CN104911222A - 一种离子液体体系下无载体固定化脂肪酶催化制备生物柴油的方法 - Google Patents

一种离子液体体系下无载体固定化脂肪酶催化制备生物柴油的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种离子液体体系下无载体固定化脂肪酶催化制备生物柴油的方法，该方法包括以下两个步骤：(1)制备无载体固定化脂肪酶；(2)在离子液体体系下，使用步骤(1)制得的无载体固定化脂肪酶催化制备生物柴油。本发明制得的无载体固定化脂肪酶活性高，无需成本高昂的载体；将离子液体介质用于固定化酶制备生物柴油，可以显著提高酶的稳定性及其对底物的立体选择性，还可防止甲醇、甘油等造成的酶中毒问题，确保了酶的高效催化，使生物柴油得率大大提高。本发明所用的固定化酶和离子液体均可回收重复使用，避免资源浪费，节约生产成本，具有良好的工业应用前景。

Description

一种离子液体体系下无载体固定化脂肪酶催化制备生物柴油的方法
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种在离子液体体系下，利用无载体固定化脂肪酶催化制备生物柴油的方法。
技术背景
随着石油资源的日益减少以及人们环境保护意识的增强，寻找并开发清洁的可再生能源已迫在眉睫。生物柴油是以植物油或动物油为原料制成的可再生能源，不含硫和芳烃、十六烷值高、润滑性好，具有环境友好，资源可再生的优点，是替代石油柴油的理想燃料，近年来备受关注。传统制备生物柴油的工艺使用均相无机酸碱作为催化剂，存在着醇消耗量大，产物难回收，环境污染大等缺点，因此人们正在积极寻找环境友好型可替代催化剂。
利用脂肪酶的酶法制备生物柴油具有反应条件温和，特异性强，对环境无污染等优势，但直接用游离的脂肪酶作催化剂，其存在操作稳定性差、易失活、不易重复使用、分离纯化操作复杂的问题。为了解决以上问题，人们将脂肪酶固定在载体上以克服游离脂肪酶存在的缺点，固定化酶与游离酶相比稳定性高、易从反应系统中分离、能重复使用、利于实现自动化生产。因此获得性能优异的固定化脂肪酶对实现工业环境下高效利用，促进生物催化产业的快速发展具有重要意义。但目前，常用的固定化方法中大都通过将脂肪酶固定在成本高昂不溶性聚合物或无机载体上，载体的存在会“稀释”脂肪酶的活性(在整个固定化酶重量中，载体一般占90％以上)，降低脂肪酶的结合容量和反应能力，同时，由于脂肪酶具有一定的高级空间结构，极易受到表面活性剂、载体表面物理性状、化学接枝等因素的影响，对脂肪酶的空间结构或活性中心造成不可逆的破坏，使得脂肪酶活力下降、或失活，严重影响了固定化脂肪酶的效果和催化效率。另外，在使用固定化脂肪酶催化剂催化酯交换反应的时候，通常以有机溶剂作为反应介质，而有机溶剂毒性和易挥发性常会使酶失活和对环境造成危害。
针对上述待解决的技术问题，如若能找到一种新的无载体脂肪酶固定方法，提高固定化酶的效果，并找到能够有效提高油脂转化效率的新型生物酶催化反应体系，提高酯化合成量，对生物柴油工业化制备，具有一定意义。
发明内容
本发明的目的在于解决目前生物柴油生产过程中存在的脂肪酶固定成本高，且酶的活性容易下降甚至失活、油脂转化率低下等问题，提供一种在离子液体体系下、通过无载体固定化脂肪酶催化制备生物柴油的方法，具有酶活性高、稳定性好、可循环利用、节约成本等优点。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
一种离子液体体系下无载体固定化脂肪酶催化制备生物柴油的方法，包括如下步骤：
(1)无载体固定化脂肪酶的制备：将脂肪酶、BSA保护剂、氯化钙和碳酸钠溶液混合震荡，共沉淀制备酶/碳酸钙微球；将酶/碳酸钙微球离心洗涤后，加入还原剂二硫苏糖醇溶液，使酶分子间交联自组装成固定化酶微粒；将固定化酶微粒离心洗涤后加入EDTA溶液，震荡反应、离心分离后，洗涤去除碳酸钙，得到形状可控的多孔固定化脂肪酶微球，即为无载体固定化脂肪酶；
(2)生物柴油的合成：将油脂、离子液体、无载体固定化脂肪酶、甲醇混合加入到反应釜中进行反应，反应完全后的物料经过滤回收固定化酶后，静止分层、收集上层溶液进行减压蒸馏，即得生物柴油；下层经常压蒸馏、减压蒸馏除去甲醇和甘油，提纯处理后得到的离子液体进行循环使用。
