CN1269836A

CN1269836A - 突变酵母的乙醇产生

Info

Publication number: CN1269836A
Application number: CN98808832A
Authority: CN
Inventors: S·G·奥利弗; A·胡特
Original assignee: SACHETPACK Ltd
Current assignee: SACHETPACK Ltd
Priority date: 1997-09-04
Filing date: 1998-09-04
Publication date: 2000-10-11
Also published as: CA2301876A1; AU727784B2; GB9718711D0; WO1999011804A3; BR9812429A; WO1999011804A2; AU9082498A; DE69813576D1; EP1009837B1; EP1009837A2

Abstract

本发明涉及生产乙醇的方法和可以根据该方法使用的酵母细胞。该方法包括培养呼吸缺陷型酵母细胞(如在此所述的K1△pet191ab),其具有至少一种呼吸所需的在生长培养基中无功能和/或被抑制的核基因或其产物。该方法可用于燃料乙醇的生产或用于酒精饮料的生产。

Description

突变酵母的乙醇产生

本发明涉及使用一种特殊类型的酵母细胞生产乙醇。

一般是通过发酵法生产乙醇，其中酵母将碳水化合物转化为乙醇。

有几种因素限制这些发酵中乙醇的产量。例如，氧对乙醇的产量可具有不利的影响(称作巴斯德效应)，在有氧条件下乙醇倾向于由于进一步代谢而丢失(主要由于线粒体呼吸)。影响乙醇产生的另一种因素是发酵中碳水化合物的量。在有些酵母株中过量碳水化合物的供给有助于抑制呼吸(称为Crabtree效应)，从而使乙醇甚至在氧存在下产生。因此，通过提高碳水化合物的浓度可使Crabtree效应敏感酵母的乙醇产量达到最大，此外或另外，通过限制氧的可用性也可使任何酵母的乙醇产量达到最大。然而，尽管采取这些措施，乙醇的实际产量仍低于所希望的。制约乙醇产量的另一个因素与酵母通常不耐受高乙醇浓度的事实有关。当乙醇浓度提高时，首先延迟酵母细胞的生长速度，然后当浓度再提高时细胞生存力进一步受到不利影响。

已经进行了多种尝试来提供产生高乙醇产量的酵母细胞。一种这样的尝试包括开发了因为含有非功能性线粒体基因而为呼吸缺陷型的酵母突变体(也被称为线粒体或胞质小菌落突变体)。这种突变体无巴斯德效应，因此对发酵中氧供应的严格控制不是必要的，如同使用呼吸充分型(grande)酵母株的发酵情况一样。

然而，只要向p⁺培养物中的氧气供应保持为足以进行固醇和不饱和脂肪酸生物合成的水平，则当原料气中的氧气受限制时，发现在亲代grande株(p⁺)中乙醇产生的比速率高于小菌落突变体。

因此本发明的一个目的在于消除或减少上述缺点。

根据本发明的第一方面，提供了一种生产乙醇的方法，包括培养呼吸缺陷型酵母细胞，以及从该酵母细胞中分离乙醇，该细胞具有至少一种呼吸所需的核基因或其产物，其在生长培养基中无功能和/或被抑制。

“呼吸缺陷型酵母细胞”是指一种酵母细胞，它无线粒体介导的呼吸(即100％呼吸缺陷)，或者相对于其中至少一种呼吸所需的核基因或其产物是功能性的和/或未被抑制的相应酵母细胞，其呼吸降低至少60％、优选地至少75％、更优选地85％、以至更优选地95％。例如，可以突变亲代grande株(p⁺)的核基因或抑制一种基因产物，使得相对于未操作的亲代grande株而言，线粒体呼吸降低至少60％。

发明者发现，其中促进线粒体呼吸或为线粒体呼吸所需的核基因是非功能性的酵母细胞(或当其基因产物被抑制时)，对于巴斯德效应不敏感或敏感性低，并且具有相当于未操作的细胞且好于线粒体小菌落突变体的乙醇耐受性。因此，当用于乙醇生产时，根据本发明的方法使用的酵母细胞具有极大好处，因为不必要将细胞保持于严格厌氧条件中，并且，每批培养的酵母细胞的乙醇产量能达到比以前所知呼吸缺陷型酵母株可能达到的更高的浓度。这些细胞尤其可用于乙醇的商业生产，因为氧气供应不需要严格控制。此外，这些细胞不能在双峰生长期生长，所以不能将发酵产物(即乙醇)作为其次级底物代谢。这使得达到更高的最终滴度，并且也排除了快速阻止酵母培养(避免损失产量)的必要性。

我们不希望被任何假说所束缚，但我们相信，根据本发明的方法使用的呼吸缺陷型酵母细胞(在此也称为核小菌落酵母突变体)能够产生大量的乙醇，因为它们对乙醇比线粒体小菌落突变体更不敏感。我们已经证实，与grande亲代酵母细胞相比，外源加入的乙醇延迟了线粒体小菌落突变体的生长，而在乙醇存在下核小菌落突变酵母显示比线粒体小菌落突变体更好的生长速度。此外，我们证实，核小菌落突变体以比线粒体小菌落突变体或衍生出核小菌落突变体的grande亲本(p⁺)更快的速度产生乙醇。在线粒体小菌落突变体中，我们相信完整线粒体基因组的缺乏导致几种有害的细胞表面特征(如降低的糖摄取、改变的细胞絮凝及凝集和对质膜蛋白质的影响)，这导致其乙醇耐受性的降低。根据溶解氧的存在或不存在，线粒体以两种不同的、明确的生理状态存在(前线粒体形式和功能性线粒体形式)。前线粒体形式在厌氧生长期间产生，并在可获得微量溶解氧时分化为完全功能性的线粒体。最近几年，由于Crabtree效应，即在有氧条件下酵母呼吸能力被葡萄糖抑制，基本上忽略了酿造酵母中线粒体的功能。因为酿造酵母是Crabtree阳性的，所以认为氧气的作用只是营养性的，并且通常否定酿造酵母中任何真正呼吸功能的存在。前线粒体向线粒体中的转化是一种代谢昂贵的工作，而在酿造酵母中总是观察到该现象，但从未解释其意义。因此我们提出，完全发育的功能性线粒体以一种迄今仍未知的方式对于保持酵母的乙醇耐受性从而对于发酵性能是必需的。这解释了线粒体小菌落酵母作为生产乙醇的工具的无效性，并解释了为何核小菌落酵母如此惊人地有效。

呼吸缺陷型酵母细胞可由任何酵母株衍生而来。然而优选地，细胞来源于酿造酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。可用的其它酵母包括葡萄汁酵母(S.uvarum)(卡尔酵母(S.carlsbergensis))和Saccharomyces sensu stricto组的其它成员。

可衍生出呼吸缺陷型酵母株的一种优选酵母株是FY23(Winston等人(1995)酵母(Yeast)11：53-55页)及相关菌株。根据本发明方法使用的最优选的FY23衍生物是以下及实施例1中详述的菌株，即FY23Δcox5a和FY23Δpet191。我们发现FY23Δpet191是100％呼吸缺陷的(或至少基本上如此)，是根据本发明第一方面的方法使用的特别有用的酵母株。

最优选地，可衍生出呼吸缺陷型酵母株的酵母株是那些本领域已知作为乙醇的良好生产者的菌株。例如，可操作工业高酒精产量酵母如M-株(DC(Y)L，Menstrie，苏格兰)、红星(Red Star，Fleischmann’s美国)、K1酵母(Lallamand，U.K.LTD，Fife，苏格兰，由DanstarFerment AG生产)、酒类酵母U.C.L.M.S325(Bio Springer，Maisins-Alfort，法国)和酒类酵母U.C.L.M.S377(Bio Springer，Maisins-Alfort，法国)，以开发根据本发明的方法使用的呼吸缺陷型酵母。可衍生出呼吸缺陷型酵母株的一种最优选的工业酵母株是K1。根据本发明方法使用的最优选的K1衍生物是以下详述的菌株，尤其是实施例2所述的K1Δpet191ab。

至于可以基因操作以用于本发明方法的其它合适酵母的实例，参见：Tavares F.C.A.的“燃料酒精生产的酵母培育”，Echeverriagary(59-79页)，于《工业酵母研究第1卷》(Research on industrial yeastvol.1)(1987)，Stewart G.G.，Russel I.，Klein R.D.，Hiebsch R.R.编，CRC出版社。

根据本发明的方法产生酵母细胞的一种优选方法是修饰一种呼吸所需的核基因，使得该基因无功能(即功能性删除该核基因)。该修饰可引起一种破坏基因产物表达或功能的突变。这些突变可以是对于作为该基因的5’或3’调节序列的核酸序列，或者可以优选地是一种引入该基因编码序列中的突变。例如以核苷酸置换、添加或优选地核苷酸缺失的形式通过基因突变可以进行该基因的功能性删除。

可通过下列方法使该基因无功能：

(i)移动该基因编码序列的读框；

(ii)在该基因编码的蛋白质中添加、置换或删除氨基酸；或

(iii)部分或完整地删除编码该基因的DNA和/或与该基因有关的上游及下游调节序列。

向呼吸所需的染色体基因中引入突变的一种优选方法是使用分子生物学技术，尤其定向于待突变的染色体基因。可以用一种DNA分子诱导突变。一种引入突变的最优选的方法是使用一种特殊制备的DNA分子，使得在靶基因与DNA分子之间发生同源重组。当情况如此时，DNA分子理想地含有与靶染色体位置互补的碱基序列，以使该DNA分子能与该靶杂交(并且随后与之重组)。使用PCR介导的基因置换技术如Wach等人(1994)酵母10：1793-7876发展的方法产生呼吸缺陷型核小菌落突变体是特别优选的。

引起基因破坏产生核小菌落酵母的备择方法在《酶学方法》(Methods in Enzymology)(1983)第101卷，重组DNA部分C(WuR.，Grossman L.，Moldave K.编)202-228页中有描述。

可被修饰的核基因是那些当变得无功能时产生核小菌落表型的基因。这些基因通常与直接或间接参与氧化磷酸化的蛋白质的功能或表达有关。

可成为无功能的和/或被抑制的优选基因与细胞色素c氧化酶(氧化磷酸化中的最终电子载体复合体)的功能有关。

向PET191基因中引入突变产生一种优选的酵母细胞，其中细胞色素c氧化酶的功能减弱。发现PET191位于酵母染色体X上，编码一种14.1kDa的蛋白质，该蛋白质为组成活性细胞色素c氧化酶全酶的多肽亚基的装配所必需。PET191基因和相邻DNA的序列资料可在http：//genome.www.stanford.edu：8000/acedb/SacchDB？find+DNA+％22cseqX_6+％28SGD％29％22处获得。

PET191基因的一种优选突变产生一种核小菌落突变体，该突变体可导致全酶装配的失败并诱导高达100％的呼吸缺陷。一种含有PET191突变的最优选的细胞是在此被称为FY23Δpet191的核小菌落突变体，其中从酵母基因组染色体X上切除确定为SEQ ID NO.1的DNA序列，并用确定为SEQ ID NO.2的DNA序列替换。

