TW201350503A - 雙特異性抗體及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於使用雙特異性抗體拮抗IL-17A、IL-17F及IL-23之活性，該等雙特異性抗體包括對IL-17A及IL-17F具有交叉反應性之結合實體以及結合IL-23p19之結合實體。本發明係關於新穎的雙特異性抗體形式及其使用方法。

Description

雙特異性抗體及其使用方法
細胞因子係調介各種生物效應(包含誘導免疫細胞增殖、發育、分化及/或遷移，以及調控許多細胞類型之生長及分化)之可溶性小蛋白(例如參見Arai等人，Annu.Rev.Biochem.59：783(1990)；Mosmann,Curr.Opin.Immunol.3：311(1991)；Paul等人，Cell,76：241(1994))。細胞因子誘導之免疫功能亦可包含發炎性反應，其特徵在於免疫細胞之全身性或局部積累。儘管該等免疫反應具有宿主保護效應，但在反應涉及過度及/或慢性發炎時，其可產生病理學後果，例如在自體免疫病症(例如多發性硬化)及癌症/腫瘤疾病中(Oppenheim等人編輯，Cytokine Reference,Academic Press,San Diego,CA(2001)；von Andrian等人，New Engl.J.Med.,343：1020(2000)；Davidson等人，New Engl.J.Med.,345：340(2001)；Lu等人，Mol.Cancer Res.,4：221(2006)；Dalgleish等人，Cancer Treat Res.,130：1(2006))。
IL-17A、IL-17F及IL-23係與發炎有關之細胞因子。IL-17A誘導由滑膜成纖維細胞、單核球及巨噬細胞產生諸如IL-1β、TNF-α、IL-6及IL-23等發炎性細胞因子，所有該等因子皆促進發炎及Th17發育。IL-17A亦誘導大量趨化因子(包含CXCL-1、CXCL-2、CXCL-5、CXCL-8、CCL-2及CCL-20)，從而引起T細胞、B細胞、單核球及嗜中性球之募集。Lundy,S.K.,Arthritis Res.Ther.,9：202(2007)。IL-17F與 IL-17A擁有最大同源性(55%)且亦係促發炎細胞因子。IL-17A及IL-17F皆係由Th17細胞產生，而其他IL-17家族成員IL-17B、IL-17C及IL-17D係由非T細胞源產生。IL-17A及IL-17F可以IL-17A同二聚體及IL-17F同二聚體或IL-17A/F雜二聚體形式存在。Liang,S.C.等人，J.Immunol.,179：7791-7799(2007)。IL-17A在類風濕性關節炎血清及滑液中有所增多，且存在於滑膜之富T細胞區域中。Shahrara,S.,Arthritis Res.Ther.,10：R93(2005)。IL-17A亦可造成骨及軟骨損害。IL-17之有效阻斷需要中和IL-17A同二聚體、IL-17F同二聚體及IL-17A/F雜二聚體。
IL-23係1型雜二聚體，其包括經由二硫化物相連接之19千道爾頓(kilodalton，kD)之四重螺旋核心α亞單位(IL-23p19)及40kD之另一不同β亞單位(IL-12p40)。IL-23係聯繫先天性種類免疫反應與適應性種類免疫反應之重要細胞因子；其在早期係因應抗原攻擊而產生，且對於驅動早期局部免疫反應而言至關重要。另外，IL-23在活化NK細胞、增強T細胞增殖及調控抗體產生中發揮主要作用。IL-23亦調控在針對細胞內病原體之細胞調介之免疫性中較為重要之促發炎性細胞因子(例如IFN-γ)。最新報導指示，在人類中，增加量之IL-23與若干自體免疫疾病(包含類風濕性關節炎(RA)、萊姆關節炎(Lyme arthritis)、發炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病(Crohn's disease)(CD)、牛皮癬及多發性硬化(MS))有關。IL-23p19基因敲除小鼠可抵抗自體免疫腦脊髓炎(EAE)、膠原誘導之關節炎(CIA)及中樞神經系統自體免疫誘導。IL-23對於人類Th17細胞之發育而言並不重要，但似乎為其存活及/或擴增所需。Paradowska-Gorycka,A.,Scandinavian Journal of Immunology,71：134-145(2010)。基因研究揭露，IL-23受體基因與對於若干自體免疫疾病(包含CD、RA及葛瑞夫茲式眼病(Graves' ophthalmopathy))之易感性有關。IL-23-Th17軸對於自體免疫疾病之發 生至關重要。Leng等人，Archives of Medical Research,41：221-225(2010)。
IL-17A、IL-17F及IL-23p19在介導及促進若干自體免疫疾病中之所顯示活性闡釋了可拮抗該等靶之分子之臨床潛力及需要。如本文所闡述之本發明可滿足該等及其他需要。
圖1係全抗體及其模組組份之示意性圖解。
圖2繪示稱為biAbFabL之雙特異性抗體之模型，其含有具有經由連接體附接之雙特異性抗體之第二臂之C末端Fab單元之全抗體且利用公用輕鏈。
圖3繪示稱為taFab之雙特異性抗體之模型，其含有具有經由連接體附接之雙特異性抗體之第二臂之N末端Fab單元之全抗體。如同重鏈部分一樣，雙特異性抗體之每一臂具有兩條經由連接體附接之輕鏈。
圖4繪示稱為雜二聚體Fc之雙特異性抗體之模型，其類似於傳統抗體，然而，其含有兩條經由CH3區中之靜電互補性締合而締合之不同重鏈。雜二聚體Fc利用公用輕鏈。
圖5繪示稱為VCVFc之雙特異性抗體之模型，其含有具有經由連接體插入Fab區與鉸鏈間之雙特異性抗體之第二臂之Fv單元的全抗體。
圖6繪示稱為VCDFc之雙特異性抗體之模型，其含有具有經由連接體插入Fab區與鉸鏈間之雙特異性抗體之第二臂之單一結構域抗體的全抗體。
圖7圖解說明ELISA結果，其展示與IL-23p19具有較強抗體結合且缺乏對IL-12之交叉反應性。
圖8圖解說明如在kit225分析中所觀察到之IL-23信號傳導之強力 中和。
圖9展示7B7、STELARA®(優特克單抗(ustekinumab)，抗IL-23p40抗體)及人類IL-23受體結合各種IL-23p19丙胺酸切削突變體、野生型及經純化野生型L-23p19(陽性對照)及陰性對照之能力之Biacore結果。7B7 mAb結合展示於左側欄中，STELARA®展示於中間欄中且hIL-23R-Fc結合展示於右側欄中。選擇使用星號展示之4種突變體進行按比例放大以證實該等結果。
圖10展示IL-23p19抗體與IL-23丙胺酸突變體之結合之Biacore動力學分析。
圖11示意性圖解說明用於鑑別及選擇7B7抗體(抗IL-23p19)之過程。
圖12示意性圖解說明狨猿EAE模型中之隨時間變化之臨床疾病評分。
圖13示意性圖解說明狨猿EAE模型中之MRI損傷評分。
圖14示意性圖解說明狨猿EAE模型中之MRI視神經評分。
圖15展示Fab與IL-17A或IL-17F之所有4種結構根據介白素對準之重疊圖。
圖16以圖表形式展示IL-17A突變體之細胞功能活性。
圖17以圖表形式展示IL-17F突變體之細胞功能活性。
圖18係結合BiAb3之9nM IL-17A突變體之示意性重疊圖，其顯示含有Y108A突變之突變體及其組合具有加速離解速率。
圖19展示IL-17A突變體與BiAb3之結合之計算能量分析。
在一實施例中，本發明提供包括結合至IL-17A及IL-17F之IL-17A/F結合實體及經由p19結合至IL-23之IL-23結合實體之雙特異性抗體。本發明亦包含編碼本發明雙特異性抗體之重鏈及輕鏈之分離核酸 以及包括該等核酸之載體、包括該等載體之宿主細胞以及製備及使用雙特異性抗體之方法。
在其他實施例中，本發明提供包括雙特異性抗體之組合物及包括雙特異性抗體之套組以及包括雙特異性抗體之製造物件。
本發明雙特異性抗體可用於抑制促發炎性細胞因子(例如IL-17A、IL-17F及IL-23p19)。該等抗體可用於減小、限制、中和或阻斷IL-17A同二聚體、IL-17F同二聚體或IL-17A/F雜二聚體之促發炎性效應。同樣，該等抗體可用於減小、限制、中和或阻斷IL-17A同二聚體、IL-17F同二聚體或IL-17A/F雜二聚體之促癌效應。在該等情形下，使用抗體之抗IL-23p19部分來減小、限制、中和或阻斷將產生IL-17A及/或IL-17F(包含同二聚體及雜二聚體)之新T細胞之產生。本文所闡述之雙特異性抗體可用於治療發炎性病症及自體免疫疾病，例如多發性硬化(例如復發緩解型多發性硬化、繼發進展型多發性硬化、原發進展型多發性硬化及進展復發型多發性硬化)、發炎性腸病、牛皮癬、全身性硬化、全身性紅斑狼瘡、抗嗜中性球胞質抗體(ANCA)相關性血管炎(AAV)及巨細胞動脈炎。本文所闡述之雙特異性抗體亦可用於治療癌症(包含血管生成)。舉例而言，如本文所闡述之雙特異性抗體可用於治療多發性骨髓瘤誘導之溶骨性疾病(Sotomayor,E.M.,Blood,116(18)：3380-3382(2010))。
在下列闡述中，廣泛使用諸多術語。提供下述定義以便於理解本發明。
除非另有所指，否則「一個」(a、an)、「該」(the)及「至少一個」(at least one)可互換使用且意指一個或一個以上。
「抗體」(Ab)及「免疫球蛋白」(Ig)係具有相同結構特性之糖蛋白。儘管抗體可對於特定抗原展現結合特異性，但免疫球蛋白既包含抗體亦包含其他缺乏抗原特異性之抗體樣分子。舉例而言，後一種類 之多肽由淋巴系統以較低濃度產生而由骨髓瘤以升高之濃度產生。因此，如本文中所使用，術語「抗體」或「抗體肽」係指完整抗體或其與完整抗體競爭進行特異性結合之抗原結合片段且包含嵌合抗體、人類化抗體、完全人類抗體及雙特異性抗體。在某些實施例中，抗原結合片段係(例如)藉由重組DNA技術產生。在其他實施例中，抗原結合片段係藉由完整抗體之酶或化學解離產生。抗原結合片段包含(但不限於)Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv及單鏈抗體。
本文所用之術語「分離抗體」係指自天然環境之組份鑑別及分離及/或回收之抗體。其天然環境之污染組份係會幹擾抗體診斷或治療用途之物質，且可包含酶、激素及其他蛋白質性溶質或非蛋白質性溶質。在較佳實施例中，需將抗體純化至(1)如藉由Lowry方法所測定，含有大於95重量%之抗體，且最佳含有99重量%以上之抗體，(2)藉由使用旋杯式序列分析儀測定，達到足以獲得至少15個N末端或內部胺基酸序列殘基之程度，或(3)藉由還原或非還原條件下以SDS-PAGE使用考馬斯藍(Coomassie blue)或(較佳)銀染色量測達到均質性。因不應存在至少一種抗體天然環境組份，故分離抗體包含重組細胞內之原位抗體。然而，分離抗體通常需藉由至少一個純化步驟來製備。
術語「激動劑」係指增加另一分子之活性、活化或功能之任一化合物，包含蛋白質、多肽、肽、抗體、抗體片段、大分子或小分子(小於10kD)。
術語「拮抗劑」係指降低另一分子之活性、活化或功能之任一化合物，包含蛋白質、多肽、肽、抗體、抗體片段、大分子或小分子(小於10kD)。
術語「結合多肽」包含但不限於：本發明之配體多肽與受體之結合；本發明之受體多肽與配體之結合；本發明抗體與抗原或表位之 結合；本發明之抗原或表位與抗體之結合；本發明抗體與抗獨特型抗體之結合；本發明之抗獨特型抗體與配體之結合；本發明之抗獨特型抗體與受體之結合；本發明之抗抗獨特型抗體與配體、受體或抗體之結合等等。
「雙特異性」或「雙功能」抗體係具有兩個不同重/輕鏈對及兩個不同結合位點之雜交抗體。雙特異性抗體可藉由各種方法(包含但不限於雜交瘤融合或連接Fab'片段)產生。例如參見Songsivilai等人，Clin.Exp.Immunol.,79：315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.,148：1547-1553(1992)。
如本文中所使用，術語「表位」係指抗體特異性結合之抗原部分。因此，術語「表位」包含能夠特異性結合至免疫球蛋白或T細胞受體之任一蛋白質決定子。表位決定子通常由分子之化學活性表面基團(例如胺基酸或糖之側鏈)組成，且其通常具有特定三維結構特性及特定電荷特性。更具體而言，如本文所用之術語「IL-17表位」、「IL-23表位」及/或「L-23/p19表位」係指在動物中、較佳地在哺乳動物中及最佳地在小鼠或人類中具有抗原性或免疫原性活性之相應多肽部分。具有免疫原性活性之表位係(例如)在動物中誘發抗體反應之IL-17A或IL-17F或IL-23/p19多肽之一部分。具有抗原性活性之表位係(例如)抗體免疫特異性結合之IL-17A或IL-17F或IL-23/p19多肽之一部分，如藉由業內熟知之任一方法(例如免疫分析、蛋白酶消化、結晶學或H/D交換)所測定。抗原性表位未必具有免疫原性。該等表位可為線性或可為不連續表位。因此，如本文中所使用，術語「構象表位」係指藉由除連續胺基酸系列外之抗原胺基酸間之空間關係形成之不連續表位。
如本文中所使用，術語「免疫球蛋白」係指由一或多種實質上藉由免疫球蛋白基因編碼之多肽組成之蛋白質。一種免疫球蛋白形式 構成抗體之基礎結構單元。此形式係四聚體且由兩對相同之免疫球蛋白鏈組成，每一對具有一條輕鏈及一條重鏈。在每一對中，輕鏈及重鏈可變區一起負責抗原結合，且恆定區負責抗體效應子功能。
全長免疫球蛋白「輕鏈」(約25Kd或約214個胺基酸)係藉由NH2末端處之可變區基因(約110個胺基酸)及COOH末端處之κ或λ恆定區基因編碼。類似地，全長免疫球蛋白「重鏈」(約50Kd或約446個胺基酸)係藉由可變區基因(約116個胺基酸)及其他上述恆定區基因中之一者(約330個胺基酸)編碼。重鏈可分類為γ、μ、α、δ或ε，且將抗體之同種型分別界定為IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)、IgM、IgA、IgD及IgE在輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區係藉由具有約12個或更多個胺基酸之「J」區連結，其中重鏈亦包含具有約10個或更多個胺基酸之「D」區。(一般參見Fundamental Immunology，(Paul,W.編輯，第2版，Raven Press,NY(1989))，第7章(出於所有目的，其全部內容以引用方式併入本文中))。
免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變區由雜有三個超變區之「框架」區組成。因此，術語「超變區」係指負責抗原結合之抗體胺基酸殘基。超變區包括來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))及/或彼等來自「超變環」之殘基(Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))(此兩個文獻皆以引用方式併入本文中)。「框架區」或「FR」殘基係彼等除如本文所定義之超變區殘基以外之可變結構域殘基。不同輕鏈或重鏈之框架區之序列在物種內相對保守。因此，「人類框架區」係與天然存在之人類免疫球蛋白之框架區實質上一致(約85%或更高，通常90-95%或更高)之框架區。抗體之框架區係輕鏈及重鏈成份之組合框架區，其用於定位及對準CDR。CDR主要負責抗 原表位之結合。因此，術語「人類化」免疫球蛋白係指包括人類框架區及一或多個來自非人類(通常係小鼠或大鼠)免疫球蛋白之CDR之免疫球蛋白。提供CDR之非人類免疫球蛋白稱為「供體」且提供框架之人類免疫球蛋白稱為「受體」。恆定區未必存在，但若其存在，則其必須與人類免疫球蛋白恆定區實質上一致，亦即至少約85-90%、較佳地約95%或更高程度地一致。因此，人類化免疫球蛋白之所有部分(除了可能之CDR)與天然人類免疫球蛋白序列之相應部分實質上一致。另外，人類框架區中之一或多個殘基可反突變回親代序列以保留最佳抗原結合親和力及特異性。以此方式，來自非人類親代抗體之某些框架殘基保留於人類化抗體中以保留親代抗體之結合性質同時最小化其免疫原性。如本文所用之術語「人類框架區」包含具有該等反突變之區。「人類化抗體」係包括人類化輕鏈及人類化重鏈免疫球蛋白之抗體。舉例而言，人類化抗體並不涵蓋如上文所定義之典型嵌合抗體，此乃因(例如)嵌合抗體之整個可變區係非人類的。
術語「人類化」免疫球蛋白係指包括人類框架區及一或多個來自非人類(例如小鼠、大鼠或兔)免疫球蛋白之CDR之免疫球蛋白。提供CDR之非人類免疫球蛋白稱為「供體」且提供框架之人類免疫球蛋白稱為「受體」。恆定區未必存在，但若其存在，則其必須與人類免疫球蛋白恆定區實質上一致，亦即至少約85-90%、較佳地約95%或更高程度地一致。因此，人類化免疫球蛋白之所有部分(除可能之CDR及框架區中可能之一些反突變胺基酸殘基(例如1-15個殘基)外)與天然人類免疫球蛋白序列之相應部分實質上一致。「人類化抗體」係包括人類化輕鏈及人類化重鏈免疫球蛋白之抗體。舉例而言，人類化抗體並不涵蓋如上文所定義之典型嵌合抗體，此乃因(例如)嵌合抗體之整個可變區係非人類的。
如本文中所使用，術語「人類抗體」包含具有人類免疫球蛋白 之胺基酸序列之抗體，且包含自人類免疫球蛋白文庫或自一或多種人類免疫球蛋白之轉基因動物分離且並不表現內源性免疫球蛋白之抗體，如(例如)藉由Kucherlapati等人在美國專利第5,939,598號中所闡述。
術語「遺傳改變抗體」意指胺基酸序列自原始抗體發生變化之抗體。因重組DNA技術在抗體生成中之相關作用，無需限於在天然抗體中所發現之胺基酸序列；可再設計抗體以獲得期望特性。可能變化多種多樣且可自改變僅一種或一些胺基酸延伸至完全再設計(例如)可變及/或恆定區。一般而言，改變恆定區係用以改良或改變諸如補體結合、與膜之相互作用及其他效應子功能等特性。改變可變區係用以改良抗原結合特性。
「Fab片段」包括一條輕鏈以及一條重鏈之CH1及可變區。Fab分子之重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫鍵。
「Fab'片段」含有一條輕鏈及一條在CH1與CH2結構域之間含有額外恆定區之重鏈，從而可在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab')2分子。
「F(ab')2片段」含有兩條輕鏈及兩條在CH1及CH2結構域之間含有一部分恆定區之重鏈，從而在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。
「Fv片段」含有來自重鏈及輕鏈之可變區但缺乏恆定區。
「單結構域抗體」係由單一結構域Fv單元(例如VH或VL)組成之抗體片段。如同全抗體，其能夠選擇性結合至特異性抗原。單結構域抗體之分子量僅為12-15kDa，其遠小於由兩條蛋白質重鏈及兩條輕鏈構成之常見抗體(150-160kDa)，且甚至小於Fab片段(約50kDa，一條輕鏈及重鏈的一半)及單鏈可變片段(約25kDa，兩個可變結構域，一個來自輕鏈且一個來自重鏈)。第一單結構域抗體係自在駱駝科中發現之重鏈抗體改造而來。儘管關於單結構域抗體之大部分研究當前 係基於重鏈可變結構域，但輕鏈可變結構域及衍生自輕鏈之奈米抗體亦展示特異性結合至靶表位。
本文所用之術語「單株抗體」或「mAb」或「MAb」或「Mab」或「mab」不限於經由雜交瘤技術產生之抗體。術語「單株抗體」或「mAb」或「MAb」或「Mab」或「mab」係指衍生自單一純系(包含任一真核、原核或噬菌體純系)之抗體，且並不涉及產生其之方法。
如本文中所使用，「核酸」或「核酸分子」係指聚核苷酸(例如去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))、寡核苷酸、藉由聚合酶鏈反應(PCR)生成之片段及藉由連接、分裂、核酸內切酶作用及核酸外切酶作用中之任一者生成之片段。核酸分子可由以下單體構成：天然存在之核苷酸(例如DNA及RNA)或天然存在之核苷酸之類似物(例如天然存在之核苷酸之α-對映異構體形式)或二者之組合。改質核苷酸可在糖部分及/或嘧啶或嘌呤鹼基部分上有所改變。糖改質包含(例如)使用鹵素、烷基、胺及疊氮基代替一或多個羥基，或可將糖功能化為醚或酯。另外，可使用空間及電子類似結構(例如氮雜糖及羧酸糖類似物)代替整個糖部分。鹼基部分之改質之實例包含烷基化嘌呤及嘧啶、醯基化嘌呤或嘧啶或其他熟知雜環取代基。核酸單體可藉由磷酸二酯鍵或該等鏈接之類似物連接。磷酸二酯鏈接之類似物包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯、磷醯胺酯及諸如此類。術語「核酸分子」亦包含所謂的「肽核酸」，其包括附接至聚醯胺主鏈之天然存在或改質之核酸鹼基。核酸可為單鏈或雙鏈。
術語「核酸分子之補體」係指與參考核苷酸序列相比具有互補核苷酸序列及相反定向之核酸分子。
術語「簡並核苷酸序列」表示與編碼多肽之參考核酸分子相比包含一或多個簡並密碼子之核苷酸序列。簡並密碼子含有不同之核苷 酸三聯體，但編碼相同胺基酸殘基(亦即各自編碼Asp之GAU及GAC三聯體)。
「分離的核酸分子」係並未整合至有機體之基因組DNA中之核酸分子。舉例而言，編碼自細胞之基因組DNA分離之生長因子之DNA分子係分離的DNA分子。分離的核酸分子之另一實例係並未整合至有機體之基因組中之化學合成的核酸分子。自特定物種分離之核酸分子小於來自該物種之染色體之完整DNA分子。
「核酸分子構築體」係經由人為幹預進行改質以含有組合且並置於自然界中並不存在之配置中之核酸區段之單鏈或雙鏈核酸分子。
「互補DNA(cDNA)」係藉由轉錄酶自mRNA模板形成之單鏈DNA分子。通常，採用與mRNA部分互補之引物來引發逆轉錄。彼等熟習此項技術者亦使用術語「cDNA」來提及由此一單鏈DNA分子及其互補DNA鏈組成之雙鏈DNA分子。術語「cDNA」亦係指自RNA模板合成之cDNA分子之純系。
「啟動子」係引導結構基因之轉錄之核苷酸序列。通常，啟動子位於基因之5'非編碼區中且與結構基因之轉錄起始位點鄰近。在轉錄引發中發揮作用之啟動子內之序列元件之特徵通常在於共有核苷酸序列。該等啟動子元件包含RNA聚合酶結合位點、TATA序列、CAAT序列、分化特異性元件(DSE；McGehee等人，Mol.Endocrinol.,7：551(1993))、環AMP反應元件(CRE)、血清反應元件(SREs；Treisman,Seminars in Cancer Biol.,1：47(1990))、糖皮質激素反應元件(GRE)及用於其他轉錄因子(例如CRE/ATF(O'Reilly等人，J.Biol.Chem.,267：19938(1992))、AP2(Ye等人，J.Biol.Chem.,269：25728(1994))、SP1、cAMP反應元件結合蛋白(CREB；Loeken,Gene Expr.,3：253(1993))及八聚體因子(一般而言，參見Watson等人編輯，Molecular Biology of the Gene，第4版，The Benjamin/Cummings Publishing公司(1987)及Lemaigre等人，Biochem.J.,303：1(1994)))之結合位點。若啟動子為誘導型啟動子，則轉錄速率因應誘導劑而增加。與之相比，若啟動子為組成型啟動子，則轉錄速率不受誘導劑調控。亦已知抑制型啟動子。
「調控元件」係調節核心啟動子之活性之核苷酸序列。舉例而言，調控元件可含有與使得能夠排他性地或優先在特定細胞、組織或細胞器中轉錄之細胞因子結合之核苷酸序列。該等類型之調控元件通常與以「細胞特異性」、「組織特異性」或「細胞器特異性」方式表現之基因有關。
「增強子」係可增加轉錄效率之調控元件類型，不論增強子相對於轉錄起始位點之距離或定向如何。
「異源DNA」係指並不天然存在於給定宿主細胞內之DNA分子或DNA分子群體。只要宿主DNA與非宿主DNA(亦即外源性DNA)組合，與特定宿主細胞異源之DNA分子即可含有衍生自宿主細胞物種之DNA(亦即內源性DNA)。舉例而言，含有編碼與包括轉錄啟動子之宿主DNA區段以操作方式連接之多肽之非宿主DNA區段之DNA分子可視為異源DNA分子。與之相反，異源DNA分子可包括與外源性啟動子以操作方式連接之內源性基因。根據另一闡釋，若將包括衍生自野生型細胞之基因之DNA分子引入缺乏野生型基因之突變體細胞中，則該DNA分子可視為異源DNA。
「表現載體」係編碼表現於宿主細胞中之基因之核酸分子。通常，表現載體包括轉錄啟動子、基因及轉錄終止子。基因表現通常置於啟動子之控制下，且稱此一基因與啟動子「以操作方式連接」。類似地，若調控元件調節核心啟動子之活性，則調控元件與核心啟動子以操作方式連接。
「重組宿主」係含有異源核酸分子(例如選殖載體或表現載體)之 細胞。在本發明之上下文中，重組宿主之一實例係自表現載體產生本發明拮抗劑之細胞。與之相比，此一拮抗劑可藉由作為該拮抗劑之「天然來源」且缺乏表現載體之細胞產生。
術語「胺基末端」及「羧基末端」在本文中用於表示多肽內之位置。在上下文容許之情形下，參照多肽之特定序列或部分來使用該等術語以表示鄰近或相對位置。舉例而言，使定位於多肽內參考序列之羧基末端之某一序列位於鄰近參考序列之羧基末端處，但未必位於完整多肽之羧基末端處。
「融合蛋白」係藉由包括至少兩種基因之核苷酸序列之核酸分子表現之雜合蛋白。舉例而言，融合蛋白可包括與結合親和基質之多肽融合之IL-17RA多肽之至少一部分。此一融合蛋白提供使用親和層析分離大量IL-17A之方式。
術語「受體」表示結合至稱為「配體」之生物活性分子之細胞相關性蛋白。此相互作用調介配體對於細胞之效應。受體可為膜結合受體、細胞溶質受體或細胞核受體、單體受體(例如促甲狀腺激素受體、β-腎上腺素能受體)或多聚受體(例如PDGF受體、生長激素受體、IL-3受體、GM-CSF受體、G-CSF受體、紅細胞生成素受體及IL-6受體)。膜結合受體之特徵在於多結構域結構，其包括細胞外配體結合結構域及細胞內效應子結構域且通常涉及信號轉導。在某些膜結合受體中，細胞外配體結合結構域及細胞內效應子結構域位於構成完整功能受體之單獨多肽中。
一般而言，配體與受體之結合使得受體發生構形變化，從而導致在效應子結構域與細胞中之其他分子之間發生相互作用，此繼而在細胞代謝中引起改變。通常與受體-配體相互作用有關之代謝事件包含基因轉錄、磷酸化、去磷酸化、環AMP產生增加、細胞鈣動員、膜脂質動員、細胞黏附、肌醇脂質水解及磷脂水解。
術語「表現」係指基因產物之生物合成。舉例而言，在結構基因之情形下，表現涉及將結構基因轉錄成mRNA及將mRNA轉譯成一或多種多肽。
術語「補體/抗補體對」表示在適當條件下形成非共價締合之穩定對之不同部分。舉例而言，生物素及抗生物素(或鏈黴抗生物素)係補體/抗補體對之典型成員。其他實例性補體/抗補體對包含受體/配體對、抗體/抗原(或半抗原或表位)對、有義聚核苷酸/反義聚核苷酸對及諸如此類。在期望補體/抗補體對隨後發生離解之情形下，補體/抗補體對較佳地具有小於109M-1之結合親和力。
如本文中所使用，「治療劑」係偶聯至抗體部分以產生可用於療法之偶聯物之分子或原子。治療劑之實例包含藥物、毒素、免疫調節劑、螯合劑、硼化合物、光活性劑或染料及放射性同位素。
「可檢測標記」係可偶聯至抗體部分以產生可用於診斷之分子之分子或原子。可檢測標記之實例包含螯合劑、光活性劑、放射性同位素、螢光劑、順磁性離子或其他標記物部分。
術語「親和標籤」在本文中用於表示可附接至第二多肽以提供用於純化或檢測第二多肽或提供用於將第二多肽附接至受質之位點之多肽區段。原則上，可用於抗體或其他特異性結合劑之任一肽或蛋白質皆可用作親和標籤。親和標籤包含多組胺酸序列段、蛋白質A(Nilsson等人，EMBO J.,4：1075(1985)；Nilsson等人，Methods Enzymol.,198：3(1991))、谷胱甘肽轉移酶(Smith等人，Gene,67：31(1988))、Glu-Glu親和標籤(Grussenmeyer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：7952(1985))、物質P、FLAG®肽(Hopp等人，Biotechnology,6：1204(1988))、鏈黴抗生物素結合肽或其他抗原性表位或結合結構域。一般而言，參見Ford等人，Protein Expression and Purification,2：95(1991)。編碼親和標籤之DNA分子可購自商業供應商(例如 Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)。
「IL-17A結合實體」係特異性結合至同二聚體形式(IL-17A/IL-17A)及雜二聚體形式(IL-17A/IL-17F)之IL-17A之結合實體(例如抗體)。
「IL-17F結合實體」係特異性結合至同二聚體形式(IL-17F/IL-17F)及雜二聚體形式(IL-17A/IL-17F)之IL-17F之結合實體(例如抗體)。
「IL-17A/F結合實體」係藉由識別由IL-17A及IL-17F所共用之相同或類似表位(例如連續或不連續表位)且與其結合而特異性結合至IL-17A及IL-17F之結合實體(例如抗體)。IL-17A/F結合實體係結合至IL-17A同二聚體、IL-17F同二聚體及IL-17A/IL-17F雜二聚體。
一種問題係IL-17A、IL-17F及IL-23p19過度表現於若干發炎性及/或自體免疫病症中且與其病因及/或持續性有關。本發明之若干實施例所提供之一種解決方案係，藉由投與結合至每一細胞因子且抑制或減小每一細胞因子(例如同二聚體或雜二聚體形式)經由其同源受體發生信號傳導之雙特異性抗體來抑制或減小該等細胞因子發生細胞信號傳導之能力。
另一問題在於在產生雙特異性IL-17A/F及IL-23p19雙特異性抗體(例如biAb3)時發現，難以生成對IL-17A具有高親和力且係IL-17A之有效中和劑(例如IC50)之雙特異性抗體。表1中所展示之小鼠親代抗體(例如嵌合339.15、339.15.3.5、339.15.5.3或339.15.3.6)具有0.30nM之IL-17A/F IC50及0.26nM之IL-17F IC50，但僅具有11nM之IL-17A IC50。需要增強抗體抑制或中和IL-17A發生信號傳導之能力。如表3中所展示，小鼠親代嵌合339.15及人類化親代339.134對IL-17A具有類似結合親和力。另外，如表8中所展示，與抑制IL-17A/F(IC50為0.27nM)及IL-17F(IC50為0.24nM)之能力相比，人類化親代339.134抑 制IL-17A(IC50為1.3nM)之能力仍顯著減小。令人吃驚地是，可藉由利用biAb3之IL-23p19抗體之輕鏈(SEQ ID NO：17)來解決此問題。在將IL-23p19輕鏈與339.134之人類化重鏈配對時，所得單株抗體抑制IL-17A發生信號傳導之能力顯著增加(參見表9)且其對IL-17A之親和力顯著增加(參見表10)。可提供此增強親和力及中和能力之(例如)biAb3之當前所共用IL-23p19/IL-17A/F輕鏈之主要殘基可為SEQ ID NO：2之Y108或Tyr108，如藉由實例9之X射線結晶學及丙胺酸突變體研究所證實。
在一實施例中，本發明提供雙特異性抗體、抗體及其抗原結合片段。本發明雙特異性抗體包括結合至IL-17A之IL-17A結合實體及經由p19結合至IL-23之IL-23結合實體。在另一態樣中，本發明雙特異性抗體包括結合至IL-17F之IL-17F結合實體及經由p19結合至IL-23之IL-23結合實體。在另一態樣中，本發明雙特異性抗體包括結合至IL-17A及IL-17F之IL-17A/F結合實體及經由p19結合至IL-23之IL-23結合實體。經由p19結合至IL-23之結合實體在下文中稱為結合至IL-23之結合實體或「IL-23結合實體」。人類IL-17A之聚核苷酸序列展示於SEQ ID NO：1中且相應多肽序列展示於SEQ ID NO：2中。IL-17A多肽之信號序列係SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1-23。因此，SEQ ID NO：2之胺基酸殘基24-155構成成熟IL-17A多肽。本文所揭示結合至IL-17A之抗體(及其抗原結合片段)及雙特異性抗體結合至成熟IL-17A多肽(SEQ ID NO：2之胺基酸殘基24-155)。人類IL-17F之聚核苷酸序列展示於SEQ ID NO：3中且相應多肽序列展示於SEQ ID NO：4中。IL-17F多肽之信號序列係SEQ ID NO：4之胺基酸殘基1-30。因此，SEQ ID NO：4之胺基酸殘基31-163構成成熟IL-17F多肽。本文所揭示結合至IL-17F之抗體(及其抗原結合片段)及雙特異性抗體結合至成熟IL-17F多肽(SEQ ID NO：4之胺基酸殘基31-163)。IL-23之人類p19亞單位之聚 核苷酸序列展示於SEQ ID NO：5中且相應多肽序列展示於SEQ ID NO：6中。IL-23p19多肽之信號序列係SEQ ID NO：6之胺基酸殘基1-19。因此，SEQ ID NO：6之胺基酸殘基20-189構成成熟IL-23p19多肽。本文所揭示結合至IL-23p19之抗體(及其抗原結合片段)及雙特異性抗體結合至成熟IL-23p19多肽(SEQ ID NO：6之胺基酸殘基20-189)。
在本發明之一態樣中，IL-17A/F結合實體包括抗體，亦即兩對免疫球蛋白鏈，每一對具有一條輕鏈及一條重鏈，且IL-23結合實體包括兩個Fab片段，其各自包括輕鏈及重鏈之CH1與可變區，且IL-23結合實體之Fab片段與IL-17A/F結合實體之重鏈(Fc)之C末端連接。此雙特異性抗體形式在本文中稱為biAbFabL(參見圖2)。在另一實施例中，構成IL-23結合實體中Fab片段之輕鏈及重鏈之CH1及可變區中之每一者分別與IL-17A/F結合實體中輕鏈及重鏈的N末端連接。此雙特異性抗體形式在本文中稱為taFab(參見圖3)。
在本發明之另一態樣中，IL-23結合實體包括抗體，亦即兩對免疫球蛋白鏈，每一對具有一條輕鏈及一條重鏈，且IL-17A/F結合實體包括兩個Fab片段，其各自包括輕鏈及重鏈之CH1與可變區，且IL-17A/F結合實體之Fab片段與IL-23結合實體之重鏈(Fc)之C末端連接。此雙特異性抗體形式在本文中稱為biAbFabL(參見圖2)。在另一實施例中，構成IL-17A/F結合實體中Fab片段之輕鏈及重鏈之CH1及可變區中之每一者分別與IL-23結合實體中輕鏈及重鏈的N末端連接。此雙特異性抗體形式在本文中稱為taFab(參見圖3)。
在本發明之另一態樣中，IL-23結合實體包括輕鏈及IL-23重鏈且IL-17A/F結合實體包括輕鏈及IL-17A/F重鏈。此雙特異性抗體類似於傳統抗體，只是其包括兩條經由CH3區中之靜電互補性締合而締合之不同重鏈。其利用公用輕鏈。此雙特異性抗體形式在本文中稱為雜二聚體Fc(參見圖4)。
在另一實施例中，本發明提供雙特異性抗體，其包括含有抗體之第一結合實體(亦即兩對免疫球蛋白鏈，每一對具有一條輕鏈及一條重鏈)及含有Fv單元之第二結合實體(亦即來自重鏈及輕鏈之可變結構域)，且其中包括Fv單元之第二結合實體定位於第一結合實體之Fab區與鉸鏈之間，如圖5中所展示。Fv單元藉由連接體分子與第一結合實體之Fab區連接。更具體而言，Fv單元包括可變輕鏈結構域(其與Fab片段之輕鏈恆定區連接)及可變重鏈結構域(其與Fab片段之CH1區連接)。此雙特異性抗體形式在本文中稱為VCVFc。VCVFc之第一結合實體及第二結合實體未必共用公用輕鏈，而biAbFabL之第一結合實體及第二結合實體必須共用公用輕鏈。在本發明之此實施例之一態樣中，第一結合實體特異性結合淋巴球抗原、細胞因子、細胞因子受體、生長因子、生長因子受體、介白素(例如IL-17A、IL-17F、IL-17A/F及IL-23)或介白素受體，且第二結合實體特異性結合淋巴球抗原、細胞因子、細胞因子受體、生長因子、生長因子受體、介白素(例如IL-17A、IL-17F、IL-17A/F及IL-23)或介白素受體。在本發明之此實施例之另一態樣中，第一結合實體係IL-17A/F結合實體且第二結合實體係IL-23結合實體。在本發明之此實施例之另一態樣中，第一結合實體係IL-23結合實體且第二結合實體係IL-17A/F結合實體。
在另一實施例中，本發明提供雙特異性抗體，其包括含有抗體之第一結合實體(亦即兩對免疫球蛋白鏈，每一對具有一條輕鏈及一條重鏈)及含有單一結構域抗體之第二結合實體。此雙特異性抗體形式在本文中稱為VCDFc。VCDFc雙特異性抗體之圖解說明展示於圖6中。包括單一結構域抗體之第二結合實體定位於Fab區、更具體而言Fab片段之CH1區與第一結合實體之鉸鏈之間。單一結構域抗體藉由連接體分子(例如但不限於10mer G4S(其由式(G4S)2表示)或SSASTKGPS(SEQ ID NO：86))與第一結合實體之Fab之CH1區連接。在 本發明之此實施例之一態樣中，第一結合實體特異性結合淋巴球抗原、細胞因子、細胞因子受體、生長因子、生長因子受體、介白素(例如IL-17A、IL-17F、IL-17A/F及IL-23)或介白素受體，且第二結合實體特異性結合淋巴球抗原、細胞因子、細胞因子受體、生長因子、生長因子受體、介白素(例如IL-17A、IL-17F、IL-17A/F及IL-23)或介白素受體。在本發明之此實施例之一態樣中，第一結合實體係IL-23結合實體且第二結合實體係IL-17A/F結合實體。在本發明之此實施例之另一態樣中，第一結合實體係IL-17A/F結合實體且第二結合實體係IL-23結合實體。
結合實體之胺基酸序列較佳地基於針對淋巴球抗原、細胞因子、細胞因子受體、生長因子、生長因子受體、介白素(例如IL-17A、IL-17F、IL-17A/F及IL-23)或介白素受體之人類及/或人類化單株抗體之序列。