作为一种优选方案，上述步骤(1)中，所述无载体固定化脂肪酶的制备方法具体包括如下步骤：
(a)将质量比为10～5:1的脂肪酶和牛血清白蛋白保护剂溶于浓度为0.1～1.0mol/L、pH值为5.8～8的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为10～15mg/ml的酶溶液，加入0.2～0.5mol/L氯化钙水溶液，混合均匀后，快速加入等量、等摩尔浓度的碳酸钠溶液，在4～25℃条件下磁力搅拌1～2min，静置2～3h，通过共沉淀让游离态脂肪酶分子均匀分散于碳酸钙微粒内部，形成稳定的球形碳酸钙颗粒；再滴加酶溶液体积3～4倍的饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4～25℃下震荡1～2min，静置2～3h后，3000rpm离心洗涤3min，得到脂肪酶共沉淀颗粒；
(b)向步骤(a)得到的脂肪酶共沉淀颗粒中加入50mmol/L的二硫苏糖醇溶液，4～25℃下震荡1～2min，静置30～45min以打开酶分子内的二硫键，然后3000rpm离心洗涤3min以去除二硫苏糖醇，将获得的沉淀物重新用磷酸盐缓冲液悬浮分散，静置2～3h，使游离的巯基在脂肪酶分子间重新形成新的二硫键，得到分子间交联自组装固定化酶微粒；
(c)向步骤(b)得到的分子间交联自组装固定化脂肪酶颗粒中加入0.05～0.5mol/L的EDTA溶液，4～25℃下震荡洗涤1h，再离心洗涤3～5次以去除碳酸钙，得到无载体固定化脂肪酶。
更进一步地，所述无载体固定化脂肪酶的制备方法中，所述脂肪酶与碳酸钙的质量比为0.1～1:1；所述脂肪酶与二硫苏糖醇的质量比为0.01～0.1:1；所述EDTA与碳酸钙的质量比为0.05～0.1:1。
本发明所述无载体固定化脂肪酶制备过程中所用的脂肪酶可以根据实际情况进行选择，作为一种较优选的方案，所述脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶、米黑根毛霉脂肪酶、扩展青霉脂肪酶、柱状假丝酵母脂肪酶或皱褶假丝酵母脂肪酶。
本发明所述生物柴油的合成步骤中，作为一种较优选的方案，所述油脂为大豆油、蓖麻油、菜籽油、花生油、桐子油、棉籽油、鱼油、微藻油脂中的一种或几种的混合物。
本发明所述生物柴油的合成步骤中，作为一种较优选的方案，所述离子液体为[Bmim][PF6]、[Bmim][NTf2]、[Bmim][Tf2N]、[Emim][Tf2N]、[Emim][TfO]中的一种。
本发明所述生物柴油的合成步骤中，作为一种较优选的方案，所述离子液体与油脂的质量比为1:10～50；所述无载体固定化脂肪酶与油脂的质量比为1～2.5:10；所述甲醇与油脂的醇油摩尔比为3～12:1。
本发明所述生物柴油的合成步骤中，作为一种较优选的方案，所述将油脂、离子液体、无载体固定化脂肪酶、甲醇混合加入到反应釜中进行反应是在搅拌速率为60～160rpm的恒温水浴摇床上，反应温度为30～50℃，反应时间为24～48h。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明将脂肪酶进行浓缩沉淀，使脂肪酶相互堆积形成超分子结构，再利用活化试剂二硫苏糖醇(DTT)对超分子结构进行分子间共价捆绑，获得无需引入载体的固定化脂肪酶，该方法将脂肪酶堆积形成超分子结构保持下来，不会破坏脂肪酶原有的三维结构，因而脂肪酶的负载量及催化活性大大提高；
(2)本发明将碳酸钙模板剂引入到脂肪酶的固定化中，碳酸钙具有多孔球形结构，以其为模板(俗称模具)能够使肪酶超分子结构塑造出所需规则形状，当碳酸钙模板去除后，脂肪酶超分子结构仍能保持规则形状，实现了脂肪酶粒径和孔径可控的多孔性微球的制备，且能够改善固定化脂肪酶催化过程中，底物分子扩散限制、空间位阻等传质问题；
(3)本发明无载体固定化脂肪酶的制备方法简单、无需成本高昂的载体，无需特殊的仪器和设备，获得的无载体固定化酶与传统的载体固定化酶相比具有更大的催化比表面积、单位体积活性大、空间效率高、稳定性好，与传统的无载体固定化酶相比具有统一的尺寸，稳定的框架，更多的孔道结构，有利于固定化脂肪酶催化生物柴油的工业化应用；