另一种含有PET191突变的最优选的细胞是在此被称为K1Δpet191ab的核小菌落突变体。K1WT是二倍体，而K1Δpet191 ab具有PET191基因的一种拷贝(PET191 a)，其中确定为SEQ ID NO.1的DNA序列已被切除，并用确定为SEQ ID NO.17的DNA序列替换。K1Δpet191 ab中PET191的第二种拷贝(PET191b)已切除确定为SEQ ID NO.4的DNA序列，并用确定为SEQ ID NO.17的DNA序列替换。

含有PET191基因突变的细胞代表本发明的一个重要特征，根据本发明的第二方面，提供了一种特征在于PET191基因被功能性删除的酵母细胞。

优选地，根据本发明第二方面的酵母细胞由呼吸充分的野生型酵母株衍生而来，其中通过DNA分子与编码PET191基因的DNA之间的同源重组功能性删除PET191基因。

根据本发明第二方面的优选酵母细胞是在此表征的FY23Δpet191和K1Δpet191 ab。

向位于染色体XIV上的COX5a基因中引入突变产生可供本发明的方法使用的另一种优选酵母细胞，其中细胞色素c氧化酶的功能减弱。COX5a编码由9个多肽亚基组成的细胞色素c氧化酶的亚基V。COX5a基因和相邻DNA的序列资料可在http：∥genome.www.stanford.edu：8000/acedb/SacchDB？find+DNA+％22YSCCOX5AA+％28GB％29％22处获得。

一种含有COX5a基因突变的最优选的细胞是在此被称为FY23Δcox5a的核小菌落突变体，其中从酵母基因组(染色体XIV)上切除确定为SEQ ID NO.5的DNA序列，并用确定为SEQ ID NO.2的DNA序列替换。优选地，FY23Δcox5a突变体是85-90％呼吸缺陷的。

当在酵母中成为无功能的和/或被抑制时，产生核小菌落酵母的其它核基因可以根据本发明的方法使用，可能选自被称为PET基因的酵母基因(例如PET192或PET100)。这些PET基因的实例可于酵母基因组数据库中公开获得，在Tzagaloff A.和Dieckman C.L.(1990)“酿酒酵母的PET基因”微生物综述(Microbiol Rev.)(54)9：211-225中也有描述。可经操作形成核小菌落酵母细胞的核基因的其它实例包括其它COX基因(例如COX1-17中的任一个)、ATP基因、CEM1、CYB2和QCR基因(例如QCR1-10中的任一个)。

根据本发明方法使用的优选核小菌落酵母具有这样的核基因，当它成为无功能的和/或被抑制时，产生至少95％呼吸缺陷、最优选地100％呼吸缺陷的表型。在这方面，我们发现PET基因尤其是PET191的功能性缺失可产生至少95％呼吸缺陷的酵母。

当用一种DNA分子诱导亲代野生型菌株的突变而形成根据本发明第二方面的酵母细胞或根据本发明方法使用的酵母细胞时，用来转化亲代酵母株的该DNA分子可包含于合适的载体中形成重组载体。该载体可以是例如质粒、粘粒或噬菌体。当复制该DNA分子时，这类重组载体是非常有用的，一种优选的载体是pFA6-kanMX4(见SEQ ID NO.6)。另一种优选载体是pUG6(在Guldener等人，核酸研究(Nucl.AcidsRes.)(24)13：2519-2524，1996中公开)，除了kanMX4基因一侧为LoxP序列外，它含有与pFA6-kanMX4相应的DNA(在下面讨论，含有SEQ ID NO.17的34bp LoxP序列)。

重组载体和/或DNA分子常常包含一种或多种选择性标记，而使得用载体和/或核小菌落突变体转染的细胞的筛选成为可能。这种选择性标记的一个实例是赋予对遗传霉素(G418)抗性的基因如KanMX4的内含物。例如，一种产生可在本发明方法中使用的细胞的优选方法是，用一种DNA盒转化呼吸充分型亲代酵母株，该DNA盒含有编码一种标记基因的DNA，其侧翼为能与编码参与呼吸的蛋白质的靶核基因同源重组的DNA。

当使用选择性标记时，完成基因操作后人基因组中切除标记常常是希望的(K1Δpet191ab的情况中也是如此一参见实施例2)。当情况如此时，可用多种已知的重组酶系统切除标记。这些系统利用重组酶切割特异核苷酸重复序列的能力。核苷酸重复序列可包含于用来转化酵母细胞的DNA盒中，使得它们位于编码该标记的DNA的侧翼。酵母转化形成一种核小菌落后，可利用重组酶切除核苷酸重复序列。可用来切除标记基因的系统的一个实例是在对于K1Δpet191ab的实施例2中详述的LoxP/Cre系统。

用于kanMX组件体内切除的loxP/Cre重组酶系统的一种替代是使用大范围核酸酶I-SceI。I-SceI的限制位点由酵母线粒体的一种可移动I组内含子所编码，长为18bp，缺失盒可设计为含有任一侧侧翼为I-SceI位点(代替loxP位点)的kanMX组件。另外，这些I-SceI位点的外部侧翼区应彼此同源，使得一旦通过内切核酸酶I-SceI的表达切除kanMX组件，线性化的基因组DNA即再连接，修复该DNA。该技术的一个优点是缺失株中未留下任何异源DNA。

因此，根据本发明第二方面或根据本发明方法使用的最优选的核小菌落，是通过用DNA盒转化呼吸充分型酵母而形成的，该DNA盒含有编码一种标记基因的DNA，其侧翼为可与一种编码参与呼吸的蛋白质的靶核基因同源重组的DNA，并且进一步含有上段所述的核苷酸重复序列。

也能提供一种呼吸缺陷型酵母细胞，对于该细胞，在未向该酵母基因组中引入突变时，至少一种呼吸所需的染色体基因产物是无功能的和/或被抑制的。使用可阻止酵母中发生的呼吸的特异性抑制剂可做到这一点。这类抑制剂的实例包括阻止基因转录、阻止表达或破坏翻译后修饰的试剂。此外，该抑制剂也可以是一种增强基因产物降解的试剂(例如一种特异性蛋白水解酶)。同样地，该抑制剂可以是一种阻止基因产物与线粒体成分结合的试剂，如一种中和抗体(例如抗PET191抗体)。该抑制剂也可以是一种反义寡核苷酸或能抑制由核基因介导的呼吸成分的任何合成化学药品。

本发明的方法是非常有益的，因为乙醇生产的速度及有些情况下生产乙醇的产量高于使用常规酵母株的已知方法。这些方法可用于为了任何目的(包括肉汤)的乙醇生产，尽管这些方法尤其适合于用于化学工业的乙醇商业生产，最特别地用于燃料乙醇的生产。

生长培养基可以是对酵母常规使用的任何生长培养基(例如YPD生长培养基)，并且应当理想地含有一种碳水化合物来源，其可以是一种可发酵的糖。例如，该碳水化合物可以是甜菜或甘蔗的一种衍生物(如蔗汁或糖蜜)。用于向乙醇代谢转化的优选碳水化合物是蔗糖或葡萄糖。

生长培养基应含有理想量的必需养分(即碳水化合物、氮源等)，以使最适生长和乙醇生产成为可能。该培养基的确切组成取决于多种因素(例如所用的特定酵母)。仅根据实施例，合适的生长培养基可含有：

尿素 2.34g/L

磷酸二氢钾 1.49g/L

硫酸镁 0.9g/L

肌醇 0.1g/L

烟酸 0.07g/L

盐酸吡哆醇 0.005g/L

盐酸硫胺素 0.008g/L

泛酸钙 0.005g/L

生物素 0.0002g/L

硫酸锌 0.006g/L

硫酸亚铁二铵 0.004g/L

硫酸铜 0.0001g/L

+碳水化合物底物

碳水化合物底物的浓度影响产生的乙醇量，通常，碳水化合物浓度越高，乙醇产量越高。然而，如果碳水化合物的浓度太高，则由于渗透作用而能诱导酵母的质壁分离。质壁分离的程度又取决于发酵条件和所用的酵母类型。因此向发酵中加入的碳水化合物的准确量必须适合于特定酵母培养的实际需要。根据实施例，向上述培养基中加入351g/L蔗糖在适宜的发酵条件下能达到最佳v/v乙醇产量。

在培养基中也可补充其它多种养分，如复合氮源(例如肽、氨基酸)、其它维生素或脂肪酸和其它脂类。

培养基也应被缓冲，使得在发酵过程中pH保持于pH4-7、最优选地pH4.5-5。虽然某些嗜温及嗜热酵母株分别具有在28-35℃和40-50℃左右生长的最适温度范围，但对于最佳乙醇生产，发酵期间培养基的温度可保持为环境温度(20℃左右)。

最适酵母生长和乙醇生产至少部分地取决于使用前如何贮存酵母及随后如何引入生长培养基中。酵母可以以干燥形式供应，然后在接种于发酵培养基之前再水合。酵母最好在35-40℃水中再水合(10ml/g酵母)15分钟。假定为每克约1×10¹⁰的菌落形成单位，则向发酵培养基中加入的干酵母的最适量为2.13g/L左右的活性酵母。

在含有生长培养基的发酵罐中培养酵母。它可以是酵母细胞能在其中生长的任何容器。用于工业规模乙醇生产(例如燃料乙醇生产)的发酵罐通常进一步包括一种或多种：

1.用于搅拌酵母培养物的转子或类似装置。

2.一种空气(或氧气)供给。

3.一种添加养分的进口。

4.一种提取废产物和/或产生的乙醇的装置。

5.一种恒温器和调节温度的装置。

优选的发酵罐是本领域已知用于酵母培养的发酵罐。所用的发酵罐类型取决于酵母细胞是在作为实验性工厂的实验室中用肉汤培养，还是在对于乙醇工业生产的完全放大中生长。例如，当酵母细胞用于实验目的时，一种优选的发酵罐是3L Bioengineering LKF2000基本发酵罐(Bioengineering AC，CH8636-Wald，瑞士)。

这些发酵罐可以具有使温度调节、空气供给、养分含量、废料去除和产物提取自动化的装置。一种优选的自动化装置是“Pi”计算机控制系统(Process Intelligence Ltd.，Warwick，英国)电子控制发酵的应用。

生产乙醇的方法可以包括酵母细胞通过分批培养或连续培养的生长。

当由于某些原因生产乙醇时(例如乙醇的工业生产)，该方法需要从所述酵母细胞中分离乙醇的步骤。可通过任何方便的方法从酵母细胞中分离乙醇。对于乙醇(如燃料乙醇)的工业生产，可包括几个步骤，包括蒸馏步骤和/或过滤步骤。如果细胞用于肉汤，则可通过沉淀、漂浮或过滤从细胞中分离乙醇。

在酿造某些酒精饮料(尤其是含有约20％或更少乙醇的饮料，如啤酒)中，使乙醇留在生长的培养基中是理想的。当情况如此时，通常希望的是从培养基中分离酵母(例如通过沉淀)，而不是分离乙醇。

