CN109593695A - 一种在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的方法与应用，通过向载体中插入芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotB‑god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotC‑god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotE‑god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotG‑god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotX‑god基因片段，构建重组载体，然后转化枯草芽孢杆菌制得。本发明所述的枯草芽孢杆菌工程菌表达体系具有安全、无内毒素的特点，在食品和医药产业化领域备受认可。

Description

一种在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的方法与 应用

技术领域

本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的方法与应用，属于基因工程和发酵工程技术领域。

背景技术

葡萄糖氧化酶(GOD)是一种氧化还原酶，在有氧条件下能专一性地催化β-D-葡糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。GOD广泛分布于动植物和微生物体内。由于微生物生长繁殖快、来源广，是生产GOD的主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。目前GOD的应用领域不断拓展，国内外市场需求量急剧增加。产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制性因素。

芽孢表面展示是一项能在芽孢表面表达并展示具有生物活性的外源蛋白的技术，它将外源蛋白的基因与芽孢衣壳蛋白基因融合，从而将外源蛋白锚定在芽孢表面。(Isticatoet al.2001))第一次实现外源蛋白与枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白的融合表达，从此芽孢表面展示技术受到广泛的关注，枯草芽孢杆菌芽孢表面展示技术应用最普遍的原因是因为具有以下几种优势：(1)枯草芽孢杆菌是好氧微生物，并且是典型的革兰氏阳性微生物，属于GRAS分类，生长所需营养要求低；(2)芽孢是在母细胞中自然形成的；(3)细胞质中的分子伴侣可适当促进异源蛋白的正确折叠。

中国专利文献CN105132450A(申请号201510571328.3)公开了一种枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法。本发明利用Cot系列芽孢衣壳蛋白作为芽孢表面展示外源蛋白的分子载体，设计出Cot分子载体的系列引物，通过双酶切既可以替换分子载体又可以更改外源目的蛋白，最后通过基因技术将海藻糖合酶展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，筛选出可以高效展示海藻糖合酶的芽孢衣壳蛋白。

将GOD展示在枯草芽孢杆菌芽孢表面，然后投入以葡萄糖为底物的转化体系中生产葡萄糖酸衍生物，使反应达到循环往复，提高了酶的热稳定性和操作稳定性，又降低了生产成本，同时其可控、简单的工艺便于连续生产为工业化大规模应用提供可能。但上述衣壳蛋白在展示GOD时酶活过低，没有工业化应用价值是制约该技术应用的主要瓶颈。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的方法与应用。本发明利用五种不同的枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白同时作为分子载体，在整合型质粒pDG1730的基础上构建一个可以在芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的载体，通过电转化的方法将重组载体转化到枯草芽孢杆菌中，从而得到一种可以在芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的枯草芽孢杆菌。

本发明技术方案如下：

一种在芽孢表面高效展示葡萄糖氧化酶的枯草芽孢杆菌工程菌，通过向载体中插入芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotB-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotC-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotE-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotG-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotX-god基因片段，构建重组载体，然后转化枯草芽孢杆菌制得；

所述cotB-god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述cotC-god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述cotE-god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述cotG-god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述cotX-god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

根据本发明优选的，所述载体为整合型载体pDG1730。

根据本发明优选的，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述在芽孢表面高效展示葡萄糖氧化酶的枯草芽孢杆菌工程菌的方法，步骤如下：

(1)以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，PCR扩增芽孢衣壳蛋白中CotB，CotC，CotE，CotG和CotX蛋白的基因序列；

所述CotC蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotC-F：aaaactggtctgatcggatccGCAAAGAAGACAAACAAATGTAGGA BamHI；

cotC-R：GGGAACTTCATGTAGTGTTTTTTATGCTTTTTATACTC；

所述CotG蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotG-F：ggatgctggtaatgcttagTTTTTAAAACCGCGCGTACTATG；

cotG-R：ACTTCATTTTGTATTTCTTTTTGACTACCCAG；

所述CotX蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotX-F：gatgctggtaatgcttagCCAATCATAAAAAATAGGGTTCTTCA；

cotX-R：GATTGGGAACTTCATGAGGACAAGAGTGATAACTAGG；

所述CotE蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotE-F：gctggtaatgcttaggctagcGAACTAAATAATCTATGTACCAAATGTTCAA NheI；

cotE-R：GGAACTTCATTTCTTCAGGATCTCCCACTAAAAACTC；

所述CotB蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotB-F：gctggtaatgcttagATGCGTGAAAATGGGTATTCG；

cotB-R：GAACTTCATAAATTTACGTTTCCAGTGATAG；

以黑曲霉Aspergillus niger为模板扩增分别与芽孢衣壳蛋白中CotB，CotC，CotE，CotG和CotX蛋白重叠的葡萄糖氧化酶的基因序列；

所述与CotC蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：

cotc-god-F：AAAGCATAAAAAACACTACATGAAGTTCCCAATCCTT；

cotc-god-R：aCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC；

所述与CotG蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：

cotG-god-F：CAAAAAGAAATACAAAATGAAGTTCCCAATCCTT；

cotG-god-R：ggCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC；

所述与CotX蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：

cotX-god-F：GTTATCACTCTTGTCCTCATGAAGTTCCCAATCCTT；

cotX-god-R：tgcaggaattcgataagcttGCGGCCGCTTTAGGCTAGCCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC NheI、NotI；

所述与CotE蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：

cotE-god-F：GGAGATCCTGAAGAAATGAAGTTCCCAATCCTT；

cotE-god-R：cgcatCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC；

所述与CotB蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：

cotB-god-F：TATCACTGGAAACGTAAATTTATGAAGTTCCCAATCCTT；

cotB-god-R：gaattcgataagcttgcggccgcCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC NotI、HindIII；

(2)分别采用重叠PCR将步骤(1)制得的孢衣壳蛋白中CotB，CotC，CotE，CotG和CotX蛋白的基因序列与其对应的葡萄糖氧化酶基因片段god分别融合，制得cotC-god(Cg)、cotG-god(Gg)、cotX-god(Xg)、cotE-god(Eg)和cotB-god(Bg)融合基因片段；

(3)将整合型质粒pDG1730经BamHI和HindIII双酶切后，同时与步骤(2)中制得的cotC-god、cotG-god、cotX-god三种融合基因进行无缝克隆连接，并转入大肠杆菌DH5α中，制得重组质粒pDG1730-Cg-Gg-Xg；