在本發明之前述態樣之一實施例中，雙特異性抗體之IL-17A/F結合實體及IL-23結合實體之輕鏈各自包括含有CDR1(其具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO：23之胺基酸序列)及CDR3(其具有SEQ ID NO：24之序列)之可變結構域。在另一實施例中，IL-17A/F結合實體及IL-23結合實體之輕鏈各自包括含有SEQ ID NO：9之胺基酸序列之可變結構域。在另一實施例中，IL-17A/F結合實體及IL-23結合實體之輕鏈各自包括含有SEQ ID NO：10之胺基酸序列之恆定結構域。在另一實施例中，IL-17A/F結合實體及IL-23結合實體之輕鏈各自包括含有SEQ ID NO：9之胺基酸序列之可變結構域及含有SEQ ID NO：10之胺基酸序列之恆定結構域。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，雙特異性抗體之IL-17A/F結合實體之重鏈包括含有CDR1(其具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列)及CDR3(其具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列)之可變結構域。在另一實施例中，IL-17A/F結合實體之重鏈包括含有SEQ ID NO：13之胺基酸序列之可變結構域。在另一實施例中，在IL-17A/F結合實體包括抗體時，重鏈恆定結構域包括SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：127或SEQ ID NO：128之胺基酸序列。在另一實施例中，在IL-17A/F結合實體包括Fab片段時，重鏈之CH1區包括SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15之胺基酸序列。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，雙特異性抗體之IL-17A/F結合實體包括與SEQ ID NO：13之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性之重鏈可變結構域。視情況，所有取代、添加或缺失皆在重鏈可變結構域之框架區內。視情況，雙特異性抗體之IL-17A/F結合實體包括與SEQ ID NO：13之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性之重鏈可變結構域，其中可變結構域包括CDR1(其具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列)及CDR3(其具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列)。視情況，重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：13之胺基酸序列。視情況，三個IL-17A/F重鏈可變結構域CDR包含CDR1區，其包括與SEQ ID NO：25之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性之胺基酸序列；CDR2區，其包括與SEQ ID NO：26之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性之胺基酸序列；及CDR3區，其包括與SEQ ID NO：27之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少 93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性之胺基酸序列。視情況，IL-17A/F重鏈可變結構域CDR1具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列；重鏈可變結構域CDR2具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列；且重鏈可變結構域CDR3具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列。IL-17A/F及/或IL-23p19結合實體包括與SEQ ID NO：9之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性之輕鏈可變結構域。視情況，所有取代、添加或缺失皆在輕鏈可變結構域之框架區內。視情況，雙特異性抗體之IL-17A/F及/或IL-23p19結合實體包括與SEQ ID NO：9之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性之輕鏈可變結構域，其中可變結構域包括CDR1(其具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO：23之胺基酸序列)及CDR3(其具有具有SEQ ID NO：24之胺基酸序列)。視情況，輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：9之胺基酸序列。視情況，三個IL-17A/F及/或IL-23p19輕鏈可變結構域CDR包含CDRI區，其包括與SEQ ID NO：22之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性之胺基酸序列；CDR2區，其包括與SEQ ID NO：23之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性之胺基酸序列；及CDR3區，其包括與SEQ ID NO：24之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性之胺基酸序列。視情況，IL-17A/F及/或IL-23p19輕鏈可變結構域CDR1具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列；IL-17A/F及/或 IL-23p19輕鏈可變結構域CDR2具有SEQ ID NO：23之胺基酸序列；且IL-17A/F及/或IL-23p19輕鏈可變結構域CDR3具有SEQ ID NO：24之胺基酸序列。IL-23p19結合實體包括與SEQ ID NO：7之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性之重鏈可變結構域。視情況，所有取代、添加或缺失皆在IL-23p19重鏈可變結構域之框架區內。視情況，雙特異性抗體之IL-23p19結合實體包括與SEQ ID NO：7之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性之重鏈可變結構域，其中可變結構域包括CDR1(其具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列)及CDR3(其具有SEQ ID NO：21之胺基酸序列)。視情況，IL-23p19重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：7之胺基酸序列。視情況，三個IL-23p19重鏈可變結構域CDR包含CDR1區，其包括與SEQ ID NO：19之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性之胺基酸序列；CDR2區，其包括與SEQ ID NO：20之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性之胺基酸序列；及CDR3區，其包括與SEQ ID NO：21之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性之胺基酸序列。視情況，IL-23p19重鏈可變結構域CDR1具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列；重鏈可變結構域CDR2具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列；且重鏈可變結構域CDR3具有SEQ ID NO：21之胺基酸序列。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，雙特異性抗體之IL-23結 合實體之重鏈包括含有CDR1(其具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列)及CDR3(其具有SEQ ID NO：21之胺基酸序列)之可變結構域。在另一實施例中，IL-23結合實體之重鏈包括含有SEQ ID NO：7之胺基酸序列之可變結構域。在另一實施例中，在IL-23結合實體包括抗體時，重鏈恆定結構域包括SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：127或SEQ ID NO：128之胺基酸序列。在一些實施例中，SEQ ID NO：8之C末端離胺酸已發生解離，且因此重鏈恆定結構域包括SEQ ID NO：8之殘基1-326之胺基酸序列。在另一實施例中，在IL-23結合實體包括Fab片段時，重鏈之CH1區包括SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15之胺基酸序列。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，在雙特異性抗體之IL-23結合實體或IL-17A/F結合實體係Fv單元時，輕鏈之可變結構域包括CDR1(其具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO：23之胺基酸序列)及CDR3(其具有SEQ ID NO：24之序列)。在另一實施例中，IL-17A/F結合實體及IL-23結合實體之輕鏈各自包括含有SEQ ID NO：9之胺基酸序列之可變結構域。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，在雙特異性抗體之IL-17A/F結合實體係Fv單元時，重鏈之可變結構域包括CDR1(其具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列)及CDR3(其具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列)。在另一實施例中，IL-17A/F結合實體之重鏈包括含有SEQ ID NO：13之胺基酸序列之可變結構域。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，在雙特異性抗體之IL-23結合實體係Fv單元時，重鏈之可變結構域包括CDR1(其具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列)、CDR2(其具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列)及CDR3(其具有SEQ ID NO：21之胺基酸序列)。在另一實施例中，IL-23 結合實體之重鏈包括含有SEQ ID NO：7之胺基酸序列之可變結構域。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，雙特異性抗體之IL-23結合實體之Fab片段與IL-17A/F結合實體之重鏈(Fc)之C末端連接，或IL-17A/F結合實體之Fab片段與(例如)IL-23結合實體之重鏈(Fc)之C末端藉由連接體分子連接(例如參見圖2)。在另一實施例中，構成IL-23結合實體中Fab片段之輕鏈及重鏈之CH1及可變區中之每一者分別與IL-17A/F結合實體中輕鏈及重鏈的N末端連接，或構成IL-17A/F結合實體中Fab片段之輕鏈及重鏈之CH1及可變區中之每一者分別與IL-23結合實體中輕鏈及重鏈的N末端藉由連接體分子連接(例如參見圖3)。在VCVFc雙特異性抗體之另一實施例中，構成第二結合實體中Fv單元之輕鏈可變區及重鏈可變區中之每一者分別與第一結合實體中Fab片段之輕鏈恆定區及CH1區中之每一者藉由連接體分子連接(參見圖5)。業內已知適宜連接體分子且包含(例如)短多肽。適宜連接體可包含含有甘胺酸(其賦予撓性)及絲胺酸或蘇胺酸(其賦予溶解性)之短多肽。適宜連接體可包括Gly4Ser1單元。舉例而言，連接體可為(Gly4Ser1)x，其中x為1、2或3。視情況，連接體多肽具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列。在VCVFc雙特異性抗體之另一實施例中，用於輕鏈之連接體具有SEQ ID NO：85之胺基酸序列且用於重鏈之連接體具有SEQ ID NO：86之胺基酸序列。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，雙特異性抗體包括一對各自包括SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：84之胺基酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列之輕鏈。在一較佳實施例中，雙特異性抗體包括一對包括SEQ ID NO：74之胺基酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列之輕鏈。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，雙特異性抗體(例如 biAbFabL(參見圖2)、taFab(參見圖3)、雜二聚體Fc(參見圖4)、VCVFc(參見圖5)或VCDFc(參見圖6))之IL-17A/F抗體(或其抗原結合片段)或IL-17A/F結合實體係結合(a)IL-17A同二聚體，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-9M、至少5×10-9M、至少1×10-10M、至少5×10-10M、至少8×10-10M或至少至少1×10-11M；(b)IL-17F同二聚體，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-9M、至少5×10-9M、至少1×10-10M、至少2×10-10M、至少3×10-10M、至少4×10-10M、至少5×10-10M或至少1×10-11M；及/或(c)IL-17A/F雜二聚體，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-8M、至少5×10-8M、至少1×10-9M、至少2×10-9M、至少3×10-9M、至少4×10-9M、至少5×10-9M、至少6×10-9M、至少7×10-9M、至少9×10-9M、至少1×10-10M或至少5×10-10M，其中結合親和力係藉由表面電漿共振(例如Biacore)量測。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，雙特異性抗體(例如biAbFabL(參見圖2)、taFab(參見圖3)、雜二聚體Fc(參見圖4)、VCVFc(參見圖5)或VCDFc(參見圖6))之IL-23p19抗體(或其抗原結合片段)或IL-23p19結合實體係結合IL-23p19，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-9M、至少5×10-9M、至少1×10-10M、至少2×10-10M、至少3×10-10M、至少4×10-10M、至少5×10-10、至少6×10-10、至少7×10-10、至少8×10-10或至少9×10-10、至少1×10-11，其中結合親和力係藉由表面電漿共振(例如Biacore)量測。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，雙特異性抗體(例如biAbFabL(參見圖2)、taFab(參見圖3)、雜二聚體Fc(參見圖4)、VCVFc(參見圖5)或VCDFc(參見圖6))之IL-17A/F結合實體係結合(a)IL-17A同二聚體，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-9M、至少5×10-9M、至少1×10-10M、至少5×10-10M、至少8×10-10M或至少至 少1×10-11M；(b)IL-17F同二聚體，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-9M、至少5×10-9M、至少1×10-10M、至少2×10-10M、至少3×10-10M、至少4×10-10M、至少5×10-10M或至少1×10-11M；及/或(c)IL-17A/F雜二聚體，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-8M、至少5×10-8M、至少1×10-9M、至少2×10-9M、至少3×10-9M、至少4×10-9M、至少5×10-9M、至少6×10-9M、至少7×10-9M、至少9×10-9M、至少1×10-10M或至少5×10-10M；且雙特異性抗體之IL-23p19結合實體係結合IL-23p19，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-9M、至少5×10-9M、至少1×10-10M、至少2×10-10M、至少3×10-10M、至少4×10-10M、至少5×10-10、至少6×10-10、至少7×10-10、至少8×10-10或至少9×10-10、至少1×10-11，其中結合親和力係藉由表面電漿共振(例如Biacore)量測。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，雙特異性抗體之IL-17A/F抗體(或其抗原結合片段)或IL-17A/F結合實體係中和或抑制(a)IL-17A在初代人類小呼吸道上皮細胞(SAEC)中誘導G-CSF，其中IC50為0.5 pm或更小；(b)IL-17F在初代人類小呼吸道上皮細胞(SAEC)中誘導G-CSF，其中IC50為2.0nM或更小、1.5nM或更小、1.4nM或更小、1.3nM或更小、1.2nM或更小、1.1nM或更小或1.0nM或更小；及/或(c)IL-17A/F在初代人類小呼吸道上皮細胞(SAEC)中誘導G-CSF，其中IC50為1.3nM或更小、1.2nM或更小、1.1nM或更小、1.0nM或更小、0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、0.6nM或更小或0.5nM或更小。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，雙特異性抗體之IL-17A/F抗體(或其抗原結合片段)或IL-17A/F結合實體係中和或抑制(a)IL-17A在人類初代成纖維細胞(HFFF)中誘導IL-6，其中IC50為0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小、0.1nM或更小、 0.09nM或更小、0.08nM或更小、0.07nM或更小、0.06nM或更小、0.05nM或更小、0.04nM或更小、0.03nM或更小、0.02nM或更小或0.01nM或更小；(b)IL-17F在人類初代成纖維細胞(HFFF)中誘導IL-6，其中IC50為30nM或更小、28nM或更小、26nM或更小、25nM或更小、22nM或更小、20nM或更小、19nM或更小、18nM或更小、17nM或更小、16nM或更小、15nM或更小、14nM或更小、13nM或更小、12nM或更小、11nM或更小或10nM或更小；及/或(c)IL-17A/F在人類初代成纖維細胞(HFFF)中誘導IL-6，其中IC50為30nM或更小、28nM或更小、26nM或更小、22nM或更小、20nM或更小、18nM或更小、17nM或更小、16nM或更小、15nM或更小、14nM或更小、13nM或更小、12nM或更小、11nM或更小、10nM或更小、9.5nM或更小、9.4nM或更小、9.3nM或更小、9.2nM或更小、9.1nM或更小或9.0nM或更小。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，雙特異性抗體之IL-23p19抗體(或其抗原結合片段)或IL-23p19結合實體係中和或抑制(a)IL-23在鼠類脾細胞中誘導IL-17A及IL-17F產生，其中IC50為0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小、0.1nM或更小、0.09nM或更小、0.08nM或更小、0.07nM或更小或0.06nM或更小。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，雙特異性抗體之IL-23p19抗體(或其抗原結合片段)或IL-23p19結合實體係中和或抑制IL-23在活化之初代人類T細胞中誘導STAT3磷酸化，其中IC50為0.1nM或更小、0.2nM或更小、0.3nM或更小、0.4nM或更小、0.5nM或更小、0.8nM或更小、0.9nM或更小、0.01nM或更小、0.02nM或更小、0.03nM或更小、0.04nM或更小或0.05nM或更小。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，雙特異性抗體(例如biAbFabL(參見圖2)、taFab(參見圖3)、雜二聚體Fc(參見圖4)、 VCVFc(參見圖5)或VCDFc(參見圖6))之IL-17A/F結合實體係結合(a)IL-17A同二聚體，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-9M、至少5×10-9M、至少1×10-10M、至少5×10-10M、至少8×10-10M或至少1×10-11M；(b)IL-17F同二聚體，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-9M、至少5×10-9M、至少1×10-10M、至少2×10-10M、至少3×10-10M、至少4×10-10M、至少5×10-10M或至少1×10-11M；及/或(c)IL-17A/F雜二聚體，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-8M、至少5×10-8M、至少1×10-9M、至少2×10-9M、至少3×10-9M、至少4×10-9M、至少5×10-9M、至少6×10-9M、至少7×10-9M、至少9×10-9M、至少1×10-10M或至少5×10-10M。視情況，雙特異性抗體之IL-23p19結合實體係結合IL-23p19，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-9M、至少5×10-9M、至少1×10-10M、至少2×10-10M、至少3×10-10M、至少4×10-10M、至少5×10-10、至少6×10-10、至少7×10-10、至少8×10-10或至少9×10-10、至少1×10-11，其中結合親和力係藉由表面電漿共振(例如Biacore)量測。視情況，雙特異性抗體之IL-17A/F結合實體係中和或抑制(a)IL-17A在初代人類小呼吸道上皮細胞(SAEC)中誘導G-CSF，其中IC50為0.5 pm或更小；(b)IL-17F在初代人類小呼吸道上皮細胞(SAEC)中誘導G-CSF，其中IC50為2.0nM或更小、1.5nM或更小、1.4nM或更小、1.3nM或更小、1.2nM或更小、1.1nM或更小或1.0nM或更小；及/或(c)IL-17A/F在初代人類小呼吸道上皮細胞(SAEC)中誘導G-CSF，其中IC50為1.3nM或更小、1.2nM或更小、1.1nM或更小、1.0nM或更小、0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、0.6nM或更小或0.5nM或更小。視情況，雙特異性抗體之IL-17A/F結合實體係中和或抑制(a)IL-17A在人類初代成纖維細胞(HFFF)中誘導IL-6，其中IC50為0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小、0.1nM或更小、0.09nM或更小、0.08 nM或更小、0.07nM或更小、0.06nM或更小、0.05nM或更小、0.04nM或更小、0.03nM或更小、0.02nM或更小或0.01nM或更小；(b)IL-17F在人類初代成纖維細胞(HFFF)中誘導IL-6，其中IC50為30nM或更小、28nM或更小、26nM或更小、25nM或更小、22nM或更小、20nM或更小、19nM或更小、18nM或更小、17nM或更小、16nM或更小、15nM或更小、14nM或更小、13nM或更小、12nM或更小、11nM或更小或10nM或更小；及/或(c)IL-17A/F在人類初代成纖維細胞(HFFF)中誘導IL-6，其中IC50為30nM或更小、28nM或更小、26nM或更小、22nM或更小、20nM或更小、18nM或更小、17nM或更小、16nM或更小、15nM或更小、14nM或更小、13nM或更小、12nM或更小、11nM或更小、10nM或更小、9.5nM或更小、9.4nM或更小、9.3nM或更小、9.2nM或更小、9.1nM或更小或9.0nM或更小。視情況，雙特異性抗體之IL-23p19結合實體係中和或抑制IL-23在活化之初代人類T細胞中誘導STAT3磷酸化，其中IC50為0.1nM或更小、0.2nM或更小、0.3nM或更小、0.4nM或更小、0.5nM或更小、0.8nM或更小、0.9nM或更小、0.01nM或更小、0.02nM或更小、0.03nM或更小、0.04nM或更小或0.05nM或更小。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，包括一對重鏈(其包括SEQ ID NO：28之胺基酸序列)及一對輕鏈(其包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列)之雙特異性抗體在本文中稱為「biAb1」、「bAb1」或「23/17bAb1」。包括一對重鏈(其各自包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列)及一對輕鏈(其各自包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列)之雙特異性抗體在本文中稱為「biAb2」、「bAb2」或「23/17bAb2」。包括一對重鏈(其各自包括SEQ ID NO：74之胺基酸序列)及一對輕鏈(其各自包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列)之雙特異性抗體在本文中稱為「biAb3」、「bAb3」或「23/17bAb3」。包括一對重鏈(其包括SEQ ID NO：29之胺基酸序列)及一對輕鏈(其各自包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列)之雙特異性抗體在本文中稱為「biAb4」、「bAb4」或「23/17bAb4」。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，雙特異性抗體包括一對各自包括SEQ ID NO：77之胺基酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：79之胺基酸序列之輕鏈且在本文中稱為「taFab1」。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，雙特異性抗體包括IL-23重鏈(其包括SEQ ID NO：63之胺基酸序列)、IL-17A/F重鏈(其包括SEQ ID NO：65之胺基酸序列)及一對輕鏈(其各自包括SEQ ID NO：17之序列)，且在本文中稱為「hetero1」。在另一實施例中，雙特異性抗體包括IL-23重鏈(其包括SEQ ID NO：61之胺基酸序列)、IL-17A/F重鏈(其包括SEQ ID NO：81之胺基酸序列)及一對輕鏈(其各自包括SEQ ID NO：17之序列)，且在本文中稱為「hetero2」。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，呈VCVFc形式之雙特異性抗體(參見圖5)具有一對各自包括SEQ ID NO：88之胺基酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：90之胺基酸序列之輕鏈，或一對各自包括SEQ ID NO：92之胺基酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：94之胺基酸序列之輕鏈，或一對各自包括SEQ ID NO：96之胺基酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：90之胺基酸序列之輕鏈，或一對各自包括SEQ ID NO：98之胺基酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：94之胺基酸序列之輕鏈，或一對各自包括SEQ ID NO：100之胺基酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：102之胺基酸序列之輕鏈，或一對各自包括SEQ ID NO：104之胺基酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：106之胺基酸序列之輕鏈，或一對各自包括SEQ ID NO：112之胺基酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：114之胺基酸序列之輕鏈，或一對各自包括SEQ ID NO：116之胺基酸序列之重鏈及 一對各自包括SEQ ID NO：118之胺基酸序列之輕鏈。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，特異性結合至IL-17A(SEQ ID NO：2)及IL-17F(SEQ ID NO：4)之分離單株抗體或其抗原結合片段包括重鏈可變結構域及輕鏈可變結構域，其中重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：13之胺基酸殘基且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：9之胺基酸殘基。視情況，單株抗體包括人類恆定區，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。IgG4人類恆定區可在241位(根據Kabat)具有絲胺酸至脯胺酸突變。視情況，重鏈包括SEQ ID NO：16、18、28、29或74之胺基酸殘基。視情況，輕鏈包括SEQ ID NO：17之胺基酸殘基。視情況，重鏈包括SEQ ID NO：16、18、28、29或74之胺基酸殘基，且輕鏈包括SEQ ID NO：17之胺基酸殘基。視情況，雙特異性抗體包括單株抗體。
重鏈及輕鏈恆定區包含IgG1.1(SEQ ID NO：11，其可由SEQ ID NO：82編碼)、沒有C末端離胺酸之IgG1.1f(SEQ ID NO：127)、具有C末端離胺酸之IgG1.1f(SEQ ID NO：128)、人類κ恆定區(SEQ ID NO：10，其可由SEQ ID NO：83編碼)或IgG4.1(SEQ ID NO：8)。IgG4重鏈恆定結構域可包含野生型IgG4之變體，其在鉸鏈區中具有突變S228P(EU索引編號系統)或S241P(Kabat編號系統)。在小鼠/人類嵌合重鏈中將241(Kabat)處之絲胺酸改變為脯胺酸(在IgG1及IgG2中之該位置發現)使得產生同源抗體且消除異源性。另外，與原始嵌合IgG4相比，變體IgG4具有顯著延長之血清半衰期且展示改良之組織分佈。Angal等人，Molecular Immunology,30(1)：105-108(1993)；Schuurman等人，Molecular Immunology,38：1-8(2001)；Lewis等人，Molecular Immunology,46：3488-3494(2009)。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，特異性結合至IL-23p19(SEQ ID NO：6)之分離單株抗體或其抗原結合片段包括重鏈可變結構 域及輕鏈可變結構域，其中重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：7之胺基酸殘基，且其中輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：9之胺基酸殘基。視情況，單株抗體包括人類恆定區，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。視情況，IgG4人類恆定區在241位(根據Kabat)具有絲胺酸至脯胺酸突變。視情況，重鏈包括SEQ ID NO：16、18、28、29或74之胺基酸殘基。視情況，輕鏈包括SEQ ID NO：17之胺基酸殘基。視情況，重鏈包括SEQ ID NO：16、18、28、29或74之胺基酸殘基，且輕鏈包括SEQ ID NO：17之胺基酸殘基。視情況，雙特異性抗體包括單株抗體。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，抗體、雙特異性抗體或其抗原結合片段特異性結合IL-23p19，其中抗體或抗原結合片段結合IL-23p19上之不連續表位(包括第一表位及第二表位)，其中第一表位由SEQ ID NO：6之胺基酸殘基33-59之至少一個胺基酸組成且第二表位由SEQ ID NO：6之胺基酸殘基89-125之至少一個胺基酸組成。視情況，抗體、雙特異性抗體或其抗原結合片段至少結合至第一表位之SEQ ID NO：6之胺基酸殘基54。視情況，抗體、雙特異性抗體或其抗原結合片段至少結合至第一表位之SEQ ID NO：6之胺基酸殘基55。視情況，抗體、雙特異性抗體或其抗原結合片段至少結合至第一表位之SEQ ID NO：6之胺基酸殘基54及55。視情況，抗體、雙特異性抗體或其抗原結合片段至少結合至第二表位之SEQ ID NO：6之胺基酸殘基116。視情況，抗體、雙特異性抗體或其抗原結合片段至少結合至第一表位之SEQ ID NO：6之胺基酸殘基54及55，且至少結合至第二表位之SEQ ID NO：6之胺基酸殘基116。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，抗體、雙特異性抗體或其抗原結合片段特異性結合IL-23p19，其中抗體或抗原結合片段結合IL-23p19上之不連續表位(包括第一表位及第二表位)，其中抗體或抗原結合片段至少結合至第一表位之SEQ ID NO：6之胺基酸殘基54及 55，且至少結合至第二表位之SEQ ID NO：6之胺基酸殘基116。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，IL-17A/F結合實體特異性結合在至少包括SEQ ID NO：2之胺基酸殘基108(Tyr)之表位上之IL-17A(IL-17A/IL-17A同二聚體及IL-17A/IL-17F雜二聚體)，其中IL-17A/F結合實體係單株抗體或其抗原結合片段。視情況，藉由丙胺酸誘變法及/或X射線結晶學測定IL-17A上之表位。IL-17A/F結合實體在上面結合IL-17A之表位可為連續或不連續表位。
在本發明之前述態樣之另一實施例中，IL-17A/F交叉反應性單株抗體或其抗原結合片段在至少包括SEQ ID NO：2之胺基酸殘基108(Tyr)之表位上結合IL-17A。視情況，藉由丙胺酸誘變法及/或X射線結晶學測定IL-17A上之表位。IL-17A/F交叉反應性單株抗體或其抗原結合片段在上面結合IL-17A之表位可為連續或不連續表位。
本發明雙特異性抗體可單獨使用或以與細胞毒性劑之免疫偶聯物形式使用。在一些實施例中，藥劑係化學治療劑。在一些實施例中，藥劑係放射性同位素，包含但不限於鉛-212、鉍-212、砹-211、碘-131、鈧-47、錸-186、錸-188、釔-90、碘-123、碘-125、溴-77、銦-111及可裂變核素(例如硼-10或錒系元素)。在其他實施例中，藥劑係毒素或細胞毒性藥物，包含但不限於蓖麻毒素、相思豆毒素、改質假單胞菌腸毒素A(modified Pseudomonas enterotoxin A)、假單胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、卡奇黴素(calicheamicin)、阿黴素(adriamycin)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、白喉毒素及諸如此類。文獻中已知抗體與該等藥劑之偶聯方法，且包含直接偶聯及間接偶聯。
可將適宜可檢測分子直接或間接附接至本發明抗體。適宜可檢測分子包含放射性核素、酶、受質、輔因子、抑制劑、螢光標記物、化學發光標記物、磁性粒子及諸如此類。為間接附接可檢測或細胞毒性分子，可使可檢測或細胞毒性分子與互補/抗互補對之一個成員偶 聯，其中使另一成員結合至結合多肽或抗體部分。出於該等目的，生物素/鏈黴抗生物素係實例性互補/抗互補對。
本發明之雙特異性抗體、抗體及抗原結合片段亦包含改質衍生物，例如藉由將任一類型之分子共價附接至抗體，其中共價附接並不防止抗體結合至其表位。適宜衍生物之實例包含但不限於岩藻糖基化抗體、糖基化抗體、乙醯化抗體、聚乙二醇化抗體、磷酸化抗體及醯胺化抗體。本發明之抗體及其衍生物自身可藉由已知保護/阻斷基團、溶蛋白性解離、鏈接至細胞配體或其他蛋白質及諸如此類來衍生。在本發明之一些實施例中，抗體之至少一條重鏈經岩藻糖基化。在一些實施例中，岩藻糖基化係N-連接。在一些較佳實施例中，抗體之至少一條重鏈包括岩藻糖基化N-連接寡糖。
本發明之雙特異性抗體、抗體及抗原結合片段包含具有單一或多個胺基酸取代、缺失、添加或代替之變體，其保留本發明抗體之生物性質(例如阻斷IL-17A或IL-17F及/或IL-23與其各別受體之結合，抑制IL-17A或IL-17F及IL-23之生物活性)。熟習此項技術者可產生具有單一或多個胺基酸取代、缺失、添加或代替之變體。該等變體可尤其包含：(a)一或多個胺基酸殘基經保守或非保守胺基酸取代之變體，(b)將一或多個胺基酸添加至多肽或從其缺失之變體，(c)一或多個胺基酸包含取代基團之變體，及(d)多肽與另一肽或多肽(例如融合配偶體、蛋白質標籤或可賦予多肽有用性質之其他化學部分(例如抗體之表位、多組胺酸序列、生物素部分及諸如此類))融合之變體。本發明抗體可包含來自一個物種之胺基酸殘基在保守或非保守位置替換為另一物種中之相應殘基之變體。在另一實施例中，非保守位置處之胺基酸殘基經保守或非保守殘基取代。獲得該等變體之技術(包含遺傳(阻抑、缺失、突變等)、化學及酶技術)已為熟習此項技術者習知。
本發明亦包含編碼本發明雙特異性抗體之分離核酸，其包含(例 如)輕鏈、輕鏈可變區、輕鏈恆定區、重鏈、重鏈可變區、重鏈恆定區、連接體及本文所揭示雙特異性抗體之任一及所有組份及其組合。本發明核酸包含與本發明核酸具有至少80%、更佳地至少約90%、更佳地至少約95%及最佳地至少約98%同源性之核酸。在提及特定序列時，術語「類似性百分比」、「一致性百分比」及「同源性百分比」係如University of Wisconsin GCG®軟體程式中所闡述來使用。本發明核酸亦包含互補核酸。在一些情況下，序列在對準時完全互補(無失配)。在其他情況下，在序列中可具有高達約20%之失配。在本發明之一些實施例中，提供編碼本發明抗體之重鏈及輕鏈之核酸。
可將本發明核酸選殖至諸如質粒、黏粒、桿粒、噬菌體、人工染色體(BAC、YAC)或病毒等載體中，在該載體中可插入另一遺傳序列或元件(DNA或RNA)以使得可複製附接序列或元件。在一些實施例中，表現載體含有組成型活性啟動子區段(例如但不限於CMV、SV40、延伸因子或LTR序列)或誘導型啟動子序列(例如類固醇誘導型pIND載體(Invitrogen))，其中可調控核酸之表現。本發明之表現載體可進一步包括調控序列，例如內部核糖體進入位點。可藉由(例如)轉染將表現載體引入細胞中。
因此，在另一實施例中，本發明提供包括下列以操作方式連接之元件之表現載體：轉錄啟動子；編碼本發明雙特異性抗體之重鏈之核酸分子；及轉錄終止子。在另一實施例中，本發明提供包括下列以操作方式連接之元件之表現載體：轉錄啟動子；編碼本發明雙特異性抗體之輕鏈之核酸分子；及轉錄終止子。亦提供包括該等載體且表現重鏈及輕鏈之重組宿主細胞。
在另一實施例中，本發明提供包括下列以操作方式連接之元件之表現載體：轉錄啟動子；編碼本發明之雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段之重鏈之第一核酸分子；編碼本發明之雙特異性抗體、抗體 或抗原結合片段之輕鏈之第二核酸分子；及轉錄終止子。在另一實施例中，本發明提供包括下列以操作方式連接之元件之表現載體：第一轉錄啟動子；編碼本發明之雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段之重鏈之第一核酸分子；第一轉錄終止子；第二轉錄啟動子；編碼本發明之雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段之輕鏈之第二核酸分子；及第二轉錄終止子。亦提供包括該等載體且表現重鏈及輕鏈之重組宿主細胞。
可使用含有編碼本發明之雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段之重鏈之核酸及編碼其輕鏈之核酸的抗體產生細胞根據業內已知技術來產生雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段。在一實施例中，本發明提供產生本發明之雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段之方法，其包括培養表現重鏈及輕鏈之重組宿主細胞及分離藉由該細胞產生之雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段。
重組宿主細胞可為原核細胞(例如大腸桿菌(E.coli)細胞)或真核細胞(例如哺乳動物細胞或酵母細胞)。酵母細胞包含釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)及甲醇酵母菌(Pichia pastoris)細胞。哺乳動物細胞包含VERO、HeLa、中國倉鼠卵巢(Chinese hamster Ovary，CHO)細胞、W138、幼倉鼠腎(BHK)細胞、COS-7、MDCK、人類胚腎細胞系293、正常狗腎細胞系、正常貓腎細胞系、猴腎細胞、非洲綠猴腎細胞、COS細胞及非致瘤性小鼠G8成肌細胞、纖維母細胞系、骨髓瘤細胞系、小鼠NIH/3T3細胞、LMTK31細胞、小鼠支持細胞、人類子宮頸癌細胞、布法羅大鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)、人類肺細胞、人類肝細胞、小鼠乳房腫瘤細胞、TRI細胞、MRC5細胞及FS4細胞。本發明之抗體產生細胞亦包含任一已知昆蟲表現細胞系，例如草地貪夜蛾細胞(Spodoptera frugiperda cell)。在一較佳實施例中，細胞係哺乳動物細 胞。在另一較佳實施例中，哺乳動物細胞係CHO細胞。
抗體產生細胞較佳地實質上不含IL-17A、IL-17F及IL-23結合競爭劑。在較佳實施例中，抗體產生細胞包括小於約10重量%、較佳地小於約5重量%、更佳地小於約1重量%、更佳地小於約0.5重量%、更佳地小於約0.1重量%及最佳地0重量%之IL-17A、IL-17F或IL-23結合競爭劑。在一些實施例中，藉由抗體產生細胞產生之抗體實質上不含IL-17A、IL-17F及IL-23競爭劑。在較佳實施例中，藉由抗體產生細胞產生之抗體包括小於約10重量%、較佳地小於約5重量%、更佳地小於約1重量%、更佳地小於約0.5重量%、更佳地小於約0.1重量%及最佳地0重量%之IL-17及IL-23結合競爭劑。
業內已知抗體純化方法。在本發明之一些實施例中，抗體純化之方法包含過濾、親和管柱層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析及濃縮。過濾步驟較佳地包括超濾，且更佳地係超濾及透析過濾。較佳地實施過濾至少約5至50次、更佳地10至30次及最佳地14至27次。可使用(例如)PROSEP®親和層析(Millipore,Billerica,Mass.)實施親和管柱層析。在一較佳實施例中，親和層析步驟包括PROSEP®-VA管柱層析。可在溶劑洗滌劑中洗滌洗出液。陰離子交換層析可包含(例如)SP-瓊脂糖凝膠陽離子交換層析。陰離子交換層析可包含(例如但不限於)Q-瓊脂糖快速流動陰離子交換。陰離子交換步驟較佳係非結合性，由此去除包含DNA及BSA之污染物。較佳地(例如)使用Pall DV 20奈米過濾器對抗體產物實施奈米過濾。可(例如)使用超濾及透析過濾濃縮抗體產物。該方法可進一步包括尺寸排除層析之步驟以去除聚集物。
亦可藉由業內已知之其他方法(例如藉由化學偶合抗體及抗體片段)產生雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段。
本發明之雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段可用於(例如)抑制 促發炎性細胞因子(例如IL-17A、IL-17F及IL-23/p19)。該等抗體可用於減小、限制、中和或阻斷IL-17A同二聚體、IL-17F同二聚體及/或IL-17A/F雜二聚體之促發炎性效應。同樣，該等抗體可用於減小、限制、中和或阻斷IL-17A同二聚體、IL-17F同二聚體或IL-17A/F雜二聚體之促癌效應。在該等情形下，使用抗體之抗IL-23p19部分來減小、限制、中和或阻斷產生IL-17A及/或IL-17F(包含同二聚體及雜二聚體)之新T細胞的產生。本文所闡述之雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段可用於治療發炎性病症及自體免疫疾病，例如多發性硬化(例如復發緩解型多發性硬化、繼發進展型多發性硬化、原發進展型多發性硬化及進展復發型多發性硬化)、囊性纖維化、發炎性腸病、牛皮癬、全身性硬化、全身性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、IgA腎病變、糖尿病性腎病、微小病變型疾病(脂性腎變病)、局灶性節段性腎小球硬化症(FSGS)、腎因性全身性纖維化(NSF)、腎因性皮膚纖維化、纖維化膽汁鬱積性肝炎、嗜酸性球性筋膜炎(舒爾曼症候群(Shulman's syndrome))、硬化性黏液水腫(丘疹性黏蛋白沈積症)、硬皮病、硬化萎縮苔癬、POEMs症候群(克[羅]-富[克斯]二氏症候群(Crow-Fukase syndrome)、高槻病(Takatsuki disease)或PEP症候群)、腎病症候群、移植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(來自諸如以下移植體：血液、骨髓、腎、胰臟、肝、原位肝、肺、心臟、腸、小腸、大腸、胸腺、同種異體幹細胞、低強度同種異體移植物、骨、腱、角膜、皮膚、心臟瓣膜、靜脈、動脈、血管、胃及睪丸)、抗嗜中性球胞質抗體(ANCA)相關性血管炎(AAV)、巨細胞動脈炎及多發性骨髓瘤誘導之溶骨性疾病。本文所闡述之雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段亦可用於治療癌症(包含血管生成)。