在本发明方法的一种具体实施方案中，以分批培养在3LBioengineering LKF2000基本发酵罐中的完全YPD培养基[1％(w/v)酵母提取物、2％(w/v)蛋白胨、5％(w/v)葡萄糖]中培养酵母细胞(例如K1Δpet191 ab或FY23Δpet 191)，该细胞中至少含有一种呼吸所需的核基因或其产物是非功能性的和/或被抑制的。45小时培养时间后，取出含有乙醇的培养基，随后使用或然后处理来分离乙醇。用“Pi”计算机控制系统实现对发酵的监控。使用安装于中心轴上并以250WVDE电动机驱动的2×6叶片的Rushton叶轮(Lenze，D-4923，德国)以850转/分搅拌生长培养液。通过加入几滴硅基抗起泡剂(Mazu DF8005)来防止过度的泡沫形成。用转子流量计和精确控制阀以1Lmin^-1(1v/v/m)向培养液中充气。发酵罐装备有405-DPAS-50-K85/200组合式pH电极，并经W/M 501u泵(Watson and Marlow，英国)加入3MHCl和3M NaOH溶液来使所有发酵的pH保持为5.0。使用设定点为pH5.0(+0.005)的一种开/关控制回路，经“Pi”系统实现pH的控制。使用“Pi”系统的比例(P)及积分(I)控制器，在30℃(±0.005℃)下进行所有发酵。借助DO探针(Ingold，英国)连续监控培养基中的溶解氧，用一种红外气体分析仪(ADC Instruments Ltd.，Hoddesden，英国)监控废气中的CO₂。

应当理解，可利用常规生化工程技术轻易地修改本发明方法的上述实施方案，用于乙醇生产的放大。使用常规酵母的乙醇生产的放大指导(可容易地修改以用于核小菌落酵母)可见于《工业酵母研究第1卷》(1987)Stewart G.G.，Russel I.，Klein R.D.和Heibsch R.R.编，CRC出版社，或《生物化学工程与生物工程学手册》(Biochemical Engineering& Biotechnology Handbook)(1991)Atkinson B.和Mavituna F.，自然出版社。可实现乙醇生产放大的已知方法的实例是利用Berkeley法、MIT法、Natick法或甘蔗底物法。

现在将以实施例的方式、参照下列附图描述本发明：

图1是在实施例1中用来产生呼吸缺陷型酵母细胞的方法的示意图；

图2是编码PET191可读框的DNA及相邻核苷酸的示意图，显示实施例1中使用的有关PCR引物与该DNA在何处结合；

图3是编码COX5a可读框的DNA及相邻核苷酸的示意图，显示实施例1中使用的有关PCR引物与该DNA在何处结合；

图4是说明实施例1中酵母株FY23WT的发酵数据的图；

图5是说明实施例1中酵母株FY23Δpet191的发酵数据的图；

图6是说明实施例1中酵母株FY23Δcox5a的发酵数据的图；

图7是说明实施例1中酵母株FY23[ρ⁰]的发酵数据的图；

图8是在实施例2中用来产生缺失盒的载体pUG6的示意图；

图9是在实施例2中用来产生呼吸缺陷型酵母细胞K1Δpet191ab的方法的示意图；

图10是实施例2中使用的载体YEP351(a)、YEP351-cyh(b)和YEP351-cre-cyh(c)的示意图；

图11是实施例2中呼吸缺陷型酵母细胞的(1)PET191a中整合的缺失盒和(2)PET191b中整合的缺失盒的示意图。

实施例1

两种类型的核小菌落酵母细胞由酿酒酵母株FY23产生。每种细胞是一种核小菌落，具有与细胞色素c氧化酶活性的消除或降低有关的突变。然后根据本发明的方法用这些酵母细胞生产乙醇。这些酵母细胞具有良好的乙醇耐受性，通过呼吸链中的核损伤避开巴斯德效应，并可达到高于有呼吸能力的亲代酵母(FY23WT)或由FY23衍生的线粒体小菌落的发酵率。1.1方法1.1.1使用的酵母株1.1.1.1FY23WT

在这些研究中用酿酒酵母FY23亲代-单倍体，grande[ρ⁺]，MATa，ura3-52，trpΔ63，leu2Δ1(Winston等人，1995，酵母11：53-55)作为有呼吸能力的亲代酵母。FY23WT用作发酵研究中的对照酵母株，并用作产生呼吸缺陷型酵母细胞的酵母株。1.1.1.2FY23(ρ⁰)

据在CsCl Hoechst 33258密度梯度中的平衡离心(Williamson等人，1976，细胞生物学方法(Methods in Cell Biol.)12：335-351)测定线粒体小菌落突变体FY23(ρ⁰)缺乏所有可检测的线粒体DNA，其在发酵研究中用来与根据本发明第一方面的酵母细胞相对比。通过在100μg/ml溴化乙锭存在下在YPD上生长，由grande亲本衍生出线粒体小菌落。细胞在YPD而不在YEPD复制平板上生长为小菌落的指征(Slonimski等人，1968，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)30：232-239)。1.1.1.3FY23Δpet191

FY23Δpet191是一种根据本发明第二方面并可根据本发明第一方面的方法使用的酵母细胞。FY23Δpet191是FY23的一种核小菌落突变体，具有破坏的PET191基因。该突变导致细胞色素c氧化酶全酶装配的失败，从而诱导100％的呼吸缺陷。下面给出了关于该突变体产生的细节。1.1.1.4FY23Δcox5a

FY23Δcox5a是一种可根据本发明第一方面的方法使用的酵母细胞。FY23Δcox5a是FY23的一种核小菌落突变体，具有COX5a基因的破坏，大约85-90％呼吸缺陷。下面给出了关于该突变体产生的细节。1.1.2核小菌落突变体的产生

呼吸缺陷型核小菌落突变体是利用PCR-介导的基因破坏技术产生的，该技术由Wach等人(1994)酵母10：1793-7876发展，如图1的1)PCR部分所概述。

使用标准50μl PCR反应混合液及条件。标准50μl PCR反应混合液-0.1mM dNTP、0.2μM引物、1.5mM MgCl₂、20ng模板pFA6-kanMX4(SEQ ID NO.6)、2.5U Taq聚合酶。标准PCR条件-1个循环：92℃2分钟；30个循环：92℃30秒；55℃30秒；72℃90秒；随后1个循环：72℃4分钟。1.1.2.1FY23Δpet191

用PCR构建破坏盒pet191∷kanMX4(13kb)(见图1(1))，其中用PET191上游引物(SEQ ID NO.7)和PET191下游引物(SEQ IDNO.8)扩增pFA6-MX4的特定区(见表1)。这些引物与pFA6-MX4多克隆位点具有19-22nt的同源性，并且具有分别与靶ORF PET191的起始密码子直接下游区或终止密码子上游区同源的35nt延伸(见图2)。

破坏盒的正确扩增后，将1-2μg乙醇沉淀的DNA用于酵母转化(Gietz等人，1995)。一旦转化，即在pet191∷kanMX4盒的同源区与靶基因之间发生重组事件，从而破坏ORF，并导致含有SEQ ID NO.1序列的DNA片段的切除，并替换为含有SEQ ID NO.2的序列、编码KanMx4基因的DNA。在含有0.2mg/ml遗传霉素(G418)的YEPD-琼脂上进行转化子筛选。1.1.2.2FY23Δcox5a

同FY23Δpet191一样，使用破坏盒cox5a∷kanMX4实现85％呼吸缺陷的FY23Δcox5a的产生，除了使用的引物为上游Cox5a(SEQ IDNO.11)和下游Cox5a(SEQ ID NO.12)(见表1)外，cox5a∷kanMX4与pet191∷kanMX4相同。这些引物引入了与编码盒中KanMX4基因的DNA的Cox5a基因5’和3’具有同源性的DNA。

如1.1.2.1所述进行转化与重组事件，以破坏Cox5a的ORF，导致含有SEQ ID NO.5序列的DNA片段的切除，并替换为含有SEQ ID NO.2的序列、编码KanMx4基因的DNA。在含有0.2mg/ml遗传霉素(G418)的YEPD-琼脂上进行转化子筛选。1.1.3分析PCR

通过分析PCR(Wach等人，1994)证实了2种破坏盒的每一种向酵母基因组中的正确定向。对生长于0.5mg/ml G418上的转化子的总细胞基因组DNA进行该试验。分析PCR的条件-1个循环：92℃2分钟；30个循环：92℃30秒(对于PET191)或54℃30秒(对于COX5a)；72℃90秒(PET191)或72℃3分钟(COX5a)；随后72℃4分钟的1个循环。对于FY23Δpet191在分析PCR反应中使用PET191正向引物和PET191反向引物(见表1)，对于FY23Δcox5a的分析PCR，每一PCR反应中使用Cox5a正向引物和Cox5a反向引物(见表1)。

通过在YEPG平板上检测呼吸缺陷来实现对正确ORF破坏的进一步证实。为了分离染色体，也用钳位均匀电场(CHEF)技术对推断的核小菌落施以脉冲电场凝胶电泳。其后是Southern杂交，由此用³²P-标记的KanMX4盒探测膜。随后对磷成像仪(Biorad，英国)的曝光表明，cox5a∷kanMX4和pet191∷kanMX4盒已经分别正确地整合入染色体XIV和X中。

表1.在实施例1的PCR反应中使用的寡核苷酸引物

寡核苷酸引物DNA SEQ ID No.	DNA序列	描述
寡核苷酸引物DNA SEQ ID No.	DNA序列	描述	7	5’-ATG TAA AGA TCA GAA GAAGGC TGT CGC TAT ATG TT C AGC TGA AGC TTC GTA CGC-3’	PET191上游(用于KanMX4缺失盒的构建)
8	5’-GAT TAC TGG ACA AAC CGA ATAAAA GAG CTT GAC GC C ATA GGC CAC TAG TGG ATC TG-3’	PET191下游(用于KanMX4缺失盒的构建)	7		PET191上游(用于KanMX4缺失盒的构建)
8		PET191下游(用于KanMX4缺失盒的构建)	9	5’-GCA CCT CTG TCG ACT GG-3’	PET191正向(用于验证正确的染色体整合)
10	5’-GAA AGC ACG TTA ACT CCC A-3’	PET191反向(用于验证正确的染色体整合)	9	5’-GCA CCT CTG TCG ACT GG-3’	PET191正向(用于验证正确的染色体整合)
10	5’-GAA AGC ACG TTA ACT CCC A-3’	PET191反向(用于验证正确的染色体整合)	11	5’-CAC TTT TAC TAG AGC TGG TGGACT ATC ACG TAT TA C AGC TGA AGC TTC GTA CGC-3’	Cox5a上游(用于KanMX缺失盒的构建)
12	5’-TCA TTT AGA TTG GAC CTG AGAATA ACC ACC CCA AGG CAT AGG CCA CTA CTG GAT CTG-3’	Cox5a下游(用于KanMX缺失盒的构建)	11		Cox5a上游(用于KanMX缺失盒的构建)
12		Cox5a下游(用于KanMX缺失盒的构建)	13	5’-CGC CTC CCT ACG CTT C-3’	Cox5a正向(用于验证正确的染色体整合)
14	5’-GCT CAG TAA GCT GTG CCC-3’	Cox5a反向(用于验证正确的染色体整合)	13	5’-CGC CTC CCT ACG CTT C-3’	Cox5a正向(用于验证正确的染色体整合)
14	5’-GCT CAG TAA GCT GTG CCC-3’	Cox5a反向(用于验证正确的染色体整合)	15	5’-TCT CCT TCA TTA CAG AAA CGG-3’	KanMX4正向(用于验证正确的染色体整合)
16	5 ’-CCG TTT CTG TAA TGA AGG AGA-3’	KanMX4反向(用于验证正确的染色体整合)	15	5’-TCT CCT TCA TTA CAG AAA CGG-3’	KanMX4正向(用于验证正确的染色体整合)