(4)将步骤(3)中制得的重组质粒pDG1730-Cg-Gg-Xg经NheI和NotI双酶切后，与步骤(2)中制得的cotE-god和cotB-god两种融合基因进行无缝克隆连接，并转入大肠杆菌DH5α中，制得重组质粒pDG1730-Cg-Gg-Xg-Eg-Bg；

(5)将步骤(4)得到的重组质粒pDG1730-Cg-Gg-Xg-Eg-Bg电转化到枯草芽孢杆菌感受态细胞中，筛选，获得重组枯草芽孢杆菌pDG1730-Cg-Gg-Xg-Eg-Bg。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增Cot蛋白基因序列的反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物(cot-F)2.5μL，10μmol/L下游引物(cot-R)2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

PCR反应程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中PCR扩增葡萄糖氧化酶序列god基因的反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物(cot-god-F)2.5μL，10μmol/L下游引物(cot-god-R)2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

PCR反应程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，重叠PCR的初次扩增体系为25μL：

葡萄糖氧化酶基因(C-god/G-god/X-god/E-god/B-god)4μL，cot蛋白基因(cotC/cotG/cotX/cotE/cotB)4μL，2×Phanta Max Master Mix 12.5μL，ddH₂O 4.5μL；

所述重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸90s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠PCR的补充体系为25μL：

上游引物(cot-F)2μL，下游引物(cot-god-R)2μL，2×Phanta Max Master Mix12.5μL，ddH₂O 8.5μL；

所述重叠PCR补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(5)中，电转化的条件如下：

将5μL重组质粒加入50μL枯草芽孢杆菌感受态细胞中，2500V，5ms，电击一次。

根据本发明优选的，所述步骤(5)中，筛选为通过壮观霉素平板进行筛选。

上述枯草芽孢杆菌工程菌在制备葡萄糖酸盐中的应用。

上述应用，步骤如下：

(i)将枯草芽孢杆菌工程菌经活化培养、扩大培养后，在35～38℃发酵96h，离心，取芽孢，制得在芽孢表面固定化的葡萄糖氧化酶；

(ii)将步骤(i)制得的芽孢表面固定化的葡萄糖氧化酶与葡萄糖溶液混合，制得反应溶液；

(iii)将步骤(ii)制得的反应溶液在30～70℃、pH4.0～9.0条件下，搅拌反应1～24h，制得混合溶液；

(iv)将步骤(iii)制得的混合溶液中加入金属碱溶液，制得金属碱混合液；

(v)将步骤(iv)制得的金属碱混合液中固定化酶分离，洗涤回收，将反应液旋蒸，结晶，干燥得到葡萄糖酸盐。

根据本发明优选的，所述步骤(i)中，活化培养条件为37℃、200rpm培养12-16h，活化培养基为液体LB培养基，组份如下：

10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L NaCl，pH 7.0。

根据本发明优选的，所述步骤(i)中，扩大培养条件为37℃、200rpm培养96h，扩大培养培养基为TB培养基，组份如下：

丙三醇15mL/L葡萄糖，30g/L大豆蛋白胨，2.5g/L MgCl₂，17mM KH₂PO₄，72mMK₂HPO₄。

根据本发明优选的，所述步骤(i)中，离心条件为：4℃、7500rpm的条件下离心10min。

根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，葡萄糖溶液的浓度为20～200mM；优选为100mM。

根据本发明优选的，所述步骤(iii)中，搅拌反应温度为40～50℃，更优选为40℃；搅拌反应pH为6.0～7.0，更优选为6.0；搅拌反应时间为6h；搅拌速率为150～400rpm，优选为200～240rpm。

根据本发明优选的，所述步骤(iv)中，金属碱溶液的浓度为50～500mM，优选为200～400mM；加入金属碱溶液至反应的pH为10。

根据本发明优选的，所述步骤(iv)中，分离采用离心。

有益效果

1、本发明首次同时利用特定的5种不同的芽孢衣壳蛋白作为分子载体将葡萄糖氧化酶展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面上，通过基因工程手段将葡萄糖氧化酶god基因分别与芽孢衣壳蛋白CotC、CotG、CotX、CotE和CotB编码基因融合，利用枯草芽孢杆菌整合型质粒作为载体，转化到枯草芽孢杆菌中，从而得到一种可以芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的基因工程菌；通过实验发现5种特定的芽孢衣壳蛋白之间具有促进葡萄糖氧化酶god基因表面展示的作用，其表面展示的比酶活显著优于其他类似芽孢衣壳蛋白的表面展示效果。

2、本发明所述的枯草芽孢杆菌工程菌表达体系具有安全、无内毒素的特点，在食品和医药产业化领域备受认可。

3、本发明构建的芽孢表面稳定展示葡萄糖氧化酶的枯草芽孢杆菌工程菌，既不影响菌株本身形成芽孢，同时还提高葡萄糖氧化酶的稳定性。

附图说明

图1是pDG1730-Cg-Gg-Xg-Eg-Bg载体构建示意图；

图2a是cotC，cotG，cotX，cotE和cotB基因的琼脂糖凝胶电泳图；

图2b是葡萄糖氧化酶基因god的琼脂糖凝胶电泳图；

图3是融合基因片段Cg、Gg、Xg、Eg和Bg的琼脂糖凝胶电泳图；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

枯草芽孢杆菌WB800n购自杭州宝赛生物有限公司；

整合型质粒pDG1730购自优宝生物技术有限公司；

黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 6275购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。

实施例1：构建重组质粒

(1)克隆得到芽孢衣壳蛋白基因片段

以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，设计引物进行PCR扩增得到5种芽孢衣壳蛋白的基因片段。

所述CotC蛋白基因序列的PCR引物如下：

cotC-F：5’-aaaactggtctgatcggatccGCAAAGAAGACAAACAAATGTAGGA-3’

cotC-R：5’-GGGAACTTCATGTAGTGTTTTTTATGCTTTTTATACTC-3’

所述PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotC-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotC-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

所述CotG蛋白基因序列的PCR引物如下：

cotG-F：5’-ggatgctggtaatgcttagTTTTTAAAACCGCGCGTACTATG-3’

cotG-R：5’-ACTTCATTTTGTATTTCTTTTTGACTACCCAG-3’