本發明之雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段抑制IL-17A及/或IL-17F及IL-23(經由p19亞單位)之活性，且由此抑制所存在之新IL- 17A及IL-17F及IL-17產生性T細胞(Th17)之產生、維持及活性。本發明進一步係關於使用本發明之雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段來治療特徵在於存在高含量之IL-17A、IL-17F及/或IL-23之發炎性疾病，且治療特徵在於存在高含量之IL-17A、IL-17F及/或IL-23之癌症。
本發明之雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段可阻斷、抑制、減小、拮抗或中和IL-17A、IL-17F(包含同二聚體及雜二聚體)及IL-23/p19之活性，由此較僅靶向該三種細胞因子中之一者或兩者之療法更為有利。
本發明之抗體(例如雙特異性抗體)由此可用於：
(1)阻斷、抑制、減小、拮抗或中和經由IL-17A或IL-17F及IL-23進行之信號傳導以治療癌症、急性發炎性及慢性發炎性疾病(例如發炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、刺激性腸症候群(IBS)、囊性纖維化、慢性結腸炎、薛格連氏症候群(Sjögren's syndrome)、脾腫大、慢性腎病(CKD)中之發炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、類風濕性關節炎及其他與誘導急性期反應有關之疾病)。
(2)阻斷、抑制、減小、拮抗或中和經由IL-17A或IL-17F或IL-23進行之信號傳導以治療自體免疫疾病(例如胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、多發性硬化(MS)(例如復發緩解型多發性硬化、繼發進展型多發性硬化、原發進展型多發性硬化及進展復發型多發性硬化)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、重症肌無力、類風濕性關節炎、薛格連氏症候群、IBS及IBD)，且防止或抑制免疫細胞(例如淋巴球、單核球、白血球)中經由其受體(例如IL-23Rα、IL-12Rβ1、IL-17RA及IL-17RC)進行之信號傳導。使用本發明抗體阻斷、抑制、減小或拮抗經由IL-23Rα、IL-12Rβ1、IL-17RA及IL-17RC進行之信號傳導亦有益於胰臟、腎、腦垂體及神經元細胞之疾病且可用於治療IDDM、非胰島素 依賴性糖尿病(NIDDM)、胰臟炎及胰臟癌。
舉例而言，本發明之雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段可用於治療性治療發炎性疾病，特定而言作為IL-17A、IL-17F及IL-23/p19之拮抗劑來治療發炎性疾病，例如多發性硬化(MS)(例如復發緩解型多發性硬化、繼發進展型多發性硬化、原發進展型多發性硬化及進展復發型多發性硬化)、發炎性腸病(IBD)及癌症。該等拮抗劑能夠結合、阻斷、抑制、減少、拮抗或中和IL-17A、IL-17F、其同二聚體及雜二聚體及IL-23(經由p19)(個別地或一起)以治療以下疾病：特應性及接觸性皮膚炎、全身性硬化、全身性紅斑狼瘡(SLE)、抗嗜中性球胞質抗體(ANCA)相關性血管炎(AAV)、巨細胞動脈炎、多發性硬化(MS)(例如復發緩解型多發性硬化、繼發進展型多發性硬化、原發進展型多發性硬化及進展復發型多發性硬化)、結腸炎、內毒素血症、關節炎、類風濕性關節炎(RA)、薛格連氏症候群、牛皮癬性關節炎、成人呼吸道疾病(ARD)、敗血性休克、多器官衰竭、發炎性肺傷害(例如特發性肺纖維化)、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、呼吸道高反應性、慢性支氣管炎、過敏性哮喘、牛皮癬、濕疹、IBS及發炎性腸病(IBD)(例如潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病)、幽門螺桿菌感染(Helicobacter pylori infection)、狼瘡腎炎、IgA腎病變、糖尿病性腎病、微小病變型疾病(脂性腎變病)、局灶性節段性腎小球硬化症(FSGS)、腎因性全身性纖維化(NSF)、腎因性皮膚纖維化、纖維化膽汁鬱積性肝炎、嗜酸性球性筋膜炎(舒爾曼症候群)、硬化性黏液水腫(丘疹性黏蛋白沈積症)、硬皮病、硬化萎縮苔癬、POEMs症候群(克[羅]-富[克斯]二氏症候群、高槻病或PEP症候群)、腎病症候群、移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(來自諸如以下移植體：血液、骨髓、腎、胰臟、肝、原位肝、肺、心臟、腸、小腸、大腸、胸腺、同種異體幹細胞、低強度同種異體移植物、骨、 腱、角膜、皮膚、心臟瓣膜、靜脈、動脈、血管、胃及睪丸)、由腹膜發炎(例如來自感染、傷害等)所致之腹內黏連及/或膿腫、腎病症候群、囊性纖維化(Tan,H.-L.等人，American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine,184(2)：252-258(2011))、溶骨性疾病(例如多發性骨髓瘤誘導之溶骨性疾病)(Sotomayor,E.M.,Blood,116(18)：3380-3382(2010))、器官同種異體移植物排斥、鏈球菌細胞壁(SCW)誘導之關節炎、骨關節炎、牙齦炎/牙周炎、皰疹性基質角膜炎、再狹窄症、川崎病(Kawasaki disease)、年齡相關性黃斑變性(AMD；例如濕潤形式之AMD及乾燥形式之AMD)(Wei,L.等人，Cell Reports,2：1151-1158(2012年11月29日)、免疫介導之腎病、肝纖維化(Meng,F.等人，Gastroenterology,143：765-776(2012)、肺纖維化(Meng,F.等人，Gastroenterology,143：765-776(2012)、肝膽管病、心肌炎(Ding,H.-S.,Mol.Biol.Rep.,39(7)：7473-7478(2012年2月14日)；Valente,A.J.等人，Cellular Signalling,24：560-568(2012))、心臟纖維化(Valente,A.J.等人，Cellular Signalling,24：560-568(2012))、不良心肌重構(Valente,A.J.等人，Cellular Signalling,24：560-568(2012))、動脈粥樣硬化(Ding,H.-S.,Mol.Biol.Rep.,39(7)：7473-7478(2012年2月14日)、心臟缺血/再灌注傷害(Ding,H.-S.,Mol.Biol.Rep.,39(7)：7473-7478(2012年2月14日)、心臟衰竭(Ding,H.-S.,Mol.Biol.Rep.,39(7)：7473-7478(2012年2月14日)及特徵在於IL-17及/或IL-23表現之癌症/腫瘤疾病(包含但不限於前列腺癌、腎癌、結腸癌、卵巢癌及子宮頸癌及白血病)(Tartour等人，Cancer Res.,59：3698(1999)；Kato等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.,282：735(2001)；Steiner等人，Prostate,56：171(2003)；Langowksi等人，Nature，5月10日[電子出版早於印刷出版]，(2006))。
舉例而言，本發明之雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段可用 於(例如作為IL-17A、IL-17F及IL-23/p19之拮抗劑)治療性治療發炎性疾病，特定而言治療獲得性免疫缺陷症候群(AIDS，其係具有自體免疫組份之病毒性疾病)、斑禿、強直性脊柱炎、抗磷脂症候群、自體免疫阿狄森氏病(autoimmune Addison's disease)、自體免疫溶血性貧血、自體免疫肝炎、自體免疫內耳病(AIED)、自體免疫淋巴組織增殖性症候群(ALPS)、自體免疫血小板減少性紫癜(ATP)、貝切特氏病(Behcet's disease)、心肌病症、口炎性腹瀉-皰疹樣皮膚炎、慢性疲勞免疫功能障礙症候群(CFIDS)、慢性發炎性脫髓鞘多神經病(CIPD)、瘢痕性類天皰瘡、冷凝集素病、crest症候群、德戈斯氏病(Degos' disease)、幼年型皮肌炎、盤狀狼瘡(例如兒童盤狀紅斑狼瘡、廣泛性盤狀紅斑狼瘡及局部性盤狀紅斑狼瘡)、凍瘡樣紅斑狼瘡、紅斑狼瘡-扁平苔蘚重疊症候群、紅斑狼瘡性脂膜炎、腫脹性紅斑狼瘡、疣狀皮膚紅斑狼瘡、全身性紅斑狼瘡、亞急性皮膚紅斑狼瘡、急性皮膚紅斑狼瘡、本質性混合冷凝球蛋白血症、纖維肌痛-纖維肌炎、葛瑞夫茲式病(Graves' disease)、格-巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、特發性肺纖維化、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA腎病變、胰島素依賴性糖尿病、幼年型慢性關節炎(斯提耳病(Still's disease))、幼年型類風濕性關節炎、類風濕性關節炎(RA)、梅尼埃爾氏病(Meniere's disease)、混合型結締組織病、多發性硬化(MS)(例如復發緩解型多發性硬化、繼發進展型多發性硬化、原發進展型多發性硬化及進展復發型多發性硬化)、重症肌無力、惡性貧血、結節性多動脈炎、多軟骨炎、多內分泌腺症候群、風濕性多肌痛、多發性肌炎及皮肌炎、原發性無丙種球蛋白血症、原發性膽汁性肝硬化、濕疹、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、雷諾現象(Raynaud's phenomena)、萊特爾氏症候群(Reiter's syndrome)、成人呼吸道疾病(ARD)、風濕熱、關節炎、結節病、硬皮病(例如進展性全 身性硬化(PSS)，亦稱為全身性硬化(SS))、薛格連氏症候群、僵人症候群、全身性紅斑狼瘡(SLE)、抗嗜中性球胞質抗體(ANCA)相關性血管炎(AAV)、巨細胞動脈炎、高安動脈炎(Takayasu arteriti)、顳動脈炎炎/巨細胞動脈炎、內毒素血症、敗血症或敗血性休克、中毒性休克症候群、多器官衰竭、發炎性肺傷害(例如特發性肺纖維化)、結腸炎、發炎性腸病(IBD)(例如潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病)、刺激性腸症候群(IBS)、眼葡萄膜炎、白癜風、韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、特應性過敏、過敏、哮喘、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、呼吸道高反應性、過敏性哮喘、腎小球腎炎、溶血性貧血、幽門螺桿菌感染、由腹膜發炎(例如來自感染、傷害等)所致之腹內黏連及/或膿腫、腎病症候群、特發性脫髓鞘多神經病、格-巴二氏症候群、器官同種異體移植物排斥、狼瘡腎炎、IgA腎病變、糖尿病性腎病、微小病變型疾病(脂性腎變病)、局灶性節段性腎小球硬化症(FSGS)、腎因性全身性纖維化(NSF)、腎因性皮膚纖維化、纖維化膽汁鬱積性肝炎、嗜酸性球性筋膜炎(舒爾曼症候群)、硬化性黏液水腫(丘疹性黏蛋白沈積症)、硬皮病、硬化萎縮苔癬、POEMs症候群(克[羅]-富[克斯]二氏症候群、高槻病或PEP症候群)、腎病症候群、移植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(來自諸如以下移植體：血液、骨髓、腎、胰臟、肝、原位肝、肺、心臟、腸、小腸、大腸、胸腺、同種異體幹細胞、低強度同種異體移植物、骨、腱、角膜、皮膚、心臟瓣膜、靜脈、動脈、血管、胃及睪丸)、溶骨性疾病(例如多發性骨髓瘤誘導之溶骨性疾病)、囊性纖維化、年齡相關性黃斑變性(AMD；例如濕式AMD及乾式AMD)、肝纖維化、肺纖維化、動脈粥樣硬化、心臟缺血/再灌注傷害、心臟衰竭、心肌炎、心臟纖維化、不良心肌重構、糖尿病性視網膜病變及呼吸器誘導之肺傷害。
因此，在一實施例中，本發明提供抑制需要該治療之哺乳動物中之一或多種促發炎性細胞因子(例如IL-17A、IL-17F及IL-23)之方法，其包括向需要該治療之哺乳動物投與治療有效量之雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段。在一較佳實施例中，哺乳動物係人類。可使用該方法來治療特徵在於IL-17A、IL-17F或IL-23之表現升高之病症。雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段可與另一醫藥藥劑以相同調配物或單獨投與。
在另一實施例中，本發明提供治療有需要之哺乳動物之免疫相關性病症之方法，其包括向哺乳動物投與治療有效量之IL-17A/F多肽、其激動劑或其拮抗劑(例如IL-17A/F結合實體，其包含IL-17A/F交叉反應性抗體)。在一較佳態樣中，免疫相關性病症係選自由以下組成之群：全身性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎(RA)、骨關節炎、幼年型慢性關節炎、脊椎關節病、全身性硬化、特發性發炎性肌病、薛格連氏症候群、全身性血管炎、結節病、自體免疫溶血性貧血、自體免疫血小板減少症、甲狀腺炎、糖尿病、免疫介導之腎疾病、中樞及週邊神經系統之脫髓鞘疾病(例如多發性硬化(MS)(例如復發緩解型多發性硬化、繼發進展型多發性硬化、原發進展型多發性硬化及進展復發型多發性硬化)、特發性脫髓鞘多發性神經病變或格-巴二氏症候群及慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病變)、肝膽管病(例如傳染性自體免疫慢性活動性肝炎、原發性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎及硬化性膽管炎)、發炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、麩質敏感性腸病及惠伯爾病(Whipple's disease)、自體免疫或免疫介導之皮膚病(包含大皰性皮膚病、多形性紅斑及接觸性皮膚炎)、抗嗜中性球胞質抗體(ANCA)相關性血管炎(AAV)、巨細胞動脈炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、過敏性疾病(例如哮喘、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、食物過敏及蕁麻疹)、肺之免疫學疾病(例如嗜酸性球性肺炎、特發性 肺纖維化及過敏性肺炎)、狼瘡腎炎、IgA腎病變、糖尿病性腎病、微小病變型疾病(脂性腎變病)、局灶性節段性腎小球硬化症(FSGS)、腎因性全身性纖維化(NSF)、腎因性皮膚纖維化、纖維化膽汁鬱積性肝炎、嗜酸性球性筋膜炎(舒爾曼症候群)、硬化性黏液水腫(丘疹性黏蛋白沈積症)、硬皮病、硬化萎縮苔癬、POEMs症候群(克[羅]-富[克斯]二氏症候群、高槻病或PEP症候群)、腎病症候群、移植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(來自諸如以下移植體：血液、骨髓、腎、胰臟、肝、原位肝、肺、心臟、腸、小腸、大腸、胸腺、同種異體幹細胞、低強度同種異體移植物、骨、腱、角膜、皮膚、心臟瓣膜、靜脈、動脈、血管、胃及睪丸)、溶骨性疾病(例如多發性骨髓瘤誘導之溶骨性疾病)、囊性纖維化、年齡相關性黃斑變性(AMD；例如濕式AMD及乾式AMD)、肝纖維化、肺纖維化、動脈粥樣硬化、心臟缺血/再灌注傷害、心臟衰竭、心肌炎、心臟纖維化、不良心肌重構、移植相關性疾病(包含移植物排斥及移植物抗宿主病)。
在另一實施例中，本發明提供抑制需要該治療之哺乳動物之發炎之方法，其包括向需要該治療之哺乳動物投與治療有效量之本發明之雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段。在一較佳實施例中，哺乳動物係人類。發炎可與選自由以下組成之群之疾病有關：多發性硬化(MS)(例如復發緩解型多發性硬化、繼發進展型多發性硬化、原發進展型多發性硬化及進展復發型多發性硬化)、慢性發炎、薛格連氏症候群、自體免疫糖尿病、類風濕性關節炎(RA)及其他關節炎病狀、哮喘、全身性硬化、異位性皮膚炎、抗嗜中性球胞質抗體(ANCA)相關性血管炎(AAV)、巨細胞動脈炎、全身性紅斑狼瘡(SLE)、德戈斯氏病、幼年型皮肌炎、盤狀狼瘡(例如兒童盤狀紅斑狼瘡、廣泛性盤狀紅斑狼瘡及局部性盤狀紅斑狼瘡)、凍瘡樣紅斑狼瘡、紅斑狼瘡-扁平苔蘚重疊症候群、紅斑狼瘡性脂膜炎、腫脹性紅斑狼瘡、疣狀紅斑狼 瘡皮膚、全身性紅斑狼瘡、亞急性皮膚紅斑狼瘡、急性皮膚紅斑狼瘡、本質性混合冷凝球蛋白血症、纖維肌痛-纖維肌炎、葛瑞夫茲式病、溶骨性疾病(例如多發性骨髓瘤誘導之溶骨性疾病)、囊性纖維化、年齡相關性黃斑變性(AMD；例如濕式AMD及乾式AMD)、肝纖維化、肺纖維化、動脈粥樣硬化、心臟缺血/再灌注傷害、心臟衰竭、心肌炎、心臟纖維化、不良心肌重構、格-巴二氏症候群、橋本氏甲狀腺炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、刺激性腸症候群(IBS)、發炎性腸病(IBD)、狼瘡腎炎、IgA腎病變、糖尿病性腎病、微小病變型疾病(脂性腎變病)、局灶性節段性腎小球硬化症(FSGS)、腎因性全身性纖維化(NSF)、腎因性皮膚纖維化、纖維化膽汁鬱積性肝炎、嗜酸性球性筋膜炎(舒爾曼症候群)、硬化性黏液水腫(丘疹性黏蛋白沈積症)、硬皮病、硬化萎縮苔癬、POEMs症候群(克[羅]-富[克斯]二氏症候群、高槻病或PEP症候群)、腎病症候群、移植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(來自諸如以下移植體：血液、骨髓、腎、胰臟、肝、原位肝、肺、心臟、腸、小腸、大腸、胸腺、同種異體幹細胞、低強度同種異體移植物、骨、腱、角膜、皮膚、心臟瓣膜、靜脈、動脈、血管、胃及睪丸)。雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段可與另一醫藥藥劑(例如抗發炎劑)以相同調配物投與或單獨投與。
在另一實施例中，本發明提供一種組合物，其包括如本文所闡述之抗體(例如雙特異性抗體)及醫藥上可接受之載劑。可根據已知方法來調配包括本發明抗體(例如雙特異性抗體)之醫藥組合物，以製備醫藥上適用之組合物，其中將治療性蛋白質與醫藥上可接受之載劑組合於混合物中。若組合物之投與可由接受患者耐受，則可將其稱為「醫藥上可接受之載劑」。無菌磷酸鹽緩衝生理食鹽水係醫藥上可接受之載劑之一個實例。彼等熟習此項技術者熟知其他適宜載劑。例如 參見Gennaro編輯，Remington's Pharmaceutical Sciences，第19版，Mack Publishing公司(1995)。
對於醫藥應用而言，根據習用方法調配本發明抗體(例如雙特異性抗體)以用於非經腸、特定而言靜脈內或皮下遞送。靜脈內投與可藉由靜脈推注、控制釋放(例如使用微型幫浦或其他適當技術)或藉由在一至若干小時之典型時段內輸注來進行。一般而言，醫藥調配物包含本發明抗體(例如雙特異性抗體)與醫藥上可接受之載劑(例如生理食鹽水、緩衝生理食鹽水、5%右旋糖水溶液或諸如此類)之組合。調配物可進一步包含一或多種賦形劑、防腐劑、增溶劑、緩衝劑、白蛋白，以防止小瓶表面上之蛋白質損失等等。在利用此一組合療法時，抗體(其包含雙特異性抗體)可組合成單一調配物，或可呈分開調配物投與。調配方法在業內已眾所周知且揭示於(例如)Gennaro編輯，Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing公司，Easton PA(1990)中，該文獻以引用方式併入本文中。治療劑量通常在0.1-100mg/kg患者體重/天，較佳地0.5-20mg/kg/天之範圍內，其中確切劑量由臨床醫師根據接受標準並考慮擬治療病狀之性質及嚴重程度、患者特徵等來確定。熟習此項技術者即可決定劑量。更通常而言，在一週或更短時間內、通常在一至三天之時段內投與抗體。通常，所投與抗體之劑量將視諸如以下因素變化：患者之年齡、體重、身高、性別、一般醫學狀況及先前病史。通常，期望提供接受者在約1pg/kg至10mg/kg(藥劑/患者體重之量)範圍內之抗體劑量，但視情況亦可投與較低或較高劑量。
可經靜脈內、經動脈內、經腹膜腔內、經肌內、經皮下、經胸膜內、經鞘內、藉由經由區域性導管灌注或藉由直接病變內注射來向個體投與本發明抗體(例如雙特異性抗體)。在藉由注射投與治療性抗體時，可藉由連續輸注或藉由單一或多個推注投與。
其他投與途徑包含經口、經黏膜、經肺及經皮。經口遞送適用於聚酯微球體、玉米蛋白微球體、類蛋白微球體、聚氰基丙烯酸酯微球體及基於脂質之系統(例如參見DiBase等人，「Oral Delivery of Microencapsulated Proteins」,Sanders等人，編輯，Protein Delivery：Physical Systems，第255-288頁，Plenum Press(1997))。藉由胰島素投與模式來例示鼻內遞送之可行性(例如參見Hinchcliffe等人，Adv.Drug Deliv.Rev.,35：199(1999))。可製備包括本發明抗體之乾燥或液體粒子且藉助乾燥粉末分散器、液體氣溶膠生成器或霧化器吸入(例如Pettit等人，TIBTECH,16：343(1998)；Patton等人，Adv.Drug Deliv.Rev.,35：235(1999))。藉由AERX®糖尿病管控系統來闡釋此方式，該系統係將氣溶膠化胰島素遞送至肺中之手持電子吸入器。研究展示，以治療性濃度藉助低頻超音波將高達48,000kDa之蛋白質遞送穿過皮膚，此闡釋了經皮投與之可行性(Mitragotri等人，Science,269：850(1995))。使用電穿孔之經真皮遞送提供投與具有IL-17及IL-23/p19結合活性之分子之另一方式(Potts等人，Pharm.Biotechnol.,10：213(1997))。
出於療法目的，以治療有效量將包括本發明抗體(例如雙特異性抗體)及醫藥上可接受之載劑之組合物投與患者。若投與量在生理學上顯著，則本發明抗體(例如雙特異性抗體)及醫藥上可接受之載劑之組合視為以「治療有效量」投與。若藥劑之存在使得接受患者之生理學發生可檢測變化，則該藥劑在生理學上顯著。舉例而言，若用於治療發炎之藥劑之存在緩解發炎性反應，則該藥劑在生理學上顯著。可以各種方式評價有效治療。在一實施例中，藉由減小發炎來確定有效治療。在其他實施例中，有效治療之標記係抑制發炎性。在其他實施例中，藉由患者之增加之幸福感(包含諸如體重增加、恢復力量、降低疼痛、茁壯成長及來自具有較佳健康之患者之主觀指徵等跡象)來 量測有效療法。
包括本發明抗體(例如雙特異性抗體)之醫藥組合物可以液體形式、以氣溶膠形式或以固體形式提供。藉由可注射溶液及口服懸浮液來闡釋液體形式。實例性固體形式包含膠囊、錠劑及受控釋放形式。藉由微滲透幫浦及植入體來闡釋後一形式(Bremer等人，Pharm.Biotechnol.,10：239(1997)；Ranade,「Implants in Drug Delivery」，Ranade等人，編輯，Drug DeliverySystems，第95-123頁，CRC Press(1995)；Bremer等人，「Protein Delivery with Infusion Pumps」,Sanders等人，編輯，Protein Delivery：Physical Systems，第239-254頁，Plenum Press(1997)；Yewey等人，「Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant」,Sanders等人，編輯，Protein Delivery：Physical Systems，第93-117頁，Plenum Press(1997)。
脂質體提供經靜脈內、經腹膜腔內、經鞘內、經肌內、經皮下或經由經口投與、吸入或鼻內投與將治療性多肽遞送至個體之一種方式。脂質體係由一或多個環繞水性隔室之脂質雙層組成之微型囊泡(通常參見Bakker-Woudenberg等人，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.,12(增刊1)：S61(1993),Kim,Drugs,46：618(1993)，及Ranade,「Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers」,Ranade等人，編輯，Drug Delivery Systems，第3-24頁，CRC Press(1995))。脂質體之組成類似於細胞膜且由此脂質體可安全投與且係生物可降解的。端視製備方法，脂質體可為單層或多層，且脂質體之大小可有所變化且直徑介於0.02μm至大於10μm之間。可將各種藥劑囊封於脂質體中：疏水性藥劑分配於雙層中且親水性藥劑分配於內部水性空間內(例如參見Machy等人，Lippsomes in Cell Biology and Pharmacology,John Libbey(1987)，及Ostro等人，American J. Hosp.Pharm.,46：1576 (1989))。另外，可藉由改變脂質體大小、雙層數量、脂質組成以及脂質體之電荷及表面特性來控制囊封藥劑之治療可用性。
脂質體可吸收至實際上任一類型之細胞上且然後緩慢釋放所囊封藥劑。另一選擇為，所吸收脂質體可由吞噬性細胞吞噬。在吞噬後脂質體脂質發生溶酶體內降解且釋放所囊封藥劑(Scherphof等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.,446：368(1985))。在靜脈內投與之後，小脂質體(0.1μm至1.0μm)通常由主要位於肝及脾中之網狀內皮系統細胞吸收，而大於3.0μm之脂質體則沈積於肺中。較小脂質體由網狀內皮系統細胞之此優先攝取已用於將化學治療劑遞送至巨噬細胞及肝腫瘤。
可藉由若干方法來包繞網狀內皮系統，包含使用大劑量之脂質體粒子達到飽和，或藉由藥理學方式實施選擇性巨噬細胞鈍化(Claassen等人，Biochim.Biophys.Acta,802：428(1984))。此外，已展示，將糖脂或聚乙二醇衍生之磷脂納入脂質體膜中會使得藉由網狀內皮系統進行之攝取顯著減小(Allen等人，Biochim.Biophys.Acta,1068：133(1991)；Allen等人，Biochim.Biophys.Acta,1150：9(1993))。
亦可藉由改變磷脂組成藉由將受體或配體插入脂質體中來製備脂質體以靶向特定細胞或器官。舉例而言，使用高含量非離子型表面活性劑製得之脂質體已用於靶向肝(Hayakawa等人，日本專利第04-244,018號；Kato等人，Biol.Pharm.Bull.,16：960(1993))。藉由以下方式來製備該等調配物：在甲醇中混合大豆磷脂醯膽鹼、α-生育酚及乙氧基化氫化蓖麻油(HCO-60)，在真空下濃縮混合物，且然後使用水重構混合物。二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)與大豆源豆甾醇糖苷混合物(SG)及膽固醇(Ch)之脂質體調配物亦展示靶向肝(Shimizu等人，Biol.Pharm.Bull.,20：881(1997))。
另一選擇為，各種靶向配體可結合至脂質體表面，例如抗體、 抗體片段、碳水化合物、維他命及轉運蛋白。舉例而言，可使用具支鏈型半乳糖脂質衍生物來對脂質體進行改質以靶向排他性地表現於肝細胞表面上之無唾液酸糖蛋白(半乳糖)受體(Kato等人，Crit.Rev.Ther.Drug Carrie Syst.,14：287(1997)；Murahashi等人，Biol.Pharm.Bull.,20：259(1997))。類似地，Wu等人，Hepatology,27：772(1998)展示使用去唾夜酸胎蛋白標記脂質體使得可縮短脂質體血漿半衰期且大大增強肝細胞對於去唾夜酸胎蛋白標記之脂質體之攝取。另一方面，可藉由預注射去唾夜酸胎蛋白來抑制包括具支鏈型半乳糖脂質衍生物之脂質體之肝積累(Murahashi等人，Biol.Pharm.Bull.,20：259(1997))。聚烏頭醯化人類血清白蛋白脂質體提供將脂質體靶向肝細胞之另一方式(Kamps等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA,94：11681(1997))。另外，Geho等人，美國專利第4,603,044號闡述指向肝細胞之脂質體囊泡遞送系統，其對於與肝之特定代謝細胞有關之肝膽管受體具有特異性。
在組織靶向之更一般方式中，使用對於由靶細胞表現之配體具有特異性之生物素化抗體來預標記靶細胞(Harasym等人，Aav.Drug Deliv.Rev.,32：99(1998))。在對遊離抗體進行血漿消除之後，投與鏈黴抗生物素偶聯脂質體。在另一方式中，將靶向抗體直接附接至脂質體(Harasym等人，Adv.Drug Deliv.Rev.,32：99(1998))。
可使用蛋白質微囊化之標準技術將抗體囊封於脂質體內(例如參見Anderson等人，Infect.Immun.,31：1099(1981)，Anderson等人，Cancer Res.,50：1853(1990)，及Cohen等人，Biochim.Biophys.Acta,1063：95(1991)，Alving等人，「Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies」，Gregoriadis編輯，Liposome Technology，第2版，第III卷，第317頁，CRC Press(1993)，Wassef等人，Meth.Enzymol.,149：124(1987))。如上所述，治療有用之脂質體可含 有各種組份。舉例而言，脂質體可包括聚(乙二醇)之脂質衍生物(Allen等人，Biochim.Biophys.Acta,1150：9(1993))。
已設計可降解聚合物微球體以維持高全身含量之治療性蛋白。自諸如聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)、聚酸酐、聚(原酸酯)、非生物可降解性乙酸乙基乙烯酯聚合物等可降解聚合物來製備微球體，其中將蛋白質俘獲於聚合物中(Gombotz等人，Bioconjugate Chem.,6：332(1995)；Ranade,「Role of Polymers in Drug Delivery」，Ranade等人，編輯，Drug Delivery Systems，第51-93頁，CRC Press(1995)；Roskos等人，「Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery」，Sanders等人，編輯，Protein Delivery：Physical Systems，第45-92頁，Plenum Press(1997)；Bartus等人，Science,281：1161(1998)；Putney等人，Nature Biotechnology,16：153(1998)；Putney,Curr.Opin.Chem.Biol.,2：548(1998))。經聚乙二醇(PEG)塗覆之奈米球體亦可提供用於靜脈內投與治療性蛋白之載劑(例如參見Gref等人，Pharm.Biotechnol.,10：167(1996)。
調配物亦可視需要含有一種以上用於所治療特定適應症之活性化合物，較佳為彼等相互間不會產生不利影響之具有互補活性者。另一選擇為或此外，組合物可包括增強其功能之藥劑，例如細胞毒性劑、細胞因子、化學治療劑或生長抑制劑。該等分子適宜地以對預期目的有效之量以組合形式存在。
在一實施例中，以組合療法投與本發明抗體(例如雙特異性抗體)，亦即與其他藥劑組合，該等其他藥劑係(例如)可用於治療病理學病狀或病症(例如自體免疫病症及發炎性疾病)之治療劑。此背景中之術語「組合」意指實質上同期(同時或依序)給予各藥劑。若依序給予，則在開始投與第二化合物時，兩種化合物中之第一者較佳地仍以有效濃度在治療位點處可檢測。
舉例而言，組合療法可包含一或多種與一或多種其他治療劑(例如一或多種細胞因子及生長因子抑制劑、免疫阻抑劑、抗發炎劑、代謝抑制劑、酶抑制劑及/或細胞毒性劑或細胞生長抑制劑)共調配及/或共投與之本發明抗體(例如雙特異性抗體)，如下文中更詳細闡述。另外，一或多種本文所闡述抗體(例如雙特異性抗體)可與兩種或更多種本文所闡述治療劑組合使用。該等組合療法可有利地利用較低劑量之所投與治療劑，由此避免與各種單一療法有關之可能毒性或併發症。
與本發明抗體(例如雙特異性抗體)組合使用之較佳治療劑係彼等幹擾發炎性反應中之不同階段之藥劑。在一實施例中，可將一或多種本文所闡述抗體(例如雙特異性抗體)與一或多種其他藥劑(例如其他細胞因子或生長因子拮抗劑(例如可溶性受體、肽抑制劑、小分子、配體融合物)；或結合至其他靶之抗體或其抗原結合片段(例如結合至其他細胞因子或生長因子、其受體或其他細胞表面分子之抗體)；及抗發炎性細胞因子或其激動劑)共調配及/或共投與。可與本文所闡述抗體組合使用之藥劑之非限制性實例包含但不限於一或多種介白素(IL)或其受體之拮抗劑，例如IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-20、IL-21、IL-22及IL-31之拮抗劑；細胞因子或生長因子或其受體(例如腫瘤壞死因子(TNF)、LT、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF)之拮抗劑。本發明抗體亦可與諸如以下細胞表面分子之抑制劑(例如其抗體)組合：CD2、CD3、CD4、CD8、CD20(例如CD20抑制劑利妥昔單抗(rituximab)(RITUXAN®))、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90或其配體(包含CD154(gp39或CD40L))或LFA-1/ICAM-1及VLA-4/VCAM-1(Yusuf-Makagiansar等人，Med.Res.Rev.,22：146-167(2002))。可與一或多種本文所闡述抗體(例如雙特異性抗體)組合使用之較佳拮抗劑包含IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α、IL-15、IL-18、 IL-20、IL-22及IL-31之拮抗劑。
彼等藥劑之實例包含IL-12拮抗劑，例如結合至IL-12(較佳地人類IL-12)之嵌合、人類化、人類或活體外生成抗體(或其抗原結合片段)，例如WO 00/56772中所揭示之抗體；IL-12受體抑制劑，例如人類IL-12受體之抗體；及IL-12受體(例如人類IL-12受體)之可溶性片段。IL-15拮抗劑之實例包含抵抗IL-15或其受體之抗體(或其抗原結合片段，例如人類IL-15或其受體之嵌合、人類化、人類或活體外生成抗體)、IL-15受體之可溶性片段及IL-15結合蛋白。IL-18拮抗劑之實例包含人類IL-18之抗體(例如嵌合、人類化、人類或活體外生成抗體(或其抗原結合片段))、IL-18受體之可溶性片段及IL-18結合蛋白(IL-18BP)。IL-1拮抗劑之實例包含介白素-1-轉化酶(ICE)抑制劑(例如Vx740)、IL-1拮抗劑(例如IL-1 RA(阿那白滯素(anikinra)，KINERET®,Amgen)、sIL1RII(Immunex))及抗IL-1受體抗體(或其抗原結合片段)。
TNF拮抗劑之實例包含TNF(例如人類TNF-α)之嵌合、人類化、人類或活體外生成抗體(或其抗原結合片段)，例如(HUMIRA®，D2E7，人類TNF-α抗體)、CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(人類化抗TNF-α抗體；Celltech/Pharmacia)、cA2(嵌合抗TNF-α抗體；REMICADE®，Centocor)；抗TNF抗體片段(例如CPD870)；TNF受體(例如p55或p75人類TNF受體或其衍生物)之可溶性片段，例如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白，ENBREL®；Immunex)、p55kdTNFR-IgG(55kD TNF受體-IgG融合蛋白(Lenercept))；酶拮抗劑，例如TNF-α轉化酶(TACE)抑制劑(例如α-磺醯基異羥肟酸衍生物及N-羥基甲醯胺TACE抑制劑GW 3333、GW 005或GW 022)；及TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF結合蛋白)。較佳TNF拮抗劑係TNF受體(例如p55或p75人類TNF受體或其衍生物)之可溶性片 段(例如75kdTNFR-IgG)及TNF-α轉化酶(TACE)抑制劑。
在其他實施例中，可組合投與一或多種本文所闡述抗體(例如雙特異性抗體)與下列物質中之一或多者：IL-13拮抗劑，例如可溶性IL-13受體(sIL-13)及/或抵抗IL-13之抗體；IL-2拮抗劑，例如DAB 486-IL-2及/或DAB 389-IL-2(IL-2融合蛋白，Seragen)及/或IL-2R抗體(例如抗Tac(人類化抗IL-2R，Protein Design Labs))。又一組合包含一或多種本發明抗體(例如雙特異性抗體)、拮抗性小分子及/或抑制性抗體與非清除性抗CD4抑制劑(DEC-CE9.1/SB 210396；非清除性靈長源化抗CD4抗體；IDEC/SmithKline)之組合。其他較佳組合包含共刺激路徑CD80(B7.1)或CD86(B7.2)之拮抗劑，包含抗體、可溶性受體或拮抗性配體；以及p-選擇素糖蛋白配體(PSGL)、抗發炎性細胞因子，例如IL-4(DNAX/Schering)、IL-10(SCH 52000；重組IL-10DNAX/Schering)、IL-13及TGF-β及其激動劑(例如激動劑抗體)。
在其他實施例中，可將一或多種本發明抗體(例如雙特異性抗體)與一或多種抗發炎藥、免疫阻抑劑或代謝或酶抑制劑共調配及/或共投與。可與本文所闡述抗體組合使用之藥物或抑制劑之非限制性實例包含但不限於以下物質中之一或多者：非類固醇抗發炎藥(NSAID)，例如布洛芬(ibuprofen)、替尼達普(tenidap)、萘普生(naproxen)、美洛昔康(meloxicam)、吡羅昔康(piroxicam)、雙氯芬酸(diclofenac)及吲哚美辛(indomethacin)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；皮質類固醇，例如潑尼松龍(prednisolone)；細胞因子阻抑性抗發炎藥(CSAID)；核苷酸生物合成之抑制劑，例如嘌呤生物合成之抑制劑；葉酸拮抗劑(例如胺甲蝶呤(methotrexate)(N-[4-[[(2,4-二胺基-6-喋啶基)甲基]甲基胺基]苯甲醯基]-L-麩胺酸)；及嘧啶生物合成之抑制劑，例如二氫乳清酸去氫酶(DHODH)抑制劑。用於與一或多種本發明抗體(例如雙特異性抗體)組合使用之較佳治療劑包含NSAID、CSAID、(DHODH)抑制劑(例 如來氟米特(leflunomide))及葉酸拮抗劑(例如胺甲蝶呤)。
其他抑制劑之實例包含以下物質中之一或多者：皮質類固醇(經口、吸入及局部注射)；免疫阻抑劑，例如環孢素(cyclosporin)、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)；及mTOR抑制劑，例如西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素(rapamycin)-RAPAMUNE®或雷帕黴素衍生物，例如可溶性雷帕黴素衍生物(例如雷帕黴素酯衍生物，例如CCI-779)；幹擾藉由諸如TNF-α或IL-1等促發炎性細胞因子進行之信號傳導之藥劑(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑)；COX2抑制劑，例如塞來昔布(celecoxib)、羅非昔布(rofecoxib)及其變體；磷酸二酯酶抑制劑，例如R973401(磷酸二酯酶IV型抑制劑)；磷脂酶抑制劑，例如細胞溶質磷脂酶2(cPLA2)之抑制劑(例如三氟甲基酮類似物)；血管內皮細胞生長因子或生長因子受體之抑制劑，例如VEGF抑制劑及/或VEGF-R抑制劑；及血管生成之抑制劑。用於與本發明抗體組合使用之較佳治療劑係免疫阻抑劑，例如環孢素、他克莫司(FK-506)；mTOR抑制劑，例如西羅莫司(雷帕黴素)或雷帕黴素衍生物，例如可溶性雷帕黴素衍生物(例如雷帕黴素酯衍生物，例如CCI-779)；COX2抑制劑，例如塞來昔布及其變體；及磷脂酶抑制劑，例如細胞溶質磷脂酶2(cPLA2)之抑制劑，例如三氟甲基酮類似物。
可與本發明抗體(例如雙特異性抗體)組合之治療劑之其他實例包含以下物質中之一或多者：6-巰基嘌呤(6-MP)；硫唑嘌呤(azathioprine)、柳氮磺吡啶、；美沙拉嗪(mesalazine)；奧沙拉嗪(olsalazine)；氯喹(chloroquine)/羥氯喹(hydroxychloroquine)(PLAQUENIL®)；青黴胺(pencillamine)；金硫蘋果酸鹽(aurothiornalate)(肌內及口服)；硫唑嘌呤；秋水仙素(coichicine)；β-2腎上腺素能受體激動劑(沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林(terbutaline)、沙美特羅(salmeteral))；黃嘌呤(xanthine)(茶鹼 (theophylline)、胺茶鹼(aminophylline))；色甘酸鹽(cromoglycate)；奈多羅米(nedocromil)；酮替芬(ketotifen)；異丙托銨(ipratropium)及氧托溴銨(oxitropium)；麥考酚酸嗎乙酯(mycophenolate mofetil)；腺苷激動劑；抗凝血劑；補體抑制劑；及腎上腺素能劑。
