CN107384960B

CN107384960B - 基于复制缺陷性重组腺病毒携带il-17结合分子转基因载体及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN107384960B
Application number: CN201710614102.6A
Authority: CN
Inventors: 邹昊玉; 顾莉萍; 吴小江
Original assignee: Jiyounuo Shanghai Gene Technology Co ltd
Current assignee: Jiyounuo Shanghai Gene Technology Co ltd
Priority date: 2017-07-25
Filing date: 2017-07-25
Publication date: 2020-06-12
Anticipated expiration: 2037-07-25
Also published as: CN107384960A

Abstract

本发明公开了一种基于复制缺陷性重组腺病毒携带IL‑17结合分子转基因载体，包括：含氨苄抗性基因Amp序列；原核复制子pUC Ori序列；loxP位点；腺病毒5 terminal ITR；腺病毒3 terminal ITR；Hgh‑polyA；SV40 polyA；以上构建存储于腺病毒骨架质粒上；CMV启动子；IL‑6信号肽；含有IL‑17单链抗体轻链和重链以及单链抗体铰链Linker的IL‑17抗体；以上组合成表达IL‑17抗体克隆至上述腺病毒骨架质粒。此外，本发明还公开了该载体的制备方法和在制备治疗肝癌的药物中的应用。该载体分子量小，容易穿过血管壁、组织，更容易进入实体肿瘤微环境中发挥作用，且可提高IL‑17抗体的稳定性，延长半衰期，提高中和IL‑17的效果，进而提高治疗效果。

Description

基于复制缺陷性重组腺病毒携带IL-17结合分子转基因载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于医学生物领域，具体涉及一种转基因载体，尤其涉及基于复制缺陷性重组腺病毒携带IL-17结合分子转基因载体。此外，本发明还涉及该载体的制备方法和应用。

背景技术

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，全球每年被确诊为肝癌的人数达到78万，而中国是全球肝癌患病人数最多的国家，占到全球肝癌患病人数的50％。2015年中国新确诊肝癌患者达到44.6万人，同年死于肝癌患者达到37.5万(Cancer Statistics in China,2015)。

导致肝癌发生的因素主要有肝硬化、乙型、丙型肝炎、酒精及非酒精性脂肪肝等。肝癌的主要进程为慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化进而发展为肝癌。肝癌起病隐匿，初期症状不明显，多为体检普查及肝病随访时发现。一旦症状出现，常常已经进入中晚期。

肝癌患者中90％为肝细胞肝癌，恶性程度高，预后差。传统的治疗方式主要有手术治疗(肝切除、肝移植)、介入疗法(射频消融、化学栓塞)、化疗等。手术及介入疗法仅适用于临床分级处于早期的患者，且PST评分及Child-Pugh评级达到一定标准的患者，适用于手术及介入治疗的病人仅占所用肝癌患者的30％，且治愈率在30％-40％。(Patterns oftreatment and costs of intermediate and advanced hepatocellular carcinomamanagement in four Italian centers)(Global patterns of hepatocellularcarcinoma management from diagnosis to death:the BRIDGE Study)随着生物技术的发展，出现了分子靶向药物，抗体、疫苗、细胞治疗、基因治疗等生物治疗手段。目前中晚期肝癌治疗的一线药物即为小分子靶向药—索拉菲尼。索拉菲尼为一种多激酶抑制剂，在治疗效果上，其中位生存期为6.5个月，响应率DCR为53％，部分响应率仅为3.3％(Effi cacyand safety of sorafenib in patients in the Asia-Pacifi c region with advancedhepatocellular carcinoma:a phase III randomised,double-blind,placebo-controlled trial)。

在肿瘤微环境中，细胞因子可直接激活免疫效应细胞或刺激肿瘤基质细胞，为淋巴细胞的募集产生趋化因子和粘附分子。这些功能表明根据不同的肿瘤微环境，针对细胞因子也可以是肿瘤免疫治疗的一种有效途径。淋巴细胞充分浸润到肿瘤组织是免疫治疗成功的关键，在各类癌症的治疗中TIL的存在与良好的预后密切相关。细胞因子可以募集淋巴细胞尤其是T细胞进入肿瘤组织，将肿瘤微环境从免疫抑制状态转换到免疫增强状态。

IL-17的主要来源为CD4T细胞亚型Th17细胞，其他一些免疫细胞(如NK、NKT、CD8+T细胞等)也能分泌IL-17A。(IL-17Family Cytokines and the Expanding Diversity ofEffector T Cell Lineages)IL-17与许多疾病相关，如类风湿性关节炎、银血病、哮喘、骨关节炎等。IL-17受体不仅仅存在于肝细胞上，在肝组织微环境中的Kuffers细胞、上皮细胞、型状细胞等基质细胞表面都有表达。近来越来越多的研究发现IL-17在癌症中，由其是肝癌中发生了重要作用。IL-17可通过多个通路诱导肝纤维化的发生；IL-17可促进中性粒细胞在肝癌组织聚集，而中性粒细胞在肝组织的水平往往与肝癌预后密切相关；IL-17还能诱导肝癌新生血管的生成；IL-17在肝癌患者肝癌组织的表达水平与其预后密切相关；一些研究在动物水平显示抑制IL-17在肝癌组织的水平，显示出了抑制肝癌生长的效果(Inhibition of IL-17as a Pharmacological Approach for IBD、From NAFLD to HCC:Is IL-17the crucial link？、Increased intratumoral IL-17-producing cellscorrelate with poor survival in hepatocellular carcinoma patients、Interleukin-17Signaling in Inflammatory,Kupffer Cells,and Hepatic StellateCells Exacerbates Liver Fibrosis in Mice)。

目前基因治疗应用的病毒载体主要有腺病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体等。腺病毒载体应用广泛，常被用于基因治疗、疫苗及外源基因表达等。在基因治疗中，腺病毒载体由于其具有广泛高效的感染性、良好的转基因容量、容易得到高滴度及治疗时对较高剂量都有良好的耐受性等优点，成为应用最为广泛的一种载体，已有438项临床实验，占所有种类病毒载体的23.3％。其中，约70％都是针对癌症的治疗而在腺病毒当中，C类的第5血清型(Ad5)是应用最为广泛的，也是研究最为透彻的一类(1.Ginn,S.L.,Alexander,I.E.,Edelstein,M.L.,Abedi,M.R.&Wixon,J.Gene therapy clinical trials worldwideto 2012-an update.The journal of gene medicine 15,65-77,doi:10.1002/jgm.2698(2013)；2.Pesonen,S.,Kangasniemi,L.&Hemminki,A.Oncolytic adenoviruses for thetreatment of human cancer:focus on translational and clinical data.Molecularpharmaceutics 8,12-28,doi:10.1021/mp100219n(2011).)。

对于应用于肝癌基因治疗的载体有很多种，不尽相同，组成、组织特异性、载体容量等，但基本上可归为病毒载体及非病毒载体(物理载体)两类。目前为止，病毒载体依然是基因治疗中最为有效的递送系统。其中腺病毒由于其具有广泛高效的感染性、良好的转基因容量、容易得到高滴度及治疗时对较高剂量都有良好的耐受性，在肝癌基因治疗中显示出了明显的优越性。腺病毒载体进行治疗时，不会将外源基因整合到人基因组当中，降低了其他病毒载体(如慢病毒载体)在治疗过程中随机插入基因组所产生的插入突变带来的不良后果。腺病毒对于分裂及非分裂期的细胞都具有感染效力，5型腺病毒具有较其他腺病毒类型更广泛的感染细胞类型。由于病毒载体可改造性很高，所以应用于肝癌基因治疗的策略很多，如携带抑癌基因(p53、p16等)、自杀基因、干扰RNA，转录因子等通过不同机制来治疗肝癌。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供基于复制缺陷性重组腺病毒携带IL-17结合分子转基因载体，该载体分子量小，容易穿过血管壁、组织，更容易进入实体肿瘤微环境中发挥作用，且可提高IL-17抗体的稳定性，延长半衰期，提高中和IL-17的效果，进而提高治疗效果。