表1中突出的以下划线标出的序列是与KanMX4盒互补的寡核苷酸部分。1.1.4分批发酵

在完全YPD培养基[1％(w/v)酵母提取物、2％(w/v)蛋白胨、5％(w/v)葡萄糖]中培养生物。根据在含有3％(w/v)甘油作为唯一碳源的YEPG培养上的生长来测定呼吸缺陷。

在工作容积为2L的3L Bioengineering LKF2000基本发酵罐(Bioengineering AC，CH8636-Wald，瑞士)中，一式三份测定分批培养物中菌株特异的乙醇生产力。用“Pi”计算机控制系统(ProcessIntelligence Ltd.，Warwick，英国)实现对发酵的监控。在整个发酵过程中以2分钟的间隔记录以下所述变量的数据。

以850转/分搅拌培养液，实现方法是使用安装于中心轴上并以250W VDE电动机驱动的2×6叶片Rushton叶轮(Lenze，D-4923，德国)。通过加入几滴硅基抗起泡剂(Mazu DF8005)来防止过度的泡沫形成。用转子流量计和精确控制阀以1Lmin^-1(1v/v/m)向培养液中充气。发酵罐装备有405-DPAS-50-K85/200组合式pH电极，并经W/M501u泵(Watson and Marlow，英国)加入3M HCl和3M NaOH溶液来使所有发酵的pH保持为5.0的值。使用设定点为pH5.0(±0.005)的一种开/关控制回路，经“Pi”系统实现pH的控制。使用“Pi”系统的比例(P)及积分(I)控制器，在30℃(±0.005℃)下进行所有发酵。借助DO探针(Ingold，英国)连续监控培养基中的溶解氧，用一种红外气体分析仪(ADC Instruments Ltd.，Hoddesden，英国)监控废气中的CO₂。建立发酵罐的多种控制系统，然后用1％的过夜稠密种子培养物进行接种。使发酵进行45小时，经常监控废气中的CO₂浓度。以1小时的间隔从指数期中期直到稳定期末期采取样品，并用于干重分析及气相色谱分析(GC)。

在与Klett Summerson比色计和绿色滤片(Klett Summerson，美国)结合的特别改进型100ml锥形瓶(称为Klett瓶)中，测定分批培养液中的菌株特异的乙醇耐受性。培养物过夜生长到指数期早期，然后分为18ml等份，加入2ml无菌蒸馏水或乙醇溶液，产生0％、2％、3％、4％、6％和10％(w/v)乙醇的终浓度。每一浓度一式三份，并每小时测定细胞密度。从瓶中采取1ml样品，稀释并涂板于YPD上进行活细胞计数。离心剩余的样品(15000转/分，4℃，5分钟)，冷冻上清液，用于随后通过GC对乙醇浓度的分析。1.1.5细胞干重测定

离心取自发酵罐的20ml样品(15000转/分，4℃，5分钟)，并将上清液滗析入无菌容器中进行乙醇浓度测定。细胞沉淀用20ml无菌蒸馏水洗一次，再次收获细胞，并在90℃下干燥，直到达到恒定的细胞干重。1.1.6乙醇浓度的测定

发酵罐样品贮存于-20℃下，并使用装备有碳蜡柱的PYE-UNICAM204系列通过气相色谱法测定其乙醇含量。注射器和FID被设置为200℃，而柱保持80℃。火焰气是空气与氢的混合物，而载气是以161磅/平方英寸流动的不含氧的氮(BOC Ltd.)。对于所有样品使用1-丙醇内部标准，并用计算机软件计算乙醇浓度。将乙醇浓度对时间作图，并在最陡点测定乙醇生产的比速率(q_p)(q_p＝r_p/x)。1.2.结果与讨论1.2.1乙醇耐受性

在分批培养中于30℃培养等基因系列的所有四个成员(FY23WT、FY23Δpet191、FY23Δcox5a和FY23ρ⁰)，并在指数期初期引入不同浓度的乙醇。细胞生长进行8小时，用Klett计测定光密度。

向指数生长的细胞群体中加入乙醇后，生长速率立即下降。所有四种菌株都显示这一特征，这至少部分地是由于稀释效应，因为这在只用蒸馏水(即0％(w/v)乙醇)的培养中也发生。以loge Klett单位对经过时间作图，并进行线性回归分析来计算培养的比生长速率μ。通过比较每一乙醇浓度下的相对生长速率，并计算为不含乙醇时生长速率的百分比，来分析乙醇对该系列四种成员的生长速率的影响。

乙醇抑制动力学被认为遵循非竞争性抑制，并能用Monod方程式的一种变式来模拟。从计算的比生长速率值来看，通过将其插入调整的方程式[μ_m/μ_i-1＝I.1/K_i]中确定K_i的值是可能的。据显示，简单地使用原始生物量积累数据不能产生直线关系。这是由于使平衡动力学的应用无效的不可逆作用(细胞死亡)；因此必须考虑细胞生存力。计算的μ的初值是从含有活细胞和死细胞的培养物的生长所确定的μ_表观值。由于此原因，必须用每一实验期间收集的生存力数据将单纯由Klett值确定的每一乙醇浓度时的μ_表观校正为μ_真值。

表2.抑制常数表

	K_i(真实生长速率)
	K_i(真实生长速率)		菌株	％(w/v)	M
FY23WT	2.30	0.50	菌株	％(w/v)	M
FY23WT	2.30	0.50	FY23Δpet191	2.14	0.47
FY23Δcox5a	1.94	0.42	FY23Δpet191	2.14	0.47
FY23Δcox5a	1.94	0.42	FY23ρ⁰	1.71	0.37

表3.比生长速率与乙醇产量(q_p)

菌株	μ_最大(小时^-1)(n)	q_p(克乙醇/克干生物量/小时)(n)
菌株	μ_最大(小时^-1)(n)	q_p(克乙醇/克干生物量/小时)(n)	FY23WT	0.422±0.01(3)	0.939±0.10(3)
FY23Δpet191	0.403±0.02(3)	1.339±0.15(3)	FY23WT	0.422±0.01(3)	0.939±0.10(3)
FY23Δpet191	0.403±0.02(3)	1.339±0.15(3)	FY23Δcox5a	0.406±0.01(3)	1.223±0.05(3)
FY23ρ⁰	0.271±0.01(3)	0.893±0.02(2)	FY23Δcox5a	0.406±0.01(3)	1.223±0.05(3)

表4.为FY23WT百分比的比生长速率与乙醇产量(q_p)

菌株	μ_最大(％)	qp(％)
菌株	μ_最大(％)	qp(％)	FY23WT	100.0	100.0
FY23Δpet191	95.5	142.6	FY23WT	100.0	100.0
FY23Δpet191	95.5	142.6	FY23Δcox5a	96.2	130.2
FY23ρ⁰	64.2	95.1	FY23Δcox5a	96.2	130.2

1.2.2乙醇对细胞生存力的影响

用考虑了分批培养中细胞死亡的Pirt’s方程式(1975，《微生物与细胞培养原理》(Principles of microbe and cell cultivation)牛津大学出版社，Blackwell Scientific，牛津，英国)计算每一乙醇浓度时的真实比生长速率。假定分批培养中的细胞死亡速率与存在的活细胞数成比例。

Y_{T} = y_{T (0)} + \frac{μ \cdot y_{γ (0)}}{μ - k} (e^{(μ - k) t} - 1)

在修改的Monod方程式中使用校正的μ值(μ_真值)，并用它来重新计算K_i。对抑制剂浓度(i)作图[μ_{最大(真值)}/μ_i(真值)-1]产生具有梯度1/K_i的直线。为了提高图表的精确性，作图的抑制剂浓度是批次实验过程中每一Klett瓶中乙醇浓度的平均值。这通过GC分析来确定。

K_i越高，菌株对生长的乙醇抑制越耐受。表2显示4种菌株的K_i值，并显示亲本FY23WT是最耐受的，线粒体小菌落是最敏感的(FY23WT耐受性的76％)。对核小菌落的分析表明，100％呼吸缺陷的核小菌落FY23Δpet191具有与FY23WT相当的乙醇耐受性(K_i约为野生型值的95％)，而85％呼吸缺陷的FY23Δcox5a具有野生型菌株所显示的86％的耐受性。1.2.3乙醇生产

在2L工作容积的搅拌式容器中进行分批发酵，以比较等基因系列成员的乙醇生产力。为了能进行乙醇生产力的良好比较，需要高发酵率，这可通过在葡萄糖抑制-5％(w/v)葡萄糖—的条件下进行所有发酵来实现。在整个发酵过程中用无菌空气使培养基饱和。保持这一点，使得氧对于酵母是可得的，以用于发酵过程中的非呼吸功能，主要是固醇和不饱和脂肪酸的生物合成，以及卟啉和血红素的生物合成、培养基成分的氧化和前线粒体向线粒体的分化。一旦葡萄糖底物被耗尽，对于FY23WT和FY23Δcox5a的呼吸而言分子氧也是可利用的

图4-7显示等基因系列四种成员的发酵数据。在每种情况下，排出气中二氧化碳的浓度产生一种遵循典型分批生长的分布图。已经用大量术语描述了生长期(图4-6中的15-25小时，图7中的5-25小时)，其特征总是在于高水平的发酵活动和被充分抑制的呼吸。术语“呼吸发酵”生长是恰当的，因为它反映细胞的生理状态，并强调优势发酵生长，其间培养物以最大比生长速率μ最大生长。表3和表4显示每一菌株的最大比生长速率，与FY23WT的比较显示，ORF PET191和COX5a的破坏对该参数没有明显影响。另一方面，ρ⁰的比生长速率是FY23WT的64.2％，表明线粒体基因组的丢失对胞质小菌落的生长具有相当大的影响。

在接种时将溶解氧张力(DOT)设置为100％，并且也对其监控。与生长后期相符的DOT降低表示对于非呼吸功能(所有菌株)和呼吸功能(只有FY23WT和FY23Δcox5a)的氧需求，之后恢复为100％。对于所有菌株，当细胞进入双峰后期时培养的生长速率降低，因为初始可发酵底物—葡萄糖—的浓度最后降低为最小值。在图4中，双峰生长期葡萄糖底物耗尽后发生生长，其间FY23WT利用发酵产物乙醇作为其主要碳源和能源。利用通过氧化磷酸化将乙醇氧化为乙酸的呼吸实现细胞生长。FY23Δcox5a显示用乙醇作为次级底物的呼吸生长期的证据，但达不到与grande FY23WT相同的程度。双峰期的二氧化碳水平达不到与grande一样高的值，而DOT浓度不降为一样低的值，表明突变体的呼吸水平不这样高。这种10-15％的残余呼吸能力被认为直接归因于染色体COX5b基因。

