CN112391376A - 一种固定化脂肪酶杂化纳米花及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固定化脂肪酶杂化纳米花及其制备方法与用途,属于酶催化领域。该方法操作简单、成本低、重复性好,所得脂肪酶杂化纳米花酶活力高,稳定性和重复性好,是一种高效的脂肪酶固定化方法。同时本发明制备的固定化脂肪酶杂化纳米花在生物能源、油脂工程、食品医药、生物催化等领域中均可得到广泛地应用,具有较高的商业价值。
Description
技术领域
本发明属于酶催化领域,具体地涉及一种固定化脂肪酶杂化纳米花及其制备方法与用途。
背景技术
脂肪酶(E.C.3.1.1.3)作为一种有酯催化能力的酶,可以在水相或有机相体系中催化水解反应、酯化反应、转酯化反应,由于其无毒无害,绿色天然,且具有较好的水溶性、反应专一性、催化环境温和的优势,使得其在能源、食品、洗涤、制药、纺织及造纸等行业中有着广泛的应用。近年来,随着节能环保的理念逐渐被推广普及,能源问题越来越被重视。其中,酶解油脂可直接将餐饮等废弃油转化为可利用的生物柴油、工业橡胶等,使能源再生再利用,并且具有反应操作简单,副反应少,条件温和,低能耗,产率高等优点,很大程度降低了化工生产的能源浪费对环境造成的影响,符合可持续发展理念,因此得到国内外学者密切关注和研究。
然而,脂肪酶作为工业催化剂在实际应用过程中仍存在很多问题,如游离脂肪酶不能与反应物分离而难以重复利用,导致使用成本增加;生产过程中有机体系的存在易导致游离脂肪酶发生团聚影响到酶催化活性;控温的不稳定会降低酶活力等,从而导致了游离脂肪酶在应用上受到限制。
将脂肪酶固定化是改善上述问题,提高催化效率的有效手段之一。固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,克服了游离脂肪酶的上述不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点,因此酶的固定化受到研究者日益重视。
酶-无机杂化纳米花是近年来新的固定化酶方法之一,由于其易制备、酶活高、成本低廉和稳定性能好等优点,已经在多种酶中应用,是一种值得推广应用的酶固定方法。但是,从现有的研究结果看,水相中合成的脂肪酶杂化纳米花固定化酶的酶活都不高,严重影响了这种方法对脂肪酶的应用。
低共熔溶剂是一种氢键存在的新型离子液体,是一种低毒、低成本的非水溶剂。研究表明某些低共熔溶剂能够起到提高酶活力、保护酶的作用,低共熔溶剂作为高效绿色的酶催化介质也得到广泛研究和使用。但是,至今尚未见在低共熔溶剂中制备酶-无机杂化纳米花固定化酶的相关报道。
本发明使用含有一定量水的低共熔溶剂作为脂肪酶固定化合成体系,使酶在微水的环境下与磷酸钙杂化自组装形成脂肪酶/磷酸钙纳米花固定化酶,与传统水中制备脂肪酶杂化纳米花固定化酶相比,在低共熔溶剂、钙离子和磷酸钙的协同作用下,本发明制备的脂肪酶杂化纳米花固定化酶的酶活被提高了2倍,是游离脂肪酶活性的1.46倍,而且显著提高了脂肪酶的稳定性和重复使用性,具有较好的工业化应用前景。
发明内容
本发明提供了一种在低共熔溶剂中合成脂肪酶杂化纳米花及其制备方法与用途。该方法操作简单、成本低、重复性好,所得脂肪酶杂化纳米花酶活力高,稳定性和重复性好,在柴油、油脂工程、食品医药、生物催化等领域中均可得到广泛地应用。
本发明的第一个目的是提供一种制备固定化脂肪酶杂化纳米花的方法,步骤如下:
(1)向低共熔溶剂中加入终浓度为5-10mg/mL的磷酸氢二钠,得到磷酸盐-低共熔溶剂溶液;
所述步骤(1)中,所述磷酸氢二钠的含量影响着低共熔溶剂中磷酸根向水中传输的速率,进一步调控磷酸钙纳米花的形态结构,在本发明中选择添加浓度为5-10mg/mL的磷酸氢二钠可有效调控磷酸钙纳米花的形态结构为海绵状形态,从而减少底物传质阻力,浓度过高会团聚结成大块,浓度过低会造成颗粒太小难以完全回收,使得酶活回收率变低。
其中,所述步骤(1)中,所述的终浓度为在磷酸盐-低共熔溶剂溶液中,所包含的磷酸氢二钠的终浓度为5-10mg/mL。
(2)向浓度为30-60mg/mL的氯化钙溶液中添加终浓度为0.05-0.50mg/mL的脂肪酶,得到脂肪酶-氯化钙溶液;
所述步骤(2)中,本发明通过添加氯化钙对脂肪酶的二级结构进行改变,使得脂肪酶被激活,其在相应的浓度范围对脂肪酶的激活效果较为明显,而脂肪酶的添加量能影响固定化酶的固定化效率,从而提升固定化酶酶活回收。
其中,所述步骤(2)中,所述的终浓度为在脂肪酶-氯化钙溶液中,所包含的氯化钙的终浓度为0.05-0.50mg/mL。