本发明要解决的技术问题之二是提供该基于复制缺陷性重组腺病毒携带IL-17结合分子转基因载体的制备方法。

本发明要解决的技术问题之三是提供该基于复制缺陷性重组腺病毒携带IL-17结合分子转基因载体在制备治疗肝癌的药物中的应用。本发明采用腺病毒载体作为肝癌基因治疗载体可利用病毒本身的在感染肝组织细胞后，由肝组织细胞分泌IL-17抗体到肝癌微环境，这样可以提高IL-17抗体的利用效率，降低治疗时进入机体后机体对其代谢及清除。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供一种基于复制缺陷性重组腺病毒携带IL-17结合分子转基因载体，包括：含氨苄抗性基因Amp序列，如SEQ ID NO.1所示；原核复制子pUC Ori序列，如SEQ ID NO.2所示；loxP位点，如SEQ ID NO.3所示；腺病毒5terminal ITR，如SEQ IDNO.4所示；腺病毒3terminal ITR，如SEQ ID NO.5所示；Hgh-polyA，如SEQ ID NO.6所示；SV40polyA，如SEQ ID NO.7所示；以上构建存储于腺病毒骨架质粒上；

CMV启动子，如SEQ ID NO.8所示；IL-6信号肽，如SEQ ID NO.9所示；含有IL-17单链抗体轻链和重链以及单链抗体铰链Linker的IL-17抗体；所述IL-17单链抗体轻链VL，如SEQ ID NO.10所示；所述IL-17单链抗体重链VH，如SEQ ID NO.12所示；以上组合成表达IL-17抗体克隆至上述腺病毒骨架质粒。

作为本发明优选的技术方案，该载体还包括：人铰链区hIgG hinge，如SEQ IDNO.31所示。

作为本发明优选的技术方案，所述载体为5型腺病毒载体；所述单链抗体铰链Linker的序列如SEQ ID NO.11所示。

IL-17抗体指所有含有可结合IL-17的重链及轻链的所有分子形式(如：scFv，scFv-Fc，scFv-CH3，scFv-linker-scFv)。

scFv，即IL-17单链抗体轻链VL和IL-17单链抗体重链VH通过单链抗体铰链Linker连接，见图1B；

scFv-CH3，即所述含有IL-17单链抗体轻链和重链以及单链抗体铰链Linker的IL-17抗体还包括连接IL-17单链抗体重链VH的人IgG1的CH3，如SEQ ID NO.13所示(见图1C)。

scFv-Fc，即所述含有IL-17单链抗体轻链和重链以及单链抗体铰链Linker的IL-17抗体还包括连接IL-17单链抗体重链VH的人IgG1的Fc段，如SEQ ID NO.14所示(见图1A)。

scFv-linker-scFv，即所述含有IL-17单链抗体轻链和重链以及单链抗体铰链Linker的IL-17抗体具有双IL-17结合的scFv结构，所述IL-17单链抗体轻链VL为2个，所述IL-17单链抗体重链VH为2个，所述单链抗体铰链Linker为3个；其中单个IL-17单链抗体轻链VL与单个IL-17单链抗体重链VH通过单个单链抗体铰链Linker连接构成一组scFv结构，两组scFv结构之间通过另一个单链抗体铰链Linker连接(见图1D)。

在本发明的第二方面，提供所述的基于复制缺陷性重组腺病毒携带IL-17结合分子转基因载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)将含氨苄抗性基因Amp序列，如SEQ ID NO.1所示；原核复制子pUC Ori序列，如SEQ ID NO.2所示；loxP位点，如SEQ ID NO.3所示；腺病毒5terminal ITR，如SEQ ID NO.4所示；腺病毒3terminal ITR，如SEQ ID NO.5所示；Hgh-polyA，如SEQ ID NO.6所示；SV40polyA，如SEQ ID NO.7所示构建存储于腺病毒骨架质粒上；

(2)将CMV启动子，如SEQ ID NO.8所示；IL-6信号肽，如SEQ ID NO.9所示；含有IL-17单链抗体轻链和重链以及单链抗体铰链Linker的IL-17抗体；所述IL-17单链抗体轻链VL，如SEQ ID NO.10所示；所述IL-17单链抗体重链VH，如SEQ ID NO.12所示；组合成表达IL-17抗体设计方案，经过酶切、连接、重组反应克隆至腺病毒骨架中，得到表达IIL-17抗体重组腺病毒质粒；

(3)将得到的重组腺病毒质粒与腺病毒包装质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共同转染HEK293细胞，在HEK293细胞中进行基因转录表达后，包装成功重组腺病毒载体会在细胞中收集包含的重组腺病毒载体的细胞；

(4)将得到的含有重组腺病毒细胞进行纯化，得到重组腺病毒病毒载体。

作为本发明优选的技术方案，步骤(2)中，将CMV启动子、IL-6信号肽、IL-17单链抗体轻链VL、单链抗体铰链Linker、IL-17单链抗体重链VH构建进入重组腺病毒载体，由CMV启动子启动IL-17抗体的表达；IL-6信号肽位于IL-17scFv序列的N端，用于引导IL-17抗体分泌到细胞外；IL-17抗体轻链VL、单链抗体铰链Linker、IL-17单链抗体重链VH组合成IL-17抗体，用于中和IL-17；当IL-17抗体与炎症因子IL-17结合时，会阻止IL-17与肝癌细胞及肝组织微环境中其他细胞上的IL-17R结合，从而抑制肝癌细胞成长、抑制肝癌细胞及肝组织其他细胞趋化因子的分泌、抑制肝癌组织血管生成、促进肝癌微环境中IL-17的代谢清除一系列生物学效应。

作为本发明优选的技术方案，步骤(4)中，所述纯化方法为氯化铯密度梯度离心法。此方法可去除细胞成分及缺陷性病毒颗粒，得到高滴度的病毒载体。

在本发明的第三方面，提供上述基于复制缺陷性重组腺病毒携带IL-17结合分子转基因载体在制备治疗肝癌的药物中的应用。任何药物载体携带IL-17结合分子，慢病毒载体、腺相关病毒载体、单纯孢疹病毒载体等病毒载体；脂质体等非病毒载体；溶瘤病毒等。任何应用IL-17抗体与其他药物或治疗方式联用，治疗肝癌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明中腺病毒载体所表达的IL-17抗体IL-17scFv-Fc(见图1A)分子量(40KD)；IL-17scFv(见图1B)分子量(21KD)；IL-17scFv-CH3(见图1C)分子量(32KD)；IL-17scFv-Linker-IL-17scFv(见图1D)分子量(43KD)较全长单克隆抗体(如图2所示)(150KD)分子量小，容易穿过血管壁、组织，更容易进入实体肿瘤微环境中发挥作用。

应用的人源的hIgG1的Fc段(如图1A所示)旨在降低免疫原性低，应用于人体不易产生抗异种蛋白反应。经实验验证，在scFv基础上添加hIgG1的Fc段出乎意料地可提高IL-17抗体的稳定性，延长半衰期，提高中和IL-17的效果，提高IL-17抗体对IL-17的封闭作用，进而提高治疗效果。