FY23Δpet191和FY23ρ⁰在分批生长末期的CO₂分布图显示0％(±0.05％)的浓度，DOT水平恒定为100％，表明没有双峰呼吸生长期。如预期的，这2种菌株显示小菌落表型，因此不能氧化作为备择能源的乙醇。

对于所有发酵，从呼吸发酵指数期中期直到“呼吸”生长期末期，每小时采取样品，将细胞用于干重分析，上清液在-20℃冷冻用于GC分析。随后由这些数据计算乙醇生产的比速率值q_p。

表3和表4总结了等基因系列4种成员中每一种的q_p值。用线粒体小菌落FY23ρ⁰获得q_p的最低值，证实了以前工作者的结果。在试验条件下，亲代grande FY23WT显示比FY23ρ⁰略高的q_p，这或许是由于提高的μ_最大和维持其乙醇耐受性的完整线粒体基因组的存在。部分呼吸缺陷的核小菌落FY23Δcox5a显示比野生型高30.2％的生产力，而完全呼吸缺陷的小菌落FY23Δpet191比野生型高42.6％。由于不能呼吸，FY23Δpet191显示增加的由葡萄糖到乙醇的糖酵解通量。这高于有呼吸能力的野生型，后者主要通过氧化磷酸化进行ATP的产生。FY23Δcox5a的相对生产力比FY23Δpet191约低9％，这粗略地对应于COX5b基因提供的10-15％的残余呼吸能力。1.2.4呼吸商

呼吸商(RQ)被定义为产生的CO₂摩尔数/消耗的O₂摩尔数。

对于碳水化合物的完全氧化，即完全呼吸生长，RQ为6/6＝1.0。然而，实际上，酵母为了非呼吸功能消耗氧，因此看到低于1的RQ值。在真正厌氧的发酵生长中，不消耗氧，因此RQ的理论值无穷大。

为了确定等基因系列的四种菌株是呼吸性生长(低RQ值)还是发酵性生长(高RQ值)，计算每批发酵过程中的RQ值(见表5)。

两种100％呼吸缺陷小菌落FY23Δpet191和FY23ρ⁰的平均RQ值是可比的，即17.0-17.5±1.0。呼吸充分型亲本FY23WT的RQ值是8.0±1.0，而大约85％呼吸缺陷的FY23Δcox5a为15±1.0。根据理论预测，呼吸发酵生长的FY23WT具有最低的RQ值，FY23Δcox5a所显示的部分呼吸但主要发酵性生长具有较高的RQ值，两种纯粹的发酵株FY23Δpet191和FY23ρ⁰具有最高的RQ值。

表5.等基因系列的呼吸商(RQ)

菌株	RQ
菌株	RQ	FY23WT	8.0±1.0
FY23Δpet191	17.0-17.5±1.0	FY23WT	8.0±1.0
FY23Δpet191	17.0-17.5±1.0	FY23Δcox5a	15±1.0
FY23ρ⁰	17.0-17.5±1.0	FY23Δcox5a	15±1.0

1.3.结论

外源乙醇对四种菌株的影响的检查表明，功能性线粒体对于维持酵母对乙醇的耐受性是必要的，胞质小菌落突变体显示该系列中最低的耐受性。线粒体基因组被认为在某些细胞表面现象中起重要作用，因而在不确定的程度上决定一种菌株的乙醇耐受性。

比生产率数据显示，两种核小菌落所显示的提高的生产力是它们在分批生长“呼吸发酵”期不能呼吸及相对高的乙醇耐受性的结果。它们的呼吸缺陷表型的意思是，巴斯德效应被成功地克服，使得能达到比呼吸充分的野生型更高的发酵率。完全功能性线粒体的拥有足以维持其乙醇耐受性，从而保持高生长率。虽然胞质小菌落避免了巴斯德效应，但线粒体基因组的缺乏阻止达到高发酵率。

因此，呼吸缺陷型核小菌落可用于乙醇的商业生产(尤其在氧供应不能被严格控制的情况下)。100％呼吸缺陷的核小菌落不能在双峰生长期生长，因此不能将发酵产物(乙醇)作为其次级底物代谢。这使得能达到更高的乙醇终滴度。

总之，菌株FY23Δpet191显示：

(a)完全功能性线粒体基因组引起的乙醇耐受性的保持；

(b)由于对巴斯德效应的不敏感性，乙醇比生产率提高43％(这表明可达到更高的最终乙醇上限)；

(c)与其呼吸充分型亲本相当的最大比生长速率(μ_最大)；和

(d)其呼吸缺陷型表型，它在葡萄糖底物耗尽后使之不能利用乙醇或不可发酵的糖作为底物，因此导致达到更高的乙醇滴度。实施例2

实施例1中进行的工作突出了实验室核小菌落FY23Δpet191所显示的许多有利特性。

因此将核小菌落突变的有利特点引入一种可商业应用的酿造株K1(一种呼吸充分型高度乙醇耐受的高产乙醇生产株)，而产生一种根据本发明的最优选的酵母株。2.1方法2.1.1使用的酵母株2.1.1.1K1WT

在本实施例中使用K1WT，一种二倍体，grande[ρ⁺]，(LallemandU.K.LTD，Fife，苏格兰，由Danstar Ferment AG生产)，作为工业用有呼吸能力的亲代酵母。K1WT用作发酵研究中的对照酵母株，并用作产生呼吸缺陷型酵母细胞的酵母株。2.1.1.3K1Δpet191ab

K1Δpet191ab是根据本发明第一方面的一种酵母细胞。K1Δpet191ab是K1WT的一种核小菌落突变体，具有PET191基因两个拷贝的破坏。这种突变导致细胞色素c氧化酶全酶装配的失败，从而诱导100％的呼吸缺陷。以下给出了关于该突变体产生的细节。2.1.1工业酵母株的遗传修饰

K1WT具有两种拷贝的PET191(即它是该基因的二倍体)，因此采取措施来删除这两种基因拷贝(PET191a和PET191b)。

使用Guldener等人(1996，核酸研究(24)13：2519-2524)发展的改进的聚合酶链反应(PCR)-介导的基因破坏技术进行K1WT中的多基因删除，其中loxP-kanMX-loxP破坏盒结合了异源kan^R标记(Wach等人，1994，如上文)与噬菌体P1的Cre-loxP重组系统的优点。2.1.1.1第一种拷贝PET191(a)的破坏

(a)破坏盒的产生

最初用1.1.2.1中所述的PCR方法产生1.36kb的破坏盒(pet191∷loxPKanMX4(1))，用该破坏盒使K1中的ORF PET191无功能性。除了KanMX4基因侧翼为编码34bp LoxP反向重复序列的DNA(SEQ ID NO.17)外，该盒与前述相同。

该破坏盒的产生是使用载体pUG6(Guldener等人，如上文，所述的环状染色体外DNA元件)作为模板，并使用与1.1.2.1中所用相同的两种引物(SEQ ID NO 7和8)。

pUG6含有侧翼为34bp loxP反向重复序列的KanMX4基因(来源于大肠杆菌，可在酵母中表达而使该酵母对抗生素遗传霉素有抗性)(见图8)。

此两种引物具有与loxPKanMX4盒任一侧区域同源的19-22个核苷酸，并具有35个核苷酸的延伸，该延伸或者与ORF PET191起始密码子的直接上游区同源或者与其终止密码子的下游区同源(见图9(a))。

(b)用破坏盒对K1的转化

该盒正确扩增后，将1-2μg乙醇沉淀的DNA用于K1WT的转化。一旦转化，在PET191∷loxPKanMX4(1)盒的同源区与靶基因之间即发生重组事件，导致PET191的破坏(图9(b))。由于破坏盒的遗传霉素抗性基因，在遗传霉素平板上进行转化子的筛选，并对于正确的基因破坏体进行转化子筛查。

(c)正确基因破坏的验证

用1.1.3所述的分析PCR(Wach等人，1994)验证了该破坏盒向遗传霉素抗性酵母基因组基因座的正确定向。

分析PCR的结果表明，工业株K1Δpet191a(“a”指明K1中PET191第一种拷贝的破坏)具有被正确破坏的两种PET191等位基因之一，而另一种PET191 ORF(PET191b)保持完整，即该菌株在染色体X上的PET191基因座处为杂合的。

为了分离染色体，也用钳位均匀电场(CHEF)技术对K1Δpet191a施以脉冲电场凝胶电泳。其后是Southern杂交，由此用³²p-标记的loxPKanMX4盒探测硝化纤维素膜(染色体DNA与之结合)。随后对磷成像仪(Biorad，UK)的曝光表明，pet191∷loxPkanMX4盒已经正确地整合入染色体X中。

(d)YEP351-cre-cyh的构建

如图10所示，YEP351cre-cyh由YEP351(由Hill等人，酵母2：163-167，1986充分描述)衍生。YEP351cre-cyh是一种多拷贝的质粒，含有GAL1/cre重组酶系统，和赋予对抗生素环己酰亚胺(cyh)抗性的标记基因。环己酰亚胺是一种抑制蛋白质合成的抗生素，在真核生物中，这种抑制由80S核糖体的60S核糖体亚基肽基转移酶活性的抑制引起。酿酒酵母对低浓度(一般为0.2μg/ml)的环己酰亚胺敏感。

将环己酰亚胺基因(Genbank保藏号M64932，及Sasnauskas等人(1992)基因116：105-108页)的3330bp XbaI-HindIII片段连接入XbaI-HindIII消化的酵母多拷贝质粒YEP351(5644bp)中，产生YEP351-cyh(8944bp)(见图10(b))。用得到的连接混合物转化大肠杆菌(XL1-Blue)，使用蓝/白筛选系统，YEP351 lacZ基因的破坏使推断的YEP351-cyh克隆的分离成为可能。从大肠杆菌中小量制备分离质粒，并将其引入酿酒酵母FY23中，使该菌株对抗生素环己酰亚胺(2μg/ml)有抗性。

2260bp PvuII“cre重组酶”片段由GAL1启动子、cre重组酶基因和来源于pSH47的CYC1终止子组成(参见Guldener等人，如上文)，将其连接至SacI消化的平端YEP351-cyh中，产生YEP351-cre-cyh(11204bp)(见图10(c))。用得到的连接混合物转化酿酒酵母，使用³²P-标记的“cre”插入片段作为探针，对推断的YEP351-cre-cyh进行酵母菌落杂交，并以此分离。

(e)标记复原

为了从遗传霉素抗性杂合缺失体菌株K1Δpet191a中删除第二种PET191等位基因(PET191b)，首先要利用cre重组酶系统从PET191a中去除KanMX标记。实现方法是最初用YEP351-cre-cyh转化该菌株(见图9(d)和图10)。通过对基本培养基补充环己酰亚胺(cyh＝2μg/ml)对K1Δpet191a保持载体的选择压力。