所述PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotG-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotG-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

所述CotX蛋白基因序列的PCR引物如下：

cotX-F：5’-gatgctggtaatgcttagCCAATCATAAAAAATAGGGTTCTTCA-3’

cotX-R：5’-GATTGGGAACTTCATGAGGACAAGAGTGATAACTAGG-3’

所述PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotX-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotX-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

所述CotE蛋白基因序列的PCR引物如下：

cotE-F:5’-gctggtaatgcttaggctagcGAACTAAATAATCTATGTACCAAATGTTCAA-3’

cotE-R：5’-GGAACTTCATTTCTTCAGGATCTCCCACTAAAAACTC-3’

所述PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotE-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotE-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

所述CotB蛋白基因序列的PCR引物如下：

cotB-F：5’-gctggtaatgcttagATGCGTGAAAATGGGTATTCG-3’

cotB-R：5’-GAACTTCATAAATTTACGTTTCCAGTGATAG-3’

所述PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotB-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotB-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

PCR结束后通过质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，根据片段大小切下目的条带，使用上海生工胶回收试剂盒回收切胶产物。

(2)克隆得到葡萄糖氧化酶基因片段

以黑曲霉Aspergillus niger为模板设计分别PCR扩增与5种cot基因重叠的葡萄糖氧化酶god的基因序列的引物，进行PCR扩增：

与cotC基因重叠的葡萄糖氧化酶god基因序列的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：

cotC-god-F:5’-AAAGCATAAAAAACACTACATGAAGTTCCCAATCCTT-3’

cotC-god-R:5’-aCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC-3’

PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotC-god-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotC-god-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸65s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

与cotG基因重叠的葡萄糖氧化酶god基因序列的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：

cotG-god-F:5’-CAAAAAGAAATACAAAATGAAGTTCCCAATCCTT-3’

cotG-god-R:5’-ggCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC-3’

PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotG-god-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotG-god-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸65s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

与cotX基因重叠的葡萄糖氧化酶god基因序列的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：

cotX-god-F:5’-gctgggtcatTTCTTCAGGATCTCCCACTAAAAAC-3’

cotX-god-R:5’-tgcaggaattcgataagcttGCGGCCGCTTTAGGCTAGCCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC-3’

PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotX-god-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotX-god-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸65s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

与cotE基因重叠的葡萄糖氧化酶god基因序列的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：

cotE-god-F：5’-GGAGATCCTGAAGAAATGAAGTTCCCAATCCTT-3’

cotE-god-R：5’-cgcatCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC-3’

PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotE-god-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotE-god-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸65s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

与cotB基因重叠的葡萄糖氧化酶god基因序列的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：

cotB-god-F:5’-TATCACTGGAAACGTAAATTTATGAAGTTCCCAATCCTT-3’

cotB-god-R:5’-gaattcgataagcttgcggccgcCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC-3’

PCR反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物cotB-god-F 2.5μL，10μmol/L下游引物cotB-god-R 2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

上述PCR反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸65s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

PCR结束后通过1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，根据片段大小切下目的条带，使用上海生工胶回收试剂盒回收切胶。

(3)将步骤(1)制得的5种cot片段与步骤(2)制得的葡萄糖氧化酶基因片段分别进行重叠PCR，制得Cg、Gg、Xg、Eg和Bg融合片段；

Cg融合片段的制备：

重叠PCR的初次扩增体系为25μL；

与cotC基因重叠的葡萄糖氧化酶基因序列god 4μL；cotC蛋白基因序列4μL；2×Phanta Max Master Mix 12.5μL；ddH₂O 4.5μL；

所述重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸90s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠PCR的补充体系为25μL：

上游引物cotC-F 2μL，下游引物cotC-god-R 2μL，2×Phanta Max Master Mix12.5μL，ddH₂O 8.5μL；

所述重叠PCR补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

Gg融合片段的制备：

重叠PCR的初次扩增体系为25μL；

与cotG基因重叠的葡萄糖氧化酶基因序列god 4μL；cotG蛋白基因序列4μL；2×Phanta Max Master Mix 12.5μL；ddH₂O 4.5μL；

所述重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸90s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠PCR的补充体系为25μL：

上游引物cotG-F 2μL，下游引物cotG-god-R 2μL，2×Phanta Max Master Mix12.5μL，ddH₂O 8.5μL；

所述重叠PCR补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

Xg融合片段的制备：

重叠PCR的初次扩增体系为25μL；

与cotX基因重叠的葡萄糖氧化酶基因序列god 4μL；cotX蛋白基因序列4μL；2×Phanta Max Master Mix 12.5μL；ddH₂O 4.5μL；

所述重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸90s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠PCR的补充体系为25μL：

上游引物cotX-F 2μL，下游引物cotX-god-R 2μL，2×Phanta Max Master Mix12.5μL，ddH₂O 8.5μL；

所述重叠PCR补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

Eg融合片段的制备：

重叠PCR的初次扩增体系为25μL；

与cotE基因重叠的葡萄糖氧化酶基因序列god 4μL；cotE蛋白基因序列4μL；2×Phanta Max Master Mix 12.5μL；ddH₂O 4.5μL；

所述重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸90s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠PCR的补充体系为25μL：

上游引物cotE-F 2μL，下游引物cotE-god-R 2μL，2×Phanta Max Master Mix12.5μL，ddH₂O 8.5μL；

所述重叠PCR补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

Bg融合片段的制备：

重叠PCR的初次扩增体系为25μL；

与cotB基因重叠的葡萄糖氧化酶基因序列god 4μL；cotB蛋白基因序列4μL；2×Phanta Max Master Mix 12.5μL；ddH₂O 4.5μL；

所述重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸90s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠PCR的补充体系为25μL：

上游引物cotB-F 2μL，下游引物cotB-god-R 2μL，2×Phanta Max Master Mix12.5μL，ddH₂O 8.5μL；

所述重叠PCR补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

(4)将整合型质粒pDG1730经BamHI和HindIII双酶切与步骤(3)中制得的Cg、Gg、Xg融合片段利用多片段无缝克隆连接，转入大肠杆菌DH5α中；鉴定成功并测序正确后，将制得的重组载体命名为pDG1730-Cg-Gg-Xg。

所述pDG1730质粒酶切体系为：

pDG1730质粒16μL；BamHI 1μL；HindIII 1μL；10×buffer 2.5μL；ddH₂O 4.5μL；

反应条件：金属浴37℃反应2h。

质粒双酶切后的产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，并使用DNA胶回收试剂盒进行回收。

所述多片段无缝克隆连接体系为：

pDG1730质粒152ng；cotC-god 48ng；cotG-god 54ng；cotX-god 54ng；Exnase 2μL；5×CE buffer 4μL；ddH₂O补足至20μL.