应用的人源的hIgG1的CH3段(图1C所示)旨在降低免疫原性低，应用于人体不易产生抗异种蛋白反应。经实验验证，在scFv基础上添加hIgG1的CH3段出乎意料地可提高IL-17抗体的稳定性，延长半衰期，提高中和IL-17的效果，提高IL-17抗体对IL-17的封闭作用，进而提高治疗效果。

构建IL-17scFv-Linker-IL-17scFv结构的IL-17抗体，具有双IL-17结合的scFv结构(见图1D)，可以增加抗体结合能力；分子质量较单独IL-17scFv分子质量增加，经实验验证，出乎意料地可以提高抗体的稳定性，延长半衰期，提高中和IL-17的效果，提高IL-17抗体对IL-17的封闭作用，进而提高治疗效果。

本发明所采用的5型腺病毒载体(图3所示)为除去野生型病毒E1、E3区，E1区为腺病毒复制所必须的部分，当去除E1区作为病毒载体时，其已经失去了病毒自主复制的能力，降低了病毒不受控制的复制所带来的治疗风险。本发明所用的腺病毒载体为第一代腺病毒载体，是目前无论在基础研究还是临床中应用最为广泛的一代载体。此类病毒载体去除了E1区，病毒复制所必须的部分，使病毒不能在感染细胞内自主复制，提高使用安全性；为了提高载体容量，同时将E3区也去除。

本发明采用腺病毒载体作为肝癌基因治疗载体可利用病毒本身的在感染肝组织细胞后，由肝组织细胞分泌IL-17抗体到肝癌微环境，这样可以提高IL-17抗体的利用效率，降低治疗时进入机体后机体对其代谢及清除。

本发明应用病毒载体利用其天然感染细胞的能力，较脂质体等其他非基因载体有更优越的感染效率，生物相容性好。

本发明采用腺病毒载体携带IL-17抗体旨在改善肿瘤免疫微环境，改善肿瘤局部免疫抑制状态。

本发明利用复制缺陷型腺病毒载体携带IL-17抗体旨在中和肝癌组织中IL-17，促进IL-17细胞因子的代谢清除，阻止IL-17与IL-17受体IL-17R结合而引发的促肝癌发生发展的作用。本发明采用腺病毒载体携带IL-17抗体，在肝癌组织局部微环境中表达IL-17抗体来中和IL17验证因子，阻止了IL-17与IL-17受体的结合。可降低肿瘤局部CXCL1、CXCL5、CXCL6、CXCL8等趋化因子水平，抑制肝癌组织血管的生成；抑制中性粒细胞聚集；抑制肿瘤生长，降低肿瘤负荷、延长对象生存期。

本发明所述的携带IL-17抗体的复制缺陷型重组腺病毒载体用于肝肿瘤大小减小和/或肝肿瘤数减少、防止肿瘤大小增大和/或肿瘤数增加、防止、减慢和/或阻止转移进程、延长对象的总体生存时间、延长对象的无进展生存期、防止肝肿瘤的复发、防止肝肿瘤转移的复发、防止HCC衍生肿瘤的复发、防止HCC衍生肿瘤转移的复发。

本发明所设计的IL-17抗体也可用于慢病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒等其他病毒载体及脂质体等非病毒载体。

本发明采用的腺病毒包装系统是无辅助病毒的二质粒包装系统，通过两个质粒共同转染至HEK293细胞中，产生重组腺病毒载体。重组后的腺病毒载体是复制缺陷型载体，不能整合到基因组中，一次性使用，无法在自主复制和增殖，安全性有很大提高。

本发明所构建的腺病毒载体用于肝癌的治疗，给药方式可以为静脉全身给药、肝总动脉给药、瘤内给药。

附图说明

图1为本发明所述的IL-17抗体的示意图，其中，图1A是IL-17抗体的基本结构图，图1B、图1C、图1D是IL-17抗体的其他形式；

图2为传统全长单克隆抗体结构图；

图3为本发明采用5型腺病毒载体的示意图；

图4为本发明实施例1中构建本发明所述的重组腺病毒载体的构建流程图。其中，图4A是腺病毒骨架质粒PMT61的结构示意图；图4B是ADIL-17-001质粒的结构示意图；图4C是ADIL-17-002质粒的结构示意图；图4D是ADIL-17-003质粒的结构示意图；图4E是ADIL-17-004质粒的结构示意图；图4F是腺病毒包装质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre；

图5为本发明实施例1中重组腺病毒质粒PMT61的酶切预测结果及酶切琼脂糖凝胶电泳图；其中，图5A是重组腺病毒质粒PMT61的酶切预测结果示意图，图5B是重组腺病毒质粒PMT61的酶切琼脂糖凝胶电泳图；图5A中lane1是1kb DNA ladder Marker：条带从上到下依次为：10kb、8Kb、6kb、5Kb、4kb、3.5Kb、3Kb、2.5kb、2Kb、1.5kb、1Kb、750bp、500bp、250bp；图5A中lane2是PMT61的XbaI和ClaI酶切预测：条带为3911bp；图5B中lane1是1kb DNAladder Marker的电泳结果；图5B中lane2是PMT61的XbaI和ClaI酶切电泳结果；

图6是本发明实施例1中重组腺病毒质粒ADIL-17-004的片段d的PCR预测结果及PCR琼脂糖凝胶电泳图；其中，图6A是重组腺病毒质粒ADIL-17-004的片段d的PCR预测结果示意图，图6B是重组腺病毒质粒ADIL-17-004的片段d的PCR琼脂糖凝胶电泳图；图6A中lane1是1kb DNA ladder Marker：条带从上到下依次为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；图6A中lane2是ADIL-17-004的片段d的PCR预测：条带为881bp；图6B中lane1是1kb DNA ladder Marker的电泳结果；图6B中lane2是ADIL-17-004的片段d的PCR产物电泳结果；

图7是本发明实施例1中重组腺病毒质粒ADIL-17-004的片段e的PCR预测结果及PCR琼脂糖凝胶电泳图；其中，图7A是重组腺病毒质粒ADIL-17-004的片段e的PCR预测结果示意图；图7B是重组腺病毒质粒ADIL-17-004的片段e的PCR琼脂糖凝胶电泳图；图7A中lane1是1kb DNA ladder Marker：条带从上到下依次为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；图7A中lane2是ADIL-17-004的片段e的PCR预测：条带为715bp；图7B中lane1是1kb DNA ladder Marker的电泳结果；图7B中lane2是ADIL-17-004的片段e的PCR产物电泳结果；

图8是本发明实施例1中重组腺病毒质粒ADIL-17-004用001-F3/001-R3鉴定预测结果(A)及菌鉴定琼脂糖凝胶电泳图(B)；其中，图8A是重组腺病毒质粒ADIL-17-004用001-F3/001-R3鉴定预测结果示意图；图8B是重组腺病毒质粒ADIL-17-004菌鉴定琼脂糖凝胶电泳图；图8A中lane1是1kb DNA ladder Marker：条带从上到下依次为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；图8A中lane2是ADIL-17-004用001-F3/001-R3鉴定预测：条带为1716bp；图8B中lane1是1kb DNA ladder Marker的电泳结果；图8B中lane2是ADIL-17-004用001-F3/001-R3鉴定电泳结果；

图9是本发明实施例4中IL-17抗体表达在转录水平检测结果示意图；

图10为本发明实施例5中构建IL-17抗体与IL-17结合能力检测结果示意图；细胞上清浓缩液原液、梯度稀释10x、100x、1000x后行ELISA的检测结果。

图11为本发明实施例6中过表达IL-17肝癌细胞系Hep3B与正常Hep3B细胞增殖能力MTT结果示意图。

图12为本发明实施例7中重组腺病毒质粒AdIL-17-001、AdIL-17-002、AdIL-17-003、AdIL-17-004稳定性检测结果示意图，检测方式ELISA。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。