(4)本发明采用集清洁性与安全性于一体离子液体溶剂代替传统的有机溶剂，作为固定化脂肪酶催化生物柴油的反应体系，避免了传统方法中有机溶剂对脂肪酶催化剂的毒害作用，提高了脂肪酶的热稳定性及其对底物的立体选择性、延长了脂肪酶催化剂的重复使用性；
(5)本发明将无载体固定化脂肪酶和离子液体的优势特点结合起来，用于生物柴油的制备，不仅产率高，并且酶可回收重复使用，酶活性损失很小，从而进一步降低了生物柴油的生产成本，在工业应用中具有良好的前景。
附图说明
图1为本发明离子液体体系下无载体固定化脂肪酶催化制备生物柴油的方法的流程图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明做进一步阐述。但实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
无载体固定化脂肪酶制备：
①将质量比为5:1的游离态米黑根毛霉脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于pH＝5.8、摩尔浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中，制成10mg/mL的酶液，取50mL酶液，加入0.4mol/L氯化钙水溶液100mL，混合均匀后，快速加入等量的等摩尔浓度碳酸钠溶液100mL，在4～25℃条件下磁力搅拌1min，静止2h，通过共沉淀让游离态酶分子均匀分散于CaCO3微粒模板剂内部，形成稳定的球形模板化碳酸钙颗粒；再滴加150mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4～25℃下缓慢震荡1～2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min得共沉淀颗粒；
②向共沉淀颗粒中加入50mmol/L二硫苏糖醇(DTT)溶液1ml，4℃下缓慢震荡1min，静止30min后，3000rpm离心洗涤3min，去除二硫苏糖醇(DTT)，将离心获得的沉淀物重新用磷酸盐缓冲液悬浮分散，静止2～3h后，得到分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀的分散溶液；
③向分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀中加入0.05mol/l EDTA溶液10ml，4℃下震荡反应1h，于3000rpm/min离心洗涤10min，反复洗涤3次，以彻底去除CaCO3模板，经真空冷冻干燥，获得多孔无载体固定化脂肪酶微球。
生物柴油的制备：
将醇油摩尔比为6:1的大豆油和甲醇混合后置于100mL反应釜中，再加入1wt％的[Bmim][PF6]，油脂质量比为10∶1的脂肪酶催化剂，在反应温度为30℃，搅拌速率为100rpm恒温水浴摇床上，反应时间为24h，反应结束后，冷却至室温后，经过滤回收无载体固定化脂肪酶(回收的脂肪酶催化剂可直接用于下次循环使用)，滤液移入分液漏斗中静止分层，取上层溶液进行减压蒸馏，收集全部馏分，即得生物柴油，生物柴油得率达到85％以上，下层溶液经蒸馏除去甲醇和甘油回收离子液体，所述离子液体可循环使用。
实施例2
无载体固定化脂肪酶制备：
①将质量比为6:1游离态南极假丝酵母脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH＝7，摩尔浓度为0.2mol/L磷酸盐缓冲液中，制成11mg/mL酶液。取50mL酶液，加入0.4mol/L氯化钙水溶液100mL，混合均匀后，快速加入等量的等摩尔浓度碳酸钠溶液100mL，在4～25℃温度条件下磁力搅拌1min，静置2h，通过共沉淀让游离态酶分子均匀分散于CaCO3微粒模板剂内部，形成稳定的球形模板化碳酸钙颗粒；再滴加180mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4～25℃下缓慢震荡1～2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min得共沉淀颗粒；