可與本發明抗體(例如雙特異性抗體)組合用於治療或防止關節炎病症(例如類風濕性關節炎、發炎性關節炎、類風濕性關節炎、幼年型類風濕性關節炎、骨關節炎及牛皮癬性關節炎)之藥劑之非限制性實例包含下列物質中之一或多者：如本文所闡述之IL-12拮抗劑；NSAID；CSAID；如本文所闡述之TNF(例如TNF-α)拮抗劑；如本文所闡述之非清除性抗CD4抗體；如本文所闡述之IL-2拮抗劑；抗發炎性細胞因子，例如IL-4、IL-10、IL-13及TGF-α或其激動劑；如本文所闡述之IL-1或IL-1受體拮抗劑；如本文所闡述之磷酸二酯酶抑制劑；如本文所闡述之Cox-2抑制劑；伊洛前列素(iloprost)：胺甲蝶呤；沙立度胺(thalidomide)及沙立度胺相關性藥物(例如希爾跟(Celgen))；來氟米特；纖維蛋白溶酶原活化抑制劑，例如胺甲環酸；細胞因子抑制劑，例如T-614；前列腺素E1；硫唑嘌呤；介白素-1轉化酶(ICE)之抑制劑；zap-70及/或1ck抑制劑(酪胺酸激酶zap-70或1ck之抑制劑)；如本文所闡述之血管內皮細胞生長因子或血管內皮細胞生長因子受體之抑制劑；如本文所闡述之血管生成之抑制劑；皮質類固醇抗發炎藥(例如SB203580)；TNF-轉化酶抑制劑；IL-11、IL-13、IL-17抑制劑；金；青黴胺(penicillamine)；氯喹；羥氯喹；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；環磷醯胺(cyclophosphamide)；環孢素；全淋巴輻照；抗胸腺細胞球蛋白；CD5-毒素；經口投與之肽及膠原；氯苯紮利二鈉(lobenzarit disodium)；細胞因子調控劑(CRA)HP228及HP466(Houghten Pharmaceuticals公司)；ICAM-1反義硫代磷酸酯寡去氧核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals公司)；可溶性補體受體1(TP 10； T Cell Sciences公司)；潑尼松(prednisone)；奧古蛋白(orgotein)；聚硫酸葡糖胺聚糖；米諾環素(minocycline)(MINOCIN®)；抗IL2R抗體；海洋及植物脂質(魚及植物種子脂肪酸)；金諾芬(auranofin)；保泰松(phenylbutazone)；甲氯芬那酸(meclofenamic acid)；氟芬那酸(flufenamic acid)；靜脈內免疫球蛋白；齊留通(zileuton)；黴酚酸(mycophenolic acid)(RS-61443)；他克莫司(FK-506)；西羅莫司(雷帕黴素)；胺普立糖(amiprilose)(鹽酸胺普立糖(therafectin))；克拉屈濱(cladribine)(2-氯去氧腺苷)；及阿紮立平(azaribine)。較佳組合包含一或多種本發明抗體(例如雙特異性抗體)與胺甲蝶呤或來氟米特及(在中度或嚴重類風濕性關節炎情形下)環孢素之組合。
與一或多種本發明抗體(例如雙特異性抗體)組合用於治療關節炎病症之抑制劑之較佳實例包含TNF拮抗劑(例如結合至TNF之嵌合、人類化、人類或活體外生成抗體或其抗原結合片段；TNF受體(例如p55或p75人類TNF受體或其衍生物)之可溶性片段，例如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白，ENBREL®)、p55 kD TNF受體-IgG融合蛋白；TNF酶拮抗劑，例如TNF-α轉化酶(TACE)抑制劑)；IL-12、IL-15、IL-18、IL-22之拮抗劑；T細胞及B細胞清除劑(例如抗CD4或抗CD22抗體)；小分子抑制劑，例如胺甲蝶呤及來氟米特；西羅莫司(雷帕黴素)及其類似物，例如CCI-779；cox-2及cPLA2抑制劑；NSAID；p38抑制劑，TPL-2、Mk-2及NFκB抑制劑；RAGE或可溶性RAGE；P-選擇素或PSGL-1抑制劑(例如小分子抑制劑、抗體，例如P-選擇素抗體)；雌激素受體β(ERB)激動劑或ERB-NFκB拮抗劑。可與一或多種本發明抗體(例如雙特異性抗體)共投與及/或共調配之最佳其他治療劑包含以下物質中之一或多者：TNF受體(例如p55或p75人類TNF受體或其衍生物)之可溶性片段，例如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受體-IgG融合蛋白，ENBREL®)；胺甲喋呤、來氟米特或西羅莫司 (雷帕黴素)或其類似物(例如CCI-779)。
可與一或多種本發明抗體(例如雙特異性抗體)組合用於治療或預防多發性硬化(例如復發緩解型多發性硬化、繼發進展型多發性硬化、原發進展型多發性硬化及進展復發型多發性硬化)之藥劑之非限制性實例包含下列物質：干擾素，例如干擾素-α1a(例如AVONEX®，Biogen)及干擾素-1b(BETASERON®，Chiron/Berlex)；共聚物1(Cop-1；COPAXONE®，Teva Pharmaceutical Industries公司)；富馬酸二甲基酯(例如BG-12；Biogen)；高壓氧；靜脈內免疫球蛋白；克拉屈濱；如本文所闡述之TNF拮抗劑；皮質類固醇；潑尼松龍；甲基潑尼松龍；硫唑嘌呤；環磷醯胺；環孢素；環孢素A、胺甲蝶呤；4-胺基吡啶；及替紮尼定(tizanidine)。可與本發明抗體組合使用之其他拮抗劑包含其他人類細胞因子或生長因子(例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、EL-7、IL-8、IL-12 IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-11、GM-CSF、FGF及PDGF)之抗體或拮抗劑。如本文所闡述之抗體可與細胞表面分子(例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90或其配體)之抗體組合。一或多種本發明抗體(例如雙特異性抗體)亦可與諸如以下藥劑組合：胺甲蝶呤、環孢素、FK506、雷帕黴素、麥考酚酸嗎乙酯、來氟米特、NSAID(例如布洛芬)、皮質類固醇(例如潑尼松龍)、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷激動劑、抗凝血劑、補體抑制劑、腎上腺素能劑、如本文所闡述之幹擾藉由促發炎性細胞因子進行之信號傳導之藥劑、IL-1b轉化酶抑制劑(例如Vx740)、抗P7s、PSGL、TACE抑制劑、T細胞信號傳導抑制劑(例如激酶抑制劑)、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、血管緊張素轉化酶抑制劑、如本文所闡述之可溶性細胞因子受體及其衍生物及抗發炎性細胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-13及TGF)。
可與本發明抗體組合用於多發性硬化(例如復發緩解型多發性硬化、繼發進展型多發性硬化、原發進展型多發性硬化及進展復發型多發性硬化)之治療劑之較佳實例包含富馬酸二甲基酯(例如BG-12；Biogen)、干擾素-β(例如IFN-β-1a及IFN-β-1b)；COPAXONE®、皮質類固醇、IL-1抑制劑、TNF抑制劑、CD40配體及CD80之抗體、IL-12拮抗劑。
可與本發明抗體(例如雙特異性抗體)組合用於治療或預防發炎性腸病(例如克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎)之藥劑之非限制性實例包含下列物質：布替耐德(budenoside)；表皮生長因子；皮質類固醇；環孢素；柳氮磺吡啶；胺基水楊酸酯；6-巰基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑(metronidazole)；脂氧合酶抑制劑；美沙拉秦(mesalamine)；奧沙拉嗪；巴柳氮(balsalazide)；抗氧化劑；血栓烷抑制劑；IL-1受體拮抗劑；抗IL-1單株抗體；抗IL-6單株抗體(例如抗IL-6受體抗體及抗IL-6抗體)；生長因子；彈性蛋白酶抑制劑；吡啶基-咪唑化合物；如本文所闡述之TNF拮抗劑；IL-4、IL-10、IL-13及/或TGF.β.細胞因子或其激動劑(例如激動劑抗體)；IL-11；潑尼松龍、地塞米松(dexamethasone)或布地奈德(budesonide)之葡糖苷酸-或右旋糖酐-偶聯前藥；ICAM-1反義硫代磷酸酯寡去氧核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals公司)；可溶性補體受體1(TP10；T Cell Sciences公司)；緩釋型美沙拉嗪；胺甲喋呤；血小板活化因子(PAF)之拮抗劑；環丙沙星(ciprofloxacin)；及利多卡因(lignocaine)。
可與本發明抗體(例如雙特異性抗體)組合用於治療或預防牛皮癬之藥劑之非限制性實例包含下列物質：皮質類固醇；維他命D3及其類似物；類視色素(例如阿維A酸膠囊(soriatane))；胺甲喋呤；環孢素、6-硫鳥嘌呤；異維生素a酸(Accutane)；羥基脲(hydrea)；羥基脲(hydroxyurea)；柳氮磺吡啶；麥考酚酸嗎乙酯；硫唑嘌呤；他克莫 司；富馬酸酯；生物製劑，例如AMEVIVE®、ENBREL®、HUMIRA®、瑞體膚(Raptiva)及REMICADE®、優特克單抗(Ustekinmab)及XP-828L；光線療法；及光化學療法(例如組合之補骨脂素與紫外線光線療法)。
可與本發明抗體(例如雙特異性抗體)組合用於治療或預防發炎性呼吸道/呼吸道疾病(例如慢性阻塞性肺病症、哮喘)之藥劑之非限制性實例包含下列物質：β2-腎上腺素受體激動劑(例如沙丁胺醇(salbutamol)(沙丁胺醇(albuterol)，USAN)、左旋沙丁胺醇(levalbuterol)、特布他林、比托特羅(bitolterol))；長效β2-腎上腺素受體激動劑(例如沙美特羅(salmeterol)、福莫特羅(formoterol)、班布特羅(bambuterol))；腎上腺素能激動劑(例如吸入之腎上腺素及麻黃鹼錠劑)；抗膽鹼能藥劑(例如異丙托溴銨(ipratropium bromide))；吸入類固醇與長效支氣管擴張劑之組合(例如氟替卡松(fluticasone)/沙美特羅(ADVAIR®，United狀態s；及舒利迭(Seretide)，United Kingdom))或布地奈德/福莫特羅(SYMBICORT®))；吸入之糖皮質激素(例如環索奈德(ciclesonide)、倍氯米松(beclomethasone)、布地奈德、氟尼縮松(flunisolide)、氟替卡松、莫米松(mometasone)、曲安西龍(triamcinolone))；白三烯改質劑(例如孟魯司特(montelukast)、紮魯斯特(zafirlukast)、普侖司特(pranlukast)及齊留通)；肥大細胞穩定劑(例如色甘酸鹽(cromoglicate)(色甘酸鈉(cromolyn))及奈多羅米)；抗蕈毒鹼劑/抗膽鹼能劑(例如異丙托銨、氧托溴銨、噻托溴銨(tiotropium))；甲基黃嘌呤(例如茶鹼、胺茶鹼)；抗組胺劑；IgE阻斷劑(例如奧馬珠單抗(Omalizumab))；M.sub.3蕈毒鹼拮抗劑(抗膽鹼能劑)(例如異丙托銨、噻托溴銨)；色酮(例如色甘酸鹽、奈多羅米)；黃嘌呤(例如茶鹼)；及TNF拮抗劑(例如英夫利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)及依那西普(etanercept))。
在一實施例中，本發明抗體(例如雙特異性抗體)可與一或多種指向涉及調控免疫反應(例如移植排斥)之其他靶之抗體組合使用。
可與本發明抗體(例如雙特異性抗體)組合用於治療或預防免疫反應之藥劑之非限制性實例包含下列物質：抵抗其他細胞表面分子(包含但不限於CD25(介白素-2受體-a)、CD11a(LFA-1)、CD54(ICAM-1)、CD4、CD45、CD28/CTLA4(CD80(B7.1)，例如CTLA4 Ig-阿巴他塞(abatacept)(ORENCIA®))、ICOSL、ICOS及/或CD86(B7.2))之抗體。在又一實施例中，將本發明抗體與一或多種一般免疫阻抑劑(例如環孢素A或FK506)組合使用。
在其他實施例中，抗體用作抵抗自體免疫病症、發炎性疾病等之疫苗佐劑。用於治療該等類型病症之佐劑之組合適於與各種來自涉及自體免疫性之靶定自體抗原(亦即自身抗原，例如髓磷脂鹼蛋白)、發炎性自體抗原(例如澱粉樣肽蛋白)或移植抗原(例如異體抗原)之抗原組合使用。抗原可包括衍生自蛋白質之肽或多肽以及下列物質中之任一者之片段：糖、蛋白質、聚核苷酸或寡核苷酸、自身抗原、澱粉樣肽蛋白、移植抗原、過敏原或其他大分子組份。在一些情況下，一種以上抗原包含於抗原性組合物中。
舉例而言，用於調節脊椎動物宿主中之過敏原反應之期望疫苗(其含有本發明之佐劑組合)包含彼等含有過敏原或其片段者。該等過敏原之實例闡述於美國專利第5,830,877號及PCT公開案第WO 99/51259號(其全部內容以引用方式併入本文中)，且包含花粉、昆蟲毒液、動物皮屑、真菌孢子及藥物(例如青黴素(penicillin))。疫苗幹擾IgE抗體之產生，IgE抗體之產生係過敏性反應之已知病因。在另一實例中，用於預防或治療脊椎動物宿主中特徵在於澱粉樣蛋白沈積之疾病之期望疫苗(其含有本發明之佐劑組合)包含彼等含有澱粉樣肽蛋白(APP)部分者。此疾病可提及各種形式，例如阿茲海默氏病、澱粉 樣變性或澱粉樣疾病。因此，本發明疫苗包含本發明之佐劑組合及Aβ肽以及Aβ肽片段及Aβ肽或其片段之抗體。
在另一實施例中，醫藥組合物可以包括容器(其包括本發明之抗體、雙特異性抗體或抗原結合片段)之套組形式供應。本發明抗體(例如雙特異性抗體)可以用於單一或多個劑量之可注射溶液形式或以將在注射之前重構之無菌粉末形式提供。另一選擇為，此一套組可包含乾粉分散器、液體氣溶膠生成器或霧化器以用於投與抗體(例如雙特異性抗體)。此一套組可進一步包括關於醫藥組合物之適應症及用途之書面資訊。另外，該資訊可包含以下聲明：已知對IL-17及IL-23過敏之患者禁忌該抗體組合物。
在另一實施例中，本發明提供製造物件，其包括：(a)物質組合物，其包括如本文所闡述之抗體、雙特異性抗體或抗原結合片段；(b)容器，其含有個組合物；及(c)附著至該容器之標記或包含於該容器中之封裝插頁，其指示該抗體在治療免疫相關疾病中之用途。
在一態樣中，組合物包括另一成份，其可(例如)為另一抗體或抗發炎劑、細胞毒性劑或化學治療劑。較佳地，組合物無菌。
如本文所闡述之抗體、雙特異性抗體及抗原結合片段亦可用於製備用於治療免疫相關性及發炎性疾病之醫藥及藥劑，該等免疫相關性及發炎性疾病包含(例如)多發性硬化(MS)(例如復發緩解型多發性硬化、繼發進展型多發性硬化、原發進展型多發性硬化及進展復發型多發性硬化)、刺激性腸症候群(IBS)、發炎性腸病(IBD)(例如潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病)、異位性皮膚炎、接觸性皮膚炎、全身性硬化、全身性紅斑狼瘡(SLE)、抗嗜中性球胞質抗體(ANCA)相關性血管炎(AAV)、巨細胞動脈炎、多發性硬化(MS)、結腸炎、內毒素血症、關節炎、類風濕性關節炎(RA)、骨關節炎、薛格連氏症候群、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、成人呼吸道疾病(ARD)、敗血性休克、多器官 衰竭、發炎性肺傷害(例如特發性肺纖維化)、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、呼吸道高反應性、慢性支氣管炎、過敏性哮喘、濕疹、幽門螺桿菌感染、由腹膜發炎(例如來自感染、傷害等)所致之腹內黏連及/或膿腫、腎病症候群、特發性脫髓鞘多發性神經病變、格-巴二氏症候群、器官同種異體移植物排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、狼瘡腎炎、IgA腎病變、糖尿病性腎病、微小病變型疾病(脂性腎變病)、局灶性節段性腎小球硬化症(FSGS)、腎因性全身性纖維化(NSF)、腎因性皮膚纖維化、纖維化膽汁鬱積性肝炎、嗜酸性球性筋膜炎(舒爾曼症候群)、硬化性黏液水腫(丘疹性黏蛋白沈積症)、硬皮病、硬化萎縮苔癬、POEMs症候群(克[羅]-富[克斯]二氏症候群、高槻病或PEP症候群)、腎病症候群、移植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(來自諸如以下移植體：血液、骨髓、腎、胰臟、肝、原位肝、肺、心臟、腸、小腸、大腸、胸腺、同種異體幹細胞、低強度同種異體移植物、骨、腱、角膜、皮膚、心臟瓣膜、靜脈、動脈、血管、胃及睪丸)、溶骨性疾病(例如多發性骨髓瘤誘導之溶骨性疾病)、囊性纖維化、年齡相關性黃斑變性(AMD；例如濕式AMD及乾式AMD)、肝纖維化、肺纖維化、動脈粥樣硬化、心臟缺血/再灌注傷害、心臟衰竭、心肌炎、心臟纖維化、不良心肌重構、移植排斥、鏈球菌細胞壁(SCW)誘導之關節炎、牙齦炎/牙周炎、皰疹性基質角膜炎、麩質敏感性腸病再狹窄症、川崎病及免疫介導之腎病。在一特異性態樣中，該等醫藥及藥劑包括治療有效量之本發明之雙特異性抗體、抗體或抗原結合片段以及醫藥上可接受之載劑。在一實施例中，混合物無菌。
本文所引用所有專利、專利申請案及公開案及電子可用材料(例如GENBANK®胺基酸及核苷酸序列提交文件)之全部揭示內容皆以引用方式併入本文中。已僅出於清晰理解之目的給出前述詳細說明及 實例。不應由此理解不必需之限制。本發明並不限定於所展示及所闡述之精確細節，熟習此項技術者所顯而易見之各種變化將包含於由申請專利範圍所界定之本發明內。
藉由下列非限制性實例進一步闡釋本發明。
實例1 鼠類抗人類IL-17A/F雙重特異性抗體之人類化 雜交瘤純系之選擇及可變區鑑別
在ZymoGenetics公司，Bristol-Myers Squibb公司(Seattle,WA,USA)使用HEK293瞬時表現系統產生重組人類蛋白IL-17A、IL-17A/F及IL-17F。對BALB/c小鼠(Charles River實驗室，Wilmington,MA)實施免疫且使用偶聯至BSA之重組人類IL-17F進行強化，隨後使用偶聯至BSA之重組人類IL-17A進行免疫。給予具有含有最高抗IL-17F及抗IL-17A抗體結合活性之血清之小鼠最終IL-17F預融合強化。4天後，使脾細胞及淋巴結細胞與Ag8.653骨髓瘤細胞融合以生成產生抗體之雜交瘤。藉由基於板之ELISA對雜交瘤培養上清液進行IL-17F及IL-17A結合篩選，且基於IL-17A/F細胞之分析中進行IL-17F及IL-17A中和篩選。選殖對應於結合及中和IL-17F及IL-17A之上清液試樣之雜交瘤細胞以分離產生所關注中和性單株抗體之單株雜交瘤339.15.3.5(稱為339.15)。使用ISOSTRIP®小鼠單株抗體同種型分析套組(Roche,Indianapolis,IN,USA)對雜交瘤339.15進行同種型分析，且使用QIAGEN® RNeasy套組(Qiagen,Valencia,CA,USA)分離RNA。使用SMART RACE cDNA擴增套組(Clontech,Mountain View,CA,USA)利用5' RACE技術及基因特異性3'引物(設計用於小鼠恆定區序列)來選殖可變區。使用TOPO®測序用TA選殖套組(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)選殖重鏈及輕鏈可變區序列。藉由比較基因序列與在自雜交瘤339.15純化之抗體上實施之N末端胺基酸測序來驗證該基因序列。
自339.15.3.5、339.15.5.3及339.15.3.6選殖可變區序列且展示含有嚴格相同之可變區序列。根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)將來自339.15.3.5之序列用於隨後人類化，且在2006年11月7日將339.15.3.6雜交瘤純系寄存於美國典型組織培養物保藏中心(American Type Tissue Culture Collection)(ATCC,10801 University Blvd,Manassas,VA 20110-2209)專利寄存處作為原始寄存物且給予ATCC®專利寄存編號：PTA-7988。雜交瘤純系339.15.3.6(ATCC®專利寄存編號：PTA-7988)及339.15.5.3(ATCC專利寄存編號：PTA-7987)亦揭示於(例如)美國專利第7,790,163號、第7,910,703號及第8,333,968號中。
嵌合及人類化抗人類IL-17A/F可變區序列之分子建模
構築所有可變區模型且使用MOE軟體組2008版(Chemical Computing Group,Montreal,Canada)進行察驗。
抗人類IL-17A/F人類化抗體設計
將鼠類互補決定區(CDR)移植於人類種系框架序列上。將該等序列與進行V-Base(MRC,Center for Protein Engineering,UK)中之種系胺基酸序列進行比較。選擇一種種系基因用於可變重鏈區(VH1-03)。選擇若干種種系基因用於可變輕鏈區(VKVI A26、VKI A20、VKVI A14、VKIII L6及VKI L14)。VKVI種系基因家族展示與鼠類序列具有最高同源性，然而，對於人類抗體譜中之非充分代表性種系家族而言，亦考慮具有高同源性之其他種系家族。將鼠類Kabat定義CDR區移植於重鏈及輕鏈之人類Kabat定義框架區上。
人類化抗IL-17A/F抗體之構築、表現及純化
自GeneART公司(GeneART公司，Burlingame,CA,USA)訂購人類化可變區序列。利用重疊PCR(Horton等人，Gene,77：61-68(1989))及/或限制性酶選殖至pTT5(HEK293-6E瞬時表現載體)中(NCR Biotechnology Research Institute,Ottawa,ON,CAN)將人類化及鼠類可變區序列融合至人類κ恆定區(SEQ ID NO：10)或IgG1.1(SEQ ID NO：11)，IgG1.1係野生型IgG1之具有使得Fc γ受體I結合及固定補體能力減小之突變之效應子負變體(Gross等人，Immunity,15：289-302(2001))。使用mod2610(ATGCGGCGGAGAGGCTGGTCCTGGATCTTCCTGTTTCTGCTGAGCGGAACAGCCGGCGTGCTGAGC,SEQ ID NO：30)信號序列表現所有構築體，但可使用編碼胺基酸序列MRRRGWSWIFLFLLSGTAGVLS(SEQ ID NO：31)之任一核酸序列。利用表現構築體使用聚乙烯亞胺試劑轉染HEK293-6E懸浮細胞且在F17培養基(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)中培養並添加5mM L-麩醯胺酸及25μg/mL G418。在24小時之後，添加1/40體積之20%胰蛋白腖NI(Organotechnie SAS,La Courneuve,FR)。在轉染後大約120小時時，收穫條件培養基且通過0.2μm過濾器。使用Mab Select SuRe親和層析(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)與SUPERDEX® 200尺寸排除層析(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)之組合自經過濾條件培養基純化蛋白質。藉由UV-A280nm下之吸光度來估計含量且藉由分析型尺寸排除高效液相層析、SDS PAGE及西方墨點法(western blot)來評估品質。
抗人類IL-17A/F人類化組生物分析活性；藉由NF-κB誘導量測人類IL-17A、IL-17A/F及IL-17F活性之NIH/3T3/KZ170 NF-κB螢光素酶報告基因分析
使用稱為KZ170之NF-κB螢光素酶報告基因穩定轉染鼠類纖維母細胞系(NIH/3T3，ATCC®編號：CRL-1658)且選殖出來。將NIH/3T3/KZ170純系1細胞以10,000個細胞/孔接種於96孔白色不透明實心底部螢光素酶板(Corning Incorporated,Corning,NY)中之平板培養基(DMEM以及3% FBS、1mM丙酮酸鈉、2mM L-麩醯胺酸(HyClone 實驗室，South Logan,UT))中且在37℃、5% CO2下培養過夜。次日，在分析培養基(DMEM以及0.5% BSA、1mM丙酮酸鈉、2mM L-麩醯胺酸、10mM HEPES(HyClone實驗室，South Logan,UT))中製備重組人類IL-17A、IL-17A/F或IL-17F(ZymoGenetics,A Bristol-Myers Squibb公司，Seattle,WA,USA)之連續稀釋液，且添加至含有細胞之板中並在37℃、5% CO2下一起培養4小時。另外，使用該分析量測人類IL-17A、IL-17A/F及IL-17F活性之中和。將半數最大濃度(EC50，50%有效濃度)之人類IL-17A、IL-17A/F或IL-17F與本文所闡述抗人類IL-17A/F抗體之連續稀釋液在分析培養基中合併，且添加至含有細胞之板中並在37℃、5% CO2下一起培養4小時。在培養後，去除培養基且裂解細胞，然後根據製造商說明書在Berthold Centro XS3亮度計(Berthold Technologies,Wildbad,Germany)上使用閃光基板(Promega公司，Madison,WI)進行讀取。平均螢光強度增加(經由活化NF-κB螢光素酶報告基因)指示人類IL-17A、IL-17A/F、IL-17F受體-配體相互作用。平均螢光強度降低指示人類IL-17A、IL-17A/F、IL-17F受體-配體相互作用之中和。使用GraphPad Prism 4軟體(GraphPad Software公司，San Diego CA)計算每一抗人類IL-17A/F抗體之IC50(50%抑制濃度)值。
抗人類IL-17A/F人類化CDR移植及嵌合組生物分析活性；NIH/3T3/KZ170 NF-κB螢光素酶報告基因分析結果
IL-17A、IL-17A/F及IL-17F誘導NF-κB螢光素酶報告基因以劑量依賴性方式發生活化，且經測定EC50濃度為0.15nM(對於IL-17A而言)、0.50nM(對於IL-17A/F而言)及0.50nM(對於IL-17F而言)。表1及2呈現本文所闡述抗IL-17A/F抗體之實例性IC50數據。
表1
使用框架回復突變移植之抗人類IL-17A/F人類化CDR組生物分析活性 表：NIH/3T3/KZ170 NF-κB螢光素酶報告基因分析結果
抗人類IL-17A/F人類化組Biacore活性；經由表面電漿共振(Biacore)量測對人類IL-17A、IL-17A/F及IL-17F之結合親和力
使用表面電漿共振評估人類化抗人類IL-17A/F單株抗體對人類IL-17A、人類IL-17A/F及人類IL-17F之結合親和力。
經由表面電漿共振量測人類化抗人類IL-17A/F抗體與人類IL-17A、IL-17A/F及IL-17F之相互作用之動力學速率常數及平衡離解常 數。締合速率常數(ka(M-1s-1))係反映抗原-抗體複合物之形成速率之值。離解速率常數(kd(s-1))係反映此複合物之穩定性之值。藉由將離解速率常數除以締合速率常數(kd/ka)來獲得平衡離解常數(KD(M))。此值闡述相互作用之結合親和力。具有類似KD之抗體可具有變化較大之締合及離解速率常數。因此，量測抗體之ka及kd可幫助更為獨特地闡述抗體-抗原相互作用之親和力。
在BIACORE® T100系統(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上實施結合動力學及親和力研究。使用BIACORE® T100控制軟體v 2.0對BIACORE® T100之方法進行程式化。對於該等實驗而言，經由山羊抗人類IgG Fc-γ抗體(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)或山羊抗小鼠IgG Fc-γ抗體(Jackson ImmunoResearch)將人類化抗人類IL-17A/F抗體捕獲於CM4感測器晶片上。在25℃下於10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%表面活性劑P20(GE Healthcare)、1mg/mL牛血清白蛋白之緩衝液(pH 7.4)中實施與IL-17分子之結合實驗。
在10mM乙酸鈉(pH 5.0)中將捕獲抗體山羊抗人類IgG Fc-γ稀釋至濃度為20μg/mL，且然後使用胺偶合化學試劑(EDC：NHS)以共價方式固定至CM4感測器晶片之所有4個流動槽。在固定抗體之後，使用1M乙醇胺阻斷流動槽上之剩餘活性位點。獲得大約5000RU之捕獲抗體密度。以介於60-150RU之間之密度將人類化抗人類IL-17A/F抗體捕獲於CM4晶片之流動槽2、3或4上。以10μL/min之流速將測試抗體捕獲至固定表面上。BIACORE®儀器量測結合至感測器晶片表面之蛋白質之質量，且由此驗證每一循環中測試抗體之捕獲。自100nM-0.032nM(1：5連續稀釋液)製備人類IL-17A、IL-17A/F或IL-17F(ZymoGenetics,A Bristol-Myers,Squibb公司，Seattle,WA,USA)之連續稀釋液。將連續稀釋液注射至表面上且使其特異性結合至捕獲於感 測器晶片上之測試抗體。以7分鐘之締合時間及15分鐘之離解時間將每一濃度抗原重複注射。以50μL/min之流速實施動力學結合研究。在各循環之間，使用20mM鹽酸洗滌流動槽以再生表面。此洗滌步驟自固定抗體表面去除所捕獲測試抗體及任一結合抗原。隨後將測試抗體再次捕獲於下一循環中。
使用BIACORE® T100評估軟體(2.0版)編譯數據。藉由扣除參考流動槽及空白注射來處理數據。評價基線穩定性以確保再生步驟在整個注射序列中提供一致結合表面。檢查重複注射曲線之再現性。基於二價IL-17分子與二價抗體之結合，經測定二價分析物結合相互作用模型適用於與IL-17分子之相互作用。二價分析物模型先前闡述於West,A.P.等人，Biochemistry,39：9698-9708(2000)；及West,A.P.等人，J.Mol.Biol.,313：385-397(2001)中。可自如藉由表面電漿共振測定之速率常數比率(kd1/ka1)來計算二價分析物模型之親和力常數(KD1)。使用多重Rmax且在將RI設定為零下將扣除參考之結合曲線整體擬合至適當結合模型。數據與結合模型充分擬合且實驗與理論結合曲線之間具有良好一致性。與擬合有關之chi2及標準誤差較低。殘差並無傾向性。
抗人類IL-17A/F人類化組Biacore活性
與人類IL-17A、IL-17A/F及IL-17F之結合實驗之結果分別展示於表3、4及5中。
抗人類IL-17A/F人類化抗體對IL-17A之結合親和力
抗IL-17A/F人類化抗體對IL-17A/F之結合親和力
抗IL-17A/F人類化抗體對IL-17F之結合親和力
實例2 7B7抗體選擇及雜交瘤生成 藉由表面電漿共振技術(使用Biacore)基於抗體之結合及組斷性質對抗體進行分組之表位劃分方式，如圖11中所展示。
基於抗體之以下能力對抗體進行分組及選擇：1.僅特異性結合IL-23之p19亞結構域；2.僅特異性阻斷IL-23受體(IL-23R)且並不阻斷IL-12受體(IL-12R)；及3.並不與任一可特異性結合至IL-23之p40亞結構域之抗體進行競爭。
將先前已知對IL-23及IL-23R或IL-12R之p19或p40亞結構域具有選擇性之材料(例如抗體)全部選出塗覆於BIACORE® CM5晶片上。塗層密度在500-8000共振單位(RU)之間有所變化。將擬劃分抗體自介於10μg/mL至100μg/mL之間之起始濃度連續滴定(1：2或1：3，共8個濃度)至96孔ELISA板中。向每一孔中添加10nM IL-23抗原。使板上之抗體與抗原形成複合物且在4℃下達到平衡過夜。以20μL/min之流速經兩分鐘將複合物注射至CM5晶片上。以兩分鐘結束時之結合共振單位(RU)形式記錄信號。抗體-抗原複合物能夠與塗覆於晶片上之材料進行完整或並不競爭。若抗體與抗原之複合物能夠與晶片上之材料進行競爭，則在增加抗體濃度時，結合RU有所降低，且若其並不競爭，則結合RU有所增加。基於此觀察，根據結合選擇性及競爭能力來劃分所有抗IL23抗體。
使用存於RIBI佐劑中之重組人類IL-23-his對來自Medarex集群 (Milpitas,CA)之轉基因HCo12 J/K HUMAB®小鼠實施免疫。
藉由改質間接雙重ELISA測試來自經免疫小鼠之血清中IL-23特異性抗體之表現。簡言之，使用存於PBS中之2.5μg/ml小鼠抗his蛋白以50μl/孔塗覆微量滴定板(COSTAR®，96孔平底，編號：9018)，在4℃下培養過夜，且然後使用存於PBS中之1% BSA阻斷。以50μl/孔將2.5μg/ml HuIL-23或HuIL-12添加至板中用於捕獲且在室溫下培養一小時。使用PBS Tween洗滌板，且添加血清稀釋液並培養1小時。使用PBS-Tween洗滌板並與偶聯至HRP之山羊-抗人類γ重鏈(Jackson ImmunoResearch，編號：109-036-098)一起培養1小時。在洗滌3次之後，使用ABTS(Moss，CAT編號：ABTS-1000)受質使板顯影且在415nm下分析OD。分析數據且表示為血清效價，血清效價係定義為得到至少兩倍於背景之抗原陽性信號之最高血清稀釋度。基於與小組中之其他小鼠相比小鼠215094對IL-23具有相對較高效價且對IL-12具有較低交叉反應性，選擇其用於雜交瘤生成(參見表6)。
小鼠215094之基因型提供於下表7中。
藉由基於電場之電融合使用CytoPulse大室細胞融合電穿孔器件在稱為融合2378之程序中使用來自小鼠215094之脾與小鼠骨髓瘤細胞(ATCC CRL-1580)生成雜交瘤。
來自所得雜交瘤之條件培養基首先在標準自動化分析中針對人類IgG γ/κ之表現隨後經由ELISA針對IL-23結合(針對IL-12實施反篩選ELISA)進行篩選，以鑑別如先前所闡述之特異性純系。用於測試之雜交瘤選擇準則係試樣之OD在huIL23板上大於1.5且在huIL12板上小於0.15。
融合2378總共生成827個人類IgG陽性雜交瘤，其中128個具有IL-23特異性。基於與抗p19及抗p40陽性對照抗體相比雜交瘤7B7對IL-23具有較強結合且對IL-12並無交叉反應性，選擇其用於進一步測試；雜交瘤(包含藉由ELISA選擇之7B7)之實例在圖7中給出。藉由ELISA證實亞純系7B7.D之同種型4為人類IgG1κ。
在基於細胞之分析中對來自所有IL-23p-19特異性MAb之雜交瘤條件培養基針對IL-23中和活性進行篩選。Kit225(自患有T細胞慢性淋巴球白血病之患者確立之人類T細胞系)已展示對IL-23具有反應且發生劑量依賴性STAT3磷酸化(pSTAT3)。使用添加及不添加雜交瘤條件培養基或對照中和抗p19抗體之EC50下人類IL-23將細胞刺激15分鐘。裂解細胞且藉由ELISA(Cell Signaling Technology,PATHSCAN®，目錄編號：7300)評價IL-23依賴性STAT3磷酸化之抑制，其中O.D.減小指示pSTAT3含量減小。基於套組225分析中所觀察到之IL-23信號傳導之強力中和且如圖8中所展示，選擇雜交瘤7B7用 於亞選殖及進一步表徵。
使用類似於彼等闡述於上文中者之分析，7B7亞純系1413.2378.7B7.D4.H2顯示IL-23之選擇性結合及IL-23信號傳導之中和，隨後對其實施測序(IL-23p19 7B7重鏈可變結構域展示於SEQ ID NO：7中，且輕鏈可變結構域展示於SEQ ID NO：9中)。
實例3 抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體之生成 哺乳動物抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性分子之構築及表現
在GeneART公司(GeneART公司，Burlingame,CA,USA)或GenScript(GenScript,Piscataway,NJ,USA)處合成部分基因或完整基因且經由限制性酶選殖插入pTT5(HEK293-6E瞬時表現載體，NCR Biotechnology Research Institute,Ottawa,ON,Canada)中。以完整構築體形式自GenScript(GenScript,Piscataway,NJ,USA)訂購MVC1059(SEQ ID NO：62)及MVC1061(SEQ ID NO：60)。使用mod2610(SEQ ID NO：30)信號序列表現所有構築體。biAbFabL係雙特異性抗體，其含有具有經由連接體(例如10mer G4S)附接之雙特異性抗體之第二臂之C末端Fab單元之全抗體且利用公用輕鏈(參見圖2)。taFab係雙特異性抗體，其含有具有經由連接體(例如(Gly4Ser1)x(其中x為1、2或3)及SEQ ID NO：12之連接體)附接之雙特異性抗體之第二臂之N末端Fab單元之全抗體。如同重鏈部分一樣，雙特異性抗體之每一臂具有兩條經由連接體(例如(Gly4Ser1)x(其中x為1、2或3)及SEQ ID NO：12之連接體)附接之輕鏈(參見圖3)。雜二聚體Fc係類似於傳統抗體之雙特異性抗體，然而，其含有兩條經由CH3區中之靜電互補性締合而締合之不同重鏈。雜二聚體Fc利用公用輕鏈(參見圖4)。重鏈及輕鏈恆定區包含IgG1.1(SEQ ID NO：11，其可由SEQ ID NO：82編碼)、沒有C末端離胺酸之IgG1.1f(SEQ ID NO：127)、具有C末端離胺酸之IgG1.1f(SEQ ID NO：128)、人類κ恆定區(SEQ ID NO：10，其可由SEQ ID NO：83編碼)或IgG4.1(SEQ ID NO：8)。IgG4重鏈恆定結構域可為野生型IgG4之變體，其在鉸鏈區中具有突變S228P(EU索引編號系統)或S241P(Kabat編號系統)。在小鼠/人類嵌合重鏈中將241(Kabat)處之絲胺酸改變為脯胺酸(在IgG1及IgG2中之該位置發現)使得產生同源抗體且消除異源性。另外，與原始嵌合IgG4相比，變體IgG4具有顯著延長之血清半衰期且展示改良之組織分佈。Angal等人，Molecular Immunology,30(1)：105-108(1993)；Schuurman等人，Molecular Immunology,38：1-8(2001)；Lewis等人，Molecular Immunology,46：3488-3494(2009)。
使用1μl酵母DNA製劑及20μl大腸桿菌(E.coli)細胞來轉變電勝任大腸桿菌宿主細胞(DH10B)。以2.0kV、25μF及400歐姆來對細胞實施電脈衝。在電穿孔後，添加600μl SOC(2% BACTO®胰蛋白腖(Difco,Detroit,MI)、0.5%酵母提取物(Difco)、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)且將細胞以50μl及550μl等分試樣平鋪於兩個LB AMP板(LB培養液(Lennox)、1.8% BACTO®瓊脂(Difco)、100mg/L胺苄西林(Ampicillin))上。
對來自每一構築體之5種菌落實施序列分析。選擇一種含有準確序列之純系。使用ABI PRISM® BigDye Terminator v3.1循環測序套組(Applied Biosystems,Foster City,CA)實施DNA測序。使用Edge BioSystems Preforma Centriflex凝膠過濾筒(Gaithersburg,MD)純化測序反應液且在Applied Biosystems 3730 DNA分析儀(Applied Biosystems,Foster City,CA)上運行測序。使用SEQUENCHER® v4.6軟體(GeneCodes公司，Ann Arbor,MI.)彙集所得序列數據並加以編輯。選擇一種含有準確序列之純系且使用市售套組(QIAGEN®質粒大量提取套組，Qiagen,Valencia,CA)根據製造商說明書分離大尺寸質粒DNA。
利用表現構築體使用聚乙烯亞胺試劑轉染HEK293-6E懸浮細胞且在F17培養基(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)中培養並添加5mM L-麩醯胺酸及25μg/mL G418。在24小時之後，添加1/40體積之20%胰蛋白腖NI(Organotechnie SAS,La Courneuve,FR)。在轉染後大約120小時時，收穫條件培養基且通過0.2μm過濾器。使用Mab Select SuRe親和層析(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)與SUPERDEX® 200尺寸排除層析(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)之組合自經過濾條件培養基純化蛋白質。藉由UV-A280nm下之吸光度來估計含量且藉由分析型尺寸排除高效液相層析、SDS PAGE及西方墨點法來評估品質。
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體組合物
全抗體及其模組組份繪示於圖1中。biAbFabL形式繪示於圖2中。taFab形式繪示於圖3中。雜二聚體Fc形式繪示於圖4中。VCVFc形式繪示於圖5中。VCDFc形式繪示於圖6中。
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體生物分析活性；藉由NF-κB誘導量測人類IL-17A、IL-17A/F及IL-17F活性之IH/3T3/KZ170 NF-κB螢光素酶報告基因分析
用於此分析之材料及方法闡述於上文實例1中。
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體生物分析活性；藉由磷酸-STAT3誘導量測人類IL-23活性之Baf3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1轉染子磷酸-STAT3分析
使用人類IL-23Rα及人類IL-12Rβ1穩定轉染鼠類骨髓源細胞系(Baf3)並進行選殖。使用分析培養基(RPMI 1640以及10%胎牛血清、2mM L-麩醯胺酸、1mM丙酮酸鈉(HyClone實驗室，South Logan,UT)及2μM β-巰基乙醇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))將Baf3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1純系6細胞洗滌三次，然後以50,000固細胞/孔平鋪於 96孔圓底組織培養板中。在分析培養基中製備重組人類IL-23(ZymoGenetics,A Bristol-Myers Squibb公司，Seattle WA,USA)之連續稀釋液，且添加至含有細胞之板中並在37℃、5% CO2下一起培養15分鐘。另外，亦使用該分析量測IL-23活性之中和。將半數最大濃度(EC50，50%有效濃度)之IL-23與本文所闡述抗人類IL-23/IL-17A/F抗體之連續稀釋液合併且在37℃、5% CO2下於分析培養基中一起培養15分鐘，然後添加至細胞中。在預培養後，將處理劑添加至含有細胞之板中並在37℃、5% CO2下一起培養15分鐘。在培養後，根據製造商說明書(BIO-PLEX®細胞裂解套組，Bio-Rad實驗室，Hercules,CA)，使用冰冷洗滌緩衝液洗滌細胞且置於冰上以終止反應。然後將細胞在4℃下以2000rpm旋轉5分鐘，然後傾卸出培養基。將50μL/孔裂解緩衝液添加至每一孔中；將裂解物在冰上上下吸取5次，然後在300rpm及4℃下於板振盪器上攪動20分鐘。在3200rpm及4℃下將板離心20分鐘。收集上清液且轉移至新微量滴定板上以用於儲存於-80℃下。
