CN115369099B

CN115369099B - 一种米黑根毛霉脂肪酶突变体及提高米黑根毛霉脂肪酶活性和/或甲醇耐受性的方法

Info

Publication number: CN115369099B
Application number: CN202110547078.5A
Authority: CN
Inventors: 吕鹏梅; 田苗; 罗文�; 王治元; 付俊鹰; 李惠文
Original assignee: Guangzhou Institute of Energy Conversion of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Energy Conversion of CAS
Priority date: 2021-05-19
Filing date: 2021-05-19
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2041-05-19
Also published as: CN115369099A

Abstract

本发明公开了一种米黑根毛霉脂肪酶突变体及提高米黑根毛霉脂肪酶活性和/或甲醇耐受性的方法。本发明在米黑根毛霉脂肪酶成熟肽的β‑sheet二级结构中引入糖基化修饰，获得了高活性高甲醇耐受性的脂肪酶突变体。与改造前相比，本发明产生的突变酶P167N，L242N，R267N和P300N酶活分别提高了33.90，17.90，14.07和12.26倍。当在60％的甲醇溶液中孵育1h后，突变酶残余活力由改造前的19.10％提高到60％以上。本发明产生的突变酶实现高效利用废油脂一步甲醇法制备生物柴油，这不仅提高了反应效率，缩短了反应时间，还简化了反应工艺。

Description

一种米黑根毛霉脂肪酶突变体及提高米黑根毛霉脂肪酶活性和/或甲醇耐受性的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种米黑根毛霉脂肪酶突变体及提高米黑根毛霉脂肪酶活性和/或甲醇耐受性的方法，以及米黑根毛霉脂肪酶突变体在催化油脂制备生物柴油中的应用。

背景技术

脂肪酶，又称三酯酰甘油酰基水解酶(EC 3.1.1.3)，属于α/β水解酶超家族中的一员。由于对硝基苯磷酸二乙酯对脂肪酶有抑制作用，因此脂肪酶属于丝氨酸水解酶。脂肪酶能在油水界面水解三酰基甘油生成脂肪酸、甘油和单、二酰基甘油，并能逆转非水介质中的反应，是生物体进行脂质代谢必不可少的水解酶，也是一种在非水溶剂中进行脂质可逆反应的酶，在食品加工、污水处理、洗涤剂和生物柴油等领域具有很大的应用空间。

脂肪酶能催化酯化和转酯化反应，利用脂肪酶催化油脂制备生物柴油是生物柴油工业发展的一个重要方向。酶法生产生物柴油具有对原料要求低，反应条件温和，游离脂肪酸可以被脂肪酶直接酯化，且副产物甘油分离简单等优点，降低了生产工艺要求和分离成本。但是，由于游离脂肪酶在反应时容易聚集，回收和重复利用困难，甲醇对酶的失活效应等因素，限制了其在工业规模生产生物柴油中的应用。目前用于催化合成生物柴油的微生物脂肪酶有南极假丝酵母脂肪酶，皱褶假丝酵母脂肪酶和米黑根毛霉脂肪酶等，通常采用分步流加甲醇的方法降低甲醇的失活影响，反应时间36h催化效率一般为70％～100％。

米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase，RML)是一种具有优良的sn-1立体特异性的弱碱性脂肪酶，催化中心由Ser144-Asp203-His257组成。在有水的情况下，液体米黑根毛霉脂肪酶可用于生产生物柴油，但是低活性和甲醇对酶的变性效果增加了米黑根毛霉脂肪酶的生产成本，从而限制了它在生物柴油制备中的大规模应用。因此，设计一种具有高活性和高甲醇耐受性的突变型米黑根毛霉脂肪酶具有重要意义。

米黑根毛霉脂肪酶由前导肽和成熟肽组成，前导肽作为分子内分子伴侣介导成熟肽的折叠，从而形成具有生物学功能的蛋白。N-糖基化是毕赤酵母表达最常见的一种翻译后修饰。在蛋白质的功能域中添加一个大的聚糖可以显著改变其结构，从而改变蛋白的功能。N-聚糖的大小，亲水性或仅仅是他们存在的特定位置均可以改变糖蛋白的行为，使它们更容易溶解或更稳定，保护它们不被蛋白质水解。以上发生的一切，都源于N-聚糖对蛋白质二级结构和物理化学性质的影响。β-sheet是重要的二级结构，由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。在β-sheet结构中引入N-糖链，聚糖的亲水性会改变周围环境，从而影响脂肪酶的生化性质。

发明内容

针对上述领域中的缺陷，本发明提供一种米黑根毛霉脂肪酶突变体及提高米黑根毛霉脂肪酶活性和/或甲醇耐受性的方法，通过在米黑根毛霉脂肪酶的成熟肽β-sheet二级结构中引入N-糖链，获得高活性高甲醇耐受性的米黑根毛霉脂肪酶突变体，得到的米黑根毛霉脂肪酶突变体能高效催化废油脂一步甲醇法转化为生物柴油。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种米黑根毛霉脂肪酶突变体，所述的米黑根毛霉脂肪酶突变体的氨基酸序列上引入有N-糖基化位点，所述的N-糖基化位点上连接有N-糖链。

所述的米黑根毛霉脂肪酶突变体的氨基酸序列上引入有N-糖基化位点是通过以下方法获得的：将如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列上的第167位由P突变为N、第242位由L突变N、第267位由R突变为N或第300位由P突变为N。

