CN101712951A - 一种基于固定化方法的脂肪酶固定方法及其在阿魏酸酯化反应中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种采用大孔隙离子交换树脂D403固定脂肪酶的方法并用该酶催化酯化反应。技术方案是将离子交换树脂，用热水浸洗；水洗后，先后使用NaOH溶液、NaCl溶液、盐酸预处理，得到大孔吸附树脂备用；将脂肪酶粉溶于磷酸盐缓冲液中，离心弃沉淀后，取上清酶液并加入大孔吸附树脂，置于恒温振荡摇床中平衡吸附；过滤后得大孔吸附树脂固定化的脂肪酶。阿魏酸酯化反应可以采用双有机试剂异辛烷/丁酮或以纯离子液1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([Omim]PF6)为溶剂；采用本发明所述的方法，吸附树脂材料易得，同时以离子交换树脂为载体的固定化的脂肪酶在阿魏酸酯化反应中，阿魏酸转化为阿魏酸酯的转化率最高可达93％，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种以离子交换树脂为载体的脂肪酶固定方法及其在阿魏酸酯化反应中的应用，具体说涉及一种采用大孔隙鏊合型苯乙烯系离子交换树脂D403固定脂肪酶的方法并用该酶催化酯化反应。
背景技术
脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)又称三酰基甘油酰基水解酶，是一类特殊的酰基水解酶，普遍存在于动、植物和微生物中。它不仅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成反应、转酯化反应、酸解反应等反应，是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品工业、纺织和化工工业、医药工业、造纸行业等。随着世界范围内能源短缺和环境保护的需要，生物柴油(即脂肪酸单酯)的应用成为关注和研究的热点，其中生物酶法合成生物柴油已成为生物柴油研究的重要方向，其途径就是利用动植物及废弃物油脂，经脂肪酶的催化进行酰基转移反应。由于脂肪酶的价格昂贵，对环境变化的耐受力极低，很难重复利用，难与底产物分离，因而难以实现生产工艺的连续化和自动化，限制了其大规模应用。为了降低酶催化法的成本，将其固定于合适的载体形成固定化脂肪酶，是解决上述不足和进一步提高固定化脂肪酶稳定性的有效途径。固定化脂肪酶具有可以回收，重复使用，稳定性高，产品质量高等优点。许多国家如日本、美国、印度和中国等竞相开展了固定化脂肪酶的研究。脂肪酶的固定化技术不仅在工业生产的连续化和自动化上有重要价值，而且在生物学的基本理论研究、在临床医学和促进其他生化技术的发展中都有重大的意义。
脂肪酶的固定化方法大致分为物理法和化学法。物理法主要有吸附法和包埋法；化学法有共价偶联法和交联法。谭天伟的课题组以纺织物膜如尼龙、棉织物膜、纤维素膜、PS膜、真丝、聚酯类织物膜作为固定化载体，固定化假丝酵母脂肪酶99-125合成棕榈酸异辛酯以及采用廉价的废油作为原料进行酶促合成FAME(谭天伟等，中国专利，2006；陈必强等，化工学报，2004；高静等，化工学报，2005)。