实施例1构建重组腺病毒载体

一、材料

1、腺病毒骨架质粒PMT61，腺病毒包装质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre，HEK293细胞、同源重组酶由世翱(上海)生物医药科技有限公司提供；含氨苄抗性基因Amp序列(SEQ IDNO.1)、原核复制子pUC Ori序列(SEQ ID NO.2)、loxP位点(SEQ ID NO.3)、腺病毒5terminal ITR，如SEQ ID NO.29所示；腺病毒3terminal ITR，如SEQ ID NO.30所示；Hgh-polyA(SEQ ID NO.6)、SV40polyAV(SEQ ID NO.7)构建存储于腺病毒骨架质粒PMT61上；

2、引物：根据引物设计原则设计扩增DNA片段和靶位点所需的引物，该引物由上海生物公司合成，具体为：

001-F1：5’-ACCGTCAGATCTCTAGAAGCCACCATGAACTCCTTCTCC-3’(SEQ ID NO.15)

001-R1：5’-AGAGGTTGATTATCGATTCATTTACCCGGAGACAGGG-3’(SEQ ID NO.16)

004-R1：5’-TCGCAGCTTTTCGGTTCGCTGCTCACGGTCACCAG-3’(SEQ ID NO.22)

QPCR引物005-F1:ACCGATTTTACCCTGACCATTAG(SEQ ID NO.23)

QPCR引物005-R1:GCTGCTGCCATACTGCTG(SEQ ID NO.24)

004-F2：5’-GAACCGAAAAGCTGCGACAAAACTCACACATGCCC-3’(SEQ ID NO.25)

002-R1：5’-AGAGGTTGATTATCGATTCAGCTGCTCACGGTCAC-3’(SEQ ID NO.26)

004-R2：5’-GAGGTTGATTATCGATTCATTTACCCGGAGACAGGG-3’(SEQ ID NO.27)

004-F1：5’-ACCGTCAGATCTCTAGAAGCCACCATGAACTCCTTCTCCACAAGC-3’(SEQ IDNO.28)

001-F3：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’(SEQ ID NO.29)

001-R3：5’-GAAATTTGTGATGCTATTGC-3’(SEQ ID NO.30)

3、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ IDNO.30、SEQ ID NO.31所示的DNA序列由上海生物公司合成，并以寡核苷酸干粉或者质粒形式保存；

4、XbaI和ClaI限制性内切酶，T4DNA连接酶均购自NEB公司；

5、高保真酶PrimeSTAR、RN购自Takara公司；

6、0.22μm-0.8μm PES滤器购自millipore公司；

7、质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自MN公司；

8、感受态细胞TOP10购自tiangen公司；

9、NaCl、KCl、Na₂HPO₄.12H₂O、KH₂PO₄、Trypsin、EDTA、CaCl₂、NaOH、PEG6000均购自上海生工；

10、Opti-MEM、FBS、DMEM、、1640、Hepes、购自invitrogen公司；

11、Biotinylated protein L购自GeneScript公司；

12.ECL+plusTM Western blotting system购自Amersham公司；

13、DNeasy试剂盒购自上海捷瑞公司；

14、phycoerythrin(PE)-conjugated streptavidin购自BD Bioscience公司；

15、SA-HRP购自上海翊圣公司；

16、人IL-17验证因子购自ThermoFisher公司。

二、重组腺病毒载体的构建方法。

参见图4，本发明所述重组腺病毒载体的构建方法如下：

1、将人CMV启动子、IL-6信号肽、IL-17单链抗体轻链VL、单链抗体铰链Linker、IL-17单链抗体重链VH、人IgG1的Fc段(或人IgG1的CH3)、hIgG hinge构建成表达IL-17抗体克隆至病毒骨架质粒PMT61，分别得到重组腺病毒质粒pse2784、pse2887、pse2888、pse2889。

(1)将腺病毒骨架质粒PMT61使用XbaI和ClaI限制性内切酶进行双酶切，产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认3911bp的片段V1(如图5所示)，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；

表1琼脂糖凝胶回收步骤

(2)用引物001-F1和001-R1以合成的ATI21(SEQ ID NO.19)为模板PCR得片段a，引物001-F1和002-R1以合成的ATI20(SEQ ID NO.20)为模板PCR得片段b，引物001-F1和002-R1以ATI19(SEQ ID NO.21)为模板PCR得片段c，PCR使用表2中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳确认，之后割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；

(3)用引物004-F1和004-R1以合成的ATI17(SEQ ID NO.17)为模板，使用表2中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃2min)*35cycle，72℃10min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认881bp的片段d(见图6)，用引物004-F2和004-R2以合成的ATI18(SEQ ID NO.18)为模板PCR得长度715bp的片段e(见图7)，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；

试剂	体积(μl)
		H2O	32.5
5×Bμffer(with Mg2+)	10
		dNTP(各2.5mM)	4
Primer1(+)(10μM)	1
		Primer2(－)(10μM)	1
Template	1
		PrimeSTAR	0.5

表2 50μl PCR反应体系

(18)DNA片段V1、d、e；V1、a；V1、b；V1、c分别重组得重组质粒pse2784(携带图1A中抗体结构)、pse2887(携带图1C中抗体结构)、pse2888(携带图1D中抗体结构)、pse2889(携带图1B中抗体结构)的步骤：将DNA片段V1、a；V1、b；V1、c；V1、d、e分别以5μl总体积且摩尔比1:1:1:1的比例加入Eppendorf管内，加入同源重组酶反应液15μl，混匀后在42℃孵育30分钟，转移至冰上放置2-3分钟，将反应液加入50μl TOP10中，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟，将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟，每管加900μl LB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏，取100μl的转化菌液涂布于Amp LB琼脂平板上，倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。挑取克隆，对菌落PCR鉴定，鉴定正确的克隆即为重组腺病毒质粒。例如pse2784，用引物001-F3和001-R3对正确的克隆进行PCR鉴定(见图8)。

实施例2重组腺病毒载体AdIL-17-001、AdIL-17-002、AdIL-17-003、AdIL-17-004(分别对应重组质粒pse2889(携带图1B中抗体结构)、pse2887(携带图1C中抗体结构)、pse2888(携带图1D中抗体结构)、pse2784(携带图1A中抗体结构))的包装及扩增

一、重组腺病毒载体包装

1、完全培养基：取出预热好的新鲜培养基，加入10％FBS+5ml青霉素-链霉素，上下颠倒混匀即可使用

2、PBS溶液：

表3

试剂名称	1XPBS	10XPBS
			NaCL	8g	80g
KCL	0.2	2g
			Na2HPO4.12H2O	3.58g	35.8g
KH2PO4	0.24g	2.4g

将上述试剂配制完成后置于1000ml烧杯中，加入900ml Milli-Q grade超纯水溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，121℃高温湿热灭菌20min。

3、25％Trypsin溶液:

表4

1XPBS	100ml	200ml	500ml	1000ml
					Trypsin(0.25％)	0.25g	0.5g	1.25g	2.5g
EDTA(0.53mM)	0.1973g	0.03946g	0.09864g	0.19729g

将上述试剂配制完成后置于1000ml烧杯中，加入900ml1XPBS溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，0.22uM过滤除菌，长期使用可保存至-20℃冰箱，若短期使用完毕即可直接放入4℃冰箱。