本发明的第二个目的是提供一种提高米黑根毛霉脂肪酶活性和/或甲醇耐受性的方法，在米黑根毛霉脂肪酶成熟肽的β-sheet二级结构中引入N-糖链。所述引入N-糖链是通过将表达载体pPIC9K-RML/WT上的米黑根毛霉脂肪酶相应基因进行点突变，从而实现在米黑根毛霉脂肪酶的氨基酸序列中引入N-糖基化位点，真核体系表达所述脂肪酶引入N-糖链。

具体步骤如下：在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列上引入N-糖基化位点，所述的N-糖基化位点上连接有N-糖链。

优选地，所述的在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列上引入N-糖基化位点是将SEQID NO.1所示的氨基酸序列上的第167位由P突变为N、第242位由L突变N、第267位由R突变为N或第300位由P突变为N。

所述的米黑根毛霉脂肪酶(即具体实施例中的米黑根毛霉脂肪酶WT)的氨基酸序列如下所示：

MVPIKRQSNSTVDSLPPLIPSRTSAPSSSPSTTDPEAPAMSRNGPLPSDVETKYGMALNATSYPDSVVQAMSIDGGIRAATSQEINELTYYTTLSANSYCRTVIPGATWDCIHCDATEDLKIIKTWSTLIYDTNAMVARGDSEKTIYIVFRGSSSIRNWIADLTFVPVSYPPVSGTKVHKGFLDSYGEVQNELVATVLDQFKQYPSYKVAVTGHSLGGATALLCALGLYQREEGLSSSNLFLYTQGQPRVGDPAFANYVVSTGIPYRRTVNERDIVPHLPPAAFGFLHAGEEYWITDNSPETVQVCTSDLETSDCSNSIVPFTSVLDHLSYFGINTGLCT(如SEQ ID NO.1所示)。

N-糖基化特征序列为Asn-Xaa-Ser/Thr(Xaa是除了脯氨酸外的任意氨基酸)。根据N-糖基化特征序列，对米黑根毛霉脂肪酶成熟肽β-sheet结构中的氨基酸进行突变，建构N-糖基化位点。

上述方法得到四个高活性高甲醇耐受性的米黑根毛霉脂肪酶突变体在真核体系中表达，获得突变酶P167N(其氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，且在N-糖基化位点(¹⁶⁷NVS¹⁶⁹)上连接有N-糖链)，L242N(其氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，且在N-糖基化位点(²⁴²NYT²⁴⁴)上连接有N-糖链)，R267N(其氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，且在N-糖基化位点(²⁶⁷NRT²⁶⁹)上连接有N-糖链)和P300N(其氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，且在N-糖基化位点(³⁰⁰NET³⁰²)上连接有N-糖链)。

优选地，获得的米黑根毛霉脂肪酶突变体P167N，L242N，R267N和P300N酶活分别是1846.12±58.56U/mg，974.86±18.88U/mg，766.25±31.04U/mg和667.59±36.70U/mg。与改造前的米黑根毛霉脂肪酶WT相比，活性分别提高了33.90，17.90，14.07和12.26倍。

优选地，当在60％的甲醇溶液中孵育1h后，获得的突变酶P167N，L242N，R267N和P300N的残余活力由改造前的残余活性19.10％提高到60％以上，其中突变酶P167N，P300N，R267N的残余活力均高于85％。

本发明的第三个目的是提供了上述的米黑根毛霉脂肪酶突变体在催化油脂制备生物柴油中的应用。

优选地，以废油脂为原料，米黑根毛霉脂肪酶突变体为催化剂，一次性加入甲醇(醇：油摩尔比＝3：1)反应24h后，米黑根毛霉脂肪酶突变体P167N，L242N，R267N和P300N的生物柴油转化率由改造前的8.44％分别提高到72.68％，64.07％，68.42％和63.99％。

与现有技术相比，本发明提供的米黑根毛霉脂肪酶突变体，具有如下优势：

(1)米黑根毛霉脂肪酶突变体为高活性高甲醇耐受性的米黑根毛霉脂肪酶突变体；

(2)突变体可以高效利用废油脂一步甲醇法制备生物柴油。

附图说明

图1是质粒pPIC9K-RML/WT的质粒图谱；

图2是米黑根毛霉脂肪酶突变体的SDS-PAGE电泳图；

图3是米黑根毛霉脂肪酶突变体的酶活分析图；

图4是米黑根毛霉脂肪酶突变体的甲醇耐受性图；

图5是米黑根毛霉脂肪酶突变体在50％甲醇浓度下的稳定性图；

图6是米黑根毛霉脂肪酶突变体的FAME转化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

实施例1：米黑根毛霉脂肪酶突变体P167N

1.米黑根毛霉脂肪酶突变体P167N表达菌株的构建

(1)以一种米黑根毛霉脂肪酶WT的质粒pPIC9K-RML/WT为模板，该模板由本发明人先前构建，pPIC9K-RML/WT的质粒图谱如图1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

(2)在米黑根毛霉脂肪酶WT成熟肽β-sheet二级结构的¹⁶⁷PVS¹⁶⁹序列上进行突变，突变为¹⁶⁷NVS¹⁶⁹，引入新的N-糖基化位点。

(3)以质粒pPIC9K-RML/WT为模板，以突变引物对N167F/N167R作为扩增引物，根据全式金定点突变试剂盒说明书进行定点突变，突变引物序列见表1。在扩增得到的PCR产物中加入1μL DpnI酶，于37℃恒温培养箱反应1h，反应结束后取10μL酶切后的PCR产物加入到100μL刚融化的DMT感受态细胞，冰上孵育30min，然后42℃水浴45sec，立即置于冰上孵育2-3min，随后加入250μL的SOC无抗培养基于37℃，200rpm复苏1h后涂布于LB固体平板(1‰Amp抗性)，37℃倒置过夜培养；用20μL无抗LB培养基稀释挑选的单克隆，取1μL菌液进行菌液PCR反应。