以大孔树脂为载体采用吸附法固定化脂肪酶，如高红娟等以AB-8、HZ-841、HZ-802种大孔树脂做载体，采用物理吸附法，制备出固定化南极假丝酵母脂肪酶(CALB)，并用其进行了拆分2-辛醇的研究(精细化工，2008)。吴茜茜等以大孔树脂D101固定化中性脂肪酶，研究了固定化条件对酶催化活性的影响，得到了最佳固定化条件(食品与发酵工业，2008)。高阳等以不同大孔树脂NKA-9、AB-8、H103、D4020、NKA等吸附法固定化假丝酵母99-125脂肪酶，通过固定化条件的优化，比较了不同树脂的固定化效率和固定化酶的催化效果，并在微水体系中利用大豆油合成生物柴油，在微水有机相中的应用表明非极性树脂NKA是最佳的固定化栽体(生物工程学报，2006)。王卫飞等选择3种大孔树脂AB-8、HZ-802、HZ-841吸附固定化Thermomyces lanuginosus脂肪酶，用AB-8树脂固定化的脂肪酶比酶活最高，达到37451U/g(王卫飞等，中国油脂，2008)。李浔等采用大孔树脂D3520作载体，获得以载体涂布法固定化脂肪酶的最适固定化条件(李浔等，应用化工，2008)。虞英等以D311离子交换树脂为载体，通过离子交换吸附法对Lipolase 100L脂肪酶进行固定化(虞英等，食品与生物技术学报，2007)。唐良华等采用大孔吸附树脂AB-8、D-201、D-204、X-5，大孔吸附树脂HZ801、HZ802固定化扩展青霉TS414脂肪酶，建立了适于非水相中选择性拆分(R，S)-布洛芬的固定化方法(唐良华等，过程工程学报，2008)。
蔡宏举等用自制大孔载体固定化脂肪酶，即以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，二乙烯基苯为聚合交联剂，采用固液联合致孔方式，通过本体聚合制备了具有大孔结构的含环氧基的多孔载体。载体上的环氧基团水解成羟基后，以戊二醛为偶联剂，用载体偶联法固定化假丝酵母脂肪酶，对固定化条件进行了优化，比较了固定化酶与游离酶的酶学参数(蔡宏举等，过程工程学报，2007)。郭道义等采用甲基三甲氧基硅和四甲氧基硅缩水和水解反应形成的硅胶包埋固定化洋葱假胞菌G63脂肪酶。研究了酶用量、醇油摩尔比、反应温度、含水量对合成生物柴油的影响(郭道义等，中国油脂，2008)。丰宗清采用壳聚糖(CS)负载在(MCM-41)介孔分子筛表面得到有机-无机复合物(CS-MCM-41)，用于制备固定化假单胞脂肪酶，研究了磷酸盐缓冲溶液的pH值、酶量、固定化时间和温度等条件对固定化脂肪酶(PSL/CS-MCM-41)催化活性的影响，得到适宜的固定化条件(丰宗清，农业科学研究，2008)。以壳聚糖为载体，用物理吸附固定化脂肪酶，对影响固定化过程的各种因素进行考察，确定最优条件，并比较了游离酶和固定化酶的最适温度、pH、酶的热稳定性以及表观Km(李志国等，华东理工大学学报，2004)。郑毅等采用吸附与交联相结合的方法固定化米曲霉脂肪酶选择性富集鱼油ω-3多不饱和脂肪酸甘油酯，载体为硅藻土、交联剂为0.5％戊二醛(郑毅等，化工学报，2006)。
发明内容
本发明的目的就是提供一种将大孔隙鏊合型苯乙烯系离子交换树脂D403预处理，并以此为载体，用于固定化吸附脂肪酶的固定方法。
本发明的另一个目的，是将经过离子交换树脂固定后的脂肪酶在阿魏酸酯化反应中的应用。
为实现本发明的目的而采用的技术方案是：
1、树脂预处理
将准备装离子交换柱使用的离子交换树脂，先用50-60℃热水反复2-3次浸洗，每隔15分钟换水一次，浸洗时要不时搅动，换水3次后结束第一轮浸洗，重复上述浸洗步骤，但换水间隔时间改为每隔30分钟换水一次，总共换水4-5次，结束第二轮浸洗。
水洗后，用0.5N NaOH以每小时1.5倍床层体积缓慢流过树脂，总用量为树脂体积的2-3倍。此后用水冲洗至出水pH值为8.5-9.5时，改用3倍树脂体积、百分比浓度为5％的NaCl溶液以每小时1.5倍床层体积流过树脂。再用0.5N盐酸以每小时1.5倍床层体积流过树脂，总用量为树脂体积的2-3倍。最后先用水冲洗至出水pH为4.5-5.5，再用去离子水冲洗至出水pH值为6.0-7.0时，即可得到预处理的大孔吸附树脂备用。