在用作唯一碳源的半乳糖的存在下完成cre重组酶基因的表达(见图9(e))。cre重组酶介导KanMX标记侧翼的两种反向重复loxP位点的重组。两种loxP位点彼此相邻地对齐并重组，引起标记从破坏的PET191基因座上的有效切除，使其重复地用于随后的基因删除。该技术确保基因删除中使用的实际上所有异源DNA的去除，由于当前对酿造工业中使用基因工程酵母的限制，因此这是重要的。两种34bp loxP位点之一仍在缺失的PET191基因座处(见图9(f))。在半乳糖培养基中只生长2小时对于≥95％细胞中loxPKanMX4标记的切除即是足够的，产生的菌落成为遗传霉素敏感的。通过将细胞涂板于补充有环己酰亚胺的基本培养基上，并将菌落转移到遗传霉素上证明不生长，证实了这一点。

通过导致只有572bp野生型带产生的菌落PCR，验证了标记从K1Δpet191a上的正确切除。缺失片段的扩增不再是可能的，因为以前整合的KanMX盒现已不存在，使菌株对遗传霉素敏感。2.1.1.2PET191第二拷贝的破坏

然后通过用第二种pet191∷loxPKanMX4(2)破坏盒转化，在含有YEP351-cre-cyh的遗传霉素敏感性菌株中进行第二轮基因破坏(图11(2))。

如2.1.1.1所述构建pet191∷loxPKanMX4(2)，所不同的是用不同引物构建该盒，使得破坏盒的5’和3’端与位于第一种破坏盒同源区内部的PET191基因区同源。在PCR步骤中使用的两种引物(SEQ ID NO 18和19)与loxPKanMX4盒任一侧区域具有核苷酸同源性，并具有与PET191基因内部区同源的核苷酸延伸。

表6用于产生第二种破坏盒pet191∷loxPKanMX4(2)的引物

寡核苷酸引物DNA SEQ ID No.	DNA序列	描述
寡核苷酸引物DNA SEQ ID No.	DNA序列	描述	18	5’-GAG ATC GCC CTG TGT CATGAT AGA GAG ACA TAA CCC TCAAGA CAG C-3’	PET191上游(2)(用于KanMX缺失盒的构建)
19	5’-TTT ATT TAT GTA TAT ATTTAC AGG CCA ATT TTC ATA AATACA TAG GCC-3’	PET191下游(2)(用于KanMX缺失盒的构建)	18		PET191上游(2)(用于KanMX缺失盒的构建)

对0.5mg/ml G418抗性的菌落进行菌落PCR。824bp缺失片段的单独出现证实具有双PET191缺失体K1Δpet191ab(“b”指明K1中未知数量的PET191 ORF第二种拷贝的破坏)。未见到572bp野生型片段，证实PET191的两种拷贝都已被成功地删除(图9(f))。

如同2.1.1.1(f)，从突变体上切除所有异源DNA(除单一34bp loxP位点外)，通过cre重组酶在半乳糖培养基上的表达产生K1Δpet191ab(如上所述)，引起菌株对遗传霉素的敏感性。2.1.1.3载体复原

通过使菌株生长至少100代，每代的载体损失率为1％，去除使菌株对环己酰亚胺有抗性的载体YEP351-cre-cyh。重复传代培养大约10天后对培养物的复制涂板(向100ml YPD中加入100μl过夜培养物)产生遗传霉素敏感的、环己酰亚胺敏感的K1Δpet191ab核小菌落。2.1.2K1Δpet191ab概述

遗传改造工业酵母株K1WT，产生呼吸缺陷型核小菌落K1Δpet191ab。除了呼吸所需的两种PET191基因缺失外，K1Δpet191ab与其亲本K1WT等基因(遗传学相同)。保持在每一缺失的PET191基因座都插入的是单一34bp loxP位点。分析PCR是一种用来验证正确基因缺失的高特异性方法，其证实：

(a)PET191两种拷贝的缺乏，和

(b)未改变其它的非靶基因。

核小菌落具有完全功能性的线粒体DNA，并且对任何抗生素(如遗传霉素或环己酰亚胺)无抗性，因为KanMX基因和载体YEP351-cre-cyh已被去除。在这两种抗生素上不能生长证实了酵母的敏感性。

应当理解，标记基因未缺失的K1的突变体也落入本发明的范围内。例如，SEQ ID NO.3的DNA片段(在同源重组过程中插入的loxP∷KanMX4 DNA片段)可留在K1中PET191的一种或两种拷贝中。当情况如此时，核小菌落酵母仍适于根据本发明的方法生产乙醇，尽管事实是标记基因的切除常常是所希望的(例如，为了防止有抗生素抗性的微生物向环境中的引入)。2.2K1Δpet191ab的表征

可基本上根据实施例1所述的方法培养K1Δpet191ab细胞，并且可以估计从该细胞中产生的乙醇。

序列表(1)一般信息：(i)申请人：

(A)姓名：SACHETPACK LIMITED

(B)街道：6 PIENTON WAY，NORTH CHESHIRE TRADINGESTATE

(C)城市：PRENTON

(E)国家：英国

(F)邮政编码：L43 3DU(ii)发明名称：乙醇生产(iii)序列数目：19(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：磁盘

(B)计算机：IBM兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatnetIn Release #1.0 Version #1.30(EPO)

(2)SEQ.ID.NO.1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：327个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(iii)假拟：非

(xi)SEQ.ID.NO.1的序列描述：

TGCAGAGATC GCCCTGTGTC ATGATAGAGA GACATAACCC TCAAGAATGT CTTGACAATC 60

CAGAGCTGAA TAAGGATCTG CCCGAACTTT GTATTGCTCA GATGAAAGCA TTTTTGGATT 120

GTAAGCGAGG AATCGTCGAC ATGACTAAGC GGTTCACAGG TAACGCACCT CTGTCGACTG 180

GCAAGTACGA TCAACAGTAC GAAAACTTGT GCAAAGGAAA GTTTGATCCG AGGGAGGAGA 240 TGGAAAAGCT AAAACTTCTG AACAGCCAGC AGAAGGACTG ATTATTTATG AAAATTGGCC 300TGTAAATATA TACATAAATA AATATAT 327(2)SEQ.ID.NO.2的信息：(i)序列特征：

(A)长度：1544个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：非(xi)SEQ.ID.NO.2的序列描述：CAGCTGAAGC TTCGTACGCT GCAGGTCGAC GGATCCCCGG GTTAATTAAG GCGCGCCAGA 60TCTGTTTAGC TTGCCTCGTC CCCGCCGGGT CACCCGGCCA GCGACATGGA GGCCCAGAAT 120ACCCTCCTTG ACAGTCTTGA CGTGCGCAGC TCAGGGGCAT GATGTGACTG TCGCCCGTAC 180ATTTAGCCCA TACATCCCCA TGTATAATCA TTTGCATCCA TACATTTTGA TGGCCGCACG 240GCGCGAAGCA AAAATTACGG CTCCTCGCTG CAGACCTGCG AGCAGGGAAA CGCTCCCCTC 300ACAGACGCGT TGAATTGTCC CCACGCCGCG CCCCTGTAGA GAAATATAAA AGGTTAGGAT 360TTGCCACTGA GGTTCTTCTT TCATATACTT CCTTTTAAAA TCTTGCTAGG ATACAGTTCT 420CACATCACAT CCGAACATAA ACAACCATGG GTAAGGAAAA GACTCACGTT TCGAGGCCGC 480GATTAAATTC CAACATGGAT GCTGATTTAT ATGGGTATAA ATGGGCTCGC GATAATGTCG 540GGCAATCAGG TGCGACAATC TATCGATTGT ATGGGAAGCC CGATGCGCCA GAGTTGTTTC 600TGAAACATGG CAAAGGTAGC GTTGCCAATG ATGTTACAGA TGAGATGGTC AGACTAAACT 660GGCTGACGGA ATTTATGCCT CTTCCGACCA TCAAGCATTT TATCCGTACT CCTGATGATG 720CATGGTTACT CACCACTGCG ATCCCCGGCA AAACAGCATT CCAGGTATTA GAAGAATATC 780CTGATTCAGG TGAAAATATT GTTGATGCGC TGGCAGTGTT CCTGCGCCGG TTGCATTCGA 840TTCCTGTTTG TAATTGTCCT TTTAACAGCG ATCGCGTATT TCGTCTCGCT CAGGCGCAAT 900 CACGAATGAA TAACGGTTTG GTTGATGCGA GTGATTTTGA TGACGAGCGT AATGGCTGGC 960CTGTTGAACA AGTCTGGAAA GAAATGCATA AGCTTTTGCC ATTCTCACCG GATTCAGTCG 1020TCACTCATGG TGATTTCTCA CTTGATAACC TTATTTTTGA CGAGGGGAAA TTAATAGGTT 1080GTATTGATGT TGGACGAGTC GGAATCGCAG ACCGATACCA GGATCTTGCC ATCCTATGGA 1140ACTGCCTCGG TGAGTTTTCT CCTTCATTAC AGAAACGGCT TTTTCAAAAA TATGGTATTG 1200ATAATCCTGA TATGAATAAA TTGCAGTTTC ATTTGATGCT CGATGAGTTT TTCTAATCAG 1260TACTGACAAT AAAAAGATTC TTGTTTTCAA GAACTTGTCA TTTGTATAGT TTTTTTATAT 1320TGTAGTTGTT CTATTTTAAT CAAATGTTAG CGTGATTTAT ATTTTTTTTC GCCTCGACAT 1380CATCTGCCCA GATGCGAAGT TAAGTGCGCA GAAAGTAATA TCATGCGTCA ATCGTATGTG 1440AATGCTGGTC GCTATACTGC TGTCGATTCG ATACTAACGC CGCCATCCAG TGTCGAAAAC 1500GAGCTCGAAT TCATCGATGA TATCAGATCC ACTAGTGGCC TATG 1544(2)SEQ.ID.NO.3的信息：(i)序列特征：

(A)长度：1598个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：非(xi)SEQ.ID.NO.3的序列描述：CAGCTGAAGC TTCGTACGCT GCAGGTCGAC AACCCTTAAT ATAACTTCGT ATAATGTATG 60CTATACGAAG TTATTAGGTC TAGATTTAGC TTGCCTCGTC CCCGCCGGGT CACCCGGCCA 120GCGACATGGA GGCCCAGAAT ACCCTCCTTG ACAGTCTTGA CGTGCGCAGC TCAGGGGCAT 180GATGTGACTG TCGCCCGTAC ATTTAGCCCA TACATCCCCA TGTATAATCA TTTGCATCCA 240