菌液PCR反应体系：

菌液PCR反应程序：

菌液PCR引物是通用引物α-factor(5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’，如SEQ IDNO.2所示)和3’AOX(5’-GGCAAATGGCATTCTGACAT-3’，如SEQ ID NO.3所示)。菌液PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，对有目的条带的单克隆进一步送上海生工测序。

表1突变引物序列

(4)对测序成功的米黑根毛霉脂肪酶突变体P167N(即含有突变质粒pPIC9K-RML/P167N的菌株)于LB液体培养基(1‰Amp抗性)过夜培养，用质粒小提试剂盒提取质粒，然后用胶回收试剂盒对1％的琼脂糖凝胶进行胶回收，胶回收产物于0.8％的琼脂糖凝胶电泳验证，得到突变质粒pPIC9K-RML/P167N，用限制性内切酶sacI对验证正确的突变质粒pPIC9K-RML/P167N酶切线性化，然后利用电转化方法将线性化后的突变质粒转化至毕赤酵母GS115感受态细胞，得到含有突变质粒pPIC9K-RML/P167N的毕赤酵母GS115。

(5)毕赤酵母GS115感受态细胞的制备：

挑取YPD平板上保藏的毕赤酵母GS115于5mL YPD液体培养基中，30℃，200rpm活化22h至OD600＝0.8-1.0；取1％的接种量于50mL YPD培养基中30℃，200rpm培养16h，于4℃冰箱预冷30min左右；4℃，4000rpm离心5min，弃上清；用50mL冰预冷的灭菌的ddH₂O重悬，4℃，4000rpm离心5min，弃上清；用25mL冰预冷的灭菌的ddH₂O重悬，4℃，4000rpm离心5min，弃上清；用2.5mL冰预冷的1M山梨醇溶液重悬，4℃，4000rpm离心5min，弃上清；用200-300μL冰预冷的1M山梨醇溶液重悬，每100μL分装于1.5mL的离心管，存储于-80℃备用。

(6)重组质粒电转化毕赤酵母GS115感受态细胞：

取10μL用限制性内切酶sacI酶切得到的线性化突变质粒pPIC9K-RML/P167N于100μL刚融化的毕赤酵母GS115感受态细胞中，轻轻混匀，转移到冰预冷的电转化杯，冰上静止5min；然后在电转仪进行电转，条件是：1500V，200Ω，0.2cm，电转完成后立即添加1mL冰预冷的1M山梨醇溶液，然后于30℃恒温培养箱孵育2-3h，取300μL涂布于MD固体平板，30℃倒置培养2-3天。

(7)挑取MD平板上的转化子于三丁酸甘油酯平板筛选阳性转化子(即为含有突变质粒pPIC9K-RML/P167N的毕赤酵母GS115)，筛选得到的阳性转化子进行保菌。

2.米黑根毛霉脂肪酶突变体P167N的表达

挑取步骤1(7)中筛选得到的阳性转化子于5mL YPD液体培养基中，30℃，200rpm过夜活化22h至OD600＝0.8左右，取1％接种于50mL BMGY培养基中30℃，200rpm培养40h，4℃，4000rpm离心5min，弃上清，将菌体转接于50mL BMMY培养基中30℃，200rpm培养，每隔24h流加甲醇至终浓度为0.5％，总共诱导120h；最后将诱导得到的菌液于4℃，8000rpm离心10min，上清即为表达的粗酶液。

3.米黑根毛霉脂肪酶突变体P167N的纯化

将步骤2的粗酶液通过10kDa膜(Millipore，USA)超滤浓缩，4℃，4000rpm离心30min。然后将浓缩液加载到经Binding buffer(20mM磷酸缓冲液，20-40mM咪唑，pH 7.4)平衡的HisTrap^TM HP柱上；目的蛋白用Elution Buffer(20mM磷酸缓冲液，400mM咪唑，pH 7.4)梯度洗脱，将洗脱的组分合并后继续浓缩，浓缩的目的蛋白(即突变酶P167N，其氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示)储存于-20℃备用。

4.米黑根毛霉脂肪酶突变体P167N的糖基化验证

(1)将纯化后的突变酶P167N(即米黑根毛霉脂肪酶突变体P167N，由米黑根毛霉脂肪酶WT的如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第167位由P突变为N，其氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示)用N-糖苷酶PNGase F酶切，然后跑SDS-PAGE电泳，检测目的条带的变化。

(2)PNGase F酶切方法：

将步骤3储存的10μg突变酶P167N和2μL 10×Glycoprotein变性缓冲液混合，添加ddH₂O至反应体系为10μL，100℃沸水煮10min。变性后的突变酶P167N，添加2μL 10×G7Buffer，2μL 10％NP40，1μL的PNGase F酶，加5μL ddH₂O至反应总体系为20μL，37℃酶切1小时。SDS-PAGE检测上清的糖基化情况。

(3)酶切后的突变酶P167N样品用15％(w/v)丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE分析。酶切后的突变酶P167N样品和6×protein buffer的体积比为6：1，混合后于100℃沸水中煮5min，12000rpm离心5min后取20μL上样，120V跑1h左右。蛋白胶在考马斯亮蓝G-250染色2-3h，染色结束后用双蒸馏水清洗，然后在脱色液中过夜脱色，脱色液需要定期更换。脱色后，将凝胶置于Fusion Fx(VILBER LOURMAT)成像仪中观察，使用FusionCapt(Advance)拍照。