反应条件：金属浴37℃反应30min。

将无缝克隆连接产物转化导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。

(5)将步骤(4)中制得的重组载体经NheI和NotI双酶切与步骤(3)中制得的Et和Bt融合片段利用多片段无缝克隆连接，转入大肠杆菌DH5α中；鉴定成功并测序正确后，将制得的重组载体命名为pDG1730-Cg-Gg-Xg-Eg-Bg。经检测，含有五种芽孢衣壳蛋白cotC、cotG、cotX、cotE和cotB及其与葡萄糖氧化酶融合基因的载体核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述重组载体pDG1730-Cg-Gg-Xg的酶切体系为：

pDG1730-Cg-Gg-Xg质粒16μL；NheI 1μL；NotI 1μL；10×buffer 2.5μL；ddH₂O 4.5μL；

反应条件：金属浴37℃反应2h。

质粒双酶切后的产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，并使用DNA胶回收试剂盒进行回收。

所述多片段无缝克隆连接体系为：

pDG1730-Cg-Gg-Xg质粒308ng；cotE-god 56ng；cotB-god 70ng；Exnase 2μL；5×CE buffer 4μL；ddH₂O补足至20μL.

反应条件：金属浴37℃反应30min。

将无缝克隆连接产物转化导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。

实施例2：枯草芽孢杆菌WB800n电转感受态细胞的制备

挑取新鲜LB固体培养基表面的枯草芽孢杆菌WB800n单菌落于5mL LB培养基中，过夜培养。取1mL过夜培养物接入50mL GM培养基(LB+0.5M山梨醇)中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为1.0。将菌液冰水浴10min，5000rpm，4℃离心8min，收集菌体。用20mL预冷的ETM培养基(0.5M山梨醇+0.5M甘露醇+10％甘油)重悬菌体，5000rpm，4℃离心8min，去上清，如此洗涤3次。将洗涤后的菌体重悬于500μL ETM培养基中，分装与EP管中，每管分装60μL。

实施例3：将重组质粒转入枯草芽孢杆菌WB800n中

将5μL重组质粒加入到50μL感受态细胞中，冰上孵育5min，加入预冷的电转杯(2mm)中，在2500V、5ms条件下进行电转化。电击完毕后，立即在电转杯中加入1mL 37℃预热的RM培养基(LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，37℃振荡复苏培养3h，涂布于含壮观霉素的LB平板上。37℃倒置培养，筛选抗壮观霉素的菌株。

实施例4：阳性重组菌的培养基鉴定

将上述阳性重组菌落接种到LB液体培养基(含壮观霉素)中培养过夜，利用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取基因组DNA，以获得的基因组DNA位模板，分别以五种对应的cot-F和cot-god-R为引物进行PCR扩增。

所述菌落PCR扩增体系为20μL：

上游引物1μL；下游引物1μL；模板1μL；2×Phanta Max Master Mix 10μL；ddH₂O 7μL；

所述菌落PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存；

琼脂糖凝胶电泳证明外源片段Cg-Gg-Xg-Eg-Bg已转入枯草芽孢杆菌WB800n中，将重组菌命名为WB800n/Cg-Gg-Xg-Eg-Bg。

实施例5：阳性重组菌的发酵

将实施例4构建好的重组菌WB800n/Cg-Gg-Xg-Eg-Bg接种于LB液体培养基(含浓度为100μg/mL的壮观霉素)，37℃过夜培养，次日按1％接种量转接与TB培养基中，37℃培养48h，4℃，7500rpm离心10min，用终浓度2mg/mL的溶菌酶37℃处理2h后离心，沉淀即为重组芽孢。

上述LB液体培养基配方为：

蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，pH 7.0。

上述TB培养基每升组分如下：

20g葡萄糖，30g大豆蛋白胨，2.5g MgCl₂，17mmol KH₂PO₄，72mmol K₂HPO₄，pH7.0。

实施例6：葡萄糖氧化酶酶活检测

通过购自北京索莱宝科技有限公司的葡萄糖氧化酶活性检测试剂盒对重组枯草芽孢杆菌芽孢表面GOD进行酶活测定。

测定方法如下：分光光度计预热30min以上，调节波长至500nm，蒸馏水调零。按下表加入反应体系：

样品测定前将GOD工作液与试剂三放入37℃水浴中保温，然后将上述试剂按顺序加入1mL玻璃比色皿中，加样本的同时开始计时：在500nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1及1分20秒时的吸光度A2。计算△A＝A2-A1。

GOD活力单位的计算

单位的定义：每mL发酵液在反应体系中每分钟催化产生1μmoL氧化型邻联茴香胺定义为1个酶活力单位。

GOD(U/g)＝△A÷d÷ε×V反总÷V样本÷T÷m＝1373×△A÷m

其中V反总：反应总体积，1.03mL；V样本：加入样本体积，0.1mL；d：光径，1cm；ε：氧化型邻联茴香胺消光系数，7.5×10^-3mL/μmoL/cm；T：反应时间，1min；m：反应体系中菌体干重(g)。

结果表明，本发明所构建的葡萄糖氧化酶基因工程菌能够实现在枯草芽孢杆菌中芽孢表面展示葡萄糖氧化酶。重组芽孢中葡萄糖氧化酶的比酶活可达113.52U/g，具有广泛的应用前景。

对比例1

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白5个CotC作为分子载体，将葡萄糖氧化酶展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pDG1730，将Cg-Cg-Cg-Cg-Cg融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的葡萄糖氧化酶的比酶活为98.2U/g。

对比例2

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白5个CotG作为分子载体，将葡萄糖氧化酶展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pDG1730，将Gg-Gg-Gg-Gg-Gg融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的葡萄糖氧化酶的比酶活为95.4U/g。

对比例3

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白5个CotX作为分子载体，将葡萄糖氧化酶展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pDG1730，将Xg-Xg-Xg-Xg-Xg融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的葡萄糖氧化酶的比酶活为89.7U/g。