2、脂肪酶的固定
将1.0g-2.5g脂肪酶粉溶于45mL-70mL 0.1mol/L pH值为7.5-9.0的磷酸盐缓冲液中，以6000rpm离心15min，弃去沉淀，吸取40mL上清酶液于三角瓶中，加入10g-50g已经预处理的大孔吸附树脂，而后将三角瓶置于30℃恒温振荡摇床中平衡吸附8h-10h，摇床转速80rpm；过滤去除溶液，用磷酸盐缓冲液淋洗3次，冷冻干燥后即可得大孔吸附树脂固定化脂肪酶。
本发明所述的脂肪酶是指黑曲霉、米曲霉、扩展青霉或洋葱假单胞菌产生的脂肪酶。
3、阿魏酸酯化反应
阿魏酸酯化反应可以采用双有机试剂异辛烷/丁酮或以纯离子液1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([Omim]PF6)为溶剂。
当以双有机试剂异辛烷/丁酮(体积比85∶15)为溶剂时，在具塞三角烧瓶中分别加入阿魏酸3.0mg-20.0mg、油醇98mg、异辛烷/丁酮10ml(85∶15，V/V)、分子筛100mg和大孔吸附树脂固定化脂肪酶30-300mg进行混合反应，反应温度65℃，摇床转速150rpm，酯化反应8天，阿魏酸酯化成阿魏酸酯。
当以纯离子液[Omim]PF6为溶剂时，在具塞三角烧瓶中分别加入阿魏酸3.0-20.0mg、[Omim]PF6 1.5mL、油醇45mg、固定化脂肪酶加量为30-200mg，反应温度75℃，摇床转速为300rpm，酯化反应6天，阿魏酸酯化成阿魏酸酯。
采用本发明所述的方法，吸附树脂材料易得，工业化成本低易于推广，同时，以离子交换树脂为载体的脂肪酶在阿魏酸酯化反应中，阿魏酸转化为阿魏酸酯的转化率最高可达93％，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
1、离子交换树脂的预处理
取400g准备装离子交换柱的大孔隙鏊合型苯乙烯系离子交换树脂D403，用500mL 55℃热水浸洗，每隔约15分钟换水一次，浸洗时要不时搅动，换水3次后，重复上述浸洗步骤，但换水间隔时间改为每隔30分钟换水一次，总共换水4次。水洗后，用750mL 0.5N NaOH缓慢流过离子交换树脂，流速为每小时1.5倍床层体积。然后用水冲洗，此时出水的pH为8.5，再用900mL 5％的NaCl溶液流过树脂，流速为每小时1.5倍床层体积流过。用750mL 0.5N盐酸流过树脂，流速为每小时1.5倍床层体积流过，用水冲洗至出水pH为5.5左右。用去离子水冲洗至出水pH值为7.0时，即可得到预处理的大孔吸附树脂备用。
2、脂肪酶固定化
在250mL三角瓶中，将1.0g黑曲霉脂肪酶粉溶于50mL0.1mol/L pH值8.0的磷酸盐缓冲液中，以6000rpm离心15min，弃去沉淀，吸取40mL上清酶液于三角瓶中加入25g预处理的大孔吸附树脂，而后将三角瓶置于30℃恒温振荡摇床中平衡吸附10h，摇床转速80rpm，过滤去除溶液，用磷酸盐缓冲液淋洗3次，冷冻干燥后即可得大孔吸附树脂固定化的黑曲霉脂肪酶。经上述固定化后的黑曲霉脂肪酶回收率50％，蛋白吸附量为40mg/g。
3、催化阿魏酸酯化反应
以混合双有机试剂异辛烷/丁酮(体积比85∶15)为溶剂，在50mL具塞三角烧瓶中分别加入阿魏酸4.8mg、油醇98mg、异辛烷/丁酮10ml、4埃分子筛100mg、固定化的黑曲霉脂肪酶100mg，反应温度65℃，摇床转速150rpm，反应8天阿魏酸酯化成阿魏酸酯，转化率为91.8％。
实施例2
1、离子交换树脂的预处理
同实施例1
2、脂肪酶固定化