(3)将所述脂肪酶-氯化钙溶液与所述磷酸盐-低共熔溶剂溶液按照体积比1:(4-9)混合,经静置、离心、洗涤得到固定化脂肪酶杂化纳米花。
所述的,所述步骤(1)中,低共熔溶剂由氯化胆碱与甘油按照摩尔比为1:(1-4)制备获得。
本发明的一个实施例中,所述步骤(1)中磷酸氢二钠在低共熔溶剂中的终浓度可以为5、6、7、8、9、10mg/mL。
优选地,所述步骤(1)中,磷酸氢二钠在低共熔溶剂中的终浓度为5-7mg/mL。
优选地,所述步骤(1)中氯化胆碱与甘油的摩尔比为1:2,即质量比为1:1.32,所述制备的温度为75-95℃,混合时间为30-120min。在此条件下,合成的低共熔溶剂清澈澄清,透明度高且氢键含量高,适合在其中合成固定化脂肪酶杂化纳米花。
本发明的一个实施例中,所述步骤(2)中氯化钙溶液的浓度可以为30、35、40、45、50、55、60mg/mL。
优选地,所述步骤(2)中,氯化钙溶液的浓度为40-50mg/mL,在此条件下,纳米花的重复使用性更好。
优选地,所述步骤(2)中,氯化钙溶液中脂肪酶的终浓度为0.1-0.3mg/mL。在此条件下,脂肪酶的固定化效率得到提升。
本发明的一个实施例中,所述步骤(2)中氯化钙溶液中脂肪酶的终浓度可以为0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.15mg/mL、0.20mg/mL、0.25mg/mL、0.30mg/mL、0.35mg/mL、0.40mg/mL、0.45mg/mL、0.50mg/mL。
优选地,所述步骤(3)中,静置时间为1-5h。
本发明的一个实施例中,所述步骤(3)中,静置时间可以为1h、2h、3h、4h、5h。
更优选地,所述步骤(3)中,静置时间为2-3h。在此条件下,固定化脂肪酶杂化纳米花的形态为海绵状多孔,其有着良好的传质效果。
优选地,所述步骤(3)中,离心条件为:8000-11000rpm,5-20min
优选地,所述步骤(3)中,洗涤步骤为:相同体积超纯水振荡/涡旋清洗。
优选地,所述制备固定化脂肪酶杂化纳米花的方法,步骤如下:
(a)将氯化胆碱与甘油按照摩尔比为1:(1-4)混合,于75-95℃搅拌20-40min,得到低共熔溶剂;
(b)向所述低共熔溶剂中加入终浓度为5-10mg/mL的磷酸氢二钠,搅拌12-24h得到磷酸盐-低共熔溶剂溶液;
(c)向浓度为30-60mg/mL的氯化钙溶液中添加终浓度为0.05-0.5mg/mL的脂肪酶,得到脂肪酶-氯化钙溶液;
(d)将所述脂肪酶-氯化钙溶液与所述磷酸盐-低共熔溶剂溶液按照体积比1:(4-9)混合,经静置得到白色悬浮颗粒、经离心、洗涤得到固定化脂肪酶杂化纳米花。
本发明的第二个目的是提供由上述方法制备获得的固定化脂肪酶杂化纳米花。
本发明的第三个目的是提供所述固定化脂肪酶杂化纳米花在生物能源、油脂工程、食品医药、生物催化等领域中的用途,添加量为40-70mg/g,酶解温度为30-50℃。
本发明的一个实施例中,固定化脂肪酶杂化纳米花在生物能源中的用途,其添加量可以为40mg/g、45mg/g、50mg/g、55mg/g、60mg/g、65mg/g、70mg/g,酶解温度可以为30℃、32℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃、47℃、50℃。
与现有技术相比,本发明有如下优势:
1、本发明首次提出了一种在一定含水量的低共熔溶剂中制备脂肪酶无机杂化纳米花固定化酶的方法。低共熔溶剂的熔点较低,且大部分在室温下为液态,其主要特征是绿色无毒性、可生物降解。本发明所用的低共熔溶剂是由氯化胆碱和甘油按照一定的摩尔比混合,并且在较温和的温度条件下通过加热搅拌制得的一种有机溶剂,其热稳定性与化学稳定性好,不易发生分解与化学变化,具有安全无毒,可生物降解、使用成本低的特点。由于在该低共熔溶剂中脂肪酶的活性结构被保持和激活,同时在协同钙离子的体系中,提高脂肪酶的活性的同时也加强了稳定性,因此本发明所制备的脂肪酶杂化纳米花固定化酶的酶活分别是游离脂肪酶和水中制备的脂肪酶纳米花固定化酶的1.45倍和2倍。