对比例4

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白5个CotE作为分子载体，将葡萄糖氧化酶展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pDG1730，将Eg-Eg-Eg-Eg-Eg融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的葡萄糖氧化酶的比酶活为92.1U/g。

对比例5

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白5个CotB作为分子载体，将葡萄糖氧化酶展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pDG1730，将Bg-Bg-Bg-Bg-Bg融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的葡萄糖氧化酶的比酶活为78.6U/g。

对比例6

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC和CotG同时作为分子载体，将葡萄糖氧化酶展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pDG1730，将cotC-god-cotG-god融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的葡萄糖氧化酶的比酶活为42.16U/g。

对比例7

按专利文献CN105132450A(申请号201510571328.3)中记载的方法分别制备CotY和CotZ，并分别作为分子载体，将葡萄糖氧化酶展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pDG1730，将cotY-god融合基因和cotZ-god融合基因分别整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，CotY展示的葡萄糖氧化酶的比酶活为12.4U/g，CotZ展示的葡萄糖氧化酶的比酶活为10.9U/g。

对比例8

以实施例中的4种枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC、CotG、CotX、CotE和对比例7中的CotY蛋白为分子载体，将葡萄糖氧化酶展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pDG1730，将Cg-Gg-Xg-Eg-Yg融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的葡萄糖氧化酶的比酶活为87.5U/g。

结果分析

通过对比实施例与对比例1～8的实验数据可以看出，将重复5次的单个芽孢衣壳Cot蛋白作为分子载体与五个不同芽孢衣壳Cot蛋白同时作为分子载体相比，制备含有五种芽孢衣壳蛋白基因cotC、cotG、cotX、cotE和cotB及其与葡萄糖氧化酶基因融合的基因片段(Cg-Gg-Xg-Eg-Bg)具有显著优势。将葡萄糖氧化酶基因god分别与芽孢衣壳蛋白基因cotC、cotG、cotX、cotE和cotB连接，同时连接到pDG1730整合型质粒中，通过电转化的方法将重组质粒转化到枯草芽孢杆菌WB800n中，使融合基因Cg-Gg-Xg-Eg-Bg整合到枯草芽孢杆菌基因组中，使得目的基因能够在枯草芽孢杆菌中得到稳定遗传，且该菌株同时利用五种枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白作为分子载体展示，使得葡萄糖氧化酶的表达量提高，比酶活高达113.52U/g，该比酶活的提高并非是不同cot蛋白比酶活的简单加和，而是具有增效的作用，并且不同cot蛋白配合后，大部分是具有抑制作用，仅芽孢衣壳蛋白基因cotC、cotG、cotX、cotE和cotB与葡萄糖氧化酶基因融合的基因片段具有相互促进作用。相比较利用单个芽孢衣壳蛋白作为分子载体展示葡萄糖氧化酶或者两个其他芽孢衣壳蛋白的组合来说，采用本发明的方法展示葡萄糖氧化酶显得更加有优势。

序列表

<110> 齐鲁工业大学

山东省科学院生物研究所

<120> 一种在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的方法与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21141

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<220>

<221> misc_feature

<222> (2358)..(2358)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (4986)..(4986)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (7568)..(7568)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10294)..(10294)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (13529)..(13529)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