②向共沉淀颗粒中加入50mmol/L二硫苏糖醇(DTT)溶液1ml，4℃下缓慢震荡1min，静置30min后，3000rpm离心洗涤3min，去除二硫苏糖醇(DTT)，将离心获得的沉淀物重新用磷酸盐缓冲液悬浮分散，静置2～3h后，得到分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀的分散溶液。
③向分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀中加入0.05mol/L的EDTA溶液12ml，4℃下震荡反应1h，于3000rpm离心洗涤10min，反复洗涤3次，以彻底去除CaCO3模板，经真空冷冻干燥，获得多孔固定化脂肪酶微球。
生物柴油的制备：
将醇油摩尔比为8:1的桐子油和甲醇混合后置于100mL反应釜中，再加入2wt％的[Bmim][NTf2]，油脂质量比为15∶1的脂肪酶催化剂，在反应温度为37℃，搅拌速率为120rpm恒温水浴摇床上，反应时间为30h，反应结束后，冷却至室温后，经过滤回收无载体固定化脂肪酶(回收的脂肪酶催化剂可直接用于下次循环使用)，滤液移入分液漏斗中静止分层，取上层溶液进行减压蒸馏，收集全部馏分，即得生物柴油，生物柴油得率达到89％以上，下层溶液经蒸馏除去甲醇和甘油回收离子液体，所述离子液体可循环使用。
实施例3
无载体固定化脂肪酶制备：
①将质量比为10:1游离态扩展青霉脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH＝8，摩尔浓度为1mol/L磷酸盐缓冲液中，制成15mg/mL酶液。取50mL酶液，加入0.5mol/L氯化钙水溶液100mL，混合均匀后，快速加入等量的等摩尔浓度碳酸钠溶液100mL，在4～25℃温度条件下磁力搅拌1min，静置2h，通过共沉淀让游离态酶分子均匀分散于CaCO3微粒模板剂内部，形成稳定的球形模板化碳酸钙颗粒；再滴加200mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4～25℃下缓慢震荡1～2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min得共沉淀颗粒；
②向共沉淀颗粒中加入50mmol/L二硫苏糖醇(DTT)溶液1.2ml，4℃下缓慢震荡1min，静置30min后，3000rpm离心洗涤3min，去除二硫苏糖醇(DTT)，将离心获得的沉淀物重新用磷酸盐缓冲液悬浮分散，静置2～3h后，得到分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀的分散溶液。
③向分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀中加入0.1mol/L的EDTA溶液10ml，4℃下震荡反应1h，于3000rpm离心洗涤10min，反复洗涤3次，以彻底去除CaCO3模板，经真空冷冻干燥，获得多孔固定化脂肪酶微球。
生物柴油的制备：
将醇油摩尔比为8:1的菜籽油和甲醇混合后置于100mL反应釜中，再加入3wt％的[Bmim][Tf2N]，油脂质量比为15∶1的脂肪酶催化剂，在反应温度为37℃，搅拌速率为120rpm恒温水浴摇床上，反应时间为36h，反应结束后，冷却至室温后，经过滤回收无载体固定化脂肪酶(回收的脂肪酶催化剂可直接用于下次循环使用)，滤液移入分液漏斗中静止分层，取上层溶液进行减压蒸馏，收集全部馏分，即得生物柴油，生物柴油得率达到90％以上，下层溶液经蒸馏除去甲醇和甘油回收离子液体，所述离子液体可循环使用。
实施例4
无载体固定化脂肪酶制备：
①将质量比为8:1柱状假丝酵母脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH＝7，摩尔浓度为0.8mol/L磷酸盐缓冲液中，制成15mg/mL酶液。取50mL酶液，加入0.5mol/l氯化钙水溶液100mL，混合均匀后，快速加入等量的等摩尔浓度碳酸钠溶液100mL，在4～25℃温度条件下磁力搅拌1min，静置2h，通过共沉淀让游离态酶分子均匀分散于CaCO3微粒模板剂内部，形成稳定的球形模板化碳酸钙颗粒；再滴加200mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4～25℃下缓慢震荡1～2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min得共沉淀颗粒；
