos sanguíneos, estómago y testículo), enfermedad osteolítica (por ejemplo, enfermedad osteolítica inducida por mieloma múltiple), fibrosis quística, degeneración macular relacionada con la edad (AMD; por ejemplo, AMD húmeda y AMD seca), fibrosis hepática, fibrosis pulmonar, ateroesclerosis, isquemia cardíaca/lesión por reperfusión, insuficiencia cardíaca, miocarditis, fibrosis cardíaca, remodelación adversa del miocardio, rechazo del trasplante, artritis inducida por la pared celular de estreptococos (SCW), gingivitis/periodontitis, queratitis del estroma herpética, reestenosis por enteropatía sensible al gluten, enfermedad de Kawasaki o una enfermedad renal mediada por el sistema inmunitario.
14. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o la composición de acuerdo con la reivindicación 11, para su uso en un método para inhibir la inflamación en un mamífero que necesite tal tratamiento.
15. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o la composición de acuerdo con la reivindicación 11 para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la inflamación está asociada a una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en esclerosis múltiple (EM) (por ejemplo, esclerosis múltiple con recidiva-remisión, esclerosis múltiple secundaria-progresiva, esclerosis múltiple primaria progresiva y/o esclerosis múltiple progresiva con recidiva), síndrome del intestino irritable (SII), enfermedad inflamatoria del intestino (EII), tal como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, dermatitis atópica, dermatitis de contacto, esclerosis sistémica, lupus eritematoso sistémico (LES), vasculitis asociada a anticuerpos antineutrófilos citoplásmicos (ANCA) (AAV), arteritis de células gigantes, esclerosis múltiple (EM), colitis, endotoxemia, artritis, artritis reumatoide (AR), osteoartritis, síndrome de Sjogren, psoriasis, artritis psoriásica, enfermedad respiratoria del adulto (ARD), choque séptico, insuficiencia multiorgánica, lesiones pulmonares inflamatorias tales como fibrosis pulmonar idiopática, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), hipersensibilidad de las vías respiratorias, bronquitis crónica, asma alérgica, eczema, infección por Helicobacter pylori, adherencias y/o abscesos intraabdominales como resultado de inflamación peritoneal (por ejemplo, por infecciones, lesiones, etc.), síndrome nefrótico, polineuropatía desmielinizante idiopática, síndrome de Guillain-Barre, rechazo al aloinjerto de órganos, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), nefritis lúpica, nefropatía por IgA, enfermedad renal diabética, enfermedad por cambios mínimos (nefrosis lipoidea), glomerulosclerosis focal segmentaria (GEFS), fibrosis sistémica nefrogénica (FSN), dermopatía nefrogénica fibrosante, hepatitis colestásica fibrosante, fascitis eosinofílica (síndrome de Shulman), escleromixedema (mucinosis popular), esclerodermia, liquen escleroatrófico, síndrome de POEM (síndrome de Crow-Fukase, enfermedad de Takatsuki o síndrome de PEP), síndrome nefrótico, enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD), enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD) (de un trasplante, tal como de sangre, médula ósea, riñón, páncreas, hígado, hígado ortotópico, pulmón, corazón, intestino, intestino delgado, intestino grueso, timo, células madre de aloinjerto, aloinjerto de menor intensidad, hueso, tendón, córnea, piel, válvulas cardíacas, venas, arterias, vasos sanguíneos, estómago y testículo), enfermedad osteolítica (por ejemplo, enfermedad osteolítica inducida por mieloma múltiple), fibrosis quística, degeneración macular relacionada con la edad (AMD; por ejemplo, AMD húmeda y AMD seca), fibrosis hepática, fibrosis pulmonar, ateroesclerosis, isquemia cardíaca/lesión por reperfusión, insuficiencia cardíaca, miocarditis, fibrosis cardíaca, remodelación adversa del miocardio, rechazo del trasplante, artritis inducida por la pared celular de estreptococos (SCW), gingivitis/periodontitis, queratitis del estroma herpética, reestenosis por enteropatía sensible al gluten, enfermedad de Kawasaki y una enfermedad renal mediada por el sistema inmunitario.
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