aacaaaattc tccagtcttc acatcggttt gaaaggagga agcggaagaa tgaagtaaga 60

gggatttttg actccgaagt aagtcttcaa aaaatcaaat aaggagtgtc aagaatgttt 120

gcaaaacgat tcaaaacctc tttactgccg ttattcgctg gatttttatt gctgtttcat 180

ttggttctgg caggaccggc ggctgcgagt gctgaaacgg cgaacaaatc gaatgagctt 240

acagcaccgt cgatcaaaag cggaaccatt cttcatgcat ggaattggtc gttcaatacg 300

ttaaaacaca atatgaagga tattcatgat gcaggatata cagccattca gacatctccg 360

attaaccaag taaaggaagg gaatcaagga gataaaagca tgtcgaactg gtactggctg 420

tatcagccga catcgtatca aattggcaac cgttacttag gtactgaaca agaatttaaa 480

gaaatgtgtg cagccgctga agaatatggc ataaaggtca ttgttgacgc ggtcatcaat 540

cataccacca gtgattatgc cgcgatttcc aatgaggtta agagtattcc aaactggaca 600

catggaaaca cacaaattaa aaactggtct gatcggatcc gcaaagaaga caaacaaatg 660

taggataaat cgtttgggcc gatgaaaaat cggctcttta ttttgatttg tttttgtgtc 720

atctgtcttt ttctatcatt tggacagccc ttttttcctt ctatgatttt aactgtccaa 780

gccgcaaaat ctactcgccg tataataaag cgtagtaaaa ataaaggagg agtatatatg 840

ggttattaca aaaaatacaa agaagagtat tatacggtca aaaaaacgta ttataagaag 900

tattacgaat atgataaaaa agattatgac tgtgattacg acaaaaaata tgatgactat 960

gataaaaaat attatgatca cgataaaaaa gactatgatt atgttgtaga gtataaaaag 1020

cataaaaaac actacatgaa gttcccaatc cttgcttcag ctctacttct ctccggggtc 1080

ctggcggagc acttccaggt ccctttacaa cataccatct caccttgctc caccaaacca 1140

catactagcc acgacgacct caaccacaac atcaacacca tcccgcacgg catcactgac 1200

gaccctcgca gtatcgacaa ccagacattc gactacataa ttgccggcgg cgggctaact 1260

ggcctcaccc tcgccgccaa actagtcgag cagaagaaat acaccgtcct agtgatcgaa 1320

agcggcttct atgcatggga atacggcccc aagattgacg acctcaacac ctacggccaa 1380

gtattcggca gcagcgtcga tcatgcctac gagaccagtc cgcagctcgt cggcaacgac 1440

ggtgaaactg gactagataa agacatcaga attgttcggt ccggaaatgg tctcggaggg 1500

tcaacgctca tcaatggggg aacgtggaca cggccacaca agtcgcagct tgattcgtgg 1560

gaagaggtct ttgggaatac cgggtggaat tgggacgcgc tgaaggggaa gatggatgag 1620

attgaggttc cgagggatcc gacgtcggat gatattacga aggggtcgtt ccataagttt 1680

gatgccgagt gtcataataa ggaaccggag aaggggaagg ttaaagtcgg ggcgagggat 1740

cggaagtatg gttggtcgcc gttgattcgg gcgttgatgc acacggttaa cagtacgtat 1800

gaagaggtgg tgaatcagaa ggatctgtgt tgtggggatc caactggggt gtcgatgttt 1860

ttgaacacgc ttaccaatga gcaaatccgg acggatgctg ctaggtcgtg gttgaagcca 1920

atcttggatg atgatgagtt gaagcagtat attacggttt tgacggggga gctcgttggg 1980

aaggttcatc taaacgaggc caacccttcg gagacaggaa cagaattcaa agcgaaaggt 2040

gtggagtttg gggtgcacaa gaaacaggag tggaagtggg atgcttgggc taggaaagaa 2100

gtccttctag ccgcggggtc cacgatctct cccctcattc tgcagtggtc gggaatcggt 2160

ccgaaagtct ggcttgatgc tgcgggaata gaacataagt tggagctccc tgtgggatat 2220

aacctccagg atcaaacaac gacttcggta gtgacgaagc cgaaaccaga agcgaacggc 2280

caaggccagg cagcctactt tgcaaccttt gcagagatct tcggtaaaga tgcctcagat 2340

atggaaaagc tcctgaanga cgatacagag ctcgacaaat gggcagaaca cacagtgaac 2400

ggccacggat tccccgacaa ggccaacctc ctaaaacagt acaagaacta ccgagactgg 2460

ctcctaaccg acaaagtatc ctatgccgaa ctattccttg acaccgacaa cagcacccat 2520

ttcgacctct ggaatctgat cccattcacc cgagggtatg tcaagatcct agacaacgac 2580

ccctatctgc gaagcttcga atataacccg cgatactttg aaaatatcct cgacttgaac 2640

ggccaagctg ctgctacgcg gctggcacga caattgacca acacgtatga catgaaacag 2700

tacgtggaca aagagcaggt cccggggagg tatgtaccag agaacgcgaa tctaactgaa 2760

tgggccgatt atgtgaagca aaactaccgg gccaattatc acggggtggg gacttgctct 2820

atgatgaaga aggagcttgg tggtgttgtc gacccggagg ctaaggtgta tggtgtggag 2880

gggttgagag tggtggatgg ttcaatcccg cctacgcagg tgtcgtcgca tgttatgacg 2940

gtgttttatg cgatggctgt gaaaattgca gagtcagtta ttaaggatgc tggtaatgct 3000

tagtttttaa aaccgcgcgt actatgaggg tagtaaggat cttcatcctt aacatatttt 3060

taaaaggagg atttcaaatt gggccactat tcccattctg acatcgaaga agcggtgaaa 3120

tccgcaaaaa aagaaggttt aaaggattat ttataccaag agcctcatgg aaaaaaacgc 3180

agtcataaaa agtcgcaccg cactcacaaa aaatctcgca gccataaaaa atcatactgc 3240

tctcacaaaa aatctcgcag tcacaaaaaa tcattctgtt ctcacaaaaa atctcgcagc 3300

cacaaaaaat catactgctc tcacaagaaa tctcgcagcc acaaaaaatc gtaccgttct 3360

cacaaaaaat ctcgcagcta taaaaaatct taccgttctt acaaaaaatc tcgtagctat 3420

aaaaaatctt gccgttctta caaaaaatct cgcagctaca aaaagtctta ctgttctcac 3480

aagaaaaaat ctcgcagcta taagaagtca tgccgcacac acaaaaaatc ttatcgttcc 3540

cataagaaat actacaaaaa accgcaccac cactgcgacg actacaaaag acacgatgat 3600

tatgacagca aaaaagaata ctggaaagac ggcaattgct gggtagtcaa aaagaaatac 3660

aaaatgaagt tcccaatcct tgcttcagct ctacttctct ccggggtcct ggcggagcac 3720

ttccaggtcc ctttacaaca taccatctca ccttgctcca ccaaaccaca tactagccac 3780

gacgacctca accacaacat caacaccatc ccgcacggca tcactgacga ccctcgcagt 3840

atcgacaacc agacattcga ctacataatt gccggcggcg ggctaactgg cctcaccctc 3900

gccgccaaac tagtcgagca gaagaaatac accgtcctag tgatcgaaag cggcttctat 3960

gcatgggaat acggccccaa gattgacgac ctcaacacct acggccaagt attcggcagc 4020

agcgtcgatc atgcctacga gaccagtccg cagctcgtcg gcaacgacgg tgaaactgga 4080

ctagataaag acatcagaat tgttcggtcc ggaaatggtc tcggagggtc aacgctcatc 4140

aatgggggaa cgtggacacg gccacacaag tcgcagcttg attcgtggga agaggtcttt 4200

gggaataccg ggtggaattg ggacgcgctg aaggggaaga tggatgagat tgaggttccg 4260

agggatccga cgtcggatga tattacgaag gggtcgttcc ataagtttga tgccgagtgt 4320

cataataagg aaccggagaa ggggaaggtt aaagtcgggg cgagggatcg gaagtatggt 4380

tggtcgccgt tgattcgggc gttgatgcac acggttaaca gtacgtatga agaggtggtg 4440

aatcagaagg atctgtgttg tggggatcca actggggtgt cgatgttttt gaacacgctt 4500