2、由于本发明制备的低共熔溶剂特有的物理化学性质,使得所制备的脂肪酶杂化纳米花固定化酶颗粒度比水中制备的脂肪酶杂化纳米花固定化酶更均一,因此能够均匀分散在反应体系中(见附图3,相同的比例尺下传统方法(对比例1)合成的脂肪酶磷酸钙纳米花较低共熔溶剂中合成的更易于结块),较好的克服了固定化酶扩散阻力大的问题。而且磷酸钙作为脂肪酶酶自组装的载体,其结构疏松多孔,有利于底物向酶的催化中心传递。在氯化胆碱-甘油体系与钙离子的共同存在下,脂肪酶的α螺旋结构含量明显被减少,使得其疏水活性中心暴露,从而酶活得到提升,并且氯化胆碱与甘油成分本身是酶应用中的保护剂,所以本发明所制备的脂肪酶杂化纳米花固定化酶的热稳定性、储存稳定性和重复使用稳定性显著高于水中制备的脂肪酶杂化纳米花固定化酶。与传统在水中合成的脂肪酶杂化纳米花相比,低共熔溶剂中合成的脂肪酶杂化纳米花,可提高重复使用次数,其可在重复使用10次后残余酶活可达70%,而水中制备的脂肪酶杂化纳米花在重复使用10次后残余酶活仅剩25%(见附图5)。在70℃热处理半个小时,水中制备的脂肪酶杂化纳米花只能保持65%的酶活残留,而低共熔溶剂中制备的脂肪酶杂化纳米花还能保存近80%的酶活残留率(见附图6)。100天的常温保存下,游离酶酶活损失严重,接近完全失活,在水中制备的脂肪酶杂化纳米花经过常温放置后酶活损失了71%,在低共熔溶剂中制备的脂肪酶杂化纳米花酶活出现逐渐升高的趋势,最终达到第一天的260%(见附图7)。
3、本发明利用是通过低共熔溶剂与水两种溶剂相混合把酶进行固定化,经对比脂肪酶所处在不同环境下的酶活力,得到在本发明浓度下氯化钙浓度下,酶的活力可以被提高61.2倍,等浓度下磷酸钙浊液的酶活可达游离脂肪酶的114.4%,而当脂肪酶处在含有10%水的氯化胆碱-甘油低共熔溶剂环境时酶活可达到320.45%。可以明确本发明是依据酶在低共熔溶剂、钙离子、磷酸钙的协同作用下,在这种环境下脂肪酶得到了保护并实现活力的提升。此种固定化酶方法具有高的酶活效率,材料成本经济实用,实施操作简便,固定效率高,催化活性高,稳定性能好和多次重复使用性,对大多数脂肪酶适用,利于工业化规模化使用。
附图说明
图1为本发明实施例1制备脂肪酶杂化纳米花的工艺流程图;
图2为本发明实施例1制备的脂肪酶杂化纳米花的外观图;
图3为本发明实施例2的扫描电镜SEM下的微观形态,其中A是本发明实施例2低共熔溶剂中合成的脂肪酶/磷酸钙杂化纳米花形态(放大200倍);B为传统制备方法即对比例1制备的脂肪酶/磷酸钙杂化纳米花形态(放大200倍);
图4为脂肪酶、对比例1制备的脂肪酶/磷酸钙纳米花、本发明实施例2低共熔溶剂中制备的脂肪酶/磷酸钙纳米花酶活比较;
图5为脂肪酶、对比例1制备的脂肪酶/磷酸钙纳米花、本发明实施例2低共熔溶剂中制备的脂肪酶/磷酸钙纳米花热稳定性能比较;
图6为脂肪酶、对比例1制备的脂肪酶/磷酸钙纳米花、本发明实施例2低共熔溶剂中制备的脂肪酶/磷酸钙纳米花重复利用性比较;
图7为脂肪酶、对比例1制备的脂肪酶/磷酸钙纳米花、本发明实施例2低共熔溶剂中制备的脂肪酶/磷酸钙纳米花储存稳定性能比较。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明,本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外,实施方案应理解为说明性的,而非限制本发明的范围,本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言,在不背离本发明实质和范围的前提下,对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1固定化脂肪酶纳米花的制备方法
按照如下步骤合成脂肪酶杂化纳米花:
称取14g氯化胆碱、18g甘油于烧杯中,在80℃水浴加热搅拌30min,制成低共熔溶剂,再将低共熔溶剂置于烧杯中加入0.2g磷酸氢二钠粉末搅拌使其完全溶解,此时低共熔溶液中磷酸氢二钠的浓度为6mg/mL,得到磷酸盐-低共熔溶剂溶液;取12μL浓度为25mg/mL的脂肪酶酶液,分别加入到3ml浓度为45mg/mL的氯化钙溶液,使氯化钙溶液中脂肪酶的终浓度为0.1mg/ml,得到脂肪酶-氯化钙溶液;再将脂肪酶-氯化钙溶液与磷酸盐-低共熔溶剂溶液按照体积比1:9混合均匀,静置2h后可得白色悬浊,加同体积水混匀离心:11000rpm,15min,将沉淀用相同体积超纯水清洗3次可得磷酸钙纳米花。
酶活测定方法:将含有0.003mmol的棕榈酸对硝基苯酯的0.1mol/L、pH7.5的磷酸缓冲液取3mL进行37℃预热3min,预热后向其中再加入5mg本实施例制备的纳米花,于37℃下,反应3min,反应结束后,0.22um水系滤膜过滤,得到样品,采用紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司生产的UV-5100紫外分光光度计进行酶活测定)进行测定得到OD410nm,通过标准曲线换算得到酶活。
酶活回收率按照下式进行计算:
实验结果为:在氯化钙溶液浓度为45mg/mL的合成条件下脂肪酶杂化纳米花的酶活回收率分别为146.51%。
实施例2固定化脂肪酶纳米花的制备方法
按照如下步骤合成脂肪酶杂化纳米花:
称取14g氯化胆碱、18g甘油于烧杯中,在80℃水浴加热搅拌30min,制成低共熔溶剂,再将低共熔溶剂置于烧杯中加入一定量磷酸氢二钠粉末搅拌使其完全溶解,磷酸氢二钠-低共熔溶液的浓度为8mg/mL,得到磷酸盐-低共熔溶剂溶液;取12μL浓度为25mg/mL的脂肪酶酶液,加入到3ml浓度为45mg/mL的氯化钙溶液,使配制的氯化钙溶液中脂肪酶的终浓度0.1mg/mL,得到脂肪酶-氯化钙溶液;再将脂肪酶-氯化钙溶液与磷酸盐-低共熔溶剂溶液按照体积比1:9混合均匀,静置2h后可得白色悬浊,加同体积水混匀离心:11000rpm,15min,将沉淀用相同体积超纯水清洗3次可得磷酸钙纳米花。
酶活测定方法:酶活测定方法和酶活回收率计算同实施例1。
实验结果为:在磷酸氢二钠溶于低共熔溶剂的浓度为8mg/mL的合成条件下脂肪酶杂化纳米花的酶活回收率为144.59%。
实施例3固定化脂肪酶纳米花的制备方法
按照如下步骤合成脂肪酶杂化纳米花:
称取14g氯化胆碱、18g甘油于烧杯中,在80℃水浴加热搅拌30min,制成低共熔溶剂,再将低共熔溶剂置于烧杯中加入0.2g磷酸氢二钠粉末搅拌使其完全溶解,此时低共熔溶液中磷酸氢二钠的浓度为6mg/mL,得到磷酸盐-低共熔溶剂溶液;取12μL浓度为25mg/mL的脂肪酶酶液,分别加入到3ml浓度为45mg/mL的氯化钙溶液,使得配制得到的氯化钙溶液中酶终浓度为0.1mg/mL,得到脂肪酶-氯化钙溶液;再将脂肪酶-氯化钙溶液与磷酸盐-低共熔溶剂溶液按照体积比1:9混合均匀,静置2h后可得白色悬浊,加同体积水混匀离心:10000rpm,15min,将沉淀用相同体积超纯水清洗3次可得磷酸钙纳米花。
酶活测定方法:酶活测定方法和酶活回收率计算同实施例1。
实验结果为:在酶浓度为0.1mg/mL的合成条件下脂肪酶杂化纳米花的酶活回收率为148.23%。
实施例4固定化脂肪酶纳米花的制备方法
按照如下步骤合成脂肪酶杂化纳米花:
称取14g氯化胆碱、18g甘油于烧杯中,在80℃水浴加热搅拌30min,制成低共熔溶剂,再将低共熔溶剂置于烧杯中加入0.2g磷酸氢二钠粉末搅拌使其完全溶解,此时低共熔溶液中磷酸氢二钠的浓度为6mg/mL,得到磷酸盐-低共熔溶剂溶液;取12μL浓度为25mg/mL的脂肪酶,分别加入到3ml浓度为45mg/mL的氯化钙溶液,使得配制的氯化钙溶液中酶的终浓度为0.1mg/mL,得到脂肪酶-氯化钙溶液;再将脂肪酶-氯化钙溶液与磷酸盐-低共熔溶剂溶液按照体积比1:9混合均匀,选择静置时间为1h,得到的白色悬浊加同体积水混匀离心:9000rpm,20min,将沉淀用相同体积超纯水清洗3次可得磷酸钙纳米花。
酶活测定方法:酶活测定方法和酶活回收率计算同实施例1。
实验结果为:在合成时间为1h的合成条件下脂肪酶杂化纳米花的酶活回收率为132.81%。
实施例5在不同氯化钙浓度下合成固定化脂肪酶纳米花及其酶活回收
按照如下步骤合成脂肪酶杂化纳米花:
称取14g氯化胆碱、18g甘油于烧杯中,在80℃水浴加热搅拌30min,制成低共熔溶剂,再将低共熔溶剂置于烧杯中加入0.2g磷酸氢二钠粉末搅拌使其完全溶解,此时低共熔溶液中磷酸氢二钠的浓度为6mg/mL,得到磷酸盐-低共熔溶剂溶液;取12μL浓度为25mg/mL的脂肪酶酶液,分别加入到3ml浓度为30、35、40、45、50、55、60mg/mL的氯化钙溶液,使氯化钙溶液中脂肪酶的终浓度为0.1mg/ml,得到脂肪酶-氯化钙溶液;再将脂肪酶-氯化钙溶液与磷酸盐-低共熔溶剂溶液按照体积比1:9混合均匀,静置2h后可得白色悬浊,加同体积水混匀离心:11000rpm,15min,将沉淀用相同体积超纯水清洗3次可得磷酸钙纳米花。
酶活测定方法:酶活测定方法和酶活回收率计算同实施例1。
实验结果为:在氯化钙溶液浓度为30、35、40、45、50、55、60mg/mL的合成条件下脂肪酶杂化纳米花的酶活回收率分别为105.32%、137.07%、138.24%、146.51%、140.22%、130.4%、和116.92%。
实施例6在不同磷酸盐浓度下合成固定化脂肪酶纳米花及其酶活回收
按照如下步骤合成脂肪酶杂化纳米花:
称取14g氯化胆碱、18g甘油于烧杯中,在80℃水浴加热搅拌30min,制成低共熔溶剂,再将低共熔溶剂置于烧杯中加入一定量磷酸氢二钠粉末搅拌使其完全溶解,磷酸氢二钠-低共熔溶液的浓度分别为5、6、7、8、9、10mg/mL,得到磷酸盐-低共熔溶剂溶液;取12μL浓度为25mg/mL的脂肪酶酶液,加入到3ml浓度为45mg/mL的氯化钙溶液,使得配制的氯化钙溶液中酶终浓度为0.1mg/mL,得到脂肪酶-氯化钙溶液;再将脂肪酶-氯化钙溶液与磷酸盐-低共熔溶剂溶液按照体积比1:9混合均匀,静置2h后可得白色悬浊,加同体积水混匀离心:11000rpm,15min,将沉淀用相同体积超纯水清洗3次可得磷酸钙纳米花。
酶活测定方法:酶活测定方法和酶活回收率计算同实施例1。
实验结果为:在磷酸氢二钠溶于低共熔溶剂的浓度为5、6、7、8、9、10mg/mL的合成条件下脂肪酶杂化纳米花的酶活回收率分别为110.27%、115.64%、117.93%、144.59%、120.11%、和118.75%。
实施例7在不同酶浓度下合成固定化脂肪酶纳米花及其酶活回收
按照如下步骤合成脂肪酶杂化纳米花:
称取14g氯化胆碱、18g甘油于烧杯中,在80℃水浴加热搅拌30min,制成低共熔溶剂,再将低共熔溶剂置于烧杯中加入0.2g磷酸氢二钠粉末搅拌使其完全溶解,此时低共熔溶液中磷酸氢二钠的浓度为6mg/mL,得到磷酸盐-低共熔溶剂溶液;分别取6、12、24、36、48、60μL浓度为25mg/mL的脂肪酶酶液,分别加入到3ml浓度为45mg/mL的氯化钙溶液,配制得到的氯化钙溶液中酶终浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL,得到脂肪酶-氯化钙溶液;再将脂肪酶-氯化钙溶液与磷酸盐-低共熔溶剂溶液按照体积比1:9混合均匀,静置2h后可得白色悬浊,加同体积水混匀离心:11000rpm,15min,将沉淀用相同体积超纯水清洗3次可得磷酸钙纳米花。
酶活测定方法:酶活测定方法和酶活回收率计算同实施例1。
实验结果为:在酶浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL的合成条件下脂肪酶杂化纳米花的酶活回收率分别为112.3%、148.23%、130.19%、111.07%、109.48%、和101.65%。
实施例8在不同合成时间下制备固定化脂肪酶纳米花及其酶活回收
按照如下步骤合成脂肪酶杂化纳米花:
称取14g氯化胆碱、18g甘油于烧杯中,在80℃水浴加热搅拌30min,制成低共熔溶剂,再将低共熔溶剂置于烧杯中加入0.2g磷酸氢二钠粉末搅拌使其完全溶解,此时低共熔溶液中磷酸氢二钠的浓度为6mg/mL,得到磷酸盐-低共熔溶剂溶液;取12μL浓度为25mg/mL的脂肪酶,分别加入到3ml浓度为45mg/mL的氯化钙溶液,配制的氯化钙溶液中酶终浓度为0.1mg/mL,得到脂肪酶-氯化钙溶液;再将脂肪酶-氯化钙溶液与磷酸盐-低共熔溶剂溶液按照体积比1:9混合均匀,选择静置时间为0.5、1、2、3、4、5h,得到的白色悬浊加同体积水混匀离心,将沉淀用相同体积超纯水清洗3次可得磷酸钙纳米花。
酶活测定方法:酶活测定方法和酶活回收率计算同实施例1。
实验结果为:在合成时间为0.5、1、2、3、4、5h的合成条件下脂肪酶杂化纳米花的酶活回收率分别为132.81%、135.05%、146.28%、132.81%、123.2%、和120.24%。
对比例1传统制备方法合成的脂肪酶/磷酸钙杂化纳米花
基于传统纳米花合成方法,配制6mg/L的磷酸氢二钠水溶液;向浓度为45mg/mL的氯化钙溶液中加入脂肪酶,使得氯化钙溶液中脂肪酶的终浓度为0.1mg/mL,得到脂肪酶-氯化钙溶液;将磷酸氢二钠水溶液与脂肪酶-氯化钙溶液按照体积比1:9混合均匀,静置2h后可得白色悬浊,加同体积水混匀离心,超纯水清洗3次可得磷酸钙纳米花。
实验例1:不同环境下脂肪酶的酶活力比较
为了测定不同条件下制备的脂肪酶对酶活力影响,因此将实验分为四组:
游离脂肪酶(来源于米曲霉Aspergillus oryze CJLU-31,购自sigma):作为标准对照组;用超纯水配制0.1mg/ml浓度的游离酶;
对照组1:脂肪酶(来源米曲霉CJLU-31的脂肪酶)+0.4mol/L氯化钙;
对照组2:脂肪酶(来源米曲霉CJLU-31的脂肪酶)+0.4mol/L磷酸钙;
对照组3:脂肪酶(来源米曲霉CJLU-31的脂肪酶)+10wt%低共熔溶剂;
对照组4:本发明对照例1制备的固定化脂肪酶(来源米曲霉CJLU-31的脂肪酶);
实验组:本发明实施例2制备的固定化脂肪酶(来源米曲霉CJLU-31的脂肪酶)。
对照组1制备方法如下:参照实施例2制备过程的氯化钙与酶的浓度,将脂肪酶溶于45mg/mL的氯化钙溶液(0.4mol/L),得到脂肪酶-氯化钙溶液,其中氯化钙溶液中脂肪酶的终浓度为0.1mg/mL,将取一定量该溶液进行测定。