②向共沉淀颗粒中加入50mmol/L二硫苏糖醇(DTT)溶液1.5ml，4℃下缓慢震荡1min，静置45min后，3000rpm离心洗涤3min，去除二硫苏糖醇(DTT)，将离心获得的沉淀物重新用磷酸盐缓冲液悬浮分散，静置2～3h后，得到分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀的分散溶液。
③向分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀中加入0.5mol/l EDTA溶液5ml，4℃下震荡反应1h，于3000rpm离心洗涤10min，反复洗涤3次，以彻底去除CaCO3模板，经真空冷冻干燥，获得多孔固定化脂肪酶微球。
将醇油摩尔比为10:1的大豆油和甲醇混合后置于100mL反应釜中，再加入3wt％的[Emim][Tf2N]，油脂质量比为20∶1的脂肪酶催化剂，在反应温度为40℃，搅拌速率为160rpm恒温水浴摇床上，反应时间为36h，反应结束后，冷却至室温后，经过滤回收无载体固定化脂肪酶(回收的脂肪酶催化剂可直接用于下次循环使用)，滤液移入分液漏斗中静止分层，取上层溶液进行减压蒸馏，收集全部馏分，即得生物柴油，生物柴油得率达到91％以上，下层溶液经蒸馏除去甲醇和甘油回收离子液体，所述离子液体可循环使用。
实施例5
无载体固定化脂肪酶制备：
①将质量比为7:1皱褶假丝酵母脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH＝7.5，摩尔浓度为0.5mol/L磷酸盐缓冲液中，制成15mg/mL酶液。取50mL酶液，加入0.4mol/l氯化钙水溶液100mL，混合均匀后，快速加入等量的等摩尔浓度碳酸钠溶液100mL，在4～25℃温度条件下磁力搅拌1min，静置2h，通过共沉淀让游离态酶分子均匀分散于CaCO3微粒模板剂内部，形成稳定的球形模板化碳酸钙颗粒；再滴加180mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4～25℃下缓慢震荡1～2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min得共沉淀颗粒；
②向共沉淀颗粒中加入50mmol/L二硫苏糖醇(DTT)溶液1.2ml，4℃下缓慢震荡1min，静置45min后，3000rpm离心洗涤3min，去除二硫苏糖醇(DTT)，将离心获得的沉淀物重新用磷酸盐缓冲液悬浮分散，静置2～3h后，得到分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀的分散溶液。
③向分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀中加入0.3mol/L的EDTA溶液8ml，4℃下震荡反应1h，于3000rpm离心洗涤10min，反复洗涤3次，以彻底去除CaCO3模板，经真空冷冻干燥，获得多孔固定化脂肪酶微球。
生物柴油的制备：
将醇油摩尔比为5:1的微藻油脂和甲醇混合后置于100mL反应釜中，再加入5wt％的[Emim][TfO]，油脂质量比为20∶1的脂肪酶催化剂，在反应温度为43℃，搅拌速率为160rpm恒温水浴摇床上，反应时间为42h，反应结束后，冷却至室温后，经过滤回收无载体固定化脂肪酶(回收的脂肪酶催化剂可直接用于下次循环使用)，滤液移入分液漏斗中静止分层，取上层溶液进行减压蒸馏，收集全部馏分，即得生物柴油，生物柴油得率达到93％以上，下层溶液经蒸馏除去甲醇和甘油回收离子液体，所述离子液体可循环使用。

Claims (7)

1.一种离子液体体系下无载体固定化脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
(1)无载体固定化脂肪酶的制备：将脂肪酶、BSA保护剂、氯化钙和碳酸钠溶液混合震荡，共沉淀制备酶/碳酸钙微球；将酶/碳酸钙微球离心洗涤后，加入还原剂二硫苏糖醇溶液，使酶分子间交联自组装成固定化酶微粒；将固定化酶微粒离心洗涤后加入EDTA溶液，震荡反应、离心分离后，洗涤去除碳酸钙，得到形状可控的多孔固定化脂肪酶微球，即为无载体固定化脂肪酶；