accaatgagc aaatccggac ggatgctgct aggtcgtggt tgaagccaat cttggatgat 4560

gatgagttga agcagtatat tacggttttg acgggggagc tcgttgggaa ggttcatcta 4620

aacgaggcca acccttcgga gacaggaaca gaattcaaag cgaaaggtgt ggagtttggg 4680

gtgcacaaga aacaggagtg gaagtgggat gcttgggcta ggaaagaagt ccttctagcc 4740

gcggggtcca cgatctctcc cctcattctg cagtggtcgg gaatcggtcc gaaagtctgg 4800

cttgatgctg cgggaataga acataagttg gagctccctg tgggatataa cctccaggat 4860

caaacaacga cttcggtagt gacgaagccg aaaccagaag cgaacggcca aggccaggca 4920

gcctactttg caacctttgc agagatcttc ggtaaagatg cctcagatat ggaaaagctc 4980

ctgaangacg atacagagct cgacaaatgg gcagaacaca cagtgaacgg ccacggattc 5040

cccgacaagg ccaacctcct aaaacagtac aagaactacc gagactggct cctaaccgac 5100

aaagtatcct atgccgaact attccttgac accgacaaca gcacccattt cgacctctgg 5160

aatctgatcc cattcacccg agggtatgtc aagatcctag acaacgaccc ctatctgcga 5220

agcttcgaat ataacccgcg atactttgaa aatatcctcg acttgaacgg ccaagctgct 5280

gctacgcggc tggcacgaca attgaccaac acgtatgaca tgaaacagta cgtggacaaa 5340

gagcaggtcc cggggaggta tgtaccagag aacgcgaatc taactgaatg ggccgattat 5400

gtgaagcaaa actaccgggc caattatcac ggggtgggga cttgctctat gatgaagaag 5460

gagcttggtg gtgttgtcga cccggaggct aaggtgtatg gtgtggaggg gttgagagtg 5520

gtggatggtt caatcccgcc tacgcaggtg tcgtcgcatg ttatgacggt gttttatgcg 5580

atggctgtga aaattgcaga gtcagttatt aaggatgctg gtaatgctta gccaatcata 5640

aaaaataggg ttcttcatca ggatatatga ctcagtcaaa ataagaggct cgctcattta 5700

ataacagtaa aagaaaagga ggaatagata tggaaagcag accatattct tgggttgcac 5760

ttgatcctga ctgtgaccat ccgttagatg acaaagagaa agataaagaa aaacacgaaa 5820

gaaaatgtca ttgcgacgtt tgctgtaatg gcaatggttt ttttggcaac gacaacgcct 5880

tcatcgacca agatctagct caagcaaatc tcaacaaaca agtttcagat gaaacgatta 5940

ttattagaga ttcttgtgac atcaatgtta catctacaga cgttcaagcc gtaacatcag 6000

ttgtaacagc acttaatgcc gctgtcgtaa cggcaactct gacatcaatt gcagacggcg 6060

taattgccga attagtcgca caagatttgt tacagcttac agctaacaaa caagtaaacc 6120

gccaaaaact tctcatcgaa tgttcccgcg gcgtaaacgt cacaacagta gatgccgata 6180

tcgcaaccct tatttctaca gcaacaaata cactcgtagc catcctagtt atcactcttg 6240

tcctcatgaa gttcccaatc cttgcttcag ctctacttct ctccggggtc ctggcggagc 6300

acttccaggt ccctttacaa cataccatct caccttgctc caccaaacca catactagcc 6360

acgacgacct caaccacaac atcaacacca tcccgcacgg catcactgac gaccctcgca 6420

gtatcgacaa ccagacattc gactacataa ttgccggcgg cgggctaact ggcctcaccc 6480

tcgccgccaa actagtcgag cagaagaaat acaccgtcct agtgatcgaa agcggcttct 6540

atgcatggga atacggcccc aagattgacg acctcaacac ctacggccaa gtattcggca 6600

gcagcgtcga tcatgcctac gagaccagtc cgcagctcgt cggcaacgac ggtgaaactg 6660

gactagataa agacatcaga attgttcggt ccggaaatgg tctcggaggg tcaacgctca 6720

tcaatggggg aacgtggaca cggccacaca agtcgcagct tgattcgtgg gaagaggtct 6780

ttgggaatac cgggtggaat tgggacgcgc tgaaggggaa gatggatgag attgaggttc 6840

cgagggatcc gacgtcggat gatattacga aggggtcgtt ccataagttt gatgccgagt 6900

gtcataataa ggaaccggag aaggggaagg ttaaagtcgg ggcgagggat cggaagtatg 6960

gttggtcgcc gttgattcgg gcgttgatgc acacggttaa cagtacgtat gaagaggtgg 7020

tgaatcagaa ggatctgtgt tgtggggatc caactggggt gtcgatgttt ttgaacacgc 7080

ttaccaatga gcaaatccgg acggatgctg ctaggtcgtg gttgaagcca atcttggatg 7140

atgatgagtt gaagcagtat attacggttt tgacggggga gctcgttggg aaggttcatc 7200

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ctaggaaaga agtccttcta gccgcggggt ccacgatctc tcccctcatt ctgcagtggt 13320

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ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 19920

tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 19980

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<220>

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ctgatcccat tcacccgagg gtatgtcaag atcctagaca acgaccccta tctgcgaagc 2220

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<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<220>

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<222> (1937)..(1937)

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accctcgcag tatcgacaac cagacattcg actacataat tgccggcggc gggctaactg 840

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cctatctgcg aagcttcgaa tataacccgc gatactttga aaatatcctc gacttgaacg 2220

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gggccgatta tgtgaagcaa aactaccggg ccaattatca cggggtgggg acttgctcta 2400

tgatgaagaa ggagcttggt ggtgttgtcg acccggaggc taaggtgtat ggtgtggagg 2460

ggttgagagt ggtggatggt tcaatcccgc ctacgcaggt gtcgtcgcat gttatgacgg 2520

tgttttatgc gatggctgtg aaaattgcag agtcagttat taaggatgct ggtaatgctt 2580

ag 2582

Claims (10)

1.一种在芽孢表面高效展示葡萄糖氧化酶的枯草芽孢杆菌工程菌，通过向载体中插入芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotB-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotC-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotE-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotG-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotX-god基因片段，构建重组载体，然后转化枯草芽孢杆菌制得；

所述cotB-god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述cotC-god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述cotE-god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述cotG-god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述cotX-god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述载体为整合型载体pDG1730。

3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.权利要求1所述在芽孢表面高效展示葡萄糖氧化酶的枯草芽孢杆菌工程菌的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，PCR扩增芽孢衣壳蛋白中CotB，CotC，CotE，CotG和CotX蛋白的基因序列；