在250mL三角瓶中，将2.5g黑曲霉脂肪酶粉溶于70mL 0.1mol/L pH值7.5的磷酸盐缓冲液中，以6000rpm离心15min，弃去沉淀，吸取40mL上清酶液于三角瓶中加入45g预处理的大孔吸附树脂，而后将三角瓶置于30℃恒温振荡摇床中平衡吸附8h，摇床转速80rpm，过滤去除溶液，用磷酸盐缓冲液淋洗3次，冷冻干燥后即可得大孔吸附树脂固定化的黑曲霉脂肪酶。经上述固定化后的黑曲霉脂肪酶回收率48.8％，蛋白吸附量为42mg/g。
3、催化阿魏酸酯化反应
以纯离子液[Omim]PF6为溶剂，在具塞三角烧瓶中分别加入阿魏酸8.2mg、[Omim]PF6 1.5mL、油醇45mg、固定化的黑曲霉脂肪酶100mg，反应温度75℃，摇床转速为300rpm，反应6天阿魏酸酯化成阿魏酸酯，转化率达87％。
实施例3
1、离子交换树脂的预处理
同实施例1
2、脂肪酶固定化
在250mL三角瓶中，将1.5g扩展青霉脂肪酶粉溶于65mL0.1mol/L pH值9.0的磷酸盐缓冲液中，以6000rpm离心15min，弃去沉淀，吸取40mL上清酶液于三角瓶中加入10g预处理的大孔吸附树脂，而后将三角瓶置于30℃恒温振荡摇床中平衡吸附8.5h，摇床转速80rpm，过滤去除溶液，用磷酸盐缓冲液淋洗3次，冷冻干燥后即可得大孔吸附树脂固定化的扩展青霉脂肪酶。经上述固定化后的扩展青霉脂肪酶回收率52.5％，蛋白吸附量为47mg/g。
3、催化阿魏酸酯化反应
以混合双有机试剂异辛烷/丁酮(体积比85∶15)为溶剂，在50mL具塞三角烧瓶中分别加入阿魏酸20.0mg、油醇98mg、异辛烷/丁酮10mL、4埃分子筛100mg、固定化的扩展青霉脂肪酶240mg，反应温度65℃，摇床转速150rpm，反应8天阿魏酸酯化成阿魏酸酯，转化率为93.4％。
实施例4
1、离子交换树脂的预处理
同实施例1
2、脂肪酶固定化
在250mL三角瓶中，将2.0g洋葱假单胞菌脂肪酶粉溶于60mL0.1mol/L pH值9.0的磷酸盐缓冲液中，以6000rpm离心15min，弃去沉淀，吸取40mL上清酶液于三角瓶中加入10g预处理的大孔吸附树脂，而后将三角瓶置于30℃恒温振荡摇床中平衡吸附10h，摇床转速80rpm，过滤去除溶液，用磷酸盐缓冲液淋洗3次，冷冻干燥后即可得大孔吸附树脂固定化的洋葱假单胞菌脂肪酶。经上述固定化后的洋葱假单胞菌脂肪酶回收率50.5％，蛋白吸附量为46mg/g。
3、催化阿魏酸酯化反应
当以纯离子液[Omim]PF6为溶剂时，在具塞三角烧瓶中分别加入阿魏酸15.0mg、[Omim]PF6 1.5mL、油醇45mg、固定化的洋葱假单胞菌脂肪酶为50mg，反应温度75℃，摇床转速为300rpm，反应6天，阿魏酸酯化阿魏酸酯，转化率达88.9％。
Claims (7)
1.一种基于固定化方法的以离子交换树脂为载体的脂肪酶固定方法，将离子交换树脂，分别用热水进行第一轮、第二轮浸洗；水洗后，先后使用NaOH溶液、NaCl溶液、盐酸缓慢流过树脂进行预处理，得到大孔吸附树脂，其特征是：将1.0g-2.5g脂肪酶粉溶于磷酸盐缓冲液中，离心弃去沉淀后，吸取40mL上清酶液并加入10g-50g大孔吸附树脂，而后置于30℃恒温振荡摇床中平衡吸附；过滤后得大孔吸附树脂固定化的脂肪酶。
2.根据权利要求1所述的一种基于固定化方法的以离子交换树脂为载体的脂肪酶固定方法，其特征是：脂肪酶的固定过程中，脂肪酶粉溶于磷酸盐缓冲液时，磷酸盐缓冲液的使用量为45mL-70mL，摩尔浓度为0.1mol/L，pH值为7.5-9.0。
3.根据权利要求1所述的一种基于固定化方法的以离子交换树脂为载体的脂肪酶固定方法，其特征是：脂肪酶的固定过程中恒温振荡摇床中平衡吸附时间为8h-10h，摇床转速80rpm；过滤后去除溶液，用磷酸盐缓冲液淋洗3次，冷冻干燥。
4.