(2)生物柴油的合成：将油脂、离子液体、无载体固定化脂肪酶、甲醇混合加入到反应釜中进行反应，反应完全后的物料经过滤回收固定化酶后，静止分层、收集上层溶液进行减压蒸馏，即得生物柴油；下层经常压蒸馏、减压蒸馏除去甲醇和甘油，提纯处理后得到的离子液体进行循环使用。
2.根据权利要求1所述的离子液体体系下无载体固定化脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于步骤(1)中，所述无载体固定化脂肪酶的制备方法包括如下步骤：
(a)将质量比为10～5:1的脂肪酶和牛血清白蛋白保护剂溶于浓度为0.1～1.0mol/L、pH值为5.8～8的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为10～15mg/ml的酶溶液，加入0.2～0.5mol/L氯化钙水溶液，混合均匀后，快速加入等量、等摩尔浓度的碳酸钠溶液，在4～25℃条件下磁力搅拌1～2min，静置2～3h，通过共沉淀让游离态脂肪酶分子均匀分散于碳酸钙微粒内部，形成稳定的球形碳酸钙颗粒；再滴加酶溶液体积3～4倍的饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4～25℃下震荡1～2min，静置2～3h后，3000rpm离心洗涤3min，得到脂肪酶共沉淀颗粒；
(b)向步骤(a)得到的脂肪酶共沉淀颗粒中加入50mmol/L的二硫苏糖醇溶液，4～25℃下震荡1～2min，静置30～45min以打开酶分子内的二硫键，然后3000rpm离心洗涤3min以去除二硫苏糖醇，将获得的沉淀物重新用磷酸盐缓冲液悬浮分散，静置2～3h，使游离的巯基在脂肪酶分子间重新形成新的二硫键，得到分子间交联自组装固定化酶微粒；
(c)向步骤(b)得到的分子间交联自组装固定化脂肪酶颗粒中加入0.05～0.5mol/L的EDTA溶液，4～25℃下震荡洗涤1h，再离心洗涤3～5次以去除碳酸钙，得到无载体固定化脂肪酶。
3.根据权利要求2所述的离子液体体系下无载体固定化脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于所述无载体固定化脂肪酶的制备方法中，所述脂肪酶与碳酸钙的质量比为0.1～1:1；所述脂肪酶与二硫苏糖醇的质量比为0.01～0.1:1；所述EDTA与碳酸钙的质量比为0.05～0.1:1。
4.根据权利要求1或2所述的离子液体体系下无载体固定化脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于所述脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶、米黑根毛霉脂肪酶、扩展青霉脂肪酶、柱状假丝酵母脂肪酶或皱褶假丝酵母脂肪酶。
5.根据权利要求1所述的离子液体体系下无载体固定化脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于步骤(2)中，所述油脂为大豆油、蓖麻油、菜籽油、花生油、桐子油、棉籽油、鱼油、微藻油脂中的一种或几种的混合物；所述离子液体为[Bmim][PF6]、[Bmim][NTf2]、[Bmim][Tf2N]、[Emim][Tf2N]、[Emim][TfO]中的一种。
6.根据权利要求1所述的离子液体体系下无载体固定化脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于步骤(2)中，所述离子液体与油脂的质量比为1:10～50；所述无载体固定化脂肪酶与油脂的质量比为1～2.5:10；所述甲醇与油脂的醇油摩尔比为3～12:1。
7.根据权利要求1所述的离子液体体系下无载体固定化脂肪酶催化制备生物柴油的方法，其特征在于步骤(2)中，所述将油脂、离子液体、无载体固定化脂肪酶、甲醇混合加入到反应釜中进行反应是在搅拌速率为60～160rpm的恒温水浴摇床上，反应温度为30～50℃，反应时间为24～48h。
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