4、10％NP40裂解液(40ml)：36mlPBS+4mlNP-40

5、煮膜液：2ml 0.5M EDTA-Na2+98ml去离子水煮沸10min

6、病毒沉淀液500ml:20％PEG8000：100g，2.5M NaCL:73.12g

7、透析液：1000ml：Sucrose:50g，1M Tris-Hcl:10ml，1M Mgcl2:2ml

8、CsCl溶液配制

表5

密度	浓度	质量(g)	体积(ml)
				1.4	56％	7.85	10
1.3	31％	4.03	10
				1.2	12％	1.32	10

9、HEK293细胞的培养

Day0

细胞复苏

Day 4细胞传代

传代：按8mL/10cm2培养基的量

Day 6

准备细胞悬液：取一皿需要传代细胞，待长成单层以后使用

用0.25％的胰酶消化、PBS液洗涤后，加入培养液(或Hanks液或PBS等平衡盐溶液)，吹打制成待测细胞悬液

计数：

统计四个大格的细胞数，将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的大格(每格含有16个中格)中没有被染液染上色的细胞数目；计算原细胞悬液的细胞数。按照下面公式计算细胞密度：

(细胞悬液的细胞数)/mL＝(四个大格子细胞数/4)×10×104

00000000000铺板：选择细胞状态良好、无污染的HEK293细胞，使用细胞传代的方式，均匀铺与六孔板中，保证每孔细胞量相同，应该达到3.6×106个，隔天细胞长到90％以上开始转染。

Day7

换液：转染前一小时取出6孔板，去除原有细胞培养基，加入1.5ml的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱；

制备转染试剂和质粒的复合物：

载体与质粒：载体质粒pse2784、pse2887、pse2888、pse2889分别与包装质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre按照摩尔量比(1.5ug：3ug)加入到含有250μl的Opti-MEM培养基的1.5ml Ep管中，轻轻混匀

转染试剂：将10μl PEI溶液加入到含有250μl的Opti-MEM培养基的1.5ml Ep管，轻轻混匀，静止5min

混合：将Trans-EZ稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ充分结合形成稳定的转染复合体。取出细胞培养板，将上面得到的DNA-Trans-EZ复合体加入到细胞培养器皿中，做好标记，放回培养箱；

换液：6h后吸去培养基，加入2mL新鲜生长培养基放入37℃培养箱培养，大概7-20天左右出现病毒空斑。

Day 20

收集病毒：大部分细胞出现典型的病变，收集细胞，-80℃与37℃反复冻融3次

Day21

加无血清DMEM：HEK293细胞汇合度达到80％汇合时，弃去培养液，利用1mL移液枪将5mL无血清DMEM加入10cm2dish中，混匀，放入37℃，5％CO2培养箱中

加病毒液：利用200ul移液枪加入50-200ul的病毒液体

补加10％血清DMEM：2h后利用1mL移液枪补加5mL培养液，放入培养箱培养观察,

收集病毒：2～3天后待培养的HEK293变圆，脱壁，一些细胞漂浮，并且其颜色从橙色变为黄色时即表明细胞已病变，收集细胞，-80℃与37℃反复冻融3次。

二、重组腺病毒载体AdIL-17-001、AdIL-17-002、AdIL-17-003、AdIL-17-004的包装及扩增的扩增

(1)将HEK293细胞铺于20-30个10cm dish，待细胞长至95％以上，最好是100％，每块板加入100ul小扩好的腺病毒，感染细胞.

(2)2-3天后，HEK293细胞全部病变后，每块板中加入约500μl 10％Nonidet P 40(NP40)以裂解细胞。

(3)收集细胞裂解物，12000rpm离心10min，弃细胞碎片，收集上清。加入病毒沉淀液，加入的量为：每100ml上清加入50ml，冰上放置1-4h以沉淀病毒。

实施例3重组腺病毒载体的浓缩纯化及检测

一、重组腺病毒的浓缩及纯化

1.将上述混合物12000rpm离心10min，弃上清，将沉淀物悬浮在相应量的，密度为1.10g/ml的CsCl溶液中

2.4℃7000rpm离心5min，收集病毒悬浮液

3.在Beckman超速离心管中加入2.5ml的1.40g/ml CsCl溶液。再加入2.5ml1.30g/ml的CsCl溶液。

4.最后加入病毒悬浮液5ml。23000rpm，4℃离心2.5h

5.收集密度在1.30-1.40g/ml之间的病毒条带

6.病毒放于透析袋中(透析袋使用前用EDTA Na2煮沸10min)

7.而后放在透析缓冲液(50g蔗糖，10ml pH为8.0的Tris-HCl液，2ml MgCl2溶液定容至1000ml)中，4℃透析过夜，中间更换透析液一次。收集病毒，于-80℃保存。

二、重组腺病毒滴度测定

1.选取状态良好的HEK293细胞，使用完全培养基重悬细胞，制备成5×105个/ml的细胞悬液，24孔板每个孔中种入500μl细胞，37℃、5％CO2培养1小时。

2.准备好10倍梯度稀释的病毒样品【准备7个无菌的Ep管，在第一个Ep管中加入990μl的完全培养液，其余的6个管子中各加入900μl的完全培养液；待测病毒液的稀释：取10μl腺病毒原液加入990μl的Ep管中做1:100稀释(10-2)；然后以此为起点，再取100μl稀释液加入到900μl的Ep管中做1:10稀释(10-3)，直至稀释到10-8】，然后依次将10-5至10-8稀释的病毒液加入24孔板中，每孔加入100μl，每一稀释度占用一个孔。

3.37℃、5％CO2感染48小时。

4.轻轻的去除培养液，沿着24孔板侧壁缓缓加入预冷的甲醇0.5ml，-20℃固定20min。

5.使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。

6.加入0.2ml1％BSA的PBS37℃封闭1小时。

7.加入0.2ml的1×anti-Hexon抗体溶液至每个孔中，37℃孵育1小时。

8.使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。

9.加入0.2ml的1×辣根过氧化物酶标记的二抗至每孔，37℃孵育1小时。

10.使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。

11.加入0.2ml新配置的1×DAB工作液至每孔，室温孵育5-10min。

12.弃DAB，使用PBS清洗2次，每孔加入1mlPBS。

13.每孔随机选择5个视野，使用光学显微镜10×物镜下计算阳性细胞个数。

14.计算每孔阳性细胞的平均个数和病毒滴度。

结果计算

1.计算显微镜下视野中阳性细胞的平均个数。选择一个梯度，此梯度视野中有5-50个阳性细胞，随机选择至少5个区域计数。

2.计算24孔板中每孔视野的个数。对于多数显微镜，标准10×目镜与10×物镜所观察到的视野直径为1.8mm，因此每个视野的面积＝3.14x(D/2)2＝3.14x 0.92＝2.54mm2；对于一个标准24孔板，培养面积为2.0cm2，因此每孔视野数＝2.0cm2/2.54mm2＝2.0cm2/2.54x 10-2cm2＝79，如果您不能确定您的物镜所观察到的视野直径或者您使用的不是10×物镜，视野直径可用血球计数板来确定。

计算滴度

Viral Titer(ifu/mL)＝(average positive cells/field)x(79fields/well)x(dilution factor)/(0.1mL)(参考文献：1.Bewig＝[＝[,B.,and W.E.Schmidt(2000)Accelerated titering of adenoviruses.BioTechniques 28:870-873.)