(4)SDS-PAGE电泳结果如图2所示，米黑根毛霉脂肪酶突变体P167N在没有经糖苷酶PNgase F酶切处理前，分子量大小约为55kDa左右，远高于米黑根毛霉脂肪酶WT的分子量(～40kDa)。将突变酶P167N酶切处理后，有两条带，一条与米黑根毛霉脂肪酶WT的分子量大小一致，约为40kDa，一条与PNgase F酶的大小一致，约为35kDa，说明构建的米黑根毛霉脂肪酶突变体P167N发生了N-糖基化修饰。

5.米黑根毛霉脂肪酶突变体P167N的酶活分析

为研究米黑根毛霉脂肪酶成熟肽上β-sheet二级结构中的N-糖基化修饰对脂肪酶活性的影响，采用对硝基棕榈酸苯酯(PNPP)法对获得的突变酶P167N进行酶活力的测定，以米黑根毛霉脂肪酶WT(无糖基化修饰的酶)为对照，结果如图3所示。在米黑根毛霉脂肪酶WT成熟肽的β-sheet结构中引入N-糖链后，突变酶P167N的酶活是1846.12±58.56U/mg。与改造前的米黑根毛霉脂肪酶WT相比，活性提高了33.91倍。这说明在米黑根毛霉脂肪酶成熟肽的β-sheet结构中引入N-糖链后，有利于提高RML的水解活性。

6.米黑根毛霉脂肪酶突变体P167N的甲醇耐受性分析

米黑根毛霉脂肪酶因其良好的甲醇耐受性，广泛应用于生物柴油的制备，因此提高活性和甲醇耐受性能扩大其在生物柴油行业的应用。实验考察了突变酶P167N在10-90％甲醇浓度中的稳定性，结果如图4和5所示。当在60％的甲醇溶液中孵育1h后，获得的突变酶P167N的残余活力高达91.12％，远高于改造前的米黑根毛霉脂肪酶WT的19.10％。当甲醇浓度上升至90％时，突变酶P167N的残余酶活力高达34.6％。继续将突变酶P167N在50％的甲醇溶液中孵育一段时间，结果如图5所示。孵育2.5h后，突变酶P167N的残余酶活高达92.62％，突变酶P167N的活性几乎没有损失，远高于米黑根毛霉脂肪酶WT(21.30％)，结果说明在米黑根毛霉脂肪酶成熟肽的β-sheet结构中引入N-糖链后，大大提高了酶对甲醇的耐受性。

7.米黑根毛霉脂肪酶突变体P167N的生物柴油制备

如图6所示，以废弃的大豆油(5g)为原料，突变酶P167N为催化剂(添加量为5mL)，一次性加入甲醇(醇油摩尔比3：1)反应24h后，突变酶P167N的生物柴油(FAME)转化率得到明显提高，是72.68％，远高于米黑根毛霉脂肪酶WT的生物柴油转化率8.45％；继续反应至48h后，突变酶P167N的转化率是79.06％，远高于米黑根毛霉脂肪酶WT的FAME转化率，这说明在米黑根毛霉脂肪酶成熟肽的β-sheet结构中引入N-糖链后，可以高效的将废弃的食用油转化为生物柴油，这不仅提高了反应效率，缩短了反应时间，还使分步流加甲醇工艺简化为一步甲醇流加工艺。

实施例2：米黑根毛霉脂肪酶突变体L242N

1.米黑根毛霉脂肪酶突变体L242N表达菌株的构建

构建方法同实施例1，突变酶L242N(即米黑根毛霉脂肪酶突变体L242N)在米黑根毛霉脂肪酶WT成熟肽β-sheet二级结构的²⁴⁰LFLYTQ ²⁴⁵序列上进行突变，突变为序列²⁴⁰LFNYTQ ²⁴⁵，引入新的N-糖基化位点。突变引物为表1所示的引物对N242F/N242R，构建得到的突变质粒为pPIC9K-RML/L242N。按照实施例1步骤(4)-步骤(7)获得阳性转化子即含有突变质粒pPIC9K-RML/L242N的毕赤酵母GS115。

2.米黑根毛霉脂肪酶突变体L242N的表达，方法同实施例1。

3.米黑根毛霉脂肪酶突变体L242N(即突变酶L242N，由米黑根毛霉脂肪酶WT的如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第242位由L突变为N，其氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示)的纯化，方法同实施例1。

4.米黑根毛霉脂肪酶突变体L242N的糖基化验证，方法同实施例1。

SDS-PAGE电泳结果如图2所示，米黑根毛霉脂肪酶突变体L242N在没有经糖苷酶PNgase F酶切处理前，分子量大小约为55kDa左右，远高于米黑根毛霉脂肪酶WT的分子量(～40kDa)。将突变酶L242N酶切处理后，有两条带，一条与米黑根毛霉脂肪酶WT的分子量大小一致，约为40kDa，一条与PNgase F酶的大小一致，约为35kDa，说明构建的米黑根毛霉脂肪酶突变体L242N发生了N-糖基化修饰。

5.米黑根毛霉脂肪酶突变体L242N的酶活分析，方法同实施例1。

如图3所示，突变酶L242N的酶活是974.86±18.88U/mg。与改造前的米黑根毛霉脂肪酶WT相比，活性提高了17.90倍。

6.米黑根毛霉脂肪酶突变体L242N的甲醇耐受性分析，方法同实施例1。

如图4和5所示，当在60％的甲醇溶液中孵育1h后，获得的突变酶L242N的残余活力高达62.27％，远高于对照组WT的19.10％。当甲醇浓度上升至90％时，突变酶L242N的残余酶活力高达36.26％。继续将突变酶L242N在50％的甲醇溶液中孵育一段时间，结果如图5所示。孵育2.5h后，突变酶L242N的残余酶活高达67.48％，远高于米黑根毛霉脂肪酶WT的残余活性21.30％。