对照组2制备方法如下:参照实施例2制备过程的氯化钙与酶的浓度,将脂肪酶溶于125mg/mL的磷酸钙悬浊液(0.4mol/L),得到脂肪酶-磷酸钙杂合液体,其中磷酸钙溶液中脂肪酶的终浓度为0.1mg/mL,将取一定量该溶液进行测定。
对照组3制备方法如下:参照实施例2制备过程,称取14g氯化胆碱、18g甘油于烧杯中,在80℃水浴加热搅拌30min,制成低共熔溶剂;将浓度为0.1mg/mL的脂肪酶溶液与该低共熔溶剂按照体积比1:9混合,在此反应体系下对该溶液中酶活进行测定(即对照组3以低共熔溶剂为反应介质)。
需要说明的是对照组和实验组所用到的溶剂均为超纯水。
酶活力的测定方法:
将游离脂肪酶和对照组1、2、4、实验组得到的样品充分涡旋后均取300ul进行酶活测定,酶活测定方法,分别取五组相同的含有0.003mmol的棕榈酸对硝基苯酯的0.1mol/L、pH7.5的磷酸缓冲液3ml于37℃预热3min,再将上述经过涡旋的游离脂肪酶和对照组1、2、4、实验组的样品各300ul分别加入上述缓冲液中,再于37℃下反应3min,反应结束后,0.22um水系滤膜过滤,得到样品,采用紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司生产的UV-5100紫外分光光度计进行酶活测定)进行测定得到OD410nm,通过标准曲线换算得到酶活。根据相同脂肪酶量的酶活对比。
将对照组3得到的样品充分涡旋后取3ml并在37℃预热3min,加入13.333mmol/L的棕榈酸对硝基苯酯200ul得到体系棕榈酸对硝基苯酯的浓度为0.003mmol/L,再于37℃下反应3min,反应结束后,0.22um水系滤膜过滤,得到样品,采用紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司生产的UV-5100紫外分光光度计进行酶活测定)进行测定得到OD348nm,通过标准曲线换算得到酶活。
酶活回收率率按照下式进行计算:
实验结果:见表1,游离脂肪酶分别在0.4mol/L氯化钙溶液、0.4mol/L磷酸钙浊液、含10%水的低共熔溶剂的环境中与单纯脂肪酶的酶活比较。本发明以来源米曲霉CJLU-31的脂肪酶为例),得到在本发明浓度下氯化钙浓度下,酶的活力可以被提高61.2倍,等浓度下磷酸钙浊液的酶活可达游离脂肪酶的114.4%,而当脂肪酶处在含有10%水的氯化胆碱-甘油低共熔溶剂环境时酶活可达到320.45%。可以明确本发明是依据酶在低共熔溶剂、钙离子、磷酸钙的协同作用下,在这种环境下脂肪酶得到了保护并实现活力的提升,其活力并未得到极大提升的原因是其磷酸钙固定化酶的合成争夺了结合在酶上的钙离子,并且由于自组织形成的纳米花增大了酶的传质阻力,但是其重复利用性、热稳定性、储存稳定性等方面显著高于对比例。
表1.游离脂肪酶所处不同环境下酶的活力对比
实验例2:不同环境下脂肪酶的蛋白结构比较
为了说明脂肪酶在不同环境下,脂肪酶与溶剂混合后对于脂肪酶结构以及功能的影响,因此测定了脂肪酶在不同环境下脂肪酶蛋白结构的变化。
实验方法:将实验分为四组,分别取游离脂肪酶(来源于米曲霉Aspergillusoryze CJLU-31,购自sigma)0.1mg,分别加入到1ml的水、1ml的0.4mol/L氯化钙溶液、1ml的含10%水的低共熔溶剂的环境中以及总体积为1ml的0.4mol/L氯化钙溶液和含10%水的低共熔溶剂按照体积比1:9混合的混合溶液中,游离酶的添加量与溶液的比例为0.1mg/1ml。其中,上述低共熔溶剂的制备方法为:称取14g氯化胆碱、18g甘油于烧杯中,在80℃水浴加热搅拌30min,制成低共熔溶剂;
待上述溶液于室温下混合充分后,比较各组中的蛋白二级结构,该结构是通过圆二色谱分析,对比结果显示其酶的二级结构主要在α螺旋与β折叠之间的变化,说明钙离子与本发明的低共熔溶剂均能影响酶的α螺旋向β折叠之间的转移。此种固定化酶方法具有高的酶活效率,材料成本经济实用,实施操作简便,固定效率高,催化活性高,稳定性能好和多次重复使用性,对大多数脂肪酶适用,利于工业化规模化使用。
由表2可以看出,脂肪酶在在氯化胆碱-甘油体系与钙离子的共同存在下(低共熔溶剂+氯化钙组),脂肪酶的α螺旋结构含量明显被减少,使得其疏水活性中心暴露,从而酶活得到提升。
表2.游离脂肪酶所处不同溶液环境下酶的二级结构对比
实验例3:不同条件下制备的脂肪酶的性能比较