根據製造商說明書(BIO-PLEX®磷蛋白檢測套組，Bio-Rad實驗室)，將捕獲珠粒(BIO-PLEX®磷酸-STAT3分析，Bio-Rad實驗室)與50μL1：1稀釋裂解物合併且添加至96孔過濾板中。將鋁箔覆蓋板在室溫及300rpm振盪下培養過夜。將板轉移至微量滴定真空裝置中並使用洗滌緩衝液洗滌三次。在添加25μL/孔檢測抗體之後，將箔覆蓋板在室溫及300rpm振盪下培養30分鐘。將板過濾並使用洗滌緩衝液洗滌三次。添加鏈黴抗生物素-PE(50μL/孔)，且將箔覆蓋板在室溫及300rpm振盪下培養15分鐘。過濾板且使用珠粒再懸浮緩衝液洗滌三次。在最終洗滌之後，將珠粒再懸浮於125μL/孔之珠粒懸浮緩衝液中，振盪30秒，且根據製造商說明書在陣列式讀取儀(BIO-PLEX® 100，Bio-Rad實驗室)上進行讀取。使用分析軟體(BIO-PLEX® Manager 4.1，Bio-Rad實驗室)分析數據。存在於裂解物中之磷酸化STAT3轉錄因子之含量增加指示IL-23受體-配體相互作用。存在於裂解物中之磷酸化STAT3轉錄因子之含量降低指示IL-23受體-配體相互作用之中和。使用GraphPad Prism 4軟體(GraphPad Software公司，San Diego CA)計算每一抗人類IL-23/IL-17A/F抗體之IC50(50%抑制濃度)值。
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體生物分析活性；NIH/3T3/KZ170 NF-κB螢光素酶報告基因分析及Baf3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1轉染子磷酸-STAT3分析結果
人類IL-17A、IL-17A/F及IL-17F以劑量依賴性方式誘導NF-κB螢光素酶報告基因發生活化且經測定EC50濃度為0.33nM(對於IL-17A而言)、1nM(對於IL-17A/F而言)及1nM(對於IL-17F而言)，且IL-23以劑量依賴性方式誘導STAT3磷酸化且經測定EC50濃度為0.02nM。抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體之IC50數據展示於下表8中。
抗人類IL-23/17A/F雙特異性抗體表
* SEQ ID NO：17之胺基酸序列可藉由SEQ ID NO：70之序列編碼；SEQ ID NO：28之胺基酸序列可藉由SEQ ID NO：71之序列編碼；SEQ ID NO：18之胺基酸序列可藉由SEQ ID NO：72之序列編碼；SEQ ID NO：29之胺基酸序列可藉由SEQ ID NO：75之序列編碼。
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體生物分析活性；藉由G-CSF誘導量測人類IL-17A、IL-17AF及IL-17F活性之初代人類SAEC分析
以8,000個細胞/孔將初代人類小呼吸道上皮細胞(SAEC)接種於96孔平底組織培養板(Corning Incorporated,Corning,NY)中之小呼吸道上皮生長培養基(SAGM)(細胞及培養基：Lonza,Walkersville,MD)中且在37℃、5% CO2下培養過夜。次日，在SAGM培養基中製備人類IL-17A、IL-17A/F或IL-17F(ZymoGenetics,A Bristol-Myers Squibb公司，Seattle WA,USA)之連續稀釋液，且添加至含有細胞之板中並在37℃、5% CO2下一起培養24小時。另外，使用該分析量測IL-17A、IL-17A/F及IL-17F活性之中和。將半數最大濃度(EC50，50%有效濃度)之IL-17A、IL-17A/F或IL-17F與本文所闡述抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體之連續稀釋液在SAGM培養基中合併，且添加至含有細胞之板中並在37℃、5% CO2下一起培養24小時。在培養之後，旋轉上清液，收集並在-80℃下冷凍直至準備處理為止。使用基於珠粒之商業人類G-CSF細胞因子ELISA根據製造說明書(Procarta/Affymetrix,Santa Clara,CA)量測上清液中之人類G-CSF蛋白質含量。上清液中之人類G-CSF含量增加指示人類IL-17A、IL-17A/F、IL-17F受體-配體相互作用。上清液中之人類G-CSF含量降低指示人類IL-17A、IL-17A/F、IL-17F受體-配體相互作用之中和。使用GraphPad Prism 4軟體(GraphPad Software公司，San Diego CA)計算每一抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體之IC50(50%抑制濃度)值。
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體生物分析活性；初代人類SAEC分析結果
人類IL-17A、IL-17A/F及IL-17F以劑量依賴性方式誘導人類G-CSF產生且經測定EC50濃度為0.03nM(對於IL-17A而言)、3nM(對於IL-17A/F而言)及3nM(對於IL-17F而言)。所測試雙特異性抗體包含23/17bAb1(SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：17)、23/17bAb2(SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：17)、23/17bAb3(SEQ ID NO：74及SEQ ID NO：17)、23/17bAb4(SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：17)。亦測試人類化抗人類IL-17A/F抗體339-134 mAb(SEQ ID NO：65及SEQ ID NO：67)。抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體之IC50數據展示於下表9中。此數據指示，抗IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體以同等效力抑制人類IL-17A、IL-17A/F、IL-17F調介之IL-6產生。
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體生物分析活性；藉由IL-6誘導量測人類IL-17A、IL-17A/F及IL-17F活性之初代人類纖維母細胞分析
將初代人類纖維母細胞系(HFFF2，目錄編號：86031405，Health Protection Agency Culture Collections,Porton Down Salisbury,UK)以5,000個細胞/孔接種於96孔平底板(Corning Incorporated,Corning,NY)中之分析培養基(DMEM以及10% FBS及2mM L-麩醯胺酸(HyClone實驗室，South Logan,UT))中且在37℃、5% CO2下培養過夜。次日，在分析培養基中製備重組人類IL-17A、IL-17AF或IL-17F(ZymoGenetics,A Bristol-Myers Squibb公司，Seattle WA 98117)之連續稀釋液，且添加至含有細胞之板中並在37℃、5% CO2下一起培養24小時。另外，使用該分析量測人類IL-17A、IL-17A/F及IL-17F活性之中和。將半數最大濃度(EC50，50%有效濃度)之人類IL-17A、IL-17A/F或IL-17F與本文所闡述抗人類IL-23/IL-17A/F抗體之連續稀釋液在分析培養基中合併，且添加至含有細胞之板中並在37℃、5% CO2下一起培養24小時。在培養之後，旋轉上清液，收集並在-80℃下冷凍直至準備處理為止。使用基於珠粒之商業人類IL-6細胞因子ELISA根據製造說明書(Bio-Rad實驗室，Hercules,CA)量測上清液中之人類IL-6蛋白質含量。上清液中之人類IL-6含量增加指示人類IL-17A、IL-17A/F、IL-17F受體-配體相互作用。上清液中之人類IL-6含量降低指示人類IL-17A、IL-17A/F、IL-17F受體-配體相互作用之中和。使用GraphPad Prism 4軟體(GraphPad Software公司，San Diego CA)計算每 一抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體之IC50(50%抑制濃度)值。
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體生物分析活性；初代人類纖維母細胞分析結異
人類IL-17A、IL-17A/F及IL-17F以劑量依賴性方式誘導人類IL-6產生且經測定EC50濃度為0.08nM(對於IL-17A而言)、25nM(對於IL-17AF而言)及25nM(對於IL-17F而言)。所測試雙特異性抗體包含23/17bAb1(SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：17)、23/17bAb2(SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：17)、23/17bAb3(SEQ ID NO：74及SEQ ID NO：17)、23/17bAb4(SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：17)。亦測試人類化抗人類IL-17A/F抗體339-134 mAb(SEQ ID NO：64及SEQ ID NO：66)。抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體之IC50數據展示於下表9中。該等數據指示，抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體以同等效力抑制人類IL-17A、IL-17A/F、IL-17F調介之IL-6產生。
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體生物分析活性；藉由鼠類IL-17A及IL-17F誘導量測人類IL-23活性之鼠類脾細胞分析
自完整脾(自BALB/c小鼠收穫)製備鼠類脾細胞之單細胞懸浮液。在使用ACK緩衝液(0.010M KHCO3、0.0001M EDTA、0.150M NH4Cl，pH 7.2)實施紅血細胞裂解之後，洗滌脾細胞且再懸浮於分析培養基(RPMI 1640以及10% FBS、非必需胺基酸、1mM丙酮酸鈉、2mM L-麩醯胺酸、10mM HEPES、100單位/mL Pen/Strep(HyClone實驗室，South Logan,UT)、50μM2-巰基乙醇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)及50ng/ml人類IL-2(R&D Systems,Minneapolis,MN))中。將脾細胞以500,000個細胞/孔接種於96孔圓底板中。在分析培養基中製備重組人類IL-23(BDC 50220AN087雜二聚體材料)之連續稀釋液，且添加至含有細胞之板中並在37℃、5% CO2下一起培養24小時。另外，亦使用該分析量測人類IL-23活性之中和。將半數最大濃度(EC50， 50%有效濃度)之人類IL-23與本文所闡述抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體之連續稀釋液合併且在37℃、5% CO2下於分析培養基中一起培養15分鐘，然後添加至細胞中。在預培養後，將處理劑添加至含有細胞之板中並在37℃、5% CO2下一起培養24小時。在培養之後，旋轉上清液，收集並在-80℃下冷凍直至準備處理為止。使用基於板之商業鼠類IL-17A及IL-17F ELISA根據製造商說明書(eBiosciences,San Diego,CA)量測上清液中鼠類IL-17A及IL-17F之蛋白質含量。上清液中之鼠類IL-17A及IL-17F含量增加指示IL-23受體-配體相互作用。上清液中之鼠類IL-17A及IL-17F含量降低指示IL-23受體-配體相互作用之中和。使用GraphPad Prism 4軟體(GraphPad Software公司，San Diego CA)計算每一抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體之IC50(50%抑制濃度)值。
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體生物分析活性；鼠類脾細胞分析結果
人類IL-23以劑量依賴性方式誘導鼠類IL-17A及IL-17F且經測定EC50濃度為0.01nM。所測試雙特異性抗體包含23/17bAb1(SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：17)、23/17bAb2(SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：17)、23/17bAb3(SEQ ID NO：74及SEQ ID NO：17)、23/17bAb4(SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：17)。亦測試抗人類IL-23.6(7B7)mAb(SEQ ID NO：68及SEQ ID NO：17)。抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體之IC50數據展示於下表9中。此數據指示，抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體抑制人類IL-23誘導之鼠類IL-17A及IL-17F產生。
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體生物分析活性；藉由磷酸-STAT3誘導量測人類IL-23活性之初代人類T細胞磷酸-STAT3分析
白血球分離術PBMC：隨機選擇正常人類供體(ZymoGenetics正常供體庫)且在FHCRC(Seattle,WA)處自動進行血球分離。將白血球分 離術PBMC以無菌血液收集袋遞送至ZymoGenetics。將細胞傾倒至無菌500mL塑膠瓶中，使用室溫PBS以及1mM EDTA(HyClone實驗室，South Logan,UT)稀釋至400mL並轉移至250mL圓錐形管中。以1500rpm將250mL管離心10分鐘以使細胞沈澱。然後取出細胞上清液並棄除。然後合併細胞沈澱物且懸浮於400mL PBS以及1mM EDTA中。將細胞懸浮液(25mL/管)覆蓋於50mL圓錐形管(總共16個管)中之FICOLL1®(20mL/管)上。以2000rpm將管在室溫下離心20分鐘。收集含有白血球細胞及殘餘血小板之界面層(「血球界面黃層」)，彙集且使用PBS以及1mM EDTA重複洗滌，直至去除大部分血小板為止。然後將白血球細胞懸浮於100mL冰冷之凍存培養基(70% RPMI 1640、20% FCS、10% DMSO(HyClone實驗室))且分佈至無菌冷凍小瓶(1mL細胞/小瓶)中。將冷凍小瓶置於-80℃冷凍器中保持24小時，然後轉移至液態氮冷凍器中。來自典型血球分離之白血球細胞產量為0.5-1.0×1010個細胞。以此方式處理之血球分離細胞含有T細胞、B細胞、NK細胞、單核球及樹突細胞。
活化T細胞之製備：必須活化T細胞以表現IL-12受體且能夠對IL-12及IL-23具有反應。將凍存白血球分離術PBMC解凍，轉移至無菌50mL圓錐形管中，且使用50mL溫熱分析培養基(RPMI 1640加上10% FBS(HyClone實驗室))洗滌，並在37℃水浴中培養1小時，以回收細胞。然後將細胞離心，且棄除細胞上清液。將細胞沈澱物再懸浮於分析培養基中，且以2×107個細胞/燒瓶分佈於無菌162cm2組織培養燒瓶中之90mL含有5μg/mL PHA-M之分析培養基(Roche,Basel，瑞士)中。然後將細胞在37℃下於增濕培養箱中總共培養5天。藉由以下方式將細胞「靜止」：在第4天下午收穫細胞，使用不含PHA之新鮮分析培養基置換培養基，再送回培養箱中歷經剩餘之5天培養期。
磷酸-STAT3分析：在培養之第5天收穫活化之人類T細胞且再懸 浮於新鮮分析培養基中，並以2×105個細胞/孔平鋪於U形底96孔板中。在分析培養基中製備重組人類IL-23(BDC 50220AN087雜二聚體材料)之連續稀釋液，且添加至含有細胞之板中，並在37℃、5% CO2下一起培養15分鐘。另外，亦使用該分析法量測IL-23活性之中和。將半數最大濃度(EC50，50%有效濃度)之IL-23與本文所闡述抗人類IL-23/IL-17AF抗體之連續稀釋液合併，且先在37℃、5% CO2下於分析培養基中一起培養15分鐘，然後才添加至細胞中。在預培養後，將處理劑添加至含有細胞之板中，並在37℃、5% CO2下一起培養15分鐘。培養後，根據製造商說明書(BIO-PLEX®細胞裂解套組，Bio-Rad實驗室，Hercules,CA)，使用冰冷洗滌緩衝液洗滌細胞且置於冰上以終止反應。然後將細胞在4℃下以2000rpm旋轉5分鐘，然後傾卸出培養基。將50μL/孔裂解緩衝液添加至每一孔中；將裂解物在冰上上下吸取5次，然後在300rpm及4℃下於板振盪器上攪動20分鐘。在3200rpm及4℃下將板離心20分鐘。收集上清液且轉移至新微量滴定板上以用於儲存於-80℃下。
根據製造商說明書(BIO-PLEX®磷蛋白檢測套組，Bio-Rad實驗室)，將捕獲珠粒(BIO-PLEX®磷酸-STAT3分析，Bio-Rad實驗室)與50μL 1：1稀釋裂解物合併且添加至96孔過濾板中。將鋁箔覆蓋板在室溫及300rpm振盪下培養過夜。將板轉移至微量滴定真空裝置中並使用洗滌緩衝液洗滌三次。在添加25μL/孔檢測抗體之後，將箔覆蓋板在室溫及300rpm振盪下培養30分鐘。將板過濾並使用洗滌緩衝液洗滌三次。添加鏈黴抗生物素-PE(50μL/孔)，且將箔覆蓋板在室溫及300rpm振盪下培養15分鐘。過濾板且使用珠粒再懸浮緩衝液洗滌三次。在最終洗滌之後，將珠粒再懸浮於125μL/孔之珠粒懸浮緩衝液中，振盪30秒，且根據製造商說明書在陣列式讀取儀(BIO-PLEX® 100，Bio-Rad實驗室)上進行讀取。使用分析軟體(BIO-PLEX® Manager 4.1，Bio-Rad實驗室)分析數據。存在於裂解物中之磷酸化STAT3轉錄因子之含量增加指示IL-23受體-配體相互作用。存在於裂解物中之磷酸化STAT3轉錄因子之含量降低指示IL-23受體-配體相互作用之中和。使用GraphPad Prism 4軟體(GraphPad Software公司，San Diego CA)計算每一抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體之IC50(50%抑制濃度)值。
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體生物分析活性；初代人類T細胞磷酸-STAT3分析結果
人類IL-23以劑量依賴性方式誘導STAT3磷酸化且經測定EC50濃度為0.02nM。所測試雙特異性抗體包含23/17bAb1(SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：17)、23/17bAb2(SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：17)、23/17bAb3(SEQ ID NO：74及SEQ ID NO：17)、23/17bAb4(SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：17)。亦測試抗人類IL-23.6(7B7)mAb(SEQ ID NO：68及SEQ ID NO：17)。抗人類IL-23/IL-17A/F抗體之IC50數據展示於下表9中。
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體生物分析活性；初代人類SAEC分析、初代人類纖維母細胞分析、鼠類脾細胞分析及初代人類T細胞磷酸-STAT3分析結果
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體共結合活性；初代人類纖維母細胞分析，用以量測同時結合至人類IL-23下對人類IL-17A、IL-7A/F或IL-F之抑制。初代人類T細胞磷酸-STAT3分析，用以量測同時結合至人類IL-17A、IL-7A/F或IL-17F下對人類IL-23之抑制。
在過量IL-23存在下在30nM下運行初代人類纖維母細胞分析。在過量IL-17A、IL-17A/F、IL-17F存在下在30nM下運行初代人類T細胞磷酸-STAT3分析。
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體生物分析共結合結果
所測試雙特異性抗體包含23/17bAb1(SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：17)、23/17bAb2(SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：17)、23/17bAb3(SEQ ID NO：74及SEQ ID NO：17)、23/17bAb4(SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：17)及23/17taFab1(SEQ ID NO：76及SEQ ID NO：78)。在人類IL-23存在下檢驗抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體時，並不幹擾對人類IL-17A、IL-17A/F、IL-17F之抑制。在人類IL-17A、IL-17A/F、IL-17F存在下檢驗抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體時，並不幹擾對人類IL-23之抑制。
經由表面電漿共振(Biacore)量測抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體對人類IL-17A、IL-17A/F、IL-17F及人類IL-23之結合親和力
使用表面電漿共振評估抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體對人類IL-17A、人類IL-17A/F、人類IL-17F及人類IL-23之結合親和力。
經由表面電漿共振量測抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體與人類IL-17A、IL-17A/F、IL-17F及人類IL-23之相互作用之動力學速率常數及平衡離解常數。締合速率常數(ka(M-1s-1))係反映抗原-抗體複合物之形成速率之值。離解速率常數(kd(s-1))係反映此複合物之穩定性之值。藉由將離解速率常數除以締合速率常數(kd/ka)來獲得平衡離解常數(KD(M))。此值闡述相互作用之結合親和力。具有類似KD之抗體 可具有變化較大之締合及離解速率常數。因此，量測抗體之ka及kd可幫助更為獨特地闡述抗體-抗原相互作用之親和力。
在BIACORE® T100系統(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上實施結合動力學及親和力研究。使用BIACORE® T100控制軟體v 2.0對BIACORE® T100之方法進行程式化。對於該等實驗而言，經由山羊抗人類IgG Fc-γ抗體(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)將單株及雙特異性抗體捕獲於CM4感測器晶片上。在25℃下於10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%表面活性劑P20(GE Healthcare)、1mg/mL牛血清白蛋白之緩衝液(pH 7.4)中實施與人類IL-17分子之結合實驗。在25℃下於10mM HEPES、500mM NaCl、3mM EDTA、0.05%表面活性劑P20(Biacore)、1mg/mL牛血清白蛋白之緩衝液(pH 7.4)中實施與IL-23/IL-12B雜二聚體之結合實驗。
在10mM乙酸鈉(pH 5.0)中將捕獲抗體山羊抗人類IgG Fc-γ稀釋至濃度為20μg/mL，且然後使用胺偶合化學試劑(EDC：NHS)以共價方式固定至CM4感測器晶片之所有4個流動槽。在固定抗體之後，使用1M乙醇胺阻斷流動槽上之剩餘活性位點。獲得大約5000RU之捕獲抗體密度。以介於60-150RU之間之密度將抗人類IL-23/IL-17A/F抗體捕獲於CM4晶片之流動槽2、3或4上。以10μL/min之流速將測試抗體捕獲至固定表面上。BIACORE®儀器量測結合至感測器晶片表面之蛋白質之質量，且由此驗證每一循環中測試抗體之捕獲。自100nM-0.032nM(1：5連續稀釋液)製備人類重組IL-17A、IL-17A/F或IL-17F(ZymoGenetics,A Bristol-Myers Squibb公司，Seattle,WA,USA)之連續稀釋液，而自200nM-0.064nM(1：5連續稀釋液)製備人類重組IL-23(ZymoGenetics,A Bristol-Myers Squibb公司，Seattle,WA,USA)之連續稀釋液。將連續稀釋液注射至表面上且使其特異性結合至捕獲於感測器晶片上之測試抗體。以7分鐘之締合時間及15分鐘之離解時間 將每一濃度抗原重複注射。以50μL/min之流速實施動力學結合研究。在各循環之間，使用20mM鹽酸洗滌流動槽以再生表面。此洗滌步驟自固定抗體表面去除所捕獲測試抗體及任一結合抗原。隨後將測試抗體再次捕獲於下一循環中。
使用BIACORE® T100評估軟體(2.0版)編譯數據。藉由扣除參考流動槽及空白注射來處理數據。評價基線穩定性以確保再生步驟在整個注射序列中提供一致結合表面。檢查重複注射曲線之再現性。基於二價IL-17分子與二價抗體之結合，經測定二價分析物結合相互作用模型適用於與IL-17分子之相互作用。基於IL-23/IL-12B雜二聚體與二價抗體之結合，經測定1：1結合相互作用模型適用於與IL-23分子之相互作用。使用多重Rmax且在將RI設定為零下將扣除參考之結合曲線整體擬合至適當結合模型。數據與結合模型充分擬合且實驗與理論結合曲線之間具有良好一致性。與擬合有關之chi2及標準誤差較低。殘差並無傾向性。
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體Biacore活性
與人類IL-17A、IL-17A/F及IL-17F之結合實驗之結果分別展示於表10、11及12中。與人類IL-23/IL-12B雜二聚體之結合實驗之結果展示於表13中。
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體對IL-17A之結合親和力
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體對IL-17A/F之結合親和力
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體對IL-17F之結合親和力
抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體對IL23/IL-12B之結合親和力
經由表面電漿共振(Biacore)測定IL-17A/F及IL-23與抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體之同時共結合
經由表面電漿共振評估抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體同時共結合IL-23及IL-17A/F之能力。
對於第一定向中之共結合實驗而言，使用胺偶合化學試劑(EDC：NHS)將人類IL-17分子以共價方式固定至CM5感測器晶片之流動槽2-4上。在固定後，使用1M乙醇胺阻斷流動槽上之剩餘活性位點。將人類IL-17A、IL-17A/F及IL-17F(ZymoGenetics,A Bristol-Myers Squibb公司，Seattle,WA,USA)分別固定於流動槽2、3或4上。該等分子之固定濃度介於4500-5200RU之間。使用流動槽1作為參考表面。隨後將雙特異性抗體稀釋至25μg/mL或50μg/mL，使其在表面上流動，且捕獲於感測器晶片之流動槽2-4上。在捕獲雙特異性抗體後，將IL-23/IL-12B雜二聚體(ZymoGenetics,A Bristol-Myers Squibb公司，Seattle,WA,USA)稀釋至500nM且使其在表面上流動以顯示共結合。以10μL/min之流速、10分鐘之締合時間及5分鐘之離解時間實施結合研究。
對於第二定向中之共結合實驗而言，使用胺偶合化學試劑 (EDC：NHS)將小鼠抗人類IL-12(p40/p70)單株抗體(BD Pharmingen,San Jose,CA)以共價方式固定於CM5感測器晶片之流動槽1-4上。在固定後，使用1M乙醇胺阻斷流動槽上之剩餘活性位點。將人類IL-23/IL-12B雜二聚體(ZymoGenetics,A Bristol-Myers Squibb公司，Seattle,WA,USA)稀釋至500nM且經由IL-12B亞單位捕獲於流動槽1-4上。IL-23/IL-12B之捕獲濃度大約為4000RU。隨後將雙特異性抗體稀釋至25μg/mL或50μg/mL，使其在表面上流動，且經由人類IL-23亞單位捕獲於感測器晶片之流動槽2-4上。使用流動槽1作為參考表面。在捕獲雙特異性抗體後，將人類IL-17A、IL-17A/F及IL-17F(ZymoGenetics,A Bristol-Myers Squibb公司，Seattle,WA,USA)稀釋至500nM且使其在表面上流動以顯示共結合。以10μL/min之流速、10分鐘之締合時間及5分鐘之離解時間實施結合研究。
在25℃下於10mM HEPES、500mM NaCl、3mM EDTA、0.05%表面活性劑P20(GE Healthcare)、1mg/mL牛血清白蛋白之緩衝液(pH 7.4)中實施所有結合實驗。在各循環之間，使用20mM鹽酸洗滌流動槽以再生表面。此洗滌步驟自晶片表面去除所捕獲測試抗體及任一結合抗原。使用BIACORE® T100評估軟體(2.0版)編譯數據。藉由扣除參考流動槽及空白注射來處理數據。評價基線穩定性以確保再生步驟在整個注射序列中提供一致結合表面。
經由表面電漿共振(Biacore)測定之IL-17A/F及IL-23與抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體之同時共結合結果
所測試雙特異性抗體包含23/17bAb1(SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：17)、23/17bAb2(SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：17)、23/17bAb3(SEQ ID NO：74及SEQ ID NO：17)、23/17bAb4(SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：17)及23/17taFab1(SEQ ID NO：76及SEQ ID NO：78)。所有雙特異性抗體皆能夠同時共結合人類IL-23及人類IL-17A/F，從而顯示雙 特異性抗體之兩個臂皆具有功能性。
經由表面電漿共振(Biacore)顯示抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體之IL-17A/F特異性結合
經由表面電漿共振評估抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體對人類IL-17B、人類IL-17C、人類IL-17D及人類IL-17E(ZymoGenetics,A Bristol-Myers Squibb公司，Seattle,WA,USA)之交叉反應性之缺乏。
在BIACORE® T100(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上實施結合研究。使用BIACORE® T100控制軟體v 2.0對該等方法進行程式化。使用胺偶合化學試劑(EDC：NHS)將山羊抗人類IgG Fc-γ特異性抗體(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)以共價方式固定至CM4感測器晶片之流動槽1-3上。隨後以大約150RU之密度將經純化雙特異性抗體捕獲於感測器晶片之流動槽2或流動槽3上。使用流動槽1作為參考表面。
以500nM、100nM、20nM及4nM之濃度將人類IL-17B、IL-17C、IL-17D及IL-17E(ZymoGenetics,A Bristol-Myers Squibb公司，Seattle,WA,USA)注射於所捕獲抗體表面(流動槽2)及參考流動槽(流動槽1)上。作為此組實驗之陽性對照，以100nM、20nM、4nM及0.8nM之濃度注射人類IL-23(ZymoGenetics,A Bristol-Myers Squibb公司，Seattle,WA,USA)。以50μL/min之流速、5分鐘之締合時間及5分鐘之離解時間實施結合研究。在25℃下於10mM HEPES、500mM NaCl、3mM EDTA、0.05%表面活性劑P20(GE Healthcare)、1mg/mL牛血清白蛋白之緩衝液(pH 7.4)中實施所有結合實驗。在各循環之間，使用20mM鹽酸洗滌流動槽以再生表面。此洗滌步驟自晶片表面去除所捕獲測試抗體及任一結合抗原。使用BIACORE® T100評估軟體(2.0版)編譯數據。藉由扣除參考流動槽及空白注射來處理數據。評價基線穩定性以確保再生步驟在整個注射序列中提供一致結合表面。
經由表面電漿共振(Biacore)顯示抗人類IL-23/IL-17A/F雙特異性抗體之IL-17A/F特異性結合結果
據觀察人類IL-17B、IL-17C、IL-17D或IL17E與雙特異性抗體並不結合。所測試雙特異性抗體包含23/17bAb1(SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：17)、23/17bAb2(SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：17)、23/17bAb3(SEQ ID NO：74及SEQ ID NO：17)、23/17bAb4(SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：17)。與之相比，IL-23陽性對照顯示與先前研究一致之劑量依賴性結合。
實例4 抗人類IL-23/17A/F bAb防止小鼠中鼠類KC(CXCL1)之血清濃度之人類IL-17A、IL-17F及IL-17AF調介之增加
IL-17A、IL-17F及IL-17AF能夠誘導產生許多下游因子，該等下游因子繼而在宿主防禦中發揮一定作用且亦有助於疾病病理學，尤其在以異常高濃度或在慢性病狀下產生時。該等下游調介物之一係CXCL1(亦稱為GRO-α(在人類中)或KC(在小鼠中))，其係具有重要嗜中性球化學吸引劑活性且在發炎中發揮一定作用之趨化因子。評估抗人類IL23/17A/F雙特異性抗體(bAb)減小小鼠中GRO-α之IL-17A、IL-17F及IL-17AF調介之增加之能力，從而展示bAb可在活體內環境中有效抵抗IL-17誘導之活性且由此bAb可用於治療IL-17A、IL-17F或IL-17AF發揮一定作用之人類疾病。然而，因該等bAb並不與小鼠IL-17A、IL-17F或IL-17AF發生交叉反應，故需要將人類(h)IL-17A、IL-17F或IL-17AF遞送至小鼠以誘導產生GRO-α(或在小鼠之情形下，誘導產生KC，其係GRO-α之鼠類類似物),GRO-α然後可在抗人類IL23/17A/F bAb存在下發生中和。
對於該等實驗而言，使用雌性BALB/c小鼠(7-9wk齡)。在18小時時，使小鼠接受腹膜腔內(i.p.)注射之媒劑(PBS)或抗人類IL- 23/17A/F bAb中之一者之劑量(如表14及15中左手側欄中所展示)。在時間0時，使其接受皮下(s.c.)注射之下列重組人類蛋白中之一者：0.175mg/kg hIL-17A、0.9mg/kg hIL-17F或0.5mg/kg hIL-17AF。使對照小鼠接受皮下注射之媒劑(PBS)代替hIL-17蛋白中之一者。兩小時後，經由眼窩後竇在異氟烷氣體麻醉下對小鼠進行抽血，在離心血液後收集血清，且然後將血清儲存於80℃下直至使用商業ELISA根據製造商說明書(Quantikine小鼠CXCL1/KC免疫分析，R&D Systems公司，Minneapolis,MN)分析血清KC濃度為止。
如表14及15中所展示，使用bAb治療之小鼠展示hIL-17A、hIL-17F或hIL-17AF調介之血清KC(CXCL1)濃度之抑制發生劑量依賴性增加，從而指示bAb可有效減小藉由該等IL-17配體調介之活性。CXCL1僅係因應於IL-17A、IL-17F或IL-17AF之一個生物讀取物實例；存在許多其他亦在IL-17A、IL-17F或IL-17AF發揮一定作用之疾病中發揮一定作用且可用作終點量測之重要下游讀取物。
實例5 抗人類IL-23/17A/F bAb防止小鼠中小鼠IL-17AF及IL-17F之血清濃度之人類IL-23調介之增加
IL-23能夠誘導Th17細胞之分化，Th17細胞繼而可使得產生IL-17A、IL-17F及IL-17AF。該等細胞因子與諸多疾病有關且可抑制IL-23及IL-17A、IL-17F及IL-17AF之治療劑可有效治療該等疾病。評估 抗人類IL23/17A/F雙特異性抗體(bAb)減小小鼠中IL-17A、IL-17F及IL-17AF之IL-23調介之增加之能力，從而展示bAb可在活體內環境中有效抵抗IL-23誘導之活性且由此bAb可用於治療IL-23及Th17細胞發揮一定作用之人類疾病。然而，因該等bAb並不與小鼠IL-23發生交叉反應，故需要將人類(h)IL-23遞送至小鼠以誘導產生小鼠IL-17F及IL-17AF，小鼠IL-17F及IL-17AF然後可在抗人類IL23/17A/F bAb存在下發生中和。小鼠IL-17A之濃度過低以致不能精確量測小鼠血清，但該等趨勢預計與針對血清IL-17F及IL-17AF所觀察之趨勢類似。
對於該等實驗而言，使用雌性C57BL/6小鼠(7-9wk齡)。在第1天10：30，使其各自經由腹膜腔內(i.p.)注射接受5微克小鼠(m)IL-2。在第2天8：30am，使小鼠接受腹膜腔內注射之媒劑(PBS)或抗人類IL-23/17A/F bAb中之一者之劑量(如表16左手側欄中所展示)。在第2天11 am，使小鼠各自接受5微克mIL-2及10微克hIL-23，且在第2天5：20 pm，使小鼠經由腹膜腔內注射接受10微克mIL-2及hIL-23中之每一者。在第3天9：30 am，使每一小鼠藉由腹膜腔內注射再接受5微克mIL-2及10微克hIL-23。在第3天4：30 pm，經由眼窩後竇在異氟烷氣體麻醉下對小鼠進行抽血，在離心血液後收集血清，且將血清儲存於-80℃下直至使用特異性量測小鼠IL-17F及IL-17AF之ELISA及luminex分析來分析該等組份之血清濃度為止。
如表16中所展示，使用bAb治療之小鼠展示小鼠IL-17F或IL-AF之hIL-23誘導之血清濃度抑制發生劑量依賴性增加，從而指示bAb可有效減小藉由hIL-23調介之活性。
實例6 VCVFc雙特異性抗體 哺乳動物VCVFc雙特異性分子之構築及表現
在GenScript(GenScript,Piscataway,NJ,USA)處合成完整基因且經由限制性酶選殖插入pTT5(HEK293-6E瞬時表現載體，NCR Biotechnology Research Institute,Ottawa,ON,CAN)中。使用mod2610(SEQ ID NO：30)信號序列表現大部分構築體。VCVFc係雙特異性抗體，其含有具有經由連接體(例如但不限於10mer G4S(對於任一鏈而言)或RTVAAPS(SEQ ID NO：85)(對於輕鏈而言)及SSASTKGPS(SEQ ID NO：86)(對於重鏈而言))插入Fab區與鉸鏈間之雙特異性抗體之第二臂之Fv單元的全抗體。VCVFc雙特異性抗體之圖解說明展示於圖5中。
利用表現構築體使用聚乙烯亞胺試劑轉染HEK293-6E懸浮細胞且 在F17培養基(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)中培養並添加5mM L-麩醯胺酸及25μg/mL G418。在24小時之後，添加1/40體積之20%胰蛋白腖NI(Organotechnie SAS,La Courneuve,FR)。在轉染後大約120小時時，收穫條件培養基且通過0.2μm過濾器。使用Mab Select SuRe親和層析(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)與SUPERDEX® 200尺寸排除層析(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)之組合自經過濾條件培養基純化蛋白質。藉由UV-A280nm下之吸光度來估計含量且藉由分析型尺寸排除高效液相層析、SDS PAGE及西方墨點法來評估品質。
IL-23/IL-17A/F VCVFc雙特異性抗體生物分析活性；藉由NF-κB誘導量測人類IL-17A、IL-17A/F及IL-17F活性之NIH/3T3/KZ170 NF-κB螢光素酶報告基因分析
如上文實例1中所闡述來實施生物分析。
IL-23/IL-17A/F VCVFc雙特異性抗體生物分析活性；藉由磷酸-STAT3誘導量測人類IL-23活性之Baf3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1轉染子磷酸-STAT3分析