7.米黑根毛霉脂肪酶突变体L242N的生物柴油制备

如图6所示，以废弃的大豆油(5g)为原料，突变酶L242N为催化剂(添加量为5mL)，一次性加入甲醇(醇油摩尔比3：1)反应24h后，突变酶L242N的生物柴油(FAME)转化率得到明显提高，是64.07％，远高于米黑根毛霉脂肪酶WT的生物柴油转化率8.45％；继续反应至48h后，突变酶L242N的转化率是67.74％，仍然远高于改造前米黑根毛霉脂肪酶WT的FAME转化率。

实施例3：米黑根毛霉脂肪酶突变体R267N

1.米黑根毛霉脂肪酶突变体R267N表达菌株的构建

构建方法同实施例1。突变酶R267N(即米黑根毛霉脂肪酶突变体R267N)在米黑根毛霉脂肪酶WT成熟肽β-sheet二级结构的²⁶⁶YRRTVN ²⁷¹序列上进行突变，突变为²⁶⁶YNRTVN²⁷¹，引入新的N-糖基化位点。突变引物为表1所示的引物对N267F/N267R，构建得到的突变质粒为pPIC9K-RML/R267N。按照实施例1步骤(4)-步骤(7)获得阳性转化子即含有突变质粒pPIC9K-RML/R267N的毕赤酵母GS115。

2.米黑根毛霉脂肪酶突变体R267N的表达，方法同实施例1。

3.米黑根毛霉脂肪酶突变体R267N(即突变酶R267N，由米黑根毛霉脂肪酶WT的如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第267位由R突变为N，其氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示)的纯化，方法同实施例1。

4.米黑根毛霉脂肪酶突变体R267N的糖基化验证，方法同实施例1。

SDS-PAGE电泳结果如图2所示，米黑根毛霉脂肪酶突变体R267N在没有经糖苷酶PNgase F酶切处理前，分子量大小约为55kDa左右，远高于米黑根毛霉脂肪酶WT的分子量(～40kDa)。将突变酶R267N酶切处理后，有两条带，一条与米黑根毛霉脂肪酶WT的分子量大小一致，约为40kDa，一条与PNgase F酶的大小一致，约为35kDa，说明构建的米黑根毛霉脂肪酶突变体R267N发生了N-糖基化修饰。

5.米黑根毛霉脂肪酶突变体R267N的酶活分析，方法同实施例1。

如图3所示，在米黑根毛霉脂肪酶WT成熟肽的β-sheet结构中引入N-糖链后，突变酶R267N的酶活是766.25±31.05U/mg。与米黑根毛霉脂肪酶WT相比，活性提高了14.07倍。

6.米黑根毛霉脂肪酶突变体R267N的甲醇耐受性分析，方法同实施例1。

如图4和5所示，当在60％的甲醇溶液中孵育1h后，获得的突变酶R267N的残余活力高达90.53％，远高于对照组WT的19.10％。当甲醇浓度上升至90％时，突变酶R267N的残余酶活力高达47.79％。继续将突变酶R267N在50％的甲醇溶液中孵育一段时间，结果如图5所示。孵育2.5h后，突变酶R267N的残余酶活高达84.94％，远高于WT的残余酶活21.30％，继续孵育至8h，突变酶R267N的残余活力高达63.88％。

7.米黑根毛霉脂肪酶突变体R267N的生物柴油制备

如图6所示，以废弃的大豆油(5g)为原料，突变酶R267N为催化剂(添加量为5mL)，一次性加入甲醇(醇油摩尔比3：1)反应24h后，突变酶R267N的生物柴油(FAME)转化率得到明显提高，是64.42％，远高于米黑根毛霉脂肪酶WT的生物柴油转化率8.45％；继续反应至48h后，突变酶R267N的转化率是81.70％，仍然远高于米黑根毛霉脂肪酶WT的FAME转化率。

实施例4：米黑根毛霉脂肪酶突变体P300N

1.米黑根毛霉脂肪酶突变体P300N表达菌株的构建

构建方法同实施例1。突变酶P300N(即米黑根毛霉脂肪酶突变体P300N)在米黑根毛霉脂肪酶WT成熟肽β-sheet二级结构的³⁰⁰PETVQVC ³⁰⁶序列上进行突变，突变为³⁰⁰NETVQVC³⁰⁶，引入新的N-糖基化位点。突变引物为表1所示的引物对N300F/N300R，构建得到的突变质粒为pPIC9K-RML/P300N。按照实施例1步骤(4)-步骤(7)获得阳性转化子即含有突变质粒pPIC9K-RML/P300N的毕赤酵母GS115。

2.米黑根毛霉脂肪酶突变体P300N的表达，方法同实施例1。

3.米黑根毛霉脂肪酶突变体P300N(即突变酶P300N，由米黑根毛霉脂肪酶WT的如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第300位由P突变为N，其氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示)的纯化，方法同实施例1。

4.米黑根毛霉脂肪酶突变体P300N的糖基化验证，方法同实施例1。

SDS-PAGE电泳结果如图2所示，米黑根毛霉脂肪酶突变体P300N在没有经糖苷酶PNgase F酶切处理前，分子量大小约为55kDa左右，远高于米黑根毛霉脂肪酶WT的分子量(～40kDa)。将突变酶P300N酶切处理后，有两条带，一条与米黑根毛霉脂肪酶WT的分子量大小一致，约为40kDa，一条与PNgase F酶的大小一致，约为35kDa，说明构建的米黑根毛霉脂肪酶突变体P300N发生了N-糖基化修饰。