将游离脂肪酶(来源于米曲霉Aspergillus oryze CJLU-31,购自sigma)、传统水中制备的脂肪酶/磷酸钙纳米花(对比例1制备)以及低共熔溶剂中制备的脂肪酶/磷酸钙纳米花酶活(本发明实施例2制备)
以下酶的酶活测定方法均采用以下方法:
酶活测定采用紫外吸收分光光度计法,上海元析仪器有限公司生产的UV-5100紫外分光光度计进行酶活测定。采用紫外分光光度计进行测定得到OD410nm,通过标准曲线换算得到酶活。
(一)酶活比较
实验方法:底物的制备:分别取九份(共三组实验,每组三个平行)0.003mmol的棕榈酸对硝基苯酯的0.1mol/L、pH7.5的磷酸缓冲液3mL进行37℃预热3min。向底物缓冲液中分别再将0.025mg游离酶(固定化前酶量)、5mg对比例1制备纳米花、5mg本发明实施例2制备的纳米花分别加入到上述缓冲液中(每组三个重复),在37℃下,反应3min,反应结束后,0.22um水系滤膜过滤,得到样品,采用紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司生产的UV-5100紫外分光光度计进行酶活测定)进行测定得到OD410nm,通过标准曲线换算得到酶活。酶活测定结果参照附图4,本发明所制备的脂肪酶杂化纳米花固定化酶的酶活分别是游离脂肪酶和水中制备的脂肪酶纳米花固定化酶的1.45倍和2倍。由于本发明的脂肪酶杂化纳米花固定化酶颗粒度比水中制备的脂肪酶杂化纳米花固定化酶更均一,因此能够均匀分散在反应体系中,较好的克服了固定化酶扩散阻力大的问题。而且磷酸钙作为脂肪酶酶自组装的载体,其结构疏松多孔,有利于底物向酶的催化中心传递。在氯化胆碱-甘油体系与钙离子的共同存在下,脂肪酶的α螺旋结构含量明显被减少,使得其疏水活性中心暴露,从而酶活得到提升,并且酶在此过程中被限制在微水环境中,酶的固定化效果得到提升。
需要说明的是本发明实施例1、3-8制备的固定化脂肪酶纳米花在酶活力上具有与实施例2相近的技术效果。
(二)热稳定性能比较
实验方法:将0.025mg游离酶(固定化前酶量)、5mg对比例1制备的纳米花、5mg本发明实施例2制备的纳米花分别放入70℃水浴中,加热30min后,冷却至室温,加入底物,即分别取0.003mmol的棕榈酸对硝基苯酯的0.1mol/L、pH7.5的磷酸缓冲液3mL进行37℃预热3min,将经过热处理的0.025mg游离酶(固定化前酶量)、5mg对比例1制备的纳米花、5mg本发明实施例2制备的纳米花分别加入各自相同的底物中,在37℃水浴中反应3min后过0.22um水系微孔滤膜在410nm下读取吸光值,计算残余酶活,对比稳定性。
酶活测定结果参照附图5,在70℃热处理半个小时,对比例1制备的脂肪酶杂化纳米花只能保持65%的酶活残留,而实验例2制备的脂肪酶杂化纳米花还能保存近80%的酶活残留率。这一结果是由于固定化酶残余的低共熔溶剂保护了脂肪酶的结构,使低共熔溶剂中合成的纳米花具有非常高的热稳定性能,参照附图5。
需要说明的是本发明实施例1、3-8制备的固定化脂肪酶纳米花在酶的热稳定性上具有与实施例2相近的技术效果。
(三)重复利用性比较
实验方法:底物的制备:分别取多份(共2组实验,每组三个平行,多次重复进行)0.003mmol的棕榈酸对硝基苯酯的0.1mol/L、pH7.5的磷酸缓冲液3mL进行37℃预热3min,分别将5mg对比例1制备的纳米花、5mg本发明实施例2制备的纳米花,分别加入到上述各自的底物缓冲液中(每组三个重复),在37℃条件下催化棕榈酸对硝基苯酯分解反应,反应3min后,离心分离出固定化酶,用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)缓冲液洗后,在固定化酶中加入新制备的上述底物进行第2轮转化,依此分批催化,每次催化反应后分别检测固定化酶剩余的酶活。
酶活测定结果参照附图6,与对比例1纳米花相比,本发明制备的纳米花,可提高重复使用次数,其可在重复使用10次后酶活损失不到30%,而水中制备的脂肪酶杂化纳米花损失高达65%。这是因为在水中合成的纳米花过程中对酶的固定不均一,从而导致较小部分酶的损失,固定化酶出现泄漏,参照附图6。。需要说明的是本发明实施例1、3-8制备的固定化脂肪酶纳米花在重复利用性上具有与实施例2相近的技术效果。
(四)储存稳定性能比较
实验方法:将游离酶、对比例1制备的脂肪酶磷酸钙纳米花和本发明实施例2制备的脂肪酶杂化纳米花在室温下储存放置,每隔2天分别取0.025mg游离酶(固定化前酶量)、5mg的传统方法合成的纳米花、5mg在低共熔溶剂中合成的纳米花在37℃条件下按照上述(一)(二)(三)底物的制备以及酶活的测定的实验方法测得残余酶活变化。