如上文實例3中所闡述來實施生物分析。
PDGF-C/PDGF-D VCVFc雙特異性抗體生物分析活性；量測人類PDGF-C及PDGF-D促有絲分裂活性之正常人類肺纖維母細胞(NHLF)增殖分析
將初代正常人類肺纖維母細胞系(NHLF,CC-2512,Lonza,Walkersville,MD)以1,000個細胞/孔接種於生長培養基(FGM-2 BulletKit,Lonza,Walkersville,MD)中且在37℃、5% CO2下培養過夜。次日，去除培養基且在分析培養基(FBM以及0.1% BSA，Lonza,Walkersville,MD)中製備重組人類PDGF-C及PDGF-D(ZymoGenetics)之連續稀釋液，且添加至含有細胞之板中並在37℃、5% CO2下一起培養48小時。另外，使用該分析量測PDGF-C及PDGF-D活性之中和。 將次最大濃度之PDGF-C或PDGF-D與抗人類PDGF-C/D或本文所闡述抗人類PDGFRα/β VCVFc抗體之連續稀釋液在分析培養基中合併，且添加至含有細胞之板中並在37℃、5% CO2下一起培養48小時。使用1μCi/孔之胸苷[甲基-3H](PerkinElmer,Waltham,MA)對細胞實施脈衝且在37℃、5% CO2下再培養24小時。在培養後，藉由量測所納入3H-胸苷之量來評價促有絲分裂活性。去除培養基且在37℃下對細胞實施胰蛋白酶化10分鐘，然後收穫於FilterMate收穫器(Packard Instrument公司，Meriden,CT)上且根據製造說明書在TOPCOUNT®微板閃爍計數器(Packard Instrument公司，Meriden,CT)上進行讀取。3H-胸苷納入之增加指示PDGF-C或PDGF-D受體-配體相互作用。3H-胸苷納入之降低指示PDGF-C或PDGF-D受體-配體相互作用之中和。使用GraphPad Prism 4軟體(GraphPad Software公司，San Diego CA)計算每一PDGF-C/PDGF-D或PDGFRα/PDGFRβ VCVFc雙特異性抗體之IC50(50%抑制濃度)值。
IL-23/IL-17A/F VCVFc雙特異性抗體生物分析活性；NIH/3T3/KZ170 NF-κB螢光素酶報告基因分析及Baf3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1轉染子磷酸-STAT3分析結果
人類IL-17A、IL-17A/F及IL-17F以劑量依賴性方式誘導NF-κB螢光素酶報告基因發生活化且經測定EC50濃度為0.15nM(對於IL-17A而言)、0.5nM(對於IL-17A/F而言)及0.5nM(對於IL-17F而言)，且IL-23以劑量依賴性方式誘導STAT3磷酸化且經測定EC50濃度為0.02nM。抗人類IL-23/IL-17A/F VCVFc雙特異性抗體之IC50數據展示於下表17、18及19中。
IL-23/17A/F VCVFc雙特異性抗體表
表17
PDGF-C/PDGF-D及PDGFRα/PDGFβ VCVFc雙特異性抗體生物分析活性；正常人類肺纖維母細胞(NHLF)增殖分析結果
PDGF-C及PDGF-D誘導NHLF細胞以劑量依賴性方式發生增殖且經測定次最大濃度為0.1nM(對於PDGF-C而言)及6nM(對於PDGF-D而 言)。表20及表21呈現本文所闡述PDGF-C/PDGF-D或PDGFRα/PDGFRβ VCVFc雙特異性抗體之IC50數據。
PDGF-C/PDGF-D VCVFc雙特異性抗體表
IL-23/IL-17A/F VCVFc雙特異性抗體生物分析活性；藉由IL-6誘導量測人類IL-17A、IL-17A/F及IL-17F活性之初代人類纖維母細胞分析
如上文實例3中所闡述來實施生物分析。
IL-23/IL-17A/F VCVFc雙特異性抗體生物分析活性；初代人類纖維母 細胞分析結果
人類IL-17A、IL-17A/F及IL-17F以劑量依賴性方式誘導人類IL-6產生且經測定EC50濃度為0.08nM(對於IL-17A而言)、25nM(對於IL-17A/F而言)及25nM(對於IL-17F而言)。抗人類IL-23/IL-17A/F VCVFc雙特異性抗體23/17VCV2(SEQ ID NO：91及SEQ ID NO：93)。表22呈現本文所闡述IL-23/IL-17A/F VCVFc雙特異性抗體之實例性IC50數據。
IL-23/IL-17A/F VCVFc雙特異性抗體共結合活性；初代人類纖維母細胞分析，用以量測同時結合至人類IL-23下對人類IL-17A、IL-7A/F或IL-F之抑制。初代人類T細胞磷酸-STAT3分析，用以量測同時結合至人類IL-17A、IL-7A/F或IL-17F下對人類IL-23之抑制。
在過量IL-23存在下在30nM下運行初代人類纖維母細胞分析。在過量IL-17A、IL-17A/F及IL-17F存在下在30nM下運行初代人類T細胞磷酸-STAT3分析。
IL-23/IL-17A/F VCVFc雙特異性抗體生物分析共結合結果
在人類IL-23存在下檢驗雙特異性抗體23/17VCV2(SEQ ID NO：91及SEQ ID NO：93)時，並不幹擾對人類IL-17A、IL-17A/F、IL-17F之抑制。在人類IL-17A、IL-17A/F、IL-17F存在下檢驗雙特異性抗體23/17VCV2時，並不幹擾對人類IL-23之抑制。
經由表面電漿共振(Biacore)量測IL-23/IL-17A/F VCVFc雙特異性抗體對人類IL-17A、IL-17A/F、IL-17F及人類IL-23之結合親和力
如上文實例3中所闡述來測定結合活性。
IL-23/IL-17A/F VCVFc雙特異性抗體Biacore活性
與人類IL-17A、IL-17A/F及IL-17F之結合實驗之結果分別展示於表23、24及25中。與人類IL-23/IL-12B雜二聚體之結合實驗之結果展示於表26中。
IL-23/IL-17A/F VCVFc雙特異性抗體對IL-17A之結合親和力
IL-23/IL-17A/F VCVFc雙特異性抗體對IL-17A/F之結合親和力
IL-23/IL-17A/F VCVFc雙特異性抗體對IL-17F之結合親和力
IL-23/IL-17A/F VCVFc雙特異性抗體對IL23/IL-12B之結合親和力
經由表面電漿共振(Biacore)測定之IL-17A/F及IL-23與IL-23/IL-17A/F VCVFc雙特異性抗體之同時共結合
如上文實例3中所闡述來實施此分析。
經由表面電漿共振(Biacore)測定之IL-17A/F及IL-23與IL-23/IL-17A/F VCVFc雙特異性抗體之同時共結合結果
雙特異性抗體23/17VCV2(SEQ ID NO：91及SEQ ID NO：93)能夠同時共結合人類IL-23及人類IL-17A/F，從而顯示雙特異性抗體之兩個臂皆具有功能性。
實例7 IL-23p19表位定位
此實例7中所闡述之分析旨在鑑別IL-23p19上IL-23p19抗體(7B7抗體或Mab、7B7 Fab及biAb3，其皆具有如SEQ ID NO：7中所展示之重鏈可變結構域及如SEQ ID NO：9中所展示之輕鏈可變結構域)所結合之表位殘基。Fab 7B7、7B7抗體及biAb3皆用於結合研究中之各個階段，此乃因就IL-23p19上之表位而言其可互換。
表位上之蛋白質分解消化法及肽數據
IL-23p19抗體之質譜表位序列分析係基於表位提取及表位切除方 法。(Parker等人，「MALDI/MS-based epitope mapping of antigens bound to immobilized antibodies」,Mol.Biotechnol.,20(1)：49-62(2002年1月))。在兩種情形下，將IL-23p19抗體以2mg mAb/1 ml床體積之平均密度經由抗體之一級胺直接固定於表面活化之珠粒上。在使用或不使用還原及烷基化下生成來自IL-23 his標籤抗原之肽。藉由與50mM二硫蘇糖醇在37℃下於PBS及4M鹽酸胍一起培養1小時來還原抗原IL-23。隨後使用100mM碘乙醯胺在室溫下經30分鐘實施烷基化。藉由PBS將經還原及烷基化之IL-23透析過夜，然後實施分段。對於表位提取而言，藉由使用內蛋白酶胰蛋白酶、糜蛋白酶、lys-C、arg-C、asp-N及或glu-C以最高2%之酶對抗原比率(w/w)進行蛋白質分解消化法來生成抗原肽。在37℃下實施培養且培養時間介於2小時至過夜之間。將所得肽與抗體樹脂在室溫下混合30分鐘。然後將此樹脂洗滌三次以去除任何非特異性結合肽。消化、培養及洗滌步驟皆係在PBS(pH 7)中實施。表位切除遵循相同方案，只是在酶消化之前將完整抗原與抗體在室溫下一起培養30分鐘。在兩種方法中，洗脫結合抗體之肽且在ESI-MS上分析。
該等數據指示，IL-23p19抗體具有包括IL-23p19中之三個肽區之不連續表位。生成合成肽以進一步檢驗該三個肽區，且藉由ELISA及質譜測試其結合並予以分析。基於該等觀察，其表明下列肽代表IL-23p19抗體表位之序列：
肽1：WQRLLLRFKILR(SEQ ID NO：6之殘基156-167)
肽2：SAHPLVGHMDLR(SEQ ID NO：6之殘基46-57)
肽3：IHQGLIFYEKLLGSDIFTGEPSLLP(SEQ ID NO：6之殘基93-117)。
藉由HDX-MS實施IL-23表位定位
氫/氘交換質譜(HDX-MS)方法藉由監測主鏈醯胺氫原子之氘交換 速率及程度來探測溶液中之蛋白質構形及構形動力學。HDX程度取決於主鏈醯胺氫原子之溶劑可及性及蛋白質構形。可藉由MS精確量測蛋白質關於HDX之質量增加。在將此技術與酶消化配對時，可解析肽層面上之結構特徵，從而使得能夠區分表面暴露肽與彼等摺疊於內部者。通常，實施氘標記及隨後之猝滅實驗，隨後實施在線胃蛋白酶消化、肽分離及MS分析。在藉由HDX-MS對IL-23中之BMS-986113實施表位定位之前，實施非氘化實驗以生成一系列關於IL-23(4.4mg/mL)及IL-23/BMS-986113(1：1莫耳比率，4.4mg/mL及3.36mg/mL)之常用胃酶解肽，從而達成對於IL-23之97%之序列覆蓋率。在此實驗中，在標記步驟期間使用10mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)，隨後添加猝滅緩衝液(含有1.5M GdnCl及0.5M TCEP之200mM磷酸鹽緩衝液，pH 2.5，1：1 v/v)。對於表位定位實驗而言，將5μL每一試樣(IL-23或IL-23/BMS-986113(1：1莫耳比率))與65μL HDX標記緩衝液(存於D2O中之10mM磷酸鹽緩衝液，pD 7.0)混合以在室溫下(約25℃)開始標記反應。在不同時間段：20sec、1min、10min、60min及240min實施反應。在每一標記反應時段結束時，藉由添加猝滅緩衝液(1：1,v/v)來猝滅反應且將猝滅試樣注射至Waters HDX-MS系統中用於分析。在不存在/存在BMS-986113下，監測所觀察常見胃酶解肽之氘攝取量。遵循相同方案以藉由HDX-MS對IL-23中之抗IL-23 7B7 Fab(4.91mg/mL)實施表位定位。
抗IL-23 7B7 Fab與IL-23之複合物及biAb3與IL-23之複合物中之表位定位指示，biAb3具有包括IL-23p19中之5個肽區之不連續表位。基於相對氘攝取量，5個肽區可分級如下：1區>2區>3區>4區>5區，其中1區之氘攝取具有最大顯著變化且5區之氘攝取具有最小顯著變化。藉由HDX-MS針對IL-23p19抗體測定之IL-23p19上之5個肽區確定如下： 1區：PDSPVGQL(SEQ ID NO：6之殘基117-124)；2區：IFTGEPSLL(SEQ ID NO：6之殘基108-116)；3區：KILRSLQAF(SEQ ID NO：6之殘基164-172)；4區：QQLSQKLCTLAWSAHPLVGHMD(SEQ ID NO：6之殘基34-55)；及5區：CLQRIHQGLIFYEKLLG(SEQ ID NO：6之殘基89-105)。
丙胺酸切削突變體之計算表位預測及設計
丙胺酸切削突變誘發係用於使相同丙胺酸構築體中之多個殘基發生突變以去除結合表位中之胺基酸側鏈之策略(Wells,J.A.,「Systemic mutational analyses of protein-protein interfaces」,Enzym.,202：390-411(1991))。組合關於潛在表位中之殘基與7B7 Fab及biAb3之關聯之資訊之多個來源以產生區域性丙胺酸切削突變體的靶定列表。將含於HDX(參見此實例7之上文)及蛋白質分解消化法肽定位(參見此實例7之上文)間之重疊區中之殘基定位於IL-23p19結構域之序列上，且將常用殘基之三個線性區確定為A區、B區及C區。A區對應於SEQ ID NO：6之胺基酸殘基33-59。B區對應於SEQ ID NO：6之胺基酸殘基89-125。C區對應於SEQ ID NO：6之胺基酸殘基144-173。為計算暴露側鏈(溶劑可及表面積，SASA)且由此位於IL-23之p19結構域之蛋白質表面上之殘基，使用IL-23雜二聚體之自身結構。對於IL-23之p19結構域中之每一殘基而言，計算可及表面與關於胺基酸類型之標準暴露表面之比率且將殘基分組成箱。如下所述將殘基置於可及性箱中：<30%、30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、>90%暴露。在延長三肽Gly-X-Gly中計算用於每一胺基酸類型之標準殘基可及性。所實施之第二計算係ODA(最佳對接區域)，其可用於預測可能之蛋白質-蛋白質相互作用表面。該方法鑑別具有最低對接去溶劑化能量之最佳面片。計算關於IL-23之p19結構域之ODA且使用該等結果優 先化用於突變誘發之殘基。
基於ODA及SASA計算中之高評分來優先化該三個區(A、B、C)中之殘基，且亦基於相對於非複合IL-23之氫-氘交換程度來測重(1號肽>2號肽>3號肽>4號肽>5號肽)。將與小鼠不一致之區選殖為小鼠互換突變體而非丙胺酸切削突變體，小鼠互換突變體在小規模測試中對於結合並不展示影響。除在延長環中含有殘基線性序列之M7外，然後基於定位至IL-23之X射線結晶學結構來將殘基組合至非線性表位中(M5、M6、M8)。使用主要係線性之殘基之亞表位生成其他備用突變體(M9、M10、M11)。藉由此方法設計之丙胺酸切削突變體展示於下表27中。
IL-23表位定位丙胺酸突變體之選殖、表現及純化
藉由PCR生成未加貼標籤野生型IL-23 p40亞單位進入載體構築體且藉由測序證實PCR片段之保真度。藉由Gateway LR重組生成瞬時表現構築體且證實序列。藉由PCR生成加貼His標籤之野生型IL-23 p19亞單位構築體及所有突變體構築體且直接選殖至瞬時表現載體中。藉由測序證實所有PCR片段之保真度。為生成野生型對照，將未加貼標籤野生型IL-23 P40亞單位與加貼His標籤之野生型P19亞單位瞬時性共表現於4 L規模之HEK293-6E細胞中以用於IL-23複合物純化。簡言 之，使用0.5(p19)/0.5(p40)/1.5(PEI)比率之表現質粒/PEI複合物轉染1×106個細胞/ml之HEK293-6E細胞。24小時後添加胰蛋白腖N1進料且在轉染後120小時時收穫細胞。使用0.2μM過濾器過濾條件培養基。遵循上述相同轉染方案，使用30ml規模之未加貼標籤野生型IL-23 p40亞單位共轉染7種加貼His標籤之IL-23 p19突變體構築體。將條件培養基轉移用於分析且藉由抗His西方墨點法證實所有突變體之表現。基於初步結合結果，選擇突變體M5、M7、M9及M10且使用相同轉染方案以2L規模按比例放大。亦以2L將野生型按比例放大。收穫在2升HEK細胞中按比例放大之野生型及IL-23突變體，且濃縮上清液並藉由使用10kDa膜之切向流過濾將緩衝液交換為PBS。然後藉由固定鎳親和層析純化蛋白質。使用40mM咪唑洗脫野生型且然後藉由脫鹽凝膠過濾層析將緩衝液交換為PBS(5.6mM Na2HPO4、1.1mM KH2PO4、154mM NaCl，pH 7.4)。藉由SDS-PAG測得野生型之純度為>95%。使用40mM咪唑洗滌突變體，隨後使用500mM咪唑洗脫。然後藉由透析將洗脫池緩衝液交換為PBS(7mM Na2HPO4、3mM NaH2PO4、130mM NaCl，pH 7.1)。藉由SDS-PAG測得突變體之純度為>95%。藉由基因合成生成藉由丙胺酸切削突變誘發鑑別之主要殘基處加貼his標籤之IL-23p19之單一丙胺酸突變體且然後選殖至瞬時轉染載體中。表現及純化類似於丙胺酸切削突變體，只是親和純化之M35A除外。
IL-23突變體與IL-23p19抗體之Biacore結合分析
藉由表面電漿共振(SPR,Biacore)在BIACORE® T100上於PBST(7mM Na2HPO4、3mM NaH2PO4、130mM NaCl、0.05% Tween 20，pH 7.4)於25℃下量測所有七(7)種丙胺酸突變體(參見表27)之30mL小規模表現之結合。藉由以2000RU固定於CM5感測器晶片上之蛋白質A以約60RU之濃度捕獲相關抗體及受體。除biAb3以外，使用Merck's IL- 23 p19 mAb(7G10)及STELARA®(IL-12/IL-23 p40 mAb)作為用於結構域結合之對照。此外，使用IL-23之商業受體作為對照：hIL-23R-Fc及hIL-12Rβ1-Fc(皆來自R&D Systems)。將上清液以1：5稀釋至PBST中且經3分鐘以30μL/min注射至mAb或受體表面，且在離解時間之後，使用10mM甘胺酸(pH 2.0)再生。在分析之前自所有特異性結合曲線扣除未捕獲任何抗體之蛋白質A之參考表面的結合。圖9中所展示之結果展示在注射結束之前10秒具有反應。
Biacore結果顯示，IL-23丙胺酸切削突變體維持與p40特異性抗體及p19特異性IL-23受體之結合(只是潛在闡述受體結合位點之M8除外)。亦實施另一IL-23p19 mAb與IL-12Rβ1-Fc之結合且與圖9之結果一致。M5突變體展示明顯損失7B7 Mab結合，而M9及M10展示部分損失7B7 Mab結合(參見圖10)。M7對於抗體或對照之結合並不展示任何影響。因此，選擇該4種突變體用於按比例放大及純化，其中三種突變體失去與23p19抗體(7B7抗體或Mab、7B7 Fab及biAb3，其皆具有如SEQ ID NO：7中所展示之重鏈可變結構域及如SEQ ID NO：9中所展示之輕鏈可變結構域)之結合且M7係作為對照。
經純化突變體之Biacore分析使用與上清液相同之分析形式，只是將野生型及突變體IL-23稀釋至25nM且以1：2連續滴定至1.5nM。使用經純化IL-23突變體獲得之所有結果證實了使用表現上清液獲得之數據。將數據擬合至1：1 Langmuir結合模型以測定圖10及表28中所展示之Kd值。使用BIAsimulation軟體2.1且使用自M9及M10之動力學分析測得之平均Rmax，模擬針對M5與IL-23p19抗體(7B7抗體或Mab、7B7 Fab及biAb3，其皆具有如SEQ ID NO：7中所展示之重鏈可變結構域及如SEQ ID NO：9中所展示之輕鏈可變結構域)之結合所觀察之1-2RU之扣除參考之結合。經估計親和力為330μM，其中Kd為野生型之1/1500，如表28中所展示。
實施單一丙胺酸突變體之Biacore分析以證實藉由M5、M9及M10丙胺酸切削突變體顯示之非線性表位。三個線性區A、B及C中之大部分單一丙胺酸突變體展示對7B7 mAb或biAb3之結合並無變化。14種所測試IL-23單一丙胺酸突變體中僅三種展示結合親和力之顯著降低大於1千卡/莫耳。丙胺酸切削突變體M5、M9及M10之間重疊之主要殘基之親和力及△△G值展示於表29中，且顯示線性區B中之一種主要殘基及線性區A中之兩種殘基主要有助於IL-23p19抗體-IL-23複合物之結合能量。
BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1轉染子中之IL-23誘導之STAT3磷酸化
使用人類IL-23Rα及人類IL-12Rβ1全長受體穩定轉染鼠類骨髓源細胞系(BaF3)並進行選殖。藉由ELISA監測關於IL-23丙胺酸切削突變體之STAT3磷酸化之IL-23誘導。使用分析培養基將BaF3/huIL-23Rα./huIL-12Rβ1(純系6)細胞洗滌三次，然後以50,000個細胞/孔平鋪於96孔圓底組織培養板中。BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1細胞以劑量依賴性方式藉由STAT3磷酸化對IL-23發生反應。為評價IL-23信號傳導之抗體抑制，將EC50濃度之20pM IL-23與每一抗體之三倍連續稀釋液(自33nM至0.56pM)預混合，且在37℃下於分析培養基中培養15分鐘，然後添加至細胞中。在預培養後，一式兩份將治療劑添加至含有 細胞之板中且在37℃下培養15分鐘以刺激STAT3之磷酸化。藉由添加冰冷洗滌緩衝液來終止刺激且根據製造商說明書(Bio-Rad實驗室細胞裂解套組，目錄編號：171-304012)裂解細胞。藉由ELISA(Bio-Rad實驗室磷酸-STAT3(Tyr705)套組，目錄編號：171-V22552)根據製造商說明書測定磷酸化STAT3含量。分析數據且使用GraphPad Prism 4軟體計算IC50值。所有IL-23丙胺酸切削突變體及所有IL-23丙胺酸單一突變體皆係活性突變體且與IL-23(未加貼標籤及加貼標籤)在誘導BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1轉染子中之pSTAT3活性方面同等有效(表30)。biAb3、TELARA®(IL-12/IL-23 p40 mAb)及Merck's IL-23p19抗體(7G10)抑制IL-23丙胺酸切削突變體誘導之pSTAT3之結果展示於表31中。在BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1轉染子中，biAb3以同等功效中和wt IL-23及IL-23 M7丙胺酸切削突變體之生物活性，以減小功效中和M9及M10之生物活性，且並不中和M5之生物活性。STELARA® IL-12 p40 mAb以同等功效中和BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1轉染子中wt IL-23及所有IL-23丙胺酸切削突變體之生物活性。在BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1轉染子中，陽性對照Merck IL-23 p19 mAb(7G10)以同等功效中和wt IL-23、M7、M9及M10丙胺酸切削突變體之生物活性且並不中和M5之生物活性。
構築單一IL-23p19突變(H53A、M54A及D55A)，且測定7B7、STELARA®(IL-12/IL-23p40 mAb)及Merck's IL-23p19抗體(7G10)(表31)抑制單一IL-23p19突變多肽誘導BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1轉染子中之pSTAT3之IC50值。在BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1轉染子中，與wt IL-23相比，7B7 mAb以同等功效中和IL-23丙胺酸單一突變體H53A、E112A及D118A之生物活性，以顯著減小功效中和M54A及D55A突變體之生物活性，且並不中和L116A突變體之生物活性(表31)。在BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1轉染子中，與wt IL-23相比，STELARA® IL-12 p40 mAb以同等功效中和所有IL-23丙胺酸單一突變體之生物活性。在BaF3/huIL-23Rα/huIL-12Rβ1轉染子中，與wt IL-23相比，Merck IL-23 p19 mAb以同等功效中和所有IL-23丙胺酸單一突變體之生物活性，只是其並不中和IL-23 E112A突變體。
綜合考慮所有該等結果，IL-23之7B7 mAb抑制需要胺基酸殘基M54、D55及L116，但無需胺基酸殘基H53、E112或D118。 STELARA®及Merck抗體能夠抑制IL-23丙胺酸單一突變體M54A、D55A及L116A且並無活性損失，從而表明關於IL-23M54、D55及L116丙胺酸突變體所看到之活性損失對7B7 mAb及biAb3具有特異性。
IL-23突變體及7B7 Fab複合物之寡聚態分析
為證實雜二聚體IL-23突變體之寡聚態及其與複合7B7 Fab之能力，藉由分析型尺寸排除層析(SEC-MALS)分離使用安裝有二極體陣列吸光度檢測器之AGILENT® 1100系列HPLC在Shodex Protein KW-803管柱上於含有200mM K2PO4(pH 6.8，含有HCl)、150mM NaCl及0.02%疊氮化鈉之緩衝液(0.1um過濾)中在0.5mL/min之流速下來研究該等蛋白質。將Wyatt Technology MINIDAWNTM TREOS®雷射散光儀器垂直置入HPLC下游，隨後置入Wyatt OPTILAB® T-REXTM差式折射計。在過濾之後，以10.3μM之濃度注射六十(60)μg每一IL-23試樣。為形成複合物，將60μg 7B7 Fab(6%莫耳過量)與IL-23蛋白(濃度為10.9μM)預混合且在室溫下一起培養3-6小時，然後實施層析分離。在注射之前使用旋轉過濾器(NANOSEP® MF，0.2μm，Pall公司)自蛋白質試樣去除微粒。使用ASTRA® 6(Wyatt)及Chemstation(Agilent)分析數據。類似於野生型，所有突變體大部分係單體突變體。M5突變體在與Fab預培養之後並不展示顯著複合物形成且以類似於單獨M5 IL-23洗脫之情形進行洗脫，從而顯示較少(若存在)複合物在此實驗之10μM濃度範圍中形成。M7發生複合且類似於野生型進行洗脫。M9及M10突變體在該等濃度下形成複合物，但質量略小於野生型且滯留時間略遲於野生型及M7，從而表明其對7B7之親和力弱於野生型及M7。14種單一丙胺酸突變體之SEC-MALS分析展示，所有突變體皆大部分係單體突變體(類似於野生型)，且僅L116A突變體展示延遲性洗脫時間及略微減小之預期複合物質量，從而表明IL-23對7B7 Fab之 親和力有所減小。該等結果與該等L116A之Kd之Biacore變化一致。在此分析之條件下，不能解析出D54A及M55A與Fab之複合物之較小親和力效應。
IL-23突變體之差示掃描熱量測定
藉由差示掃描熱量測定(DSC)使用MICROCAL® VP-毛細管DSC儀器量測野生型及突變體IL-23雜二聚體之熱穩定性特徵。以90o/hr自10-100℃掃描存於PBS(7mM Na2HPO4、3mM NaH2PO4、130mM NaCl，pH 7.1)中之0.7mg/ml蛋白質試樣，且對所得溫度記錄圖實施緩衝液空白扣除及擬合程序。每一分子之變性之特徵在於兩個伸展轉變且每一轉變之擬合轉變中點(Tm)值與野生型相差1-4℃。結果展示，相對於野生型，丙胺酸切削突變體以及14種單一丙胺酸突變體皆不展示顯著熱去穩定。
IL-23突變體之傅立葉變換紅外光譜(Fourier Transform Infrared Spectroscopy，FT-IR)分析
使用FT-IR光譜在具有CaF2窗口(路徑長度為約7μm)及Ne-He雷射(632.8nm)之Biotools Prota FT-IR儀器上實施IL-23之丙胺酸切削突變體及野生型之二級結構比較。以2cm-1之解析度收集數據且使用Prota/Bomem-GRAMS/31 AI軟體分析。重複量測每一試樣且方法變化度為約3%。使用醯胺I峰(因其具有結構敏感性)計算二級結構含量。在所有IL-23試樣中觀察到大致同等量之α-螺旋及β-片，如藉由1637cm-1處之峰(對於α-螺旋而言)及1637cm-1處之峰以及1687cm-1處之凸肩(對於β-片而言)所指示。總而言之，與野生型IL-23相比，觀察到在丙胺酸切削突變體中FT-IR光譜及所計算二級結構結果並無顯著差異。
IL-23突變體之圓二色性(CD)分析
使用Jasco J-815分光光度計且使用CD光譜實施IL-23之丙胺酸切 削突變體及野生型之二級結構比較。在0.25mg/mL IL-23蛋白質濃度下於PBS(pH7.1)中使用1mm路徑長度槽在25℃下自300-190nm以0.1nm之數據間隔、50nm/min掃描速度、1nm帶寬及2次累積來收集光譜。總而言之，與野生型IL-23相比，在使用圓二色性光譜時，觀察到在丙胺酸切削突變體中二級結構特徵並無顯著差異。
IL-23突變體之核磁共振(NMR)光譜分析
質子NMR係使得可在原子細節上評價構形狀態之高度敏感性技術。獲取4種突變體(M5、M7、M9、M10)及野生型IL23蛋白中之每一者之1D 1H NMR光譜。同時針對NMR緩衝液(存於8% D2O/92% H2O中之PBS)透析所有蛋白質以消除源自試樣製備之潛在差異。此外，藉由正規化至野生型光譜來校正之1H信號強度之蛋白質濃度差異。在32℃下於在600MHz下操作之Bruker Avance 3光譜儀上收集所有NMR數據。使用針對溶劑及賦形劑阻抑優化(使用Watergate、WET及Watergate翻轉選擇性激發脈衝方案)之標準bruker脈衝序列(ZG)獲取1D NMR光譜。對每一光譜之兩千零四十八(2048)個掃描實施信號平均化。在傅裏葉轉變之前應用餘弦平方變跡，且使用一階多項式基線校正來消除基線之出現。對於個別蛋白質之每一光譜之檢驗揭示，每一突變體蛋白皆適當摺疊，如藉由光譜之高電場(<0.5ppm)及低電場(>6.5ppM)區中之充分分散之共振所證實。高電場甲基共振指示完整疏水性核心之存在；低場醯胺質子反映了良式二級結構(α螺旋及β片)之存在。該光譜與野生型IL23光譜之比較指示極接近之匹配，從而排除了蛋白質結構中藉由胺基酸取代誘導之較大構形變化之存在。此外，NMR結果亦指示，在M5中不可能因在M5中之突變位點處之結構完整性發生極大破壞而具有額外活性損失。實際上，M5較M9更為接近野生型蛋白(藉由主要組份分析獲知)，此表明在M9中缺少之下列M5突變(亦即H53A、M54A及E112A)並不導致M5結構發生較大破壞。 亦觀察到，消除芳族殘基之突變體M7及M9似乎在主要組份分析中彼此最為類似。除D118A及M54A外，所有單一突變體似乎皆類似於野生型，然而其他對照顯示該等突變體維持類似於野生型之穩定性及活性。
IL-23表位分析之概述
已使用丙胺酸切削及單一突變誘發之方法來定位hIL-23之針對7B7 Fab、7B7抗體及biAb3中所含有之7B7 Fab之表位。使用藉由蛋白質分解消化法LCMS分析、肽結合、氫/氘交換質譜、溶劑可及表面積計算及對接算法計算生成之表位資訊來實施靶向突變誘發策略。所選經純化突變體之小規模篩選(藉由SPR)及按比例放大顯示7B7/biAb3與hIL-23之結合之特異性表位。M5突變體展示與7B7/biAb3之結合明顯降低，而維持類似於野生型之功能活性、與p40及p19特異性試劑之結合、單體寡聚態、熱穩定性及二級結構特徵。M5突變體展示與7B7/biAb3之結合明顯損失，而M9及M10(其各自含有兩個與M5相同之突變殘基)各自展示部分損失與7B7/biAb3之結合。M5 IL-23突變體對7B7/biAb3之親和力300nM，此大約為野生型IL-23之1/1,500，從而顯示M5突變體中之殘基界定了7B7/biAb3與IL-23之結合之表位。因此，數據表明7B7/biAb3抗體結合至IL-23之p19亞單位上之不連續表位。IL-23p19上之此不連續表位包括至少兩個表位區(A區(SEQ ID NO：6之胺基酸殘基33-59)及B區(SEQ ID NO：6之胺基酸殘基89-125))。具體而言，對於IL-23p19之第一表位或A區而言，SEQ ID NO：6之胺基酸殘基54(Met)及55(Asp)有助於產生大量使得7B7/biAb3能夠結合IL-23p19之結合能量。對於IL-23p19之第二表位或B區而言，胺基酸殘基116(Leu)係B區內在能量上有助於使得7B7/biAb3能夠結合IL-23p19之主要殘基。
實例8 狨猿EAE模型 背景及原理
多發性硬化(MS)係中樞神經系統(CNS)之慢性自體免疫性、發炎性、神經退化性疾病，其特徵在於在腦及脊髓中損失髓磷脂。儘管引發疾病之潛在機制尚未完全理解，但有助於多發性硬化之臨床進展之疾病過程係發炎、脫髓鞘及軸突損失或神經退化。巨噬細胞及小神經膠質細胞係CNS之主要免疫細胞。該等細胞以及T細胞、嗜中性球、星狀細胞及小神經膠質細胞可有助於(例如)多發性硬化之免疫相關性病況。另外，T細胞與若干髓磷脂蛋白(包含髓磷脂鹼蛋白(MBP)、蛋白脂質蛋白(PLP)、髓磷脂少突膠質細胞蛋白(MOG)及活性其他髓磷脂蛋白)之反應性/自體免疫性與多發性硬化之疾病狀態及病況之誘導及永存有關。自體反應性T細胞及髓磷脂蛋白之此相互作用可使得釋放促發炎性細胞因子(尤其包含TNF-α、IFN-γ及IL-17)。其他後果係使T細胞增殖、活化B細胞及巨噬細胞、上調趨化因子及黏附分子及破壞血腦障壁。後續病況係損失少突膠質細胞及軸突以及形成脫髓鞘「斑塊」。斑塊係由損傷組成，其中髓磷脂鞘此時不存在且脫髓鞘軸突嵌入神經膠質瘢痕組織內。脫髓鞘之發生原因亦可為自體抗體特異性識別髓磷脂抗原並加以調理且隨後發生補體及/或活化巨噬細胞調介之破壞。此軸突損失及神經退化可視為主要負責在進展性多發性硬化中所觀察之不可逆神經缺損。
根據疾病進展將多發性硬化(MS)分為4類。
(1)復發緩解型MS(RRMS)。RRMS之特徵在於復發(症狀發作)隨後緩解(恢復時段)。症狀可自輕度症狀至嚴重症狀有所變化，且復發及緩解可持續數天或數月。80%以上之MS患者始於復發緩解型循環。
(2)繼發進展型MS(SPMS)。SPMS通常發生於復發緩解型MS患 者中。在SPMS中，發生復發及部分恢復，但失能在循環之間並不消退。相反，其逐漸惡化直至失能之穩定進展代替發作循環為止。
(3)原發進展型MS(PPMS)。PPMS自其發作緩慢且穩定地進展。並無緩解時段且症狀強度通常並不降低。約15%之MS患者患有PPMS。
(4)進展復發型MS(PRMS)。在此相對稀有之MS類型中，患者在緩解時段期間經歷穩定惡化之症狀及發作。
梅奧診所(Mayo Clinic)(在網際網路上位於mayoclinic.org/multiple-sclerosis/types)。
關於人類多發性硬化之病程存在大量臨床及病理學異源性。大部分症狀通常始於18歲至50歲年齡期間，但可始於任一年齡。多發性硬化之臨床症狀可自輕度視覺障礙及頭疼至失明、嚴重共濟失調及癱瘓有所變化。大部分患者(大約70-75%)患有復發緩解型多發性硬化，其中疾病症狀可在大約數小時至數天內復發，隨後係極緩慢之恢復；在緩解階段期間通常不存在症狀。復發及緩解之發病率及頻率可變化較大，但隨著時間進展，恢復期可不完全且緩慢發生。將該等情形中之此疾病惡化歸類為繼發進展型多發性硬化，且發生於大約10-15%之多發性硬化患者中。另外10-15%之患者診斷有原發進展型多發性硬化，其中疾病症狀及體格缺損在整個疾病過程中以穩定速率進展。
IL-23及IL-17皆過度表現於患有多發性硬化之人類之中樞神經系統及經受多發性硬化之動物模型：實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)之小鼠中。在藉由髓磷脂少突膠質細胞糖蛋白(MOG)35-55肽或蛋白脂質肽(PLP)誘導EAE時，在小鼠中觀察到過度表現。另外，中和IL-23/p19或IL-17使得可改善小鼠中之EAE症狀(Park等人，Nat Immunol.6：1133(2005)；及Chen等人，J Clin Invest.116：1317 (2006))。
方法
實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)係複製MS之某些態樣之充分描述且可再現性動物模型。EAE可在齧齒類動物及非人類靈長類動物(例如常見狨猿)中誘導。Genain,C.P.及Hauser,S.L.,「Creation of a model for multiple sclerosis in Callithrix jacchus marmosets,」J.Mol.Med.,75：187-197(1997)。在狨猿EAE中，使用重組人類髓磷脂少突膠質細胞糖蛋白(rHuMOG)對動物實施免疫以誘導發生極其類似於人類多發性硬化之疾病。此模型之公開研究在單一接種中採用於完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant，CFA)中乳化之MOG作為免疫原。早期使用公開方法誘導狨猿中之EAE之嘗試使得在MOG注射之後23天至142天期間發作臨床症狀(數據未展示)。由於認為此時間線對於臨床前效能研究而言過長，故採用改質方案，其採用初始初免劑量隨後進行強化免疫以誘導疾病。使用如此研究中所闡述之初免/強化方案評估具有IL-17A/F結合實體及IL-23結合實體之替代雙特異性抗體在此非人類靈長類動物EAE模型中之活性。替代雙特異性抗體係biAbFabL(參見圖2)，其與biAb-1、biAb-2、biAb-3及biAb-4具有相同IL-17A/F結合實體，同時具有(例如)如同biAb-3之IL-23結合實體之替代IL-23結合實體，其對狨猿IL-23p19具有減小之親和力。因此，在替代雙特異性抗體中利用替代性IL-23結合實體。替代雙特異性抗體中所利用之替代性IL-23結合實體與如圖13及圖14中IL-23 mAb所鑑別之IL-23結合實體相同。
為誘導EAE，將rHuMOG(BlueSky Biotech,Worcester,MA)在無菌PBS中稀釋至0.66mg/ml，且然後使用等體積之含有5mg/mL結核菌(M.tuberculosis)H37 RA(Difco編號：231141)之不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s adjuvant)(IFA，Sigma編號：F5506)中乳化。將 300μL最終CFA/MOG混合物(含有0.33mg/mL MOG及2.5mg/ml H37RA)注射於每一動物之經切削肩部區域上之2個位點處(150μl×2個注射位點)。同一天(第0天)使用CFA/MOG對所有狨猿實施免疫。
在第21天，使動物接受在經切削腰/髖區域上之2個注射位點處注射IFA/MOG(如上所述來製備但不含H37 RA)之強化免疫。對於初免及強化接種而言，經由肌內注射使用氯胺酮(Ketamine)(15mg/kg)將狨猿麻醉。
將替代IL-23/17 AF bAb(IgG4.1k)調配於20mM琥珀酸、150mM精胺酸緩衝液(pH 5.6)中。在使用CFA/MOG實施初免接種之前1天，開始投藥。給予動物安慰劑(PBS，經皮下，2×/週)或IL-23/17 AF bAb(7mg/kg，經皮下，2×/週)。其他治療組包含BMS-938790(IL-23阿奈克因(adnectin)；3mg/kg，經皮下，2×/週)、ADX_PRD1651(IL-23/17比奈克因(binectin)，10mg/kg，經皮下，2×/週)及替代IL-23 mAb IgG4.1(IL-23.15-g4P，9mg/kg，經皮下，2×/週)。在整個研究時段中於週二及週五投與劑量。每週一次記錄個體體重且基於個體體重對動物進行投藥。在使用酒精局部擦洗後，將所有皮下劑量投與側腹區域。對於每一劑量投與而言，改變劑量位點(左側或右側)。在開始研究時，治療組係由8只動物/組(混合之雄性及雌性)組成。在注射藥物時，動物係清醒的且進行人工束縛。
自第12天開始每天對疾病狀態進行視覺評價。實施評價且藉由兩個研究者之一致意見進行記錄。臨床評分係基於如下表32中所闡述之公開疾病評分之修改。
結果
每組中具有EAE疾病之體徵/症狀之動物數量如下所述：
組A(PBS)：7只狨猿中之5只(71%)在研究期間之某一時間點展示EAE樣疾病及/或神經功能障礙。疾病表現係由失明及癱瘓組成。
組B(IL-23阿奈克因，BMS-938790)：6只狨猿中之1只(17%)展示EAE樣疾病。疾病表現係由進展性失明及癱瘓組成。
組C(IL-23/17比奈克因，ADX_PRD1651)：7只狨猿中之6只(86%)展示EAE樣疾病。然而，3只動物僅在單一觀察日展示EAE體徵/症狀證據。
組D(IL-23 mAb)：6只狨猿中之3只(50%)展示EAE樣疾病。失明普遍存在。
組E(IL-23/17 AF bAb)：8只狨猿中之4只(50%)展示EAE樣疾病；該4只動物中之3只僅在單一觀察日具有「正」評分瞬時症狀。疾病主要係由輕度症狀(例如移動緩慢或警覺性減小)組成。
與組A(PBS)中之疾病發病率相比，每一其他治療組中之疾病發病率之差異並無統計學顯著性(p>0.05，費希爾氏確切測試(Fisher’s Exact Test))。
在研究中有較小亞組之動物發生更嚴重之EAE體徵/症狀，其中若干狨猿需要安樂死以符合預定人道終點。各組中需要安樂死之動物數量如下所述：組A(2)；組B(1)；組C(1)；組D(0)；組E(0)。
在實施安樂死時，將因EAE症狀出於人道原因實施安樂死之動物指定臨床嚴重程度評分為「4」，將此評分用於研究之剩餘部分以用於計算組平均臨床嚴重程度評分。圖12繪示每一治療組在研究過程中之平均臨床嚴重程度評分。組A(PBS)在研究結束時達到大約1.6之峰評分。所有其他組皆顯示較低平均臨床評分，其中組E(IL-23/17 AF bAb)展示僅EAE疾病之任一體徵較為明顯之短暫時段(約1wk)。因各組中之動物數量有限且組內動物之EAE疾病評分具有動物間可變性，故組A(PBS)與其他治療組之間之差異並無統計學顯著性(曼-惠特尼U測試(Mann-Whitney U Test))。
總之，此研究展示藉由若干所評估化合物在狨猿EAE模型中減小疾病嚴重程度及減小疾病發病率之趨勢。總而言之，使用IL-23/17 AF bAb(IgG4.1k)治療之動物似乎經歷最有益結果(圖12)，但各組間之差異並無統計學顯著性。發現使用IL-23/17 AF bAb治療之動物較使用IL-23 mAb治療之動物獲得較佳保護，此表明雙重靶向IL-23及IL-17AF路徑將在治療該等細胞因子路徑發揮一定作用之人類疾病(包含但不限於多發性硬化)中得到較大效能。
屍檢後MRI
在研究結束時，對存活狨猿實施屍檢。去除顱蓋且將腦原位固定於福爾馬林(formalin)中保持3週。為評價白質及視神經束中之損傷，使用具有72mm Quad RF線圈之Bruker Biospec 7T系統使用下列參數實施T2W及質子密度MRI掃描：總掃描時間：約15-20min/試樣，收集23個軸向影像，TR/TE=5000/20ms，切片厚度=1.2mm，FOV=4cm，矩陣=256×256，平面內解析度=156mm2。