5.米黑根毛霉脂肪酶突变体P300N的酶活分析，方法同实施例1。

以米黑根毛霉脂肪酶WT(无糖基化修饰的酶)为对照，测定了突变酶P300N的酶活，结果如图3所示。在米黑根毛霉脂肪酶WT成熟肽的β-sheet结构中引入N-糖链后，突变酶P300N的酶活是667.59±36.70U/mg。与米黑根毛霉脂肪酶WT相比，活性提高了12.26倍。

6.米黑根毛霉脂肪酶突变体P300N的甲醇耐受性分析，方法同实施例1。

如图4和5所示，当在60％的甲醇溶液中孵育1h后，获得的突变酶P300N的残余活力高达85.38％，远高于对照组WT的19.10％。当甲醇浓度上升至90％时，突变酶P300N的残余酶活力高达35.90％。继续将突变酶P300N在50％的甲醇溶液中孵育一段时间，结果如图5所示。孵育2.5h后，突变酶P300N的残余酶活高达79.81％，远高于米黑根毛霉脂肪酶WT的残余酶活力21.30％，结果说明在米黑根毛霉脂肪酶成熟肽的β-sheet结构中引入N-糖链后，大大提高了酶对甲醇的耐受性。

7.米黑根毛霉脂肪酶突变体P300N的生物柴油制备

如图6所示，以废弃的大豆油(5g)为原料，突变酶P300N为催化剂(添加量为5mL)，一次性加入甲醇(醇油摩尔比3：1)反应24h后，突变酶P300N的生物柴油(FAME)转化率得到明显提高，是63.99％，远高于米黑根毛霉脂肪酶WT的生物柴油转化率8.45％；继续反应至48h后，突变酶P300N的转化率是83.62％，远高于米黑根毛霉脂肪酶WT的FAME转化率。

序列表

<110> 中国科学院广州能源研究所

<120> 一种米黑根毛霉脂肪酶突变体及提高米黑根毛霉脂肪酶活性和/或甲醇耐受性的方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 340

<212> PRT

<213> 米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)

<400> 1

Met Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro

1 5 10 15

Pro Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr

20 25 30

Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser

35 40 45

Asp Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser Tyr Pro

50 55 60

Asp Ser Val Val Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala

65 70 75 80

Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala

85 90 95

Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile

100 105 110

His Cys Asp Ala Thr Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr

115 120 125

Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys

130 135 140

Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile

145 150 155 160

Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr

165 170 175

Lys Val His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu

180 185 190

Leu Val Ala Thr Val Leu Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys

195 200 205

Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys

210 215 220

Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu

225 230 235 240

Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala

245 250 255

Asn Tyr Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu

260 265 270

Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His

275 280 285

Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln

290 295 300

Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val

305 310 315 320

Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr

325 330 335

Gly Leu Cys Thr

340

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tactattgcc agcattgctg c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcaaatggc attctgacat 20

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgaccttcg ttaacgtttc ttacccacca gtttccg 37

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgttaacga aggtcaggtc ggcaatccaa tt 32

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccatacaac agaaccgtca acgagagaga catc 34

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggttctgtt gtatgggata ccggtggaaa ca 32

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cctgttcaac tacacccagg gtcaaccaag ag 32

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gggtgtagtt gaacaggttg gaggaagaca aacc 34

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caactctaac gagaccgttc aagtttgcac ttc 33

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cggtctcgtt agagttgtcg gtgatccaat actct 35

<210> 12

<211> 340

<212> PRT

<213> 米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)

<400> 12

Met Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro

1 5 10 15

Pro Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr

20 25 30

Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser

35 40 45

Asp Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser Tyr Pro

50 55 60

Asp Ser Val Val Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala

65 70 75 80

Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala

85 90 95

Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile

100 105 110

His Cys Asp Ala Thr Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr

115 120 125

Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys

130 135 140

Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile

145 150 155 160

Ala Asp Leu Thr Phe Val Asn Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr

165 170 175

Lys Val His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu

180 185 190

Leu Val Ala Thr Val Leu Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys

195 200 205

Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys

210 215 220

Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu

225 230 235 240

Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala

245 250 255

Asn Tyr Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu

260 265 270

Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His

275 280 285

Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln

290 295 300

Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val

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Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr

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Gly Leu Cys Thr

340

<210> 13

<211> 340

<212> PRT

<213> 米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)

<400> 13

Met Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro

1 5 10 15

Pro Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr

20 25 30

Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser

35 40 45

Asp Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser Tyr Pro

50 55 60

Asp Ser Val Val Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala

65 70 75 80

Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala

85 90 95

Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile

100 105 110

His Cys Asp Ala Thr Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr

115 120 125

Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys

130 135 140

Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile

145 150 155 160

Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr

165 170 175

Lys Val His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu

180 185 190

Leu Val Ala Thr Val Leu Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys

195 200 205

Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys

210 215 220

Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu

225 230 235 240

Phe Asn Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala

245 250 255

Asn Tyr Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu

260 265 270

Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His

275 280 285

Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln

290 295 300

Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val

305 310 315 320

Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr

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Gly Leu Cys Thr

340

<210> 14

<211> 340

<212> PRT

<213> 米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)

<400> 14

Met Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro

1 5 10 15

Pro Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr

20 25 30

Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser

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Asp Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser Tyr Pro

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Asp Ser Val Val Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala

65 70 75 80

Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala

85 90 95

Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile

100 105 110

His Cys Asp Ala Thr Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr

115 120 125

Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys

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Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile

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Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr

165 170 175

Lys Val His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu

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Leu Val Ala Thr Val Leu Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys

195 200 205

Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys

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Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu

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245 250 255

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Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr

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<210> 15

<211> 340

<212> PRT

<213> 米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)

<400> 15

Met Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro

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Pro Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr

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Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser

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Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys

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Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile

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Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr

165 170 175

Lys Val His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu

180 185 190

Leu Val Ala Thr Val Leu Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys

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Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys

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Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu

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Gly Leu Cys Thr

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<210> 16

<211> 10311

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcgcca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780

atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840

actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaagga tccaaacgat gagatttcct 960

tcaattttta ctgcagtttt attcgcagca tcctccgcat tagctgctcc agtcaacact 1020

acaacagaag atgaaacggc acaaattccg gctgaagctg tcatcggtta ctcagattta 1080

gaaggggatt tcgatgttgc tgttttgcca ttttccaaca gcacaaataa cgggttattg 1140

tttataaata ctactattgc cagcattgct gctaaagaag aaggggtatc tctcgagaaa 1200

agagaggctg aagcttacgt agaattcatg gtccctatta agcgtcaatc caattccaca 1260

gttgacagtc tgccacccct gatccctagt cgaacatccg ctccttcatc cagtccatca 1320

accactgacc ctgaggcacc tgccatgtca cgtaacggac cattgccctc cgacgttgaa 1380

accaagtatg gcatggcttt gaacgctaca tcttacccag atagtgttgt tcaagcaatg 1440

tcaatcgatg gcggtatccg tgctgctact tcccaggaaa taaatgaact tacctactac 1500

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gatacaaacg ccatgcatca tcaccatcac catgttgcca gaggagattc agagaaaaca 1680

atttacattg tattccgagg atcttcctct attagaaact ggattgccga cttgacattt 1740

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ggacaaccaa gagtaggtga tcccgctttc gctaactatg ttgtttccac aggtattccc 2040

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ttaggaacag tttctgttcc gtaagccata gcagctactg cctgggcgcc tcctgctagc 3780

acgatacact tagcaccaac cttgtgggca acgtagatga cttctggggt aagggtacca 3840

tccttcttag gtggagatgc aaaaacaatt tctttgcaac cagcaacttt ggcaggaaca 3900

cccagcatca gggaagtgga aggcagaatt gcggttccac caggaatata gaggccaact 3960

ttctcaatag gtcttgcaaa acgagagcag actacaccag ggcaagtctc aacttgcaac 4020

gtctccgtta gttgagcttc atggaatttc ctgacgttat ctatagagag atcaatggct 4080

ctcttaacgt tatctggcaa ttgcataagt tcctctggga aaggagcttc taacacaggt 4140

gtcttcaaag cgactccatc aaacttggca gttagttcta aaagggcttt gtcaccattt 4200

tgacgaacat tgtcgacaat tggtttgact aattccataa tctgttccgt tttctggata 4260

ggacgacgaa gggcatcttc aatttcttgt gaggaggcct tagaaacgtc aattttgcac 4320

aattcaatac gaccttcaga agggacttct ttaggtttgg attcttcttt aggttgttcc 4380

ttggtgtatc ctggcttggc atctcctttc cttctagtga cctttaggga cttcatatcc 4440

aggtttctct ccacctcgtc caacgtcaca ccgtacttgg cacatctaac taatgcaaaa 4500

taaaataagt cagcacattc ccaggctata tcttccttgg atttagcttc tgcaagttca 4560

tcagcttcct ccctaatttt agcgttcaac aaaacttcgt cgtcaaataa ccgtttggta 4620

taagaacctt ctggagcatt gctcttacga tcccacaagg tggcttccat ggctctaaga 4680

ccctttgatt ggccaaaaca ggaagtgcgt tccaagtgac agaaaccaac acctgtttgt 4740

tcaaccacaa atttcaagca gtctccatca caatccaatt cgatacccag caacttttga 4800

gttgctccag atgtagcacc tttataccac aaaccgtgac gacgagattg gtagactcca 4860

gtttgtgtcc ttatagcctc cggaatagac tttttggacg agtacaccag gcccaacgag 4920

taattagaag agtcagccac caaagtagtg aatagaccat cggggcggtc agtagtcaaa 4980

gacgccaaca aaatttcact gacagggaac tttttgacat cttcagaaag ttcgtattca 5040

gtagtcaatt gccgagcatc aataatgggg attataccag aagcaacagt ggaagtcaca 5100

tctaccaact ttgcggtctc agaaaaagca taaacagttc tactaccgcc attagtgaaa 5160

cttttcaaat cgcccagtgg agaagaaaaa ggcacagcga tactagcatt agcgggcaag 5220

gatgcaactt tatcaaccag ggtcctatag ataaccctag cgcctgggat catcctttgg 5280

acaactcttt ctgccaaatc taggtccaaa atcacttcat tgataccatt attgtacaac 5340

ttgagcaagt tgtcgatcag ctcctcaaat tggtcctctg taacggatga ctcaacttgc 5400

acattaactt gaagctcagt cgattgagtg aacttgatca ggttgtgcag ctggtcagca 5460

gcatagggaa acacggcttt tcctaccaaa ctcaaggaat tatcaaactc tgcaacactt 5520

gcgtatgcag gtagcaaggg aaatgtcata cttgaagtcg gacagtgagt gtagtcttga 5580

gaaattctga agccgtattt ttattatcag tgagtcagtc atcaggagat cctctacgcc 5640

ggacgcatcg tggccgacct gcaggggggg ggggggcgct gaggtctgcc tcgtgaagaa 5700

ggtgttgctg actcatacca ggcctgaatc gccccatcat ccagccagaa agtgagggag 5760

ccacggttga tgagagcttt gttgtaggtg gaccagttgg tgattttgaa cttttgcttt 5820

gccacggaac ggtctgcgtt gtcgggaaga tgcgtgatct gatccttcaa ctcagcaaaa 5880

gttcgattta ttcaacaaag ccgccgtccc gtcaagtcag cgtaatgctc tgccagtgtt 5940

acaaccaatt aaccaattct gattagaaaa actcatcgag catcaaatga aactgcaatt 6000

tattcatatc aggattatca ataccatatt tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag 6060