TACATTTTGA TGGCCGCACG GCGCGAAGCA AAAATTACGG CTCCTCGCTG CAGACCTGCG 300

AGCAGGGAAA CGCTCCCCTC ACAGACGCGT TGAATTGTCC CCACGCCGCG CCCCTGTAGA 360

GAAATATAAA AGGTTAGGAT TTGCCACTGA GGTTCTTCTT TCATATACTT CCTTTTAAAA 420

TCTTGCTAGG ATACAGTTCT CACATCACAT CCGAACATAA ACAACCATGG GTAAGGAAAA 480

GACTCACGTT TCGAGGCCGC GATTAAATTC CAACATGGAT GCTGATTTAT ATGGGTATAA 540

ATGGGCTCGC GATAATGTCG GGCAATCAGG TGCGACAATC TATCGATTGT ATGGGAAGCC 600

CGATGCGCCA GAGTTGTTTC TGAAACATGG CAAAGGTAGC GTTGCCAATG ATGTTACAGA 660

TGAGATGGTC AGACTAAACT GGCTGACGGA ATTTATGCCT CTTCCGACCA TCAAGCATTT 720

TATCCGTACT CCTGATGATG CATGGTTACT CACCACTGCG ATCCCCGGCA AAACAGCATT 780

CCAGGTATTA GAAGAATATC CTGATTCAGG TGAAAATATT GTTGATGCGC TGGCAGTGTT 840

CCTGCGCCGG TTGCATTCGA TTCCTGTTTG TAATTGTCCT TTTAACAGCG ATCGCGTATT 900

TCGTCTCGCT CAGGCGCAAT CACGAATGAA TAACGGTTTG GTTGATGCGA GTGATTTTGA 960

TGACGAGCGT AATGGCTGGC CTGTTGAACA AGTCTGGAAA GAAATGCATA AGCTTTTGCC 1020

ATTCTCACCG GATTCAGTCG TCACTCATGG TGATTTCTCA CTTGATAACC TTATTTTTGA 1080

CGAGGGGAAA TTAATAGGTT GTATTGATGT TGGACGAGTC GGAATCGCAG ACCGATACCA 1140

GGATCTTGCC ATCCTATGGA ACTGCCTCGG TGAGTTTTCT CCTTCATTAC AGAAACGGCT 1200

TTTTCAAAAA TATGGTATTG ATAATCCTGA TATGAATAAA TTGCAGTTTC ATTTGATGCT 1260

CGATGAGTTT TTCTAATCAG TACTGACAAT AAAAAGATTC TTGTTTTCAA GAACTTGTCA 1320

TTTGTATAGT TTTTTTATAT TGTAGTTGTT CTATTTTAAT CAAATGTTAG CGTGATTTAT 1380

ATTTTTTTTC GCCTCGACAT CATCTGCCCA GATGCGAAGT TAAGTGCGCA GAAAGTAATA 1440

TCATGCGTCA ATCGTATGTG AATGCTGGTC GCTATACTGC TGTCGATTCG ATACTAACGC 1500

CGCCATCCAG TGTCGAAAAC GAGAACCCTT AATATAACTT CGTATAATGT ATGCTATACG 1560

AAGTTATTAG GTGATATCAG ATCCACTAGT GGCCTATG 1598(2)SEQ.ID.NO.4的信息：(i)序列特征：

(A)长度：237个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：非(xi)SEQ.ID.NO.4的序列描述： ATGTCTTGAC AATCCAGAGC TGAATAAGGA TCTGCCCGAA CTTTGTATTG CTCAGATGAA 60AGCATTTTTG GATTGTAAGC GAGGAATCGT CGACATGACT AAGCGGTTCA CAGGTAACGC 120ACCTCTGTCG ACTGGCAAGT ACGATCAACA GTACGAAAAC TTGTGCAAAG GAAAGTTTGA 180TCCGAGGGAG GAGATGGAAA AGCTAAAACT TCTGAACAGC CAGCAGAAGG ACTGATT 237(2)SEQ.ID.NO.5的信息：(i)序列特征：

(A)长度：380个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：非(xi)SEQ.ID.NO.5的序列描述：

CATCCGTAAG ATTCGCTCAA ACACATGCTC TTTCCAACGC TGCTGTAATG GATCTGCAAT 60

CCAGATGGGA GAACATGCCC TCCACTGAGC AGCAGGATAT TGTCAGTAAG TTGAGTGAAC 120

GTCAAAAATT ACCATGGGCA CAGCTTACTG AGCCTGAAAA GCAAGCTGTG TGGTACATTT 180

CTTACGGAGA ATGGGGCCCA AGAAGACCTG TATTGAATAA GGGTGATTCC AGTTTTATTG 240

CCAAAGGTGT TGCTGCAGGC CTACTATTTT CAGTGGGACT TTTTGCTGTC GTCAGGATGG 300

CGGGTGGCCA AGACGCAAAG ACCATGAATA AGGAGTGGCA GCTAAAGAGT GACGAATATT 360

TGAAGTCGAA GAATGCTAAT 380(2)SEQ.ID.NO.6的信息：(i)序列特征：

(A)长度：3938个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：非(xi)SEQ.ID.NO.6的序列描述： GAACGCGGCC GCCAGCTGAA GCTTCGTACG CTGCAGGTCG ACGGATCCCC GGGTTAATTA 60AGGCGCGCCA GATCTGTTTA GCTTGCCTCG TCCCCGCCGG GTCACCCGGC CAGCGACATG 120GAGGCCCAGA ATACCCTCCT TGACAGTCTT GACGTGCGCA GCTCAGGGGC ATGATGTGAC 180TGTCGCCCGT ACATTTAGCC CATACATCCC CATGTATAAT CATTTGCATC CATACATTTT 240GATGGCCGCA CGGCGCGAAG CAAAAATTAC GGCTCCTCGC TGCAGACCTG CGAGCAGGGA 300AACGCTCCCC TCACAGACGC GTTGAATTGT CCCCACGCCG CGCCCCTGTA GAGAAATATA 360AAAGGTTAGG ATTTGCCACT GAGGTTCTTC TTTCATATAC TTCCTTTTAA AATCTTGCTA 420GGATACAGTT CTCACATCAC ATCCGAACAT AAACAACCAT GGGTAAGGAA AAGACTCACG 480TTTCGAGGCC GCGATTAAAT TCCAACATGG ATGCTGATTT ATATGGGTAT AAATGGGCTC 540GCGATAATGT CGGGCAATCA GGTGCGACAA TCTATCGATT GTATGGGAAG CCCGATGCGC 600CAGAGTTGTT TCTGAAACAT GGCAAAGGTA GCGTTGCCAA TGATGTTACA GATGAGATGG 660TCAGACTAAA CTGGCTGACG GAATTTATGC CTCTTCCGAC CATCAAGCAT TTTATCCGTA 720CTCCTGATGA TGCATGGTTA CTCACCACTG CGATCCCCGG CAAAACAGCA TTCCAGGTAT 780TAGAAGAATA TCCTGATTCA GGTGAAAATA TTGTTGATGC GCTGGCAGTG TTCCTGCGCC 840GGTTGCATTC GATTCCTGTT TGTAATTGTC CTTTTAACAG CGATCGCGTA TTTCGTCTCG 900CTCAGGCGCA ATCACGAATG AATAACGGTT TGGTTGATGC GAGTGATTTT GATGACGAGC 960GTAATGGCTG GCCTGTTGAA CAAGTCTGGA AAGAAATGCA TAAGCTTTTG CCATTCTCAC 1020CGGATTCAGT CGTCACTCAT GGTGATTTCT CACTTGATAA CCTTATTTTT GACGAGGGGA 1080AATTAATAGG TTGTATTGAT GTTGGACGAG TCGGAATCGC AGACCGATAC CAGGATCTTG 1140CCATCCTATG GAACTGCCTC GGTGAGTTTT CTCCTTCATT ACAGAAACGG CTTTTTCAAA 1200AATATGGTAT TGATAATCCT GATATGAATA AATTGCAGTT TCATTTGATG CTCGATGAGT 1260TTTTCTAATC AGTACTGACA ATAAAAAGAT TCTTGTTTTC AAGAACTTGT CATTTGTATA 1320GTTTTTTTAT ATTGTAGTTG TTCTATTTTA ATCAAATGTT AGCGTGATTT ATATTTTTTT 1380TCGCCTCGAC ATCATCTGCC CAGATGCGAA GTTAAGTGCG CAGAAAGTAA TATCATGCGT 1440CAATCGTATG TGAATGCTGG TCGCTATACT GCTGTCGATT CGATACTAAC GCCGCCATCC 1500AGTTTAAACG AGCTCGAATT CATCGATGAT ATCAGATCCA CTAGTGGCCT ATGCGGCCGC 1560GGATCTGCCG GTCTCCCTAT AGTGAGTCGT ATTAATTTCG ATAAGCCAGG TTAACCTGCA 1620TTAATGAATC GGCCAACGCG CGGGGAGAGG CGGTTTGCGT ATTGGGCGCT CTTCCGCTTC 1680CTCGCTCACT GACTCGCTGC GCTCGGTCGT TCGGCTGCGG CGAGCGGTAT CAGCTCACTC 1740AAAGGCGGTA ATACGGTTAT CCACAGAATC AGGGGATAAC GCAGGAAAGA ACATGTGAGC 1800AAAAGGCCAG CAAAAGGCCA GGAACCGTAA AAAGGCCGCG TTGCTGGCGT TTTTCCATAG 1860GCTCCGCCCC CCTGACGAGC ATCACAAAAA TCGACGCTCA AGTCAGAGGT GGCGAAACCC 1920GACAGGACTA TAAAGATACC AGGCGTTTCC CCCTGGAAGC TCCCTCGTGC GCTCTCCTGT 1980TCCGACCCTG CCGCTTACCG GATACCTGTC CGCCTTTCTC CCTTCGGGAA GCGTGGCGCT 2040TTCTCAATGC TCACGCTGTA GGTATCTCAG TTCGGTGTAG GTCGTTCGCT CCAAGCTGGG 2100CTGTGTGCAC GAACCCCCCG TTCAGCCCGA CCGCTGCGCC TTATCCGGTA ACTATCGTCT 2160TGAGTCCAAC CCGGTAAGAC ACGACTTATC GCCACTGGCA GCAGCCACTG GTAACAGGAT 2220TAGCAGAGCG AGGTATGTAG GCGGTGCTAC AGAGTTCTTG AAGTGGTGGC CTAACTACGG 2280CTACACTAGA AGGACAGTAT TTGGTATCTG CGCTCTGCTG AAGCCAGTTA CCTTCGGAAA 2340AAGAGTTGGT AGCTCTTGAT CCGGCAAACA AACCACCGCT GGTAGCGGTG GTTTTTTTGT 2400TTGCAAGCAG CAGATTACGC GCAGAAAAAA AGGATCTCAA GAAGATCCTT TGATCTTTTC 2460TACGGGGTCT GACGCTCAGT GGAACGAAAA CTCACGTTAA GGGATTTTGG TCATGAGATT 2520ATCAAAAAGG ATCTTCACCT AGATCCTTTT AAATTAAAAA TGAAGTTTTA AATCAATCTA 2580AAGTATATAT GAGTAAACTT GGTCTGACAG TTACCAATGC TTAATCAGTG AGGCACCTAT 2640CTCAGCGATC TGTCTATTTC GTTCATCCAT AGTTGCCTGA CTCCCCGTCG TGTAGATAAC 2700TACGATACGG GAGGGCTTAC CATCTGGCCC CAGTGCTGCA ATGATACCGC GAGACCCACG 2760CTCACCGGCT CCAGATTTAT CAGCAATAAA CCAGCCAGCC GGAAGGGCCG AGCGCAGAAG 2820TGGTCCTGCA ACTTTATCCG CCTCCATCCA GTCTATTAAT TGTTGCCGGG AAGCTAGAGT 2880AAGTAGTTCG CCAGTTAATA GTTTGCGCAA CGTTGTTGCC ATTGCTACAG GCATCGTGGT 2940GTCACGCTCG TCGTTTGGTA TGGCTTCATT CAGCTCCGGT TCCCAACGAT CAAGGCGAGT 3000TACATGATCC CCCATGTTGT GCAAAAAAGC GGTTAGCTCC TTCGGTCCTC CGATCGTTGT 3060CAGAAGTAAG TTGGCCGCAG TGTTATCACT CATGGTTATG GCAGCACTGC ATAATTCTCT 3120TACTGTCATG CCATCCGTAA GATGCTTTTC TGTGACTGGT GAGTACTCAA CCAAGTCATT 3180CTGAGAATAG TGTATGCGGC GACCGAGTTG CTCTTGCCCG GCGTCAATAC GGGATAATAC 3240CGCGCCACAT AGCAGAACTT TAAAAGTGCT CATCATTGGA AAACGTTCTT CGGGGCGAAA 3300ACTCTCAAGG ATCTTACCGC TGTTGAGATC CAGTTCGATG TAACCCACTC GTGCACCCAA 3360CTGATCTTCA GCATCTTTTA CTTTCACCAG CGTTTCTGGG TGAGCAAAAA CAGGAAGGCA 3420AAATGCCGCA AAAAAGGGAA TAAGGGCGAC ACGGAAATGT TGAATACTCA TACTCTTCCT 3480TTTTCAATAT TATTGAAGCA TTTATCAGGG TTATTGTCTC ATGAGCGGAT ACATATTTGA 3540ATGTATTTAG AAAAATAAAC AAATAGGGGT TCCGCGCACA TTTCCCCGAA AAGTGCCACC 3600