实施例4 IL-17抗体基因的细胞水平表达检测：

(1)重组腺病毒载体AdIL-17-001感染293T细胞后，收集细胞采用RT-PCR进行CARmRNA转录水平的检测，验证CAR基因的表达，如果CAR mRNA转录水平增高，则说明CAR基因的转录水平表达成功；

(2)重组腺病毒载体AdIL-17-001感染293T细胞后，收集细胞上清采用westernblot进行CAR蛋白表达水平的检测，验证CAR基因的表达，如果CAR蛋白表达水平增高，则说明CAR基因的翻译水平表达成功；

(3)分别将MOI＝1的AdIL-17-001和对照病毒(用载体质粒PMT61包装病毒载体)感染细胞，48h后提取6孔板中细胞的总RNA和细胞上清中总蛋白分别进行荧光定量PCR实验和免疫印迹实验。具体步骤：种293T细胞于六孔板，1*10⁶/孔，24小时后换液，按MOI＝1加入病毒，加入500ul培养基(含10％血清、Polybrene2ug/ml)。37℃培养箱放置24h；取出的6孔板，弃掉病毒上清，加入500ul培养基(含10％血清)，37℃培养48h。

(4)Trizol法提取6孔板中293T细胞的总RNA，逆转录扩增cDNA,用QPCR引物(序列为SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24)进行荧光定量PCR实验，反应体系见表6，以内参Actin为对照组，验证其mRNA的转录情况。

表6 20μl qPCR反应体系

(5)蛋白免疫印迹(Western Blot)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将从PBMC中提取的总蛋白质按相对分子质量分离。采用湿转(4℃，400mA，120min)，将蛋白转移到PVDF膜上。用封闭液(含5％脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1h，封闭液1:1000稀释Biotinylatedprotein L，然后与封闭好的PVDF膜室温孵育4℃过夜。TBST洗膜3次，每次10min。封闭液1:500稀释相应的SA-HRP，室温下孵育PVDF膜2h，TBST洗膜3次，每次10min。采用Amersham公司ECL+plusTM Western blotting system试剂盒进行显色。X光显影获得显示条带的胶片。

(6)重组腺病毒载体AdIL-17-001、AdIL-17-002、AdIL-17-003、AdIL-17-004感染293T后的IL-17抗体的表达水平比对照和空细胞有明显升高(如图9所示)，说明IL-17抗体的转录水平表达成功。

(7)蛋白免疫印迹(Western Blot)的结果表明，IL-17抗体在重组腺病毒系统中表达，说明IL-17抗体的翻译水平表达成功。

实施例5缺陷型腺病毒载体所携带的IL-17抗体与IL-17结合能力验证

(1)重组腺病毒载体AdIL-17-004感染293T细胞后，收集细胞上清，浓缩，采用ELISA法进行IL-17抗体的检测，验证IL-17抗体与IL-17细胞因子结合能力验证，如果能检测到IL-17抗体，则说明IL-17抗体能够与IL-17细胞因子结合。具体步骤：

(2)用过滤好的PBS作为缓冲液稀释IL-17，包被96孔板，包被量200ng/孔，每孔100ul，4度过夜。

(3)洗液配制：用含TWEEN-20 0.5％到1％的PBS溶液，每次每孔400ul。

(4)洗板5次，用1％的BSA(300ul)封闭96孔板37度2小时

(5)洗板5次，加入100UL的样本，37度1小时需要做梯度用1％的BSA稀释

(6)洗板5次，加入protenG(用1％的BSA稀释1：:3000)100UL，37度1小时

(7)洗板五次，加入显色液100ul，待颜色呈蓝色，加入终止液50ul最后变黄色

(8)450nm波长单波读OD值。

检测结果(如图10所示)显示，重组腺病毒载体AdIL-17-004与对照病毒载体相比OD值明显升高，证明构建IL-17抗体可与细胞因子IL-17结合。

实施例6 IL-17对肝癌细胞系增值能力的影响

1、建立稳定表达IL-17的肝癌细胞系IL-17-Hep3B

2、细胞铺板:取对数生长期的Hep3B、IL-17-Hep3B肝癌细胞，进行消化，1000rpm离心5min，将细胞按50％的汇合度接种到6cm dish。

4、CCK8检测细胞增值

细胞培养48h后，消化收集各组细胞，1000rpm离心5min，弃上清，用新鲜的完全培养基重悬各组细胞。分别对细胞进行计数后，调整细胞密度为5×104cells/ml。100ul/孔，铺96孔板；每组细胞铺板4*6孔。铺板0h、24h、48h、72h CCK8检测：每个时间点，每组细胞各取6孔，加入10ul CCK8反应液，3h后酶标仪检测450nm和620nm吸光度。检测结果(如图11所示)显示，IL-17会对Hep3B肝癌细胞系增值能力产生影响。

实施例7不同IL-17改造抗体的重组腺病毒载体对起稳定性影响

(1)重组腺病毒载体AdIL-17-001、AdIL-17-002、AdIL-17-003、AdIL-17-004分别感染293T细胞，无血清培养48h，收集上清浓缩。浓缩上清分别与FBS1：1混合，在37℃培养0、2、4、6、8天，采用ELISA法进行IL-17抗体的检测，验证构建的IL-17抗体与IL-17细胞因子结合能力的改变，以此来检测构建的不同结构IL-17抗体在血清中的稳定性。

(4)洗板5次，用1％的BSA(300ul)封闭96孔板37度2小时

(6)洗板5次，加入protenG(用1％的BSA稀释1：:3000)100UL，37度1小时

(8)450nm波长单波读OD值。

检测结果(如图12所示)显示，重组腺病毒载体AdIL-17-003(对应图1D中抗体结构)、AdIL-17-004(对应图1A中抗体结构)所携带的IL-17抗体在FBS中的稳定性明显高于AdIL-17-001(对应图1B中抗体结构)、AdIL-17-002(对应图1C中抗体结构)。

序列表

<110>吉优诺（上海）基因科技有限公司

<120>基于复制缺陷性重组腺病毒携带IL-17结合分子转基因载体及其构建方法和应用

<130> HJ17-13504

<160> 31

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 816

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 60

tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 120

tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 180

gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 240

gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 300

aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 360

gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 420

ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 480

tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 540

atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 600

ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 660

ccggcgtcaa cacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 720

ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 780

atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagca 816

<210> 2

<211> 301

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 60

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 120

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 180

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcaa 240

tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 300

c 301

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34

<210> 4

<211> 101

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

tcatcaataa tataccttat tttggattga agccaatatg ataatgaggg ggtggagttt 60

gtgacgtggc gcggggcgtg ggaacggggc gggtgacgta g 101

<210> 5

<211> 92

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 5

ctacgtcacc cgccccgttc ccacgccccg cgccacgtca caaactccac cccctcatta 60

tcatattggc ttcaatccaa aataaggtat at 92

<210> 6

<211> 479

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

acgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc 60

cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat cattttgtct gactaggtgt 120

ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga 180

caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt 240

ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt 300

tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac 360

ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta atctcaggtg atctacccac 420

cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtcctt 479

<210> 7

<211> 160

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 7

ttcgagcaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 60

tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 120

tgtatcttat catgtctgga tcgtctagca tcgaagatcc 160

<210> 8

<211> 532

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 8

ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc 60

attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 120

tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 180

gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 240

gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 300

taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg 360

gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca 420

acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg 480

tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tc 532

<210> 9

<211> 87

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 9

atgaactcct tctccacaag cgccttcggt ccagttgcct tctccctggg gctgctcctg 60

gtgttgcctg ctgccttccc tgcccca 87

<210> 10

<211> 327

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 10

gaaattgtgc tgacccagag cccgggcacc ctgagcctga gcccgggcga acgcgcgacc 60

ctgagctgcc gcgcgagcca gagcgtgagc agcagctatc tggcgtggta tcagcagaaa 120

ccgggccagg cgccgcgcct gctgatttat ggcgcgagca gccgcgcgac cggcattccg 180

gatcgcttta gcggcagcgg cagcggcacc gattttaccc tgaccattag ccgcctggaa 240

ccggaagatt ttgcggtgta ttattgccag cagtatggca gcagcccgtg cacctttggc 300

cagggcaccc gcctggaaat taaacgc 327

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 11

ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45

<210> 12

<211> 381

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 12

gaagtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag cctgcgcctg 60

agctgcgcgg cgagcggctt tacctttagc aactattgga tgaactgggt gcgccaggcg 120

ccgggcaaag gcctggaatg ggtggcggcg attaaccagg atggcagcga aaaatattat 180

gtgggcagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acgcgaaaaa cagcctgtat 240

ctgcagatga acagcctgcg cgtggaagat accgcggtgt attattgcgt gcgcgattat 300

tatgatattc tgaccgatta ttatattcat tattggtatt ttgatctgtg gggccgcggc 360

accctggtga ccgtgagcag c 381

<210> 13

<211> 321

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 13

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 60

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 180

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 240

aacgtcttct catgctccgt gatgcacgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 300

ctctccctgt ctccgggtaa a 321

<210> 14

<211> 699

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 14

gaaccgaaaa gctgcgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420

gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc acgaggctct gcacaaccac 660

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 699

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 15

accgtcagat ctctagaagc caccatgaac tccttctcc 39

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 16

agaggttgat tatcgattca tttacccgga gacaggg 37

<210> 17

<211> 840

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 17

atgaactcct tctccacaag cgccttcggt ccagttgcct tctccctggg gctgctcctg 60

gtgttgcctg ctgccttccc tgccccagaa attgtgctga cccagagccc gggcaccctg 120

agcctgagcc cgggcgaacg cgcgaccctg agctgccgcg cgagccagag cgtgagcagc 180

agctatctgg cgtggtatca gcagaaaccg ggccaggcgc cgcgcctgct gatttatggc 240

gcgagcagcc gcgcgaccgg cattccggat cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat 300

tttaccctga ccattagccg cctggaaccg gaagattttg cggtgtatta ttgccagcag 360

tatggcagca gcccgtgcac ctttggccag ggcacccgcc tggaaattaa acgcggtggc 420

ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc ggcggatctg aagtgcagct ggtggaaagc 480

ggcggcggcc tggtgcagcc gggcggcagc ctgcgcctga gctgcgcggc gagcggcttt 540

acctttagca actattggat gaactgggtg cgccaggcgc cgggcaaagg cctggaatgg 600

gtggcggcga ttaaccagga tggcagcgaa aaatattatg tgggcagcgt gaaaggccgc 660

tttaccatta gccgcgataa cgcgaaaaac agcctgtatc tgcagatgaa cagcctgcgc 720

gtggaagata ccgcggtgta ttattgcgtg cgcgattatt atgatattct gaccgattat 780

tatattcatt attggtattt tgatctgtgg ggccgcggca ccctggtgac cgtgagcagc 840

<210> 18

<211> 684

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 18

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 420

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600

aacgtcttct catgctccgt gatgcacgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660

ctctccctgt ctccgggtaa atga 684

<210> 19

<211> 1242

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 19

gccaccatga actccttctc cacaagcgcc ttcggtccag ttgccttctc cctggggctg 60

ctcctggtgt tgcctgctgc cttccctgcc ccagaaattg tgctgaccca gagcccgggc 120

accctgagcc tgagcccggg cgaacgcgcg accctgagct gccgcgcgag ccagagcgtg 180

agcagcagct atctggcgtg gtatcagcag aaaccgggcc aggcgccgcg cctgctgatt 240

tatggcgcga gcagccgcgc gaccggcatt ccggatcgct ttagcggcag cggcagcggc 300

accgatttta ccctgaccat tagccgcctg gaaccggaag attttgcggt gtattattgc 360

cagcagtatg gcagcagccc gtgcaccttt ggccagggca cccgcctgga aattaaacgc 420

ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatctgaagt gcagctggtg 480

gaaagcggcg gcggcctggt gcagccgggc ggcagcctgc gcctgagctg cgcggcgagc 540

ggctttacct ttagcaacta ttggatgaac tgggtgcgcc aggcgccggg caaaggcctg 600

gaatgggtgg cggcgattaa ccaggatggc agcgaaaaat attatgtggg cagcgtgaaa 660

ggccgcttta ccattagccg cgataacgcg aaaaacagcc tgtatctgca gatgaacagc 720

ctgcgcgtgg aagataccgc ggtgtattat tgcgtgcgcg attattatga tattctgacc 780

gattattata ttcattattg gtattttgat ctgtggggcc gcggcaccct ggtgaccgtg 840

agcagcgaac cgaaaagctg cgacaaaact cacacatgcc caccgtgcgg cggcggcagc 900

agcggcggcg gcagcggcgg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 960

cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1020

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1080

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1140

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcacgaggc tctgcacaac 1200

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1242

<210> 20

<211> 1647

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 20

gccaccatga actccttctc cacaagcgcc ttcggtccag ttgccttctc cctggggctg 60

ctcctggtgt tgcctgctgc cttccctgcc ccagaaattg tgctgaccca gagcccgggc 120

accctgagcc tgagcccggg cgaacgcgcg accctgagct gccgcgcgag ccagagcgtg 180

agcagcagct atctggcgtg gtatcagcag aaaccgggcc aggcgccgcg cctgctgatt 240

tatggcgcga gcagccgcgc gaccggcatt ccggatcgct ttagcggcag cggcagcggc 300

accgatttta ccctgaccat tagccgcctg gaaccggaag attttgcggt gtattattgc 360

cagcagtatg gcagcagccc gtgcaccttt ggccagggca cccgcctgga aattaaacgc 420

ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatctgaagt gcagctggtg 480

gaaagcggcg gcggcctggt gcagccgggc ggcagcctgc gcctgagctg cgcggcgagc 540

ggctttacct ttagcaacta ttggatgaac tgggtgcgcc aggcgccggg caaaggcctg 600

gaatgggtgg cggcgattaa ccaggatggc agcgaaaaat attatgtggg cagcgtgaaa 660

ggccgcttta ccattagccg cgataacgcg aaaaacagcc tgtatctgca gatgaacagc 720

ctgcgcgtgg aagataccgc ggtgtattat tgcgtgcgcg attattatga tattctgacc 780

gattattata ttcattattg gtattttgat ctgtggggcc gcggcaccct ggtgaccgtg 840

agcagcggtg gcggtggctc gggcggtggt gggtcgggtg gcggcggatc tgaaattgtg 900

ctgacccaga gcccgggcac cctgagcctg agcccgggcg aacgcgcgac cctgagctgc 960

cgcgcgagcc agagcgtgag cagcagctat ctggcgtggt atcagcagaa accgggccag 1020

gcgccgcgcc tgctgattta tggcgcgagc agccgcgcga ccggcattcc ggatcgcttt 1080

agcggcagcg gcagcggcac cgattttacc ctgaccatta gccgcctgga accggaagat 1140

tttgcggtgt attattgcca gcagtatggc agcagcccgt gcacctttgg ccagggcacc 1200

cgcctggaaa ttaaacgcgg tggcggtggc tcgggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga 1260