對掃描進行評審且藉由3名放射學家在評審各組動物之所有MRI影像之後之一致見解來實施半定量解釋。損傷評分係基於覆蓋整個腦之白質中之損傷計數。視神經評分係基於腫脹及反映視神經束及神經 中之發炎之增加之信號強度。
總而言之，與媒劑組相比，觀察到IL-23/17 AF bAb組中之損傷負荷顯著(p<0.05)減小(圖13)。與媒劑相比，IL-23/17 AF bAb組中之視神經束評分亦顯著較低(圖14)。對於該等MRI量測中之任一者，其他治療組與媒劑治療組並不顯著不同。因此，與臨床疾病評分一致，使用IL-23/17 AF bAb治療之動物組同樣具有最低平均MRI值，從而表明雙重靶向IL-23及IL-17AF路徑將使得在治療人類疾病中得到較大效能。
實例9 IL-17A及IL-17F表位定位
此實例9中所闡述之分析旨在鑑別biAb3之IL-17A/F結合實體(如SEQ ID 13中所展示重鏈可變結構域及如SEQ ID NO：9中所展示之輕鏈可變結構域)所結合之IL-17A及IL-17F上的表位殘基。
鑑別biAb3及小鼠親代抗體(339.15.5.3)間之表位之主要差異之策略利用X射線結晶學、定點突變誘發、電腦上突變誘發及結合與功能分析來分析突變體。biAb3之IL-17A/F結合實體之重鏈可變結構域係純系339.15.5.3、純系339.15.3.6或純系339.15.5.3之重鏈可變結構域的人類化形式。biAb3之IL-17A/F結合實體及純系339.15.5.3、純系339.15.3.6或純系339.15.5.3之重鏈CDR殘基相同。然而，兩種mAb之重鏈可變結構域之框架區有所不同。兩種mAb具有不同輕鏈，由此IL-17中與每一mAb之輕鏈接觸之殘基係此研究之著眼點。
X射線結晶學
實施IL17A Fab複合物及IL17F Fab複合物結晶學測定以確定用於接觸表面建模以供表位/互補位殘基預測及埋入表面測定之接觸式介面殘基。亦使用三維結構以用於基於建模晶體結構複合物進行蛋白質突變體能量計算。
選殖每一抗體之Fab且以周質方式表現於大腸桿菌菌株BL21(人類化339-134)或BL21 Star(BiAb)中。其純化皆包含IMAC及隨後之SEC。使IL-17A及IL-17F表現於大腸桿菌菌株W3110中作為納入體且再摺疊，隨後進行多步純化。
使衍生自biAb3之IL-17臂之Fab(SEQ ID NO：13之重鏈可變結構域及SEQ ID NO：15之重鏈CH1結構域；及SEQ ID NO：17之輕鏈)及衍生自親代人類化抗人類IL-17A/F抗體339-134 mAb之人類化前導之Fab(SEQ ID NO：65及SEQ ID NO：67)與人類IL-17A或IL-17F複合。藉由SEC監測IL-17A或IL-17F與BiAb3及人類化抗人類IL-17A/F抗體339-134 mAb之複合物形成。
藉由廣泛篩選隨後優化結晶條件來生成4種複合物中之每一者之共晶體。在APS LS-CAT光束線下收集關於每一試樣之數據組。
藉由分子代替使用來自CCP4組之Phaser MR測定每一結構。自PDB ID 2VXS衍生IL-17A研究模型。自PDB ID 1JPY獲取IL-17F研究模型。對於每一Fab而言，使用來自PDB ID 3IDX之缺失超變環之人類化Fab生成用於恆定及可變結構域之研究模型。在迭代循環之REFMAC5精修及Coot人工模型建立之後獲得最終模型。此外，實施額外循環之Autobuster精修及圖生成以用於所有較低解析度結構之模型建立及精修。數據收集及精修之結晶學統計學展示於表34(對於人類化親代Fab結構而言)及表35(對於人類化前導Fab結構而言)。使用 已經下載在內部服務器上運行之MolProbity評價每一結構之幾何結構。
每一Fab主要經由其重鏈且在較低程度上經由輕鏈主要結合至IL-17同二聚體之一個半位點。人類化親代與人類化前導Fab之結合差異似乎與人類化前導Fab之較高親和力一致。
總體而言，IL-17/BMS Fab複合物中之每一者展現相同整體結構，其中一個Fab識別IL-17同二聚體之一個半位點(圖15)。因此，結合化學計量學在結晶學上展示為兩(2)個Fab對一(1)個IL-17同二聚體(或兩(2)個Fab對兩(2)個IL-17啟動子)。大部分與介白素之相互作用係由重鏈形成，其中超變環3(或互補決定區CDR3)形成抗體-抗原相互作用之核心。此外，重鏈之CRD2之諸多殘基與介白素發生相互作用。重鏈之CDR1似乎並不與介白素顯著發生相互作用。對於輕鏈而言，CDR3與IL-17之識別有關。輕鏈之CDR1亦似乎提供弱的較長範圍結合相互作用。
使用晶體結構坐標來定義如先前所闡述之接觸界面(S.Sheriff.,「Some Methods for Examining the Interaction between Two Molecules」,Immunomethods,3：191-196(1993))，其中極小值定義(定義為接觸殘基)係衍生自程式CONTACSYM(Sheriff,S.Hendrickson,W.A.及Smith,J.L.(1987).Structure of Myohemerythrin in the Azidomet State at 1.7/1.3Å Resolution.J.Mol.Biol.197,273-296.)。界面之極大值定義(定義為至少部分地由相互作用埋入之殘基)係衍生自程式MS(Connolly,M.L.(1983).Analytical Molecular Surface Calculation.J.Appl.Crystallogr.16,548-558)。
具有星號(*)之殘基與複合物界面接觸。
沒有星號之殘基完全埋入複合物接觸界面中。
Fab與IL-17A(SEQ ID NO：2)之主要相互作用似乎為殘基L97及來自H109-N111之殘基段(圖15)。I100、G98、N111、S112、V113及P114保留於IL-17A與IL-17F之間(SEQ ID NO：2或IL-17A之胺基酸殘基I100、G98、N111、S112、V113及P114對應於SEQ ID NO：4或IL-17F之胺基酸殘基I108、G106、N119、S120、V121及P122)。因此，在獲得此初始結構之後，預計人類化親代Fab A3052F將以基本上與使用IL-17A所觀察相同之方式結合IL-17F。然而，在鄰近該等殘基處，存在若干在IL-17A(SEQ ID NO：2)與IL-17F(SEQ ID NO：4)之間不同之殘基，例如IL-17A中之K93(IL-17F中之Q101)、IL-17A中之H95(IL-17F中之N104)、IL-17A中之Y108(IL-17F中之I116)及IL-17A中之H109(IL-17F中之S117)。IL-17A(SEQ ID NO：2)之C末端亦似乎與Fab經由殘基P149及I150(其對應於IL-17F(SEQ ID NO：4)之殘基P157及V158)發生較弱相互作用。然而，IL-17A與IL-17F之間之差異預計不會顯著改變整體抗體-抗原相互作用。
與人類化親代Fab之2.85Å解析度相比，人類化前導Fab之3.4Å解析度展現重鏈與介白素之間之極類似相互作用，如考慮到重鏈之相同序列所預計。與之相比，該兩個Fab之間之輕鏈完全不同且如所預計該等殘基以不同方式與介白素進行配位。biAb Fab在CDR3中具有較少殘基以使得環伸展跨越介白素，從而使得biAb Fab中G93(SEQ ID NO：9之G93或SEQ ID NO：27之G4)之主鏈氧與SEQ ID NO：2(IL-17A)中Y108之主鏈氮形成直接氫鍵。相同原子(人類化親代Fab中SEQ ID NO：67之N91之主鏈氧)與親代Fab中之位置相距2.3Å且不能與介白素形成氫鍵。另外，自WN變為YG使得CDR1之Y33(SEQ ID NO：9之Y33)相對於其在較低親和力親代Fab中之位置接近介白素5.1Å，由此獲得與IL-17A之H109(SEQ ID NO：2)之額外嵌合相互作用。最後，biAb Fab之Y96(SEQ ID NO：9之Y96)可與重鏈之N106(SEQ ID NO：13之N106)形成氫鍵，從而幫助其以氫鍵形式與介白素(IL-17A)之Y108(SEQ ID NO：2之Y108)主鏈氧對準。總而言之，biAb Fab之CDR3界面中之該等變化似乎與其較高親和力一致且藉由如下文所展示之定點突變誘發進行測試。
令人遺憾的是，由小鼠親代Fab與IL-17A或IL-17F組成之複合物不能獲得晶體結構。此表明優化該等複合物之相互作用之條件與彼等用於使人類化親代及前導Fab成功結晶者不同。
除個別殘基接觸之解釋外，可藉由計算藉由IL17/Fab複合物之相互作用區埋入之總表面積來獲得結合至介白素之人類化親代Fab與biAb中之差異的另一量度。使用用於IL-17A Fab複合物(此乃因其具有最高解析度)之MS算法實施此分析，且應提供最可靠比較。具有IL-17F之兩種結構為3.5Å且並不視為能可靠用於此分析。親代Fab在IL-17A上埋入720Å2，而biAb Fab埋入820Å2(參見表37)。此表面積差異(100Å2)可藉由前導Ab對IL-17A之所量測增加之結合親和力予以證實。令人感興趣的是，許多胺基酸中源於延長側鏈構形之表面積小於100Å2(A、N、D、C、G、L、P、S、T、V)，參見 Atlas of Protein Side-Chain Interactions V1. Singh及Thornton 1992,6-11)。因此，藉由此量測可總結出，IL-17A上用於前導結構與親代結構之結合表位差異可闡述為大約一(1)個殘基當量。
丙胺酸切削突變體之計算表位預測及設計
為詳細描述IL-17A及IL-17F表位殘基對於親代及前導Fab之結合動力學之不同貢獻，選擇藉由X射線結晶學所鑑別之結合界面中之殘基用於定點突變以進一步區分人類親代mAb及biAb之結合間的差異。
採用多種用於選擇單一分子上之個別及多個突變之準則來選擇一組代表性有益突變體進行測試。使用本文先前所闡述IL-17A/親代Fab、IL-17F/前導Fab之晶體結構來告知擬突變殘基之選擇。選擇配體-Fab相互作用界面處之殘基，同時著重關注與Fab輕鏈殘基接觸之殘基。亦選擇晶體結構中對於一個Fab而言較差界定但對於另一Fab而言非較差界定之區域，此乃因此可指示親代對biAb之複合物內之殘基流動性差異。此外，亦選擇同源性IL-17 A/F殘基有所不同之殘基位置，此乃因此可指示對於Fab結合之容變性，或可有助於關於親代及biAb Fab之不同結合親和力。使用所提出突變體對界面進行建模以探尋親代與biAb Fab複合物中之能量差異。組合接觸殘基簇(丙胺酸切削突變體)以生成結合親和力具有加和性或協同性變化之突變體。生成用於實驗分析之每一介白素之突變體展示於表38及39中。
IL-17A及IL-17F表位定位丙胺酸突變體之選殖及表現
藉由基因合成生成IL-17A及IL-17F之突變體構築體且然後選殖至瞬時轉染載體中以用於表現於HEK293-6E細胞中。使用表現質粒/PEI複合物轉染30mL 1×106個細胞/ml之HEK293-6E細胞培養物且在轉染後120小時收穫細胞。
IL-17A及IL-17F突變體之Biacore濃度分析
藉由抗his Fab Biacore感測器表面上之捕獲量來量化HEK捕獲上 清液中IL-17A及IL-17F之每一丙胺酸突變體之濃度。亦固定蛋白質A及huIgG表面作為對照來評價上清液之非特異性結合(未觀察到非特異性結合)。使用介於80ug/mL至0.039ug/mL之間之經純化IL-17A-his或IL-17F-his之標準曲線來量化每一上清液中的濃度。對於自0.3125ug/mL至0.0039ug/mL之數據而言，將校準曲線擬合至線性曲線。以1：20、1：60及1：180稀釋上清液以在標準曲線之線性範圍中進行多次量測。
IL-17A突變體8具有顯著減小之表現(僅為野生型表現量之約10%)。IL-17F突變體M2、M3、M7及M9具有顯著減小之表現。IL-17F之M9突變體實際上不可檢測，而IL-17F M2及M7突變體小於野生型表現量之5%。
IL-17生物分析(NIH/3T3/KZ170 NF-κB螢光素酶報告基因分析)
使用稱為KZ170之NF-κB螢光素酶報告基因穩定轉染鼠類纖維母細胞系(NIH/3T3，ATCC編號：CRL-1658)且選殖出來。將NIH/3T3/KZ170純系1細胞以10,000個細胞/孔接種於96孔白色不透明螢光素酶板中並在37℃下培養過夜。次日，使用Biacore測定濃度在分析培養基中製備重組人類IL-17A、IL-17F、IL-17A丙胺酸突變體及IL-17F丙胺酸突變體之連續稀釋液，且添加至含有細胞之板中並在37℃下培養4小時。在培養後，去除培養基且裂解細胞，然後根據製造說明書在Berthold Centro XS3亮度計上使用閃光基板進行讀取。平均螢光強度增加(經由活化NF-κB螢光素酶報告基因)指示IL-17A或IL-17F受體-配體相互作用。使用GraphPad Prism®4軟體計算每一IL-17A及IL-17F丙胺酸突變體之EC50(50%有效濃度)值。
所有IL-17A突變體皆展示細胞功能活性，但一些突變體相對於野生型失去數倍活性(圖16)。所有IL-17F突變體(M3除外)皆展示細胞功能活性，但3種突變體(M2、M5、M10)展示顯著減小之活性(圖17)。
IL-17A及IL-17F突變體與BiAb3及其他相關抗體之結合之Biacore結合分析
用於Biacore結合分析之抗體係biAb3(如SEQ ID NO：7中所展示之重鏈可變結構域及如SEQ ID NO：9中所展示之輕鏈可變結構域)及小鼠親代抗體339.15.5.3(其含有與339.15.3.5及339.15.3.6相同之可變區序列)。使用IsoStrip小鼠單株抗體同種型分析套組(Roche,Indianapolis,IN,USA)之同種型分析顯示339.15.5.3抗體係極類似於用於人類化之339.15.3.5之IgG2a/κ。在339.15.3.5與339.15.5.3之間並未測得序列或同種型差異。
藉由表面電漿共振(SPR,Biacore)在Biacore T100上於HBS-EP(10mM HEPES、3mM EDTA、150mM NaCl、0.05% Tween 20，pH 7.4)中在25℃下量測來自所有12種IL-17A及10種IL-17F丙胺酸突變體之30mL表現液之上清液及野生型對照上清液對每一抗體之結合(參見表41及表42)。藉由以3000RU固定於CM5感測器晶片上之蛋白質A以約150-250RU之濃度捕獲相關抗體及受體。除biAb3及親代mAb(339.15.3.5)外，使用其他抗IL-17 mAb作為用於結構域結合之對照。此外，使用IL-17A之商業受體作為對照：hIL-17RA-Fc(來自R&D Systems)，但並未鑑別出用於此分析之適宜IL-17RC試劑。基於抗his量化測定濃度將上清液以9nM濃度稀釋至HBS-EP中且以1：3連續稀釋，並以30uL/min注射於mAb或受體表面上保持90秒且在離解時間之後使用10mM甘胺酸(pH 1.5)再生。亦以較高濃度(在400-500nM範圍中，於上清液之表現量下)運行IL-17A M2及IL-17F M1，此乃因對於biAb捕獲表面而言觀察到極少結合信號。在分析之前自所有特異性結合曲線扣除未捕獲任何抗體之蛋白質A之參考表面的結合。將所有滴定曲線擬合至1：1 Langmuir結合模型以測定圖18及表41及42中所展示之Kd值。
Biacore結果顯示，IL-17A突變體M1、M2、M6、M10及M11展示對BiAb之結合親和力有所減小且含有造成與親代抗體相比之結合表 位差異之殘基。大部分該等突變體展示與IL-17RA-Fc之結合減小至野生型之1/15-1/3(對於M1而言為1/45)，此可能係由於受體結合位點已發生改變。然而，對於影響BiAb3相互作用之所有突變體而言，細胞功效維持於數倍範圍內，從而表明該等受體破壞對於功能而言並不重要。
IL-17F突變體M1、M2、M7及M8展示對biAb之結合親和力有所減小，然而該等相同突變體對於親代抗體展示類似之結合親和力減小，從而指示IL-17F並無IL-17A中親代抗體與biAb之間之表位變化。該4種突變體在細胞功能分析中維持類似於野生型IL-17F之功效，然而許多其他突變體並不限制關於IL-17F突變誘發之解釋。
NM-未量測，此乃因突變體未以可檢測含量表現。
電腦上突變誘發
對IL-17A-親代Fab、IL-17A-前導Fab及IL-17F-前導Fab實施能量分析。因複合物之X射線結構不完整，故使用蛋白質建模藉由使用標準方案(Maestro蛋白質製備嚮導及Prime側鏈建模)構建缺少之胺基酸側鏈來完成結構模型。然後使用該等結構模型計算野生型蛋白(IL-17A或IL-17F)或突變體IL-17分子與Fab之相互作用能量。相互作用能量係對於Fab針對IL-17(視為配體)之計算親和力之量度。為計算突變 體蛋白之穩定性及δ-穩定性，使用軟體MOE(2012.10版，Chemical Computing Group)。使用殘基掃描方案來實施計算定點突變誘發以生成突變且實施親和力及穩定性計算。
預測之計算結合能量與自IL-17A突變體Biacore親和力測得之所計算△△G值之比較展示於圖19中。圖19中所鑑別之IL-17A突變體標記錯誤。圖19中所鑑別之IL-17A突變體之SEQ ID NO：2編號比其實際應該編號小1。突變體如表38中所鑑別。舉例而言，圖中之N104A、Y107A及H108A應為N105A、Y108A及H109A等等。此比較展示，突變體組中之Biacore能量趨勢與結合界面之計算能量預測值一致。不能分析結合至小鼠親代抗體之IL-17A，此乃因複合物不能結晶且不能生成可接受模型。關於生成用於結合至BiAb3之IL-17F突變體之結果之嘗試產生不一致結果，此可能係由於用於該等過程之結構具有較差解析度且缺少所需殘基資訊。
IL-17A及IL-17F表位定位之概述
鑑別BiAb3及小鼠親代抗體(339.15.5.3)之表位間之主要差異之策略利用X射線結晶學、定點突變誘發、電腦上突變誘發及結合與功能分析來分析突變體。兩種mAb之不同之處在於其輕鏈，由此與每一mAb之輕鏈接觸之殘基係此研究之著眼點。
IL-17A突變誘發得到一組具有良好表現及適當細胞功效之突變體。對於含有Y108A之所有突變體而言，量測到biAb3結合之△△G發生顯著變化，其中經量測Y108A單點突變體變化0.5千卡/莫耳。在小鼠親代抗體結合中未觀察到該等△△G變化，從而指示Y108係與小鼠親代mAb相比用於biAb3之IL-17A表位中之新殘基。能量數據與晶體結構之界面分析一致，從而展示此殘基與biAb3中不同於小鼠親代抗體之輕鏈相互作用，且Y108A因與小鼠親代抗體相比biAb3輕鏈之CDR3差異而更為接近biAb3。此處展示影響小鼠親代抗體之結合之唯一IL- 17A突變體係與重鏈殘基相互作用者，從而指示輕鏈在小鼠親代抗體與IL-17A之結合中並不發揮較多作用。
IL-17F突變誘發得到一組具有較可變及較低表現量且功效顯著損失之突變體。針對IL-17F所獲得之晶體結構之解析度亦差於IL-17A結構。此表明IL-17F並不適於突變誘發且可能在本質上更具動態性。然而，與biAb3之結合有所減小之突變體對小鼠親代mAb之結合亦有所減小。另外，具有減小之mAb結合之所有該等突變體具有用於分析之適當功效及較低(但足夠)表現量。
自上文應瞭解，儘管本文出於闡釋之目的已對本發明具體實施例予以闡述，但可對其作出各種修改，此並不背離本發明之精神及範圍。因此，本發明僅由隨附申請專利範圍限制。
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<220>
<221> CDS
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<400> 117
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<211> 330
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<200>
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<400> 119
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<211> 1005
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<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1005)
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<211> 335
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<212> DNA
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<220>
<221> CDS
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<211> 1008
<212> DNA
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<220>
<221> CDS
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<400> 125
<210> 126
<211> 336
<212> PRT
<213> 智人
<400> 126
<210> 127
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> VARIANT
<222> (97)..(97)
<223> 同種異型變化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (117)..(117)
<223> L117A
<220>
<221> MOD_RES
<222> (118)..(118)
<223> L118E
<220>
<221> MOD_RES
<222> (120)..(120)
<223> G120A
<220>
<221> MOD_RES
<222> (213)..(213)
<223> A213S
<220>
<221> MOD_RES
<222> (214)..(214)
<223> P214S
<220>
<221> VARIANT
<222> (239)..(239)
<223> 同種異型變化
<220>
<221> VARIANT
<222> (241)..(241)
<223> 同種異型變化
<400> 127
<210> 128
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> VARIANT
<222> (97)..(97)
<223> 同種異型變化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (117)..(117)
<223> L117A
<220>
<221> MOD_RES
<222> (118)..(118)
<223> L117E
<220>
<221> MOD_RES
<222> (120)..(120)
<223> G120A
<220>
<221> MOD_RES
<222> (213)..(213)
<223> A213S
<220>
<221> MOD_RES
<222> (214)..(214)
<223> P214S
<220>
<221> VARIANT
<222> (239)..(239)
<223> 同種異型變化
<220>
<221> VARIANT
<222> (241)..(241)
<223> 同種異型變化
<400> 128

Claims (215)

  1. 一種雙特異性抗體，其包括IL-17A/F結合實體及IL-23結合實體，其中該IL-17A/F結合實體包括兩對免疫球蛋白鏈，每一對具有一條輕鏈及一條重鏈，且該IL-23結合實體包括兩個Fab片段，其各自包括輕鏈及重鏈之CH1與可變區，且該IL-23結合實體之該等Fab片段與該IL-17A/F結合實體之該等重鏈之C末端連接，或與該IL-17A/F結合實體之該等輕鏈及該等重鏈之N末端連接。
  2. 一種雙特異性抗體，其包括IL-17A/F結合實體及IL-23結合實體，其中該IL-23結合實體包括兩對免疫球蛋白鏈，每一對具有一條輕鏈及一條重鏈，且該IL-17A/F結合實體包括兩個Fab片段，其各自包括輕鏈及重鏈之CH1與可變區，且該IL-17A/F結合實體之該等Fab片段與該IL-23結合實體之該等重鏈之C末端連接，或與該IL-23結合實體之該等輕鏈及該等重鏈之N末端連接。
  3. 如請求項1或2之雙特異性抗體，其中該IL-17A/F結合實體與該IL-23結合實體藉由肽連接體連接。
  4. 如請求項3之雙特異性抗體，其中該連接體包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
  5. 一種雙特異性抗體，其包括IL-17A/F結合實體及IL-23結合實體，其中該IL-17A/F結合實體包括輕鏈及IL-17A/F重鏈，且該IL-23結合實體包括輕鏈及IL-23重鏈。
  6. 如請求項1、2或5之雙特異性抗體，其中該IL-17A/F結合實體及該IL-23結合實體之該等輕鏈包括含有以下部分之可變結構域：CDR1，其具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列；CDR2，其具有SEQ ID NO：23之胺基酸序列；及CDR3，其具有SEQ ID NO：24之序 列。
  7. 如請求項1、2或5之雙特異性抗體，其中該IL-17A/F結合實體及該IL-23結合實體之該等輕鏈包括含有SEQ ID NO：9之胺基酸序列之可變結構域。
  8. 如請求項1、2或5之雙特異性抗體，其中該IL-17A/F結合實體及該IL-23結合實體之該等輕鏈包括含有SEQ ID NO：10之胺基酸序列之恆定結構域。
  9. 如請求項1、2或5之雙特異性抗體，其中該IL-17A/F結合實體及該IL-23結合實體之該等輕鏈包括含有SEQ ID NO：9之胺基酸序列之可變結構域及含有SEQ ID NO：10之胺基酸序列之恆定結構域。
  10. 如請求項1或2之雙特異性抗體，其中該IL-17A/F結合實體之該等重鏈包括含有以下部分之可變結構域：CDR1，其具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列；CDR2，其具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列；及CDR3，其具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列。
  11. 如請求項5之雙特異性抗體，其中該IL-17A/F重鏈包括含有以下部分之可變結構域：CDR1，其具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列；CDR2，其具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列；及CDR3，其具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列。
  12. 如請求項1或2之雙特異性抗體，其中該IL-17A/F結合實體之該等重鏈包括含有SEQ ID NO：13之胺基酸序列之可變結構域。
  13. 如請求項5之雙特異性抗體，其中該IL-17A/F重鏈包括含有SEQ ID NO：13之胺基酸序列之可變結構域。
  14. 如請求項1之雙特異性抗體，其中該IL-17A/F結合實體之該等重鏈包括含有SEQ ID NO：11之胺基酸序列之恆定結構域。
  15. 如請求項2之雙特異性抗體，其中該IL-17A/F結合實體之該等重 鏈包括含有SEQ ID NO：15之胺基酸序列之CH1區。
  16. 如請求項5之雙特異性抗體，其中該IL-17A/F重鏈包括含有SEQ ID NO：15之胺基酸序列之CH1區。
  17. 如請求項1或2之雙特異性抗體，其中該IL-23結合實體之該等重鏈包括含有以下部分之可變結構域：CDR1，其具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列；CDR2，其具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列；及CDR3，其具有SEQ ID NO：21之胺基酸序列。
  18. 如請求項5之雙特異性抗體，其中該IL-23重鏈包括含有以下部分之可變結構域：CDR1，其具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列；CDR2，其具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列；及CDR3，其具有SEQ ID NO：21之胺基酸序列。
  19. 如請求項1或2之雙特異性抗體，其中該IL-23結合實體之該等重鏈包括含有SEQ ID NO：7之胺基酸序列之可變結構域。
  20. 如請求項5之雙特異性抗體，其中該IL-23重鏈包括含有SEQ ID NO：7之胺基酸序列之可變結構域。
  21. 如請求項2之雙特異性抗體，其中該IL-23結合實體之該等重鏈包括含有SEQ ID NO：8之胺基酸序列或SEQ ID NO：8之殘基1至326之胺基酸序列的恆定結構域。
  22. 如請求項5之雙特異性抗體，其中該IL-23重鏈包括含有SEQ ID NO：8之胺基酸序列或SEQ ID NO：8之殘基1至326之胺基酸序列的恆定結構域。
  23. 如請求項1之雙特異性抗體，其中該IL-23結合實體之該等重鏈包括含有SEQ ID NO：14之胺基酸序列之CH1區。
  24. 一種雙特異性抗體，其包括一對各自包括選自由SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：74及SEQ ID NO：84組成之群之胺基酸序列之重鏈及一對 各自包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列之輕鏈；或一對各自包括SEQ ID NO：77之胺基酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：79之胺基酸序列之輕鏈。
  25. 如請求項24之雙特異性抗體，其包括一對各自包括SEQ ID NO：74之胺基酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列之輕鏈。
  26. 一種雙特異性抗體，其包括IL-17A/F結合實體及IL-23結合實體，其中該IL-17A/F結合實體包括含有SEQ ID NO：17之胺基酸序列之輕鏈及含有SEQ ID NO：80之胺基酸序列之IL-17A/F重鏈，且該IL-23結合實體包括含有SEQ ID NO：17之胺基酸序列之輕鏈及含有SEQ ID NO：60之胺基酸序列之IL-23重鏈。
  27. 一種雙特異性抗體，其包括第一結合實體及第二結合實體，其中該第一結合實體係包括兩對免疫球蛋白鏈之抗體；該第二結合實體係包括重鏈可變結構域及輕鏈可變結構域之Fv單元；該第二結合實體之該Fv單元定位於該第一結合實體之該抗體之Fab區與鉸鏈區之間；且該第二結合實體之該Fv單元與該第一結合實體之該抗體之該Fab區連接。
  28. 如請求項27之雙特異性抗體，其中該第一結合實體係淋巴球抗原、細胞因子、細胞因子受體、生長因子、生長因子受體、介白素或介白素受體且該第二結合實體係淋巴球抗原、細胞因子、細胞因子受體、生長因子、生長因子受體、介白素或介白素受體。
  29. 如請求項27之雙特異性抗體，其中該第一結合實體係IL-23結合實體且該第二結合實體係IL-17A/F結合實體，或該第一結合實體係IL-17A/F結合實體且該第二結合實體係IL-23結合實體。
  30. 如請求項29之雙特異性抗體，其中該第二結合實體之該Fv單元 之該重鏈可變結構域藉由第一肽連接體分子與該第一結合實體之該抗體之該Fab片段之CH1區連接，且該第二結合實體之該Fv單元之該輕鏈可變結構域藉由第二肽連接體與該第一結合實體之該抗體之該Fab片段之該輕鏈恆定結構域連接。
  31. 如請求項30之雙特異性抗體，其中該第一肽連接體具有SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：86之胺基酸序列，且該第二肽連接體具有SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：85之胺基酸序列。
  32. 如請求項29之雙特異性抗體，其中該第二結合實體之該Fv單元具有包括以下部分之輕鏈可變結構域：CDR1，其具有SEQ ID NO：22之胺基酸序列；CDR2，其具有SEQ ID NO：23之胺基酸序列；及CDR3，其具有SEQ ID NO：24之胺基酸序列。
  33. 如請求項29之雙特異性抗體，其中該第二結合實體之該Fv單元具有包括SEQ ID NO：9之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。
  34. 如請求項29之雙特異性抗體，其中該Fv單元係包括含有以下部分之重鏈可變結構域之IL-23結合實體：CDR1，其具有SEQ ID NO：19之胺基酸序列；CDR2，其具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列；及CDR3，其具有SEQ ID NO：21之胺基酸序列。
  35. 如請求項29之雙特異性抗體，其中該Fv單元係包括含有SEQ ID NO：7之胺基酸序列之重鏈可變結構域之IL-23結合實體。
  36. 如請求項29之雙特異性抗體，其中該Fv單元係包括含有以下部分之重鏈可變結構域之IL-17A/F結合實體：CDR1，其具有SEQ ID NO：25之胺基酸序列；CDR2，其具有SEQ ID NO：26之胺基酸序列；及CDR3，其具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列。
  37. 如請求項29之雙特異性抗體，其中該Fv單元係包括含有SEQ ID NO：13之胺基酸序列之重鏈可變結構域之IL-17A/F結合實體。
  38. 一種雙特異性抗體，其包括一對各自包括SEQ ID NO：87之胺基 酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：89之胺基酸序列之輕鏈，或一對各自包括SEQ ID NO：91之胺基酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：93之胺基酸序列之輕鏈，或一對各自包括SEQ ID NO：95之胺基酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：89之胺基酸序列之輕鏈，或一對各自包括SEQ ID NO：97之胺基酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：93之胺基酸序列之輕鏈，或一對各自包括SEQ ID NO：99之胺基酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：101之胺基酸序列之輕鏈，或一對各自包括SEQ ID NO：103之胺基酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：105之胺基酸序列之輕鏈，或一對各自包括SEQ ID NO：111之胺基酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：113之胺基酸序列之輕鏈，或一對各自包括SEQ ID NO：115之胺基酸序列之重鏈及一對各自包括SEQ ID NO：117之胺基酸序列之輕鏈。
  39. 一種特異性結合至IL-17A(SEQ ID NO：2)及IL-17F(SEQ ID NO：4)之分離的單株抗體或其抗原結合片段，其包括重鏈可變結構域及輕鏈可變結構域，其中該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：13之胺基酸殘基且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：9之胺基酸殘基。
  40. 如請求項39之分離的單株抗體，其中該抗體包括人類恆定區。
  41. 如請求項40之分離的單株抗體，其中該重鏈之同種型係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
  42. 如請求項41之分離的單株抗體，其中根據Kabat，該IgG4重鏈在241位具有絲胺酸至脯胺酸突變。
  43. 如請求項39之分離的單株抗體，其中該重鏈包括SEQ ID NO：16、18、28、29或74之胺基酸殘基。
  44. 如請求項39之分離的單株抗體，其中該輕鏈包括SEQ ID NO：17 之胺基酸殘基。
  45. 如請求項39之分離的單株抗體，其中該重鏈包括SEQ ID NO：16、18、28、29或74之胺基酸殘基，且該輕鏈包括SEQ ID NO：17之胺基酸殘基。
  46. 一種雙特異性抗體，其包括如請求項39之抗體。
  47. 一種特異性結合至IL-23p19(SEQ ID NO：6)之分離的單株抗體或其抗原結合片段，其包括重鏈可變結構域及輕鏈可變結構域，其中該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：7之胺基酸殘基，且其中該輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：9之胺基酸殘基。
  48. 如請求項47之分離的單株抗體，其中該抗體包括人類恆定區。
  49. 如請求項48之分離的單株抗體，其中該重鏈之同種型係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
  50. 如請求項49之分離的單株抗體，其中根據Kabat該IgG4重鏈在241位具有絲胺酸至脯胺酸突變。
  51. 如請求項47之分離的單株抗體，其中該重鏈包括SEQ ID NO：16、18、28、29或74之胺基酸殘基。
  52. 如請求項47之分離的單株抗體，其中該輕鏈包括SEQ ID NO：17之胺基酸殘基。
  53. 如請求項47之分離的單株抗體，其中該重鏈包括SEQ ID NO：16、18、28、29或74之胺基酸殘基，且該輕鏈包括SEQ ID NO：17之胺基酸殘基。
  54. 一種分離的雙特異性抗體，其包括如請求項39之抗體。
  55. 一種分離的雙特異性抗體，其包括第一結合實體及第二結合實體，其中該第一結合實體係包括兩對免疫球蛋白鏈之抗體且該第二結合實體包括單一結構域抗體，其中該第二結合實體之該單一結構域抗體定位於該第一結合實體之Fab片段之CH1區與鉸鏈 之間。
  56. 如請求項55之分離的雙特異性抗體，其中該第二結合實體藉由連接體分子與該第一結合實體連接。
  57. 如請求項56之分離的雙特異性抗體，其中該連接體分子係(G4S)2。
  58. 如請求項56之分離的雙特異性抗體，其中該連接體分子係SEQ ID NO：86之胺基酸殘基。
  59. 如請求項56之分離的雙特異性抗體，其中該第一結合實體係淋巴球抗原、細胞因子、細胞因子受體、生長因子、生長因子受體、介白素或介白素受體且該第二結合實體係淋巴球抗原、細胞因子、細胞因子受體、生長因子、生長因子受體、介白素或介白素受體。
  60. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1、2、5、24、26、27及55中任一項之雙特異性抗體之該重鏈或該輕鏈。
  61. 一種分離的核酸，其編碼如請求項39或47之抗體之該重鏈或該輕鏈。
  62. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；聚核苷酸，其編碼如請求項1之雙特異性抗體之該重鏈；及轉錄終止子。
  63. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；聚核苷酸，其編碼如請求項1之雙特異性抗體之該輕鏈；及轉錄終止子。
  64. 一種重組宿主細胞，其包括如請求項62及63之表現載體，其中該細胞表現該重鏈及該輕鏈。
  65. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；第一聚核苷酸，其編碼如請求項1之雙特異性抗體之該重鏈；第二聚核苷酸，其編碼如請求項1之雙特異性抗體之該輕鏈；及轉錄終止子。
  66. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：第一轉錄啟動子；第一聚核苷酸，其編碼如請求項1之雙特異性抗體之該重鏈；及第一轉錄終止子；及第二轉錄啟動子；第二聚核苷酸，其編碼如請求項1之雙特異性抗體之該輕鏈；及第二轉錄終止子。
  67. 一種重組宿主細胞，其包括如請求項65或66之表現載體，其中該細胞表現該重鏈及該輕鏈。
  68. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；聚核苷酸，其編碼如請求項2之雙特異性抗體之該重鏈；及轉錄終止子。
  69. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；聚核苷酸，其編碼如請求項2之雙特異性抗體之該輕鏈；及轉錄終止子。
  70. 一種重組宿主細胞，其包括如請求項68及69之表現載體，其中 該細胞表現該重鏈及該輕鏈。
  71. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；第一聚核苷酸，其編碼如請求項2之雙特異性抗體之該重鏈；第二聚核苷酸，其編碼如請求項2之雙特異性抗體之該輕鏈；及轉錄終止子。
  72. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：第一轉錄啟動子；第一聚核苷酸，其編碼如請求項2之雙特異性抗體之該重鏈；及第一轉錄終止子；及第二轉錄啟動子；第二聚核苷酸，其編碼如請求項2之雙特異性抗體之該輕鏈；及第二轉錄終止子。
  73. 一種重組宿主細胞，其包括如請求項71或72之表現載體，其中該細胞表現該重鏈及該輕鏈。
  74. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；聚核苷酸，其編碼如請求項5之雙特異性抗體之該重鏈；及轉錄終止子。