所述CotC蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotC-F：aaaactggtctgatcggatccGCAAAGAAGACAAACAAATGTAGGA BamHI；

cotC-R：GGGAACTTCATGTAGTGTTTTTTATGCTTTTTATACTC；

所述CotG蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotG-F：ggatgctggtaatgcttagTTTTTAAAACCGCGCGTACTATG；

cotG-R：ACTTCATTTTGTATTTCTTTTTGACTACCCAG；

所述CotX蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotX-F：gatgctggtaatgcttagCCAATCATAAAAAATAGGGTTCTTCA；

cotX-R：GATTGGGAACTTCATGAGGACAAGAGTGATAACTAGG；

所述CotE蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotE-F：gctggtaatgcttaggctagcGAACTAAATAATCTATGTACCAAATGTTCAA NheI；

cotE-R：GGAACTTCATTTCTTCAGGATCTCCCACTAAAAACTC；

所述CotB蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotB-F：gctggtaatgcttagATGCGTGAAAATGGGTATTCG；

cotB-R：GAACTTCATAAATTTACGTTTCCAGTGATAG；

以黑曲霉Aspergillus niger为模板扩增分别与芽孢衣壳蛋白中CotB，CotC，CotE，CotG和CotX蛋白重叠的葡萄糖氧化酶的基因序列；

所述与CotC蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：

cotc-god-F：AAAGCATAAAAAACACTACATGAAGTTCCCAATCCTT；

cotc-god-R：aCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC；

所述与CotG蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：

cotG-god-F：CAAAAAGAAATACAAAATGAAGTTCCCAATCCTT；

cotG-god-R：ggCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC；

所述与CotX蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：

cotX-god-F：GTTATCACTCTTGTCCTCATGAAGTTCCCAATCCTT；

cotX-god-R：tgcaggaattcgataagcttGCGGCCGCTTTAGGCTAGCCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC NheI、NotI；

所述与CotE蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：

cotE-god-F：GGAGATCCTGAAGAAATGAAGTTCCCAATCCTT；

cotE-god-R：cgcatCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC；

所述与CotB蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：

cotB-god-F：TATCACTGGAAACGTAAATTTATGAAGTTCCCAATCCTT；

cotB-god-R：gaattcgataagcttgcggccgcCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC NotI、HindIII；

(2)分别采用重叠PCR将步骤(1)制得的孢衣壳蛋白中CotB，CotC，CotE，CotG和CotX蛋白的基因序列与其对应的葡萄糖氧化酶基因片段god分别融合，制得cotC-god(Cg)、cotG-god(Gg)、cotX-god(Xg)、cotE-god(Eg)和cotB-god(Bg)融合基因片段；

(3)将整合型质粒pDG1730经BamHI和HindIII双酶切后，同时与步骤(2)中制得的cotC-god、cotG-god、cotX-god三种融合基因进行无缝克隆连接，并转入大肠杆菌DH5α中，制得重组质粒pDG1730-Cg-Gg-Xg；

(4)将步骤(3)中制得的重组质粒pDG1730-Cg-Gg-Xg经NheI和NotI双酶切后，与步骤(2)中制得的cotE-god和cotB-god两种融合基因进行无缝克隆连接，并转入大肠杆菌DH5α中，制得重组质粒pDG1730-Cg-Gg-Xg-Eg-Bg；

(5)将步骤(4)得到的重组质粒pDG1730-Cg-Gg-Xg-Eg-Bg电转化到枯草芽孢杆菌感受态细胞中，筛选，获得重组枯草芽孢杆菌pDG1730-Cg-Gg-Xg-Eg-Bg。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增Cot蛋白基因序列的反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物(cot-F)2.5μL，10μmol/L下游引物(cot-R)2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

PCR反应程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存；

优选的，所述步骤(1)中PCR扩增葡萄糖氧化酶序列god基因的反应体系如下：

2×Phanta Max Master Mix 25μL，10μmol/L上游引物(cot-god-F)2.5μL，10μmol/L下游引物(cot-god-R)2.5μL，模板2.5μL，用ddH₂O补足至50μL；

PCR反应程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，重叠PCR的初次扩增体系为25μL：

葡萄糖氧化酶基因(C-god/G-god/X-god/E-god/B-god)4μL，cot蛋白基因(cotC/cotG/cotX/cotE/cotB)4μL，2×Phanta Max Master Mix 12.5μL，ddH₂O 4.5μL；

所述重叠PCR的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸90s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠PCR的补充体系为25μL：

上游引物(cot-F)2μL，下游引物(cot-god-R)2μL，2×Phanta Max Master Mix 12.5μL，ddH₂O 8.5μL；

所述重叠PCR补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，电转化的条件如下：

将5μL重组质粒加入50μL枯草芽孢杆菌感受态细胞中，2500V，5ms，电击一次；

优选的，所述步骤(5)中，筛选为通过壮观霉素平板进行筛选。

8.权利要求1所述枯草芽孢杆菌工程菌在制备葡萄糖酸盐中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤如下：

(i)将枯草芽孢杆菌工程菌经活化培养、扩大培养后，在35～38℃发酵96h，离心，取芽孢，制得在芽孢表面固定化的葡萄糖氧化酶；

(ii)将步骤(i)制得的芽孢表面固定化的葡萄糖氧化酶与葡萄糖溶液混合，制得反应溶液；

(iii)将步骤(ii)制得的反应溶液在30～70℃、pH4.0～9.0条件下，搅拌反应1～24h，制得混合溶液；

(iv)将步骤(iii)制得的混合溶液中加入金属碱溶液，制得金属碱混合液；

(v)将步骤(iv)制得的金属碱混合液中固定化酶分离，洗涤回收，将反应液旋蒸，结晶，干燥得到葡萄糖酸盐。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述步骤(i)中，活化培养条件为37℃、200rpm培养12-16h，活化培养基为液体LB培养基，组份如下：

10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L NaCl，pH 7.0；

优选的，所述步骤(i)中，扩大培养条件为37℃、200rpm培养96h，扩大培养培养基为TB培养基，组份如下：

丙三醇15mL/L葡萄糖，30g/L大豆蛋白胨，2.5g/L MgCl₂，17mM KH₂PO₄，72mM K₂HPO₄；

优选的，所述步骤(i)中，离心条件为：4℃、7500rpm的条件下离心10min；

优选的，所述步骤(ii)中，葡萄糖溶液的浓度为20～200mM；优选为100mM；

优选的，所述步骤(iii)中，搅拌反应温度为40～50℃，更优选为40℃；搅拌反应pH为6.0～7.0，更优选为6.0；搅拌反应时间为6h；搅拌速率为150～400rpm，优选为200～240rpm；

优选的，所述步骤(iv)中，金属碱溶液的浓度为50～500mM，优选为200～400mM；加入金属碱溶液至反应的pH为10；

优选的，所述步骤(iv)中，分离采用离心。