tctgaagtgc agctggtgga aagcggcggc ggcctggtgc agccgggcgg cagcctgcgc 1320

ctgagctgcg cggcgagcgg ctttaccttt agcaactatt ggatgaactg ggtgcgccag 1380

gcgccgggca aaggcctgga atgggtggcg gcgattaacc aggatggcag cgaaaaatat 1440

tatgtgggca gcgtgaaagg ccgctttacc attagccgcg ataacgcgaa aaacagcctg 1500

tatctgcaga tgaacagcct gcgcgtggaa gataccgcgg tgtattattg cgtgcgcgat 1560

tattatgata ttctgaccga ttattatatt cattattggt attttgatct gtggggccgc 1620

ggcaccctgg tgaccgtgag cagctga 1647

<210> 21

<211> 849

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 21

gccaccatga actccttctc cacaagcgcc ttcggtccag ttgccttctc cctggggctg 60

ctcctggtgt tgcctgctgc cttccctgcc ccagaaattg tgctgaccca gagcccgggc 120

accctgagcc tgagcccggg cgaacgcgcg accctgagct gccgcgcgag ccagagcgtg 180

agcagcagct atctggcgtg gtatcagcag aaaccgggcc aggcgccgcg cctgctgatt 240

tatggcgcga gcagccgcgc gaccggcatt ccggatcgct ttagcggcag cggcagcggc 300

accgatttta ccctgaccat tagccgcctg gaaccggaag attttgcggt gtattattgc 360

cagcagtatg gcagcagccc gtgcaccttt ggccagggca cccgcctgga aattaaacgc 420

ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatctgaagt gcagctggtg 480

gaaagcggcg gcggcctggt gcagccgggc ggcagcctgc gcctgagctg cgcggcgagc 540

ggctttacct ttagcaacta ttggatgaac tgggtgcgcc aggcgccggg caaaggcctg 600

gaatgggtgg cggcgattaa ccaggatggc agcgaaaaat attatgtggg cagcgtgaaa 660

ggccgcttta ccattagccg cgataacgcg aaaaacagcc tgtatctgca gatgaacagc 720

ctgcgcgtgg aagataccgc ggtgtattat tgcgtgcgcg attattatga tattctgacc 780

gattattata ttcattattg gtattttgat ctgtggggcc gcggcaccct ggtgaccgtg 840

agcagctga 849

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 22

tcgcagcttt tcggttcgct gctcacggtc accag 35

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 23

accgatttta ccctgaccat tag 23

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 24

gctgctgcca tactgctg 18

<210> 25

<211> 35

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 25

gaaccgaaaa gctgcgacaa aactcacaca tgccc 35

<210> 26

<211> 35

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 26

agaggttgat tatcgattca gctgctcacg gtcac 35

<210> 27

<211> 36

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 27

gaggttgatt atcgattcat ttacccggag acaggg 36

<210> 28

<211> 45

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 28

accgtcagat ctctagaagc caccatgaac tccttctcca caagc 45

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 29

cgcaaatggg cggtaggcgt g 21

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 30

gaaatttgtg atgctattgc 20

<210> 31

<211> 72

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 31

gaaccgaaaa gctgcgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcggcggcgg cagcagcggc 60

ggcggcagcg gc 72

Claims

1.一种基于复制缺陷性重组腺病毒携带IL-17结合分子转基因载体，其特征在于，包括：含氨苄抗性基因Amp序列，如SEQ ID NO.1所示；原核复制子pUC Ori序列，如SEQ IDNO.2所示；loxP位点，如SEQ ID NO.3所示；腺病毒5 terminal ITR，如SEQ ID NO.4所示；腺病毒3 terminal ITR，如SEQ ID NO.5所示；Hgh-polyA，如SEQ ID NO.6所示；SV40 polyA，如SEQ ID NO.7所示；以上构建存储于腺病毒骨架质粒上；

CMV启动子，如SEQ ID NO.8所示；IL-6信号肽，如SEQ ID NO.9所示；含有IL-17单链抗体轻链和重链以及单链抗体铰链Linker的IL-17抗体；所述IL-17单链抗体轻链VL，如SEQID NO.10所示；所述IL-17单链抗体重链VH，如SEQ ID NO.12所示；所述单链抗体铰链Linker的序列如SEQ ID NO.11所示；以上组合成表达IL-17抗体克隆至上述腺病毒骨架质粒；

所述IL-6信号肽位于IL-17 单链抗体序列的N端，用于引导IL-17抗体分泌到细胞外；

所述载体为5型腺病毒载体。

2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，

该载体还包括：人铰链区hIgG hinge，如SEQ ID NO.31所示。

3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述含有IL-17单链抗体轻链和重链以及单链抗体铰链Linker的IL-17抗体还包括连接IL-17单链抗体重链VH的人IgG1的CH3，如SEQID NO.13所示。

4.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述含有IL-17单链抗体轻链和重链以及单链抗体铰链Linker的IL-17抗体还包括：连接IL-17单链抗体重链VH的人IgG1的Fc段，如SEQID NO.14所示。

5.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述含有IL-17单链抗体轻链和重链以及单链抗体铰链Linker的IL-17抗体具有双IL-17结合的scFv结构，所述IL-17单链抗体轻链VL为2个，所述IL-17单链抗体重链VH为2个，所述单链抗体铰链Linker为3个；其中单个IL-17单链抗体轻链VL与单个IL-17单链抗体重链VH通过单个单链抗体铰链Linker连接构成一组scFv结构，两组scFv结构之间通过另一个单链抗体铰链Linker连接。

6.一种如权利要求1所述的载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将含氨苄抗性基因Amp序列，如SEQ ID NO.1所示；原核复制子pUC Ori序列，如SEQID NO.2所示；loxP位点，如SEQ ID NO.3所示；腺病毒5 terminal ITR，如SEQ ID NO.4所示；腺病毒3 terminal ITR，如SEQ ID NO.5所示；Hgh-polyA，如SEQ ID NO.6所示；SV40polyA，如SEQ ID NO.7所示构建存储于腺病毒骨架质粒上；

（2）将CMV启动子，如SEQ ID NO.8所示；IL-6信号肽，如SEQ ID NO.9所示；含有IL-17单链抗体轻链和重链以及单链抗体铰链Linker的IL-17抗体；所述IL-17单链抗体轻链VL，如SEQ ID NO.10所示；所述IL-17单链抗体重链VH，如SEQ ID NO.12所示；组合成表达IL-17抗体设计方案，经过酶切、连接、重组反应克隆至腺病毒骨架中，得到表达IL-17抗体重组腺病毒质粒；

（3）将得到的重组腺病毒质粒与腺病毒包装质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共同转染HEK293细胞，在HEK293细胞中进行基因转录表达后，包装成功重组腺病毒载体会在细胞中收集包含的重组腺病毒载体的细胞；

（4）将得到的含有重组腺病毒细胞进行纯化，得到重组腺病毒病毒载体。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，将CMV启动子、IL-6信号肽、IL-17单链抗体轻链VL、单链抗体铰链Linker、IL-17单链抗体重链VH构建进入重组腺病毒载体，由CMV启动子启动IL-17抗体的表达；IL-6信号肽位于IL-17 scFv序列的N端，用于引导IL-17抗体分泌到细胞外；IL-17抗体轻链VL、单链抗体铰链Linker、IL-17单链抗体重链VH组合成IL-17抗体，用于中和IL-17；当IL-17抗体与炎症因子IL-17结合时，会阻止IL-17与肝癌细胞及肝组织微环境中其他细胞上的IL-17R结合，从而抑制肝癌细胞成长、抑制肝癌细胞及肝组织其他细胞趋化因子的分泌、抑制肝癌组织血管生成、促进肝癌微环境中IL-17的代谢清除一系列生物学效应。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述纯化方法为氯化铯密度梯度离心法。

9.如权利要求1-5任一项所述的载体在制备治疗肝癌的药物中的应用。