TGACGTCTAA GAAACCATTA TTATCATGAC ATTAACCTAT AAAAATAGGC GTATCACGAG 3660

GCCCTTTCGT CTCGCGCGTT TCGGTGATGA CGGTGAAAAC CTCTGACACA TGCAGCTCCC 3720

GGAGACGGTC ACAGCTTGTC TGTAAGCGGA TGCCGGGAGC AGACAAGCCC GTCAGGGCGC 3780

GTCAGCGGGT GTTGGCGGGT GTCGGGGCTG GCTTAACTAT GCGGCATCAG AGCAGATTGT 3840

ACTGAGAGTG CACCATATGG ACATATTGTC GTTAGAACGC GGCTACAATT AATACATAAC 3900

CTTATGTATC ATACACATAC GATTTAGGTG ACACTATA 3938(2)SEQ.ID.NO.7的信息：(i)序列特征：

(A)长度：54个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：非(xi)SEQ.ID.NO.7的序列描述：ATGTAAAGAT CAGAAGAAGG CTGTCGCTAT ATGTTCAGCT GAAGCTTCGT ACGC 54(2)SEQ.ID.NO.8的信息：(i)序列特征：

(A)长度：56个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：非(xi)SEQ.ID.NO.8的序列描述：GATTACTGGA CAAACCGAAT AAAAGAGCTT GACGCCATAG GCCACTAGTG GATCTG 56(2)SEQ.ID.NO.9的信息：(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：非(xi)SEQ.ID.NO.9的序列描述：GCACCTCTGT CGACTGG 17(2)SEQ.ID.NO.10的信息：(i)序列特征：

(A)长度：19个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：非(xi)SEQ.ID.NO.10的序列描述：GAAAGCACGT TAACTCCCA 19(2)SEQ.ID.NO.11的信息：(i)序列特征：

(A)长度：54个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组) (iii)假拟：非(xi)SEQ.ID.NO.11的序列描述：CACTTTTACT AGAGCTGGTG GACTATCACG TATTACAGCT GAAGCTTCGT ACGC 54(2)SEQ.ID.NO.12的信息：(i)序列特征：

(A)长度：57个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：非(xi)SEQ.ID.NO.12的序列描述：TCATTTAGAT TGGACCTGAG AATAACCACC CCAAGGCATA GGCCACTACT GGATCTG 57(2)SEQ.ID.NO.13的信息：(i)序列特征：

(A)长度：16个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：非(xi)SEQ.ID.NO.13的序列描述：CGCCTCCCTA CGCTTC 16(2)SEQ.ID.NO.14的信息：(i)序列特征：

(A)长度：18个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：非(xi)SEQ.ID.NO.14的序列描述：

GCTCAGTAAG CTGTGCCC 18(2)SEQ.ID.NO.15的信息：(i)序列特征：

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：非(xi)SEQ.ID.NO.15的序列描述：

TCTCCTTCAT TACAGAAACG G 21(2)SEQ.ID.NO.16的信息：(i)序列特征：

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：非(xi)SEQ.ID.NO.16的序列描述：

CCGTTTCTGT AATGAAGGAG A 21(2)SEQ.ID.NO.17的信息：(i)序列特征：

(A)长度：34个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：非(xi)SEQ.ID.NO.17的序列描述：

ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTAT 34(2)SEQ.ID.NO.18的信息：(i)序列特征：

(A)长度：46个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：非(xi)SEQ.ID.NO.18的序列描述：GAGATCGCCC TGTGTCATGA TAGAGAGACA TAACCCTCAA GACAGC 46(2)SEQ.ID.NO.19的信息：(i)序列特征：

(A)长度：48个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假拟：非(xi)SEQ.ID.NO.19的序列描述：TTTATTTATG TATATATTTA CAGGCCAATT TTCATAAATA CATAGGCC 48

Claims

1.一种生产乙醇的方法，包括培养呼吸缺陷型酵母细胞及从该酵母细胞中分离乙醇，该细胞具有至少一种呼吸所需的在生长培养基中是无功能的和/或被抑制的核基因，或其产物。

2.根据权利要求1的方法，其中呼吸缺陷型酵母细胞由一种呼吸充分型酵母株衍生而来。

3.根据权利要求2的方法，其中相对于呼吸充分型酵母株，呼吸缺陷型酵母细胞的呼吸至少降低了60％。

4.根据权利要求2的方法，其中相对于呼吸充分型酵母株，呼吸缺陷型酵母细胞的呼吸至少降低了75％。

5.根据权利要求2的方法，其中相对于呼吸充分型酵母株，呼吸缺陷型酵母细胞的呼吸至少降低了85％。

6.根据权利要求2的方法，其中相对于呼吸充分型酵母株，呼吸缺陷型酵母细胞的呼吸至少降低了95％。

7.根据权利要求2-6中任一个的方法，其中通过对呼吸充分型酵母株的遗传修饰使得至少一种呼吸所需的核基因或其产物是无功能的，从而产生呼吸缺陷型酵母细胞。

8.根据权利要求7的方法，其中修饰是一种破坏基因产物的表达或功能的突变。

9.根据权利要求8的方法，其中通过核基因与DNA分子之间的同源重组引入突变。

10.根据权利要求9的方法，其中使用PCR-介导的基因破坏技术产生呼吸缺陷型酵母细胞。

11.根据前述任一权利要求的方法，其中核基因是PET基因。

12.根据权利要求11的方法，其中该基因为PET191。

13.根据权利要求12的方法，其中修饰PET191基因，使得从酵母细胞基因组中切除鉴定为SEQ ID NO.1的DNA序列，并用鉴定为SEQID NO.2的DNA序列替换。

14.根据权利要求12的方法，其中修饰PET191基因，使得从酵母细胞基因组中切除鉴定为SEQ ID NO.1的DNA序列，并用鉴定为SEQID NO.17的DNA序列替换。

15.根据权利要求12的方法，其中修饰PET191基因，使得从酵母细胞基因组中切除鉴定为SEQ ID NO.4的DNA序列，并用鉴定为SEQID NO.17的DNA序列替换。

16.根据权利要求1-10中任一个的方法，其中修饰的核基因与细胞色素c氧化酶的功能或表达有关。

17.根据权利要求14的方法，其中修饰的核基因是COX5a。

18.根据权利要求17的方法，其中修饰COX5a基因，使得从酵母细胞基因组中切除鉴定为SEQ ID NO.5的DNA序列，并用鉴定为SEQID NO.2的DNA序列替换。

19.根据权利要求1-6中任一个的方法，其中至少一种呼吸所需的核基因产物是无功能的和/或被抑制的。

20.根据前述任一权利要求的方法，其中呼吸缺陷型酵母细胞是酿酒酵母或其衍生物。

21.根据权利要求1-19中任一个的方法，其中呼吸缺陷型酵母细胞是葡萄汁酵母(卡尔酵母)或其衍生物。

22.根据权利要求1-19中任一个的方法，其中呼吸缺陷型酵母细胞是Saccharomyces sensu stricto组的成员或其衍生物。

23.根据权利要求1-19中任一个的方法，其中呼吸缺陷型酵母细胞是FY23或其衍生物。

24.根据权利要求1-19中任一个的方法，其中呼吸缺陷型酵母细胞是K1或其衍生物。

25.根据权利要求1-19中任一个的方法，其中呼吸缺陷型酵母细胞选自：M-株或其衍生物、红星或其衍生物、酒类酵母U.C.L.M.S325或其衍生物或酒类酵母U.C.L.M.S377或其衍生物。

26.根据前述任一权利要求的方法，其中生长培养基含有一种可发酵的糖作为碳水化合物来源。

27.根据前述任一权利要求的方法，其中生长培养基是YPD。

28.根据前述任一权利要求的方法，其中细胞在一种发酵罐中生长，该发酵罐具有至少一种调节温度、空气供给、养分含量、废料去除及产品提取的装置。

29.根据前述任一权利要求的方法，其中通过分批培养来培养呼吸缺陷型酵母。

30.根据权利要求1-28中任一项的方法，其中通过连续培养来培养呼吸缺陷型酵母。

31.根据前述任一权利要求用于燃料乙醇生产的方法。

32.一种酵母细胞，其特征在于PET191基因被功能性删除。

33.根据权利要求32的酵母细胞，其中通过DNA分子和编码PET191基因的DNA之间的同源重组，功能性删除PET191基因。

34.根据权利要求32或33的酵母细胞，其中该酵母是FY23株。

35.根据权利要求34的酵母细胞，其中通过从酵母细胞基因组中切除鉴定为SEQ ID NO.1的DNA序列，并用鉴定为SEQ ID NO.2的DNA序列替换，从而功能性删除PET191基因。

36.根据权利要求32或33的酵母细胞，其中该酵母是K1株。

37.根据权利要求36的酵母细胞，其中具有鉴定为SEQ ID NO.1的DNA序列的PET191基因的一种拷贝(PET191a)被切除，并用鉴定为SEQ ID NO.17的DNA序列替换，且具有鉴定为SEQ ID NO.4的DNA序列的PET191基因的第二种拷贝(PET191b)被切除，并用鉴定为SEQ ID NO.17的DNA序列替换。