酶活测定结果参照附图7,100天的常温保存下,游离酶酶活损失严重,接近完全失活,对比例1合成的纳米花经过常温放置后酶活损失了71%,而实验例2制备的纳米花由于低共熔溶剂的存在酶活出现逐渐升高的趋势,最终达到第一天的260%。需要说明的是本发明实施例1、3-8制备的固定化脂肪酶纳米花在酶的储存稳定性能上具有与实施例2相近的技术效果。
(五)底物选择性比较
实验方法:选择乙酸对硝基苯酯(2C)、丁酸对硝基苯酯(4C)、辛酸对硝基苯酯(8C)、月桂酸对硝基苯酯(12C)、棕榈酸对硝基苯酯(16C)为不同碳链长度的底物,通过改变底物浓度,每种酯设置浓度梯度0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mM测定相同脂肪酶量下游离酶、对比例1制备的固定化酶、实验例2制备的固定化酶酶活,双倒数作图获得不同底物下游离酶与两种固定化酶的反应动力学参数Km、Vmax,结果如下表3。从整体来看,对比例1的固定化酶均没有游离酶对底物更有亲和力,本发明(实验例2)的固定化酶对底物的亲和性随着碳链升高其逐渐提高,在8C时其略高于游离酶并且在12C时达到最大。
表3.不同底物下三种酶的动力学参数
需要说明的是本发明实施例1、3-8制备的固定化脂肪酶纳米花在对上述底物的亲和性能上具有与实施例2相近的技术效果。
以上所述实例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但其技术范围不受限于以上实施方式。对于本领域的技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,可以做各种改进并实施,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种制备固定化脂肪酶杂化纳米花的方法,其特征在于:步骤如下:
(1)向低共熔溶剂中加入终浓度为5-10mg/mL的磷酸氢二钠,得到磷酸盐-低共熔溶剂溶液;
(2)向浓度为30-60mg/mL的氯化钙溶液中添加终浓度为0.05-0.5mg/mL的脂肪酶,得到脂肪酶-氯化钙溶液;
(3)将所述脂肪酶-氯化钙溶液与所述磷酸盐-低共熔溶剂溶液按照体积比1:(4-9)混合,经静置、离心、洗涤得到固定化脂肪酶杂化纳米花。
2.根据权利要求1所述的一种制备固定化脂肪酶杂化纳米花的方法,其特征在于:所述步骤(1)中,低共熔溶剂由氯化胆碱与甘油按照摩尔比为1:(1-4)制备获得。
3.根据权利要求1所述的一种制备固定化脂肪酶杂化纳米花的方法,其特征在于:所述步骤(1)中,磷酸氢二钠在低共熔溶剂中的终浓度为5-7mg/mL。
4.根据权利要求2所述的一种制备固定化脂肪酶杂化纳米花的方法,其特征在于:所述步骤(1)中氯化胆碱与甘油的摩尔比为1:2;所述制备的混合温度为75-95℃,混合时间为30-120min。
5.根据权利要求1所述的一种制备固定化脂肪酶杂化纳米花的方法,其特征在于:所述步骤(2)中,氯化钙溶液的浓度为40-50mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种制备固定化脂肪酶杂化纳米花的方法,其特征在于:所述步骤(2)中,所述氯化钙溶液中脂肪酶的终浓度为0.1-0.3mg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种制备固定化脂肪酶杂化纳米花的方法,其特征在于:所述步骤(3)中,静置时间为1-5h。
8.根据权利要求1所述的一种制备固定化脂肪酶杂化纳米花的方法,其特征在于:步骤如下:
(a)将氯化胆碱与甘油按照摩尔比为1:(1-4)混合,于75-95℃搅拌20-40min,得到低共熔溶剂;
(b)向所述低共熔溶剂中加入终浓度为5-10mg/mL的磷酸氢二钠,搅拌12-24h得到磷酸盐-低共熔溶剂溶液;
(c)向浓度为30-60mg/mL的氯化钙溶液中添加终浓度为0.05-0.5mg/mL的脂肪酶,得到脂肪酶-氯化钙溶液;
(d)将所述脂肪酶-氯化钙溶液与所述磷酸盐-低共熔溶剂溶液按照体积比1:(4-9)混合,经静置得到白色悬浮颗粒、经离心、洗涤得到固定化脂肪酶杂化纳米花。
9.由权利要求1-8任一所述方法制备获得的固定化脂肪酶杂化纳米花。
10.根据权利要求9所述的固定化脂肪酶杂化纳米花在生物能源、油脂工程、食品医药、生物催化等领域中的用途,所述纳米花的添加量为40-70mg/g,酶解温度为30-50℃。
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