  75. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；聚核苷酸，其編碼如請求項5之雙特異性抗體之該輕鏈；及轉錄終止子。
  76. 一種重組宿主細胞，其包括如請求項74及75之表現載體，其中該細胞表現該重鏈及該輕鏈。
  77. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；第一聚核苷酸，其編碼如請求項5之雙特異性抗體之該重鏈；第二聚核苷酸，其編碼如請求項5之雙特異性抗體之該輕鏈；及轉錄終止子。
  78. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：第一轉錄啟動子；第一聚核苷酸，其編碼如請求項5之雙特異性抗體之該重鏈；及第一轉錄終止子；及第二轉錄啟動子；第二聚核苷酸，其編碼如請求項5之雙特異性抗體之該輕鏈；及第二轉錄終止子。
  79. 一種重組宿主細胞，其包括如請求項77或78之表現載體，其中該細胞表現該重鏈及該輕鏈。
  80. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；聚核苷酸，其編碼如請求項24之雙特異性抗體之該重鏈；及轉錄終止子。
  81. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；聚核苷酸，其編碼如請求項24之雙特異性抗體之該輕鏈；及 轉錄終止子。
  82. 一種重組宿主細胞，其包括如請求項80及81之表現載體，其中該細胞表現該重鏈及該輕鏈。
  83. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；第一聚核苷酸，其編碼如請求項24之雙特異性抗體之該重鏈；第二聚核苷酸，其編碼如請求項24之雙特異性抗體之該輕鏈；及轉錄終止子。
  84. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：第一轉錄啟動子；第一聚核苷酸，其編碼如請求項24之雙特異性抗體之該重鏈；及第一轉錄終止子；及第二轉錄啟動子；第二聚核苷酸，其編碼如請求項24之雙特異性抗體之該輕鏈；及第二轉錄終止子。
  85. 一種重組宿主細胞，其包括如請求項83或84之表現載體，其中該細胞表現該重鏈及該輕鏈。
  86. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；聚核苷酸，其編碼如請求項27之雙特異性抗體之該重鏈；及轉錄終止子。
  87. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件： 轉錄啟動子；聚核苷酸，其編碼如請求項27之雙特異性抗體之該輕鏈；及轉錄終止子。
  88. 一種重組宿主細胞，其包括如請求項86及87之表現載體，其中該細胞表現該重鏈及該輕鏈。
  89. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；第一聚核苷酸，其編碼如請求項27之雙特異性抗體之該重鏈；第二聚核苷酸，其編碼如請求項27之雙特異性抗體之該輕鏈；及轉錄終止子。
  90. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：第一轉錄啟動子；第一聚核苷酸，其編碼如請求項27之雙特異性抗體之該重鏈；及第一轉錄終止子；及第二轉錄啟動子；第二聚核苷酸，其編碼如請求項27之雙特異性抗體之該輕鏈；及第二轉錄終止子。
  91. 一種重組宿主細胞，其包括如請求項89或90之表現載體，其中該細胞表現該重鏈及該輕鏈。
  92. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；聚核苷酸，其編碼如請求項55之雙特異性抗體之該重鏈；及 轉錄終止子。
  93. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；聚核苷酸，其編碼如請求項55之雙特異性抗體之該輕鏈；及轉錄終止子。
  94. 一種重組宿主細胞，其包括如請求項92及93之表現載體，其中該細胞表現該重鏈及該輕鏈。
  95. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；第一聚核苷酸，其編碼如請求項55之雙特異性抗體之該重鏈；第二聚核苷酸，其編碼如請求項55之雙特異性抗體之該輕鏈；及轉錄終止子。
  96. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：第一轉錄啟動子；第一聚核苷酸，其編碼如請求項55之雙特異性抗體之該重鏈；及第一轉錄終止子；及第二轉錄啟動子；第二聚核苷酸，其編碼如請求項55之雙特異性抗體之該輕鏈；及第二轉錄終止子。
  97. 一種重組宿主細胞，其包括如請求項95或96之表現載體，其中該細胞表現該重鏈及該輕鏈。
  98. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件： 轉錄啟動子；聚核苷酸，其編碼如請求項39之抗體之該重鏈；及轉錄終止子。
  99. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；聚核苷酸，其編碼如請求項39之抗體之該輕鏈；及轉錄終止子。
  100. 一種重組宿主細胞，其包括如請求項98及99之表現載體，其中該細胞表現該重鏈及該輕鏈。
  101. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；第一聚核苷酸，其編碼如請求項39之抗體之該重鏈；第二聚核苷酸，其編碼如請求項39之抗體之該輕鏈；及轉錄終止子。
  102. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：第一轉錄啟動子；第一聚核苷酸，其編碼如請求項39之抗體之該重鏈；及第一轉錄終止子；及第二轉錄啟動子；第二聚核苷酸，其編碼如請求項39之抗體之該輕鏈；及第二轉錄終止子。
  103. 一種重組宿主細胞，其包括如請求項101或102之表現載體，其中該細胞表現該重鏈及該輕鏈。
  104. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；聚核苷酸，其編碼如請求項47之抗體之該重鏈；及 轉錄終止子。
  105. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；聚核苷酸，其編碼如請求項47之抗體之該輕鏈；及轉錄終止子。
  106. 一種重組宿主細胞，其包括如請求項104及105之表現載體，其中該細胞表現該重鏈及該輕鏈。
  107. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：轉錄啟動子；第一聚核苷酸，其編碼如請求項47之抗體之該重鏈；第二聚核苷酸，其編碼如請求項47之抗體之該輕鏈；及轉錄終止子。
  108. 一種表現載體，其包括下列以操作方式連接之元件：第一轉錄啟動子；第一聚核苷酸，其編碼如請求項47之抗體之該重鏈；及第一轉錄終止子；及第二轉錄啟動子；第二聚核苷酸，其編碼如請求項47之抗體之該輕鏈；及第二轉錄終止子。
  109. 一種重組宿主細胞，其包括如請求項107或108之表現載體，其中該細胞表現該重鏈及該輕鏈。
  110. 一種產生如請求項1之雙特異性抗體之方法，該方法包括：培養如請求項64或67之細胞；及分離由該細胞產生之該雙特異性抗體。
  111. 一種產生如請求項2之雙特異性抗體之方法，該方法包括：培養如請求項70或73之細胞；及 分離由該細胞產生之該雙特異性抗體。
  112. 一種產生如請求項5之雙特異性抗體之方法，該方法包括：培養如請求項76或79之細胞；及分離由該細胞產生之該雙特異性抗體。
  113. 一種產生如請求項24之雙特異性抗體之方法，該方法包括：培養如請求項82或85之細胞；及分離由該細胞產生之該雙特異性抗體。
  114. 一種產生如請求項27之雙特異性抗體之方法，該方法包括：培養如請求項88或91之細胞；及分離由該細胞產生之該雙特異性抗體。
  115. 一種產生如請求項55之雙特異性抗體之方法，該方法包括：培養如請求項94或97之細胞；及分離由該細胞產生之該雙特異性抗體。
  116. 一種產生如請求項39之抗體之方法，該方法包括：培養如請求項100或103之細胞；及分離由該細胞產生之雙特異性抗體。
  117. 一種產生如請求項47之抗體之方法，該方法包括：培養如請求項106或109之細胞；及分離由該細胞產生之雙特異性抗體。
  118. 如請求項110之方法，其中該細胞係原核細胞。
  119. 如請求項118之方法，其中該原核細胞係大腸桿菌(E.coli)細胞。
  120. 如請求項110之方法，其中該細胞係真核細胞。
  121. 如請求項120之方法，其中該真核細胞係哺乳動物細胞。
  122. 如請求項121之方法，其中該哺乳動物細胞係選自由以下組成之群：VERO、HeLa、中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)、W138、BHK、COS-7及MDCK細胞。
  123. 如請求項120之方法，其中該真核細胞係酵母細胞。
  124. 如請求項123之方法，其中該酵母細胞係釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)細胞或甲醇酵母菌(Pichia pastoris)細胞。
  125. 如請求項111之方法，其中該細胞係原核細胞。
  126. 如請求項125之方法，其中該原核細胞係大腸桿菌細胞。
  127. 如請求項111之方法，其中該細胞係真核細胞。
  128. 如請求項127之方法，其中該真核細胞係哺乳動物細胞。
  129. 如請求項128之方法，其中該哺乳動物細胞係選自由以下組成之群：VERO、HeLa、中國倉鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7及MDCK細胞。
  130. 如請求項127之方法，其中該真核細胞係酵母細胞。
  131. 如請求項130之方法，其中該酵母細胞係釀酒酵母菌細胞或甲醇酵母菌細胞。
  132. 如請求項111之方法，其中該細胞係原核細胞。
  133. 如請求項132之方法，其中該原核細胞係大腸桿菌細胞。
  134. 如請求項111之方法，其中該細胞係真核細胞。
  135. 如請求項134之方法，其中該真核細胞係哺乳動物細胞。
  136. 如請求項135之方法，其中該哺乳動物細胞係選自由以下組成之群：VERO、HeLa、中國倉鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7及MDCK細胞。
  137. 如請求項134之方法，其中該真核細胞係酵母細胞。
  138. 如請求項137之方法，其中該酵母細胞係釀酒酵母菌細胞或甲醇酵母菌細胞。
  139. 如請求項112之方法，其中該細胞係原核細胞。
  140. 如請求項139之方法，其中該原核細胞係大腸桿菌細胞。
  141. 如請求項112之方法，其中該細胞係真核細胞。
  142. 如請求項141之方法，其中該真核細胞係哺乳動物細胞。
  143. 如請求項142之方法，其中該哺乳動物細胞係選自由以下組成之群：VERO、HeLa、中國倉鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7及MDCK細胞。
  144. 如請求項141之方法，其中該真核細胞係酵母細胞。
  145. 如請求項144之方法，其中該酵母細胞係釀酒酵母菌細胞或甲醇酵母菌細胞。
  146. 如請求項113之方法，其中該細胞係原核細胞。
  147. 如請求項146之方法，其中該原核細胞係大腸桿菌細胞。
  148. 如請求項113之方法，其中該細胞係真核細胞。
  149. 如請求項148之方法，其中該真核細胞係哺乳動物細胞。
  150. 如請求項149之方法，其中該哺乳動物細胞係選自由以下組成之群：VERO、HeLa、中國倉鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7及MDCK細胞。
  151. 如請求項148之方法，其中該真核細胞係酵母細胞。
  152. 如請求項151之方法，其中該酵母細胞係釀酒酵母菌細胞或甲醇酵母菌細胞。
  153. 如請求項114之方法，其中該細胞係原核細胞。
  154. 如請求項153之方法，其中該原核細胞係大腸桿菌細胞。
  155. 如請求項114之方法，其中該細胞係真核細胞。
  156. 如請求項155之方法，其中該真核細胞係哺乳動物細胞。
  157. 如請求項156之方法，其中該哺乳動物細胞係選自由以下組成之群：VERO、HeLa、中國倉鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7及MDCK細胞。
  158. 如請求項155之方法，其中該真核細胞係酵母細胞。
  159. 如請求項158之方法，其中該酵母細胞係釀酒酵母菌細胞或甲醇酵母菌細胞。
  160. 如請求項115之方法，其中該細胞係原核細胞。
  161. 如請求項160之方法，其中該原核細胞係大腸桿菌細胞。
  162. 如請求項115之方法，其中該細胞係真核細胞。
  163. 如請求項162之方法，其中該真核細胞係哺乳動物細胞。
  164. 如請求項163之方法，其中該哺乳動物細胞係選自由以下組成之群：VERO、HeLa、中國倉鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7及MDCK細胞。
  165. 如請求項162之方法，其中該真核細胞係酵母細胞。
  166. 如請求項165之方法，其中該酵母細胞係釀酒酵母菌細胞或甲醇酵母菌細胞。
  167. 一種如請求項1、2、5、24、26、27、37或55之雙特異性抗體或如請求項39或47之抗體之用途，其用以製造藥劑，為需要該治療之哺乳動物治療特徵在於IL-17A、IL-17F及IL-23中一或多者之表現升高之疾病。
  168. 如請求項167之用途，其中該疾病係多發性硬化(MS)、刺激性腸症候群(IBS)、諸如潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病(Crohn's disease)等發炎性腸病(IBD)、異位性皮膚炎、接觸性皮膚炎、全身性硬化、全身性紅斑狼瘡(SLE)、抗嗜中性球胞質抗體(ANCA)相關性血管炎(AAV)、巨細胞動脈炎、多發性硬化(MS)(例如復發緩解型多發性硬化、繼發進展型多發性硬化、原發進展型多發性硬化及/或進展復發型多發性硬化)、結腸炎、內毒素血症、關節炎、類風濕性關節炎(RA)、骨關節炎、薛格連氏症候群(Sjögren's syndrome)、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、成人呼吸道疾病(ARD)、敗血性休克、多器官衰竭、諸如特發性肺纖維化等發 炎性肺傷害、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、呼吸道高反應性、慢性支氣管炎、過敏性哮喘、濕疹、幽門螺桿菌感染(Helicobacter pylori infection)、由腹膜發炎(例如來自感染、傷害等)所致之腹內黏連及/或膿腫、腎病症候群、特發性脫髓鞘多發性神經病變、格-巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)、器官同種異體移植物排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、狼瘡腎炎、IgA腎病變、糖尿病性腎病、微小病變型疾病(脂性腎變病)、局灶性節段性腎小球硬化症(FSGS)、腎因性全身性纖維化(NSF)、腎因性皮膚纖維化、纖維化膽汁鬱積性肝炎、嗜酸性球性筋膜炎(舒爾曼症候群(Shulman's syndrome))、硬化性黏液水腫(丘疹性黏蛋白沈積症)、硬皮病、硬化萎縮苔癬、POEMs症候群(克[羅]-富[克斯]二氏症候群(Crow-Fukase syndrome)、高槻病(Takatsuki disease)或PEP症候群)、腎病症候群、移植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(來自諸如以下移植體：血液、骨髓、腎、胰臟、肝、原位肝、肺、心臟、腸、小腸、大腸、胸腺、同種異體幹細胞、低強度同種異體移植物、骨、腱、角膜、皮膚、心臟瓣膜、靜脈、動脈、血管、胃及睪丸)、溶骨性疾病(例如多發性骨髓瘤誘導之溶骨性疾病)、囊性纖維化、年齡相關性黃斑變性(AMD；例如濕式AMD及乾式AMD)、肝纖維化、肺纖維化、動脈粥樣硬化、心臟缺血/再灌注傷害、心臟衰竭、心肌炎、心臟纖維化、不良心肌重構、移植排斥、鏈球菌細胞壁(SCW)誘導之關節炎、牙齦炎/牙周炎、皰疹性基質角膜炎、麩質敏感性腸病再狹窄症、川崎病(Kawasaki disease)或免疫介導之腎病。
  169. 一種如請求項1、2、5、24、26、27、37或55之雙特異性抗體或如請求項39或47之抗體之用途，其用以製藥劑，為需要該治療 之哺乳動物抑制發炎。
  170. 如請求項169之用途，其中該發炎與選自由以下組成之群之疾病有關：多發性硬化(MS)(例如復發緩解型多發性硬化、繼發進展型多發性硬化、原發進展型多發性硬化及/或進展復發型多發性硬化)、刺激性腸症候群(IBS)、諸如潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病等發炎性腸病(IBD)、異位性皮膚炎、接觸性皮膚炎、全身性硬化、全身性紅斑狼瘡(SLE)、抗嗜中性球胞質抗體(ANCA)相關性血管炎(AAV)、巨細胞動脈炎、多發性硬化(MS)、結腸炎、內毒素血症、關節炎、類風濕性關節炎(RA)、骨關節炎、薛格連氏症候群、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、成人呼吸道疾病(ARD)、敗血性休克、多器官衰竭、諸如特發性肺纖維化等發炎性肺傷害、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、呼吸道高反應性、慢性支氣管炎、過敏性哮喘、濕疹、幽門螺桿菌感染、由腹膜發炎(例如來自感染、傷害等)所致之腹內黏連及/或膿腫、腎病症候群、特發性脫髓鞘多發性神經病變、格-巴二氏症候群、器官同種異體移植物排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、狼瘡腎炎、IgA腎病變、糖尿病性腎病、微小病變型疾病(脂性腎變病)、局灶性節段性腎小球硬化症(FSGS)、腎因性全身性纖維化(NSF)、腎因性皮膚纖維化、纖維化膽汁鬱積性肝炎、嗜酸性球性筋膜炎(舒爾曼症候群)、硬化性黏液水腫(丘疹性黏蛋白沈積症)、硬皮病、硬化萎縮苔癬、POEMs症候群(克[羅]-富[克斯]二氏症候群、高槻病或PEP症候群)、腎病症候群、移植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(來自諸如以下移植體：血液、骨髓、腎、胰臟、肝、原位肝、肺、心臟、腸、小腸、大腸、胸腺、同種異體幹細胞、低強度同種異體移植物、骨、腱、角膜、皮膚、心臟瓣膜、靜脈、動脈、血管、胃及睪丸)、 溶骨性疾病(例如多發性骨髓瘤誘導之溶骨性疾病)、囊性纖維化、年齡相關性黃斑變性(AMD；例如濕式AMD及乾式AMD)、肝纖維化、肺纖維化、動脈粥樣硬化、心臟缺血/再灌注傷害、心臟衰竭、心肌炎、心臟纖維化、不良心肌重構、移植排斥、鏈球菌細胞壁(SCW)誘導之關節炎、牙齦炎/牙周炎、皰疹性基質角膜炎、麩質敏感性腸病再狹窄症、川崎病及免疫介導之腎病。
  171. 一種組合物，其包括如請求項1、2、5、24、26、27、37或55之雙特異性抗體或如請求項39或47之抗體及醫藥上可接受之載劑。
  172. 一種如請求項171之組合物之用途，其用以製造藥劑，為需要該治療之哺乳動物治療特徵在於IL-17A、IL-17F及IL-23中之一或多者之表現升高之疾病。
  173. 如請求項172之用途，其中該疾病係多發性硬化(MS)(例如復發緩解型多發性硬化、繼發進展型多發性硬化、原發進展型多發性硬化及/或進展復發型多發性硬化)、刺激性腸症候群(IBS)、諸如潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病等發炎性腸病(IBD)、異位性皮膚炎、接觸性皮膚炎、全身性硬化、全身性紅斑狼瘡(SLE)、抗嗜中性球胞質抗體(ANCA)相關性血管炎(AAV)、巨細胞動脈炎、多發性硬化(MS)、結腸炎、內毒素血症、關節炎、類風濕性關節炎(RA)、骨關節炎、薛格連氏症候群、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、成人呼吸道疾病(ARD)、敗血性休克、多器官衰竭、諸如特發性肺纖維化等發炎性肺傷害、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、呼吸道高反應性、慢性支氣管炎、過敏性哮喘、濕疹、幽門螺桿菌感染、由腹膜發炎(例如來自感染、傷害等)所致之腹內黏連及/或膿腫、腎病症候群、特發性脫髓鞘多發性神經 病變、格-巴二氏症候群、器官同種異體移植物排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、狼瘡腎炎、IgA腎病變、糖尿病性腎病、微小病變型疾病(脂性腎變病)、局灶性節段性腎小球硬化症(FSGS)、腎因性全身性纖維化(NSF)、腎因性皮膚纖維化、纖維化膽汁鬱積性肝炎、嗜酸性球性筋膜炎(舒爾曼症候群)、硬化性黏液水腫(丘疹性黏蛋白沈積症)、硬皮病、硬化萎縮苔癬、POEMs症候群(克[羅]-富[克斯]二氏症候群、高槻病或PEP症候群)、腎病症候群、移植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(來自諸如以下移植體：血液、骨髓、腎、胰臟、肝、原位肝、肺、心臟、腸、小腸、大腸、胸腺、同種異體幹細胞、低強度同種異體移植物、骨、腱、角膜、皮膚、心臟瓣膜、靜脈、動脈、血管、胃及睪丸)、溶骨性疾病(例如多發性骨髓瘤誘導之溶骨性疾病)、囊性纖維化、年齡相關性黃斑變性(AMD；例如濕式AMD及乾式AMD)、肝纖維化、肺纖維化、動脈粥樣硬化、心臟缺血/再灌注傷害、心臟衰竭、心肌炎、心臟纖維化、不良心肌重構、移植排斥、鏈球菌細胞壁(SCW)誘導之關節炎、牙齦炎/牙周炎、皰疹性基質角膜炎、麩質敏感性腸病再狹窄症、川崎病或免疫介導之腎病。
  174. 一種如請求項171之組合物之用途，其用以製造藥劑，為需要治療之哺乳動物抑制發炎。
  175. 如請求項174之用途，其中該發炎與選自由以下組成之群之疾病有關：多發性硬化(MS)(例如復發緩解型多發性硬化、繼發進展型多發性硬化、原發進展型多發性硬化及/或進展復發型多發性硬化)、刺激性腸症候群(IBS)、諸如潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病等發炎性腸病(IBD)、異位性皮膚炎、接觸性皮膚炎、全身性硬化、全身性紅斑狼瘡(SLE)、抗嗜中性球胞質抗體(ANCA)相關性 血管炎(AAV)、巨細胞動脈炎、多發性硬化(MS)、結腸炎、內毒素血症、關節炎、類風濕性關節炎(RA)、骨關節炎、薛格連氏症候群、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、成人呼吸道疾病(ARD)、敗血性休克、多器官衰竭、諸如特發性肺纖維化等發炎性肺傷害、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、呼吸道高反應性、慢性支氣管炎、過敏性哮喘、濕疹、幽門螺桿菌感染、由腹膜發炎(例如來自感染、傷害等)所致之腹內黏連及/或膿腫、腎病症候群、特發性脫髓鞘多發性神經病變、格-巴二氏症候群、器官同種異體移植物排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、狼瘡腎炎、IgA腎病變、糖尿病性腎病、微小病變型疾病(脂性腎變病)、局灶性節段性腎小球硬化症(FSGS)、腎因性全身性纖維化(NSF)、腎因性皮膚纖維化、纖維化膽汁鬱積性肝炎、嗜酸性球性筋膜炎(舒爾曼症候群)、硬化性黏液水腫(丘疹性黏蛋白沈積症)、硬皮病、硬化萎縮苔癬、POEMs症候群(克[羅]-富[克斯]二氏症候群、高槻病或PEP症候群)、腎病症候群、移植物抗宿主病(GVHD)、移植物抗宿主病(GVHD)(來自諸如以下移植體：血液、骨髓、腎、胰臟、肝、原位肝、肺、心臟、腸、小腸、大腸、胸腺、同種異體幹細胞、低強度同種異體移植物、骨、腱、角膜、皮膚、心臟瓣膜、靜脈、動脈、血管、胃及睪丸)、溶骨性疾病(例如多發性骨髓瘤誘導之溶骨性疾病)、囊性纖維化、年齡相關性黃斑變性(AMD；例如濕式AMD及乾式AMD)、肝纖維化、肺纖維化、動脈粥樣硬化、心臟缺血/再灌注傷害、心臟衰竭、心肌炎、心臟纖維化、不良心肌重構、移植排斥、鏈球菌細胞壁(SCW)誘導之關節炎、牙齦炎/牙周炎、皰疹性基質角膜炎、麩質敏感性腸病再狹窄症、川崎病及免疫介導之腎病。
  176. 如請求項1、2及26中任一項之雙特異性抗體，其中該IL-17A/F結合實體係結合；(a)IL-17A同二聚體，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-9M、至少5×10-9M、至少1×10-10M、至少5×10-10M、至少8×10-10M或至少至少1×10-11M；(b)IL-17F同二聚體，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-9M、至少5×10-9M、至少1×10-10M、至少2×10-10M、至少3×10-10M、至少4×10-10M、至少5×10-10M或至少1×10-11M；及/或(c)IL-17A/F雜二聚體，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-8M、至少5×10-8M、至少1×10-9M、至少2×10-9M、至少3×10-9M、至少4×10-9M、至少5×10-9M、至少6×10-9M、至少7×10-9M、至少9×10-9M、至少1×10-10M或至少5×10-10M，且其中藉由諸如Biacore等表面電漿共振法量測該結合親和力。
  177. 如請求項1、2及26中任一項之雙特異性抗體，其中該IL-23結合實體係結合IL-23p19，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-9M、至少5×10-9M、至少1×10-10M、至少2×10-10M、至少3×10-10M、至少4×10-10M、至少5×10-10、至少6×10-10、至少7×10-10、至少8×10-10或至少9×10-10、至少1×10-11，其中藉由諸如Biacore等表面電漿共振法量測該結合親和力。
  178. 如請求項1、2及26中任一項之雙特異性抗體，其中該IL-17A/F結合實體係結合：(a)IL-17A同二聚體，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-9M、至少5×10-9M、至少1×10-10M、至少5×10-10M、至少8×10-10M或至少至少1×10-11M； (b)IL-17F同二聚體，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-9M、至少5×10-9M、至少1×10-10M、至少2×10-10M、至少3×10-10M、至少4×10-10M、至少5×10-10M或至少1×10-11M；及/或(c)IL-17A/F雜二聚體，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-8M、至少5×10-8M、至少1×10-9M、至少2×10-9M、至少3×10-9M、至少4×10-9M、至少5×10-9M、至少6×10-9M、至少7×10-9M、至少9×10-9M、至少1×10-10M或至少5×10-10M；且其中該IL-23結合實體係結合IL-23p19，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-9M、至少5×10-9M、至少1×10-10M、至少2×10-10M、至少3×10-10M、至少4×10-10M、至少5×10-10、至少6×10-10、至少7×10-10、至少8×10-10或至少9×10-10、至少1×10-11；且其中藉由諸如Biacore等表面電漿共振法量測該結合親和力。
  179. 如請求項1、2及26中任一項之雙特異性抗體，其中該IL-17A/F結合實體係中和或抑制(a)初代人類小呼吸道上皮細胞(SAEC)中誘導G-CSF之IL-17A，其中IC50為0.5 pm或更小；(b)初代人類小呼吸道上皮細胞(SAEC)中誘導G-CSF之IL-17F，其中IC50為2.0nM或更小、1.5nM或更小、1.4nM或更小、1.3nM或更小、1.2nM或更小、1.1nM或更小或1.0nM或更小；及/或(c)初代人類小呼吸道上皮細胞(SAEC)中誘導G-CSF之IL-17A/F，其中IC50為1.3nM或更小、1.2nM或更小、1.1nM或更小、1.0nM或更小、0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、0.6nM或更小或0.5nM或更小。
  180. 如請求項1、2及26中任一項之雙特異性抗體，其中該IL-17A/F結 合實體係中和或抑制(a)IL-17A在人類初代成纖維細胞(HFFF)中誘導IL-6，其中IC50為0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小、0.1nM或更小、0.09nM或更小、0.08nM或更小、0.07nM或更小、0.06nM或更小、0.05nM或更小、0.04nM或更小、0.03nM或更小、0.02nM或更小或0.01nM或更小；(b)IL-17F在人類初代成纖維細胞(HFFF)中誘導IL-6，其中IC50為30nM或更小、28nM或更小、26nM或更小、25nM或更小、22nM或更小、20nM或更小、19nM或更小、18nM或更小、17nM或更小、16nM或更小、15nM或更小、14nM或更小、13nM或更小、12nM或更小、11nM或更小或10nM或更小；及/或(c)IL-17A/F在人類初代成纖維細胞(HFFF)中誘導IL-6，其中IC50為30nM或更小、28nM或更小、26nM或更小、22nM或更小、20nM或更小、18nM或更小、17nM或更小、16nM或更小、15nM或更小、14nM或更小、13nM或更小、12nM或更小、11nM或更小、10nM或更小、9.5nM或更小、9.4nM或更小、9.3nM或更小、9.2nM或更小、9.1nM或更小或9.0nM或更小。
  181. 如請求項1、2及26中任一項之雙特異性抗體，其中該IL-23結合實體係中和或抑制(a)IL-23在鼠類脾細胞中誘導IL-17A及IL-17F產生，其中IC50為0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小、0.1nM或更小、0.09nM或更小、0.08nM或更小、0.07nM或更小或0.06nM或更小。
  182. 如請求項1、2及26中任一項之雙特異性抗體，其中該IL-23結合實體係中和或抑制IL-23在活化之初代人類T細胞中誘導STAT3磷酸化，其中IC50為0.1nM或更小、0.2nM或更小、0.3nM或更小、0.4nM或更小、0.5nM或更小、0.8nM或更小、0.9nM或更小、0.01nM或更小、0.02nM或更小、0.03nM或更小、0.04nM 或更小或0.05nM或更小。
  183. 如請求項27之單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段結合：(a)IL-17A同二聚體，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-9M、至少5×10-9M、至少1×10-10M、至少5×10-10M、至少8×10-10M或至少至少1×10-11M；(b)IL-17F同二聚體，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-9M、至少5×10-9M、至少1×10-10M、至少2×10-10M、至少3×10-10M、至少4×10-10M、至少5×10-10M或至少1×10-11M；及/或(c)IL-17A/F雜二聚體，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-8M、至少5×10-8M、至少1×10-9M、至少2×10-9M、至少3×10-9M、至少4×10-9M、至少5×10-9M、至少6×10-9M、至少7×10-9M、至少9×10-9M、至少1×10-10M或至少5×10-10M，且其中藉由諸如Biacore等表面電漿共振法量測該結合親和力。
  184. 如請求項27之單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段中和或抑制(a)IL-17A在初代人類小呼吸道上皮細胞(SAEC)中誘導G-CSF，其中IC50為0.5 pm或更小；(b)IL-17F在初代人類小呼吸道上皮細胞(SAEC)中誘導G-CSF，其中IC50為2.0nM或更小、1.5nM或更小、1.4nM或更小、1.3nM或更小、1.2nM或更小、1.1nM或更小或1.0nM或更小；及/或(c)IL-17A/F在初代人類小呼吸道上皮細胞(SAEC)中誘導G-CSF，其中IC50為1.3nM或更小、1.2nM或更小、1.1nM或更小、1.0nM或更小、0.9nM或更小、0.8nM或更小、0.7nM或更小、0.6nM或更小或0.5nM或更小。
  185. 如請求項27之單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段中和或抑制(a)IL-17A在人類初代成纖維細胞(HFFF)中誘導IL-6，其中IC50為0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更小、0.2nM或更小、0.1nM或更小、0.09nM或更小、0.08nM或更小、0.07nM或更小、0.06nM或更小、0.05nM或更小、0.04nM或更小、0.03nM或更小、0.02nM或更小或0.01nM或更小；(b)IL-17F在人類初代成纖維細胞(HFFF)中誘導IL-6，其中IC50為30nM或更小、28nM或更小、26nM或更小、25nM或更小、22nM或更小、20nM或更小、19nM或更小、18nM或更小、17nM或更小、16nM或更小、15nM或更小、14nM或更小、13nM或更小、12nM或更小、11nM或更小或10nM或更小；及/或(c)IL-17A/F在人類初代成纖維細胞(HFFF)中誘導IL-6，其中IC50為30nM或更小、28nM或更小、26nM或更小、22nM或更小、20nM或更小、18nM或更小、17nM或更小、16nM或更小、15nM或更小、14nM或更小、13nM或更小、12nM或更小、11nM或更小、10nM或更小、9.5nM或更小、9.4nM或更小、9.3nM或更小、9.2nM或更小、9.1nM或更小或9.0nM或更小。
  186. 如請求項47之單株抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段結合IL-23p19，其中結合親和力(KD1)為至少1×10-9M、至少5×10-9M、至少1×10-10M、至少2×10-10M、至少3×10-10M、至少4×10-10M、至少5×10-10、至少6×10-10、至少7×10-10、至少8×10-10或至少9×10-10、至少1×10-11，其中藉由諸如Biacore等表面電漿共振法量測該結合親和力。
  187. 如請求項47之單株抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段中和或抑制(a)IL-23在鼠類脾細胞中誘導IL-17A及IL-17F產生，其中IC50為0.5nM或更小、0.4nM或更小、0.3nM或更 小、0.2nM或更小、0.1nM或更小、0.09nM或更小、0.08nM或更小、0.07nM或更小或0.06nM或更小。
  188. 如請求項47之單株抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段中和或抑制IL-23在活化之初代人類T細胞中誘導STAT3磷酸化，其中IC50為0.1nM或更小、0.2nM或更小、0.3nM或更小、0.4nM或更小、0.5nM或更小、0.8nM或更小、0.9nM或更小、0.01nM或更小、0.02nM或更小、0.03nM或更小、0.04nM或更小或0.05nM或更小。
  189. 一種特異性結合IL-23p19之分離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係結合IL-23p19上包括第一表位及第二表位之不連續表位，其中該第一表位係由SEQ ID NO：6之胺基酸殘基33至59中之至少一者組成且該第二表位係由SEQ ID NO：6之胺基酸殘基89至125中之至少一者組成。
  190. 如請求項189之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段至少結合至該第一表位之SEQ ID NO：6之胺基酸殘基54。
  191. 如請求項189之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段至少結合至該第一表位之SEQ ID NO：6之胺基酸殘基55。
  192. 如請求項189之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段至少結合至該第一表位之SEQ ID NO：6之胺基酸殘基54及55。
  193. 如請求項189之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段至少結合至該第二表位之SEQ ID NO：6之胺基酸殘基116。
  194. 如請求項189之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段至少結合至該第一表位之SEQ ID NO：6之胺基酸殘基54及55，且至少結合至該第二表位之SEQ ID NO：6之胺基酸殘基116。
  195. 如請求項189之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係雙特異性抗體或雙特異性抗原結合片段。
  196. 如請求項189至195中任一項之抗體或抗原結合片段，其中藉由蛋白質分解消化法、氫/氘交換質譜及丙胺酸誘變法中之至少一者測定IL-23p19上之該不連續表位。
  197. 如請求項189至195中任一項之抗體或抗原結合片段，其中藉由蛋白質分解消化法測定IL-23p19上之該不連續表位。
  198. 如請求項189至195中任一項之抗體或抗原結合片段，其中藉由氫/氘交換質譜或丙胺酸誘變法測定IL-23p19上之該不連續表位。
  199. 如請求項189至195中任一項之抗體或抗原結合片段，其中藉由丙胺酸誘變法測定IL-23p19上之該不連續表位。
  200. 一種特異性結合IL-23p19之分離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段結合IL-23p19上包括第一表位及第二表位之不連續表位，其中該抗體或抗原結合片段至少結合至該第一表位之SEQ ID NO：6之胺基酸殘基54及55，且至少結合至該第二表位之SEQ ID NO：6之胺基酸殘基116。
  201. 如請求項200之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係雙特異性抗體或雙特異性抗原結合片段。
  202. 如請求項200或201之抗體或抗原結合片段，其中藉由蛋白質分解消化法、氫/氘交換質譜及丙胺酸誘變法中之至少一者測定IL-23p19上之該不連續表位。
  203. 如請求項200或201之抗體或抗原結合片段，其中藉由蛋白質分解消化法測定IL-23p19上之該不連續表位。
  204. 如請求項200或201之抗體或抗原結合片段，其中藉由氫/氘交換質譜或丙胺酸誘變法測定IL-23p19上之該不連續表位。
  205. 如請求項200或201之抗體或抗原結合片段，其中藉由丙胺酸誘變法測定IL-23p19上之該不連續表位。
  206. 如請求項196之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係雙特異性抗體或雙特異性抗原結合片段。
  207. 一種分離的IL-17A/F結合實體，其特異性結合在至少包括SEQ ID NO：2之胺基酸殘基108(Tyr)之表位上之IL-17A，其中該IL-17A/F結合實體係單株抗體或其抗原結合片段。
  208. 如請求項207之IL-17A/F結合實體，其中藉由丙胺酸誘變法測定IL-17A上之該表位。
  209. 如請求項207之IL-17A/F結合實體，其中藉由X射線結晶學測定IL-17A上之該表位。
  210. 如請求項207之IL-17A/F結合實體，其中藉由丙胺酸誘變法及X射線結晶學測定IL-17A上之該表位。
  211. 如請求項207至210中任一項之IL-17A/F結合實體，其中該IL-17A表位係連續或不連續表位。
  212. 一種分離的IL-17A/F交叉反應性單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係結合在至少包括SEQ ID NO：2之胺基酸殘基108(Tyr)之表位上之IL-17A。
  213. 如請求項212之單株抗體或其抗原結合片段，其中藉由丙胺酸誘變法測定IL-17A上之該表位。
  214. 如請求項212之單株抗體或其抗原結合片段，其中藉由X射線結晶學測定IL-17A上之該表位。
  215. 如請求項212至214中任一項之單株抗體或其抗原結合片段，其中該IL-17A表位係連續或不連續表位。
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