aaaactcacc gaggcagttc cataggatgg caagatcctg gtatcggtct gcgattccga 6120

ctcgtccaac atcaatacaa cctattaatt tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg 6180

agaaatcacc atgagtgacg actgaatccg gtgagaatgg caaaagctta tgcatttctt 6240

tccagacttg ttcaacaggc cagccattac gctcgtcatc aaaatcactc gcatcaacca 6300

aaccgttatt cattcgtgat tgcgcctgag cgagacgaaa tacgcgatcg ctgttaaaag 6360

gacaattaca aacaggaatc gaatgcaacc ggcgcaggaa cactgccagc gcatcaacaa 6420

tattttcacc tgaatcagga tattcttcta atacctggaa tgctgttttc ccggggatcg 6480

cagtggtgag taaccatgca tcatcaggag tacggataaa atgcttgatg gtcggaagag 6540

gcataaattc cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc tgtaacatca ttggcaacgc 6600

tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg cttcccatac aatcgataga 6660

ttgtcgcacc tgattgcccg acattatcgc gagcccattt atacccatat aaatcagcat 6720

ccatgttgga atttaatcgc ggcctcgagc aagacgtttc ccgttgaata tggctcataa 6780

caccccttgt attactgttt atgtaagcag acagttttat tgttcatgat gatatatttt 6840

tatcttgtgc aatgtaacat cagagatttt gagacacaac gtggctttcc cccccccccc 6900

tgcaggtcgg catcaccggc gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc gccgacatca 6960

ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc ggcgtgggta 7020

tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat gcaccattcc 7080

ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta atgcaggagt 7140

cgcataaggg agagcgtcga gtatctatga ttggaagtat gggaatggtg atacccgcat 7200

tcttcagtgt cttgaggtct cctatcagat tatgcccaac taaagcaacc ggaggaggag 7260

atttcatggt aaatttctct gacttttggt catcagtaga ctcgaactgt gagactatct 7320

cggttatgac agcagaaatg tccttcttgg agacagtaaa tgaagtccca ccaataaaga 7380

aatccttgtt atcaggaaca aacttcttgt ttcgaacttt ttcggtgcct tgaactataa 7440

aatgtagagt ggatatgtcg ggtaggaatg gagcgggcaa atgcttacct tctggacctt 7500

caagaggtat gtagggtttg tagatactga tgccaacttc agtgacaacg ttgctatttc 7560

gttcaaacca ttccgaatcc agagaaatca aagttgtttg tctactattg atccaagcca 7620

gtgcggtctt gaaactgaca atagtgtgct cgtgttttga ggtcatcttt gtatgaataa 7680

atctagtctt tgatctaaat aatcttgacg agccaaggcg ataaataccc aaatctaaaa 7740

ctcttttaaa acgttaaaag gacaagtatg tctgcctgta ttaaacccca aatcagctcg 7800

tagtctgatc ctcatcaact tgaggggcac tatcttgttt tagagaaatt tgcggagatg 7860

cgatatcgag aaaaaggtac gctgatttta aacgtgaaat ttatctcaag atctctgcct 7920

cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac 7980

agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt 8040

tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg 8100

cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata 8160

ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact 8220

gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 8280

atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 8340

caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 8400

cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 8460

taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 8520

ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc 8580

tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 8640

gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 8700

ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 8760

aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 8820

aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 8880

agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 8940

cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 9000

gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 9060

atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 9120

gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 9180

tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 9240

gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 9300

ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 9360

actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg 9420

ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctgcag gcatcgtggt gtcacgctcg 9480

tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 9540

cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 9600

ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 9660

ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 9720

tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat 9780

agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 9840

atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 9900

gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 9960

aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 10020

tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag 10080

aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa 10140

gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 10200

cttcaagaat taattctcat gtttgacagc ttatcatcga taagctgact catgttggta 10260

ttgtgaaata gacgcagatc gggaacactg aaaaataaca gttattattc g 10311

Claims

1.一种米黑根毛霉脂肪酶突变体，其特征在于，所述的米黑根毛霉脂肪酶突变体的氨基酸序列上引入有N-糖基化位点，所述的N-糖基化位点上连接有N-糖链；所述的米黑根毛霉脂肪酶突变体的氨基酸序列上引入有N-糖基化位点是通过以下方法获得的：将如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列上的第167位由P突变为N、第242位由L突变N、第267位由R突变为N或第300位由P突变为N。

2.一种提高米黑根毛霉脂肪酶活性和/或甲醇耐受性的方法，其特征在于，在米黑根毛霉脂肪酶成熟肽β-sheet二级结构中引入N-糖链；具体步骤如下：在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列上引入N-糖基化位点，所述的N-糖基化位点上连接有N-糖链；所述的在如SEQID NO.1所示的氨基酸序列上引入N-糖基化位点是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列上的第167位由P突变为N、第242位由L突变N、第267位由R突变为N或第300位由P突变为N。

3.权利要求1所述的米黑根毛霉脂肪酶突变体在催化油脂转化生物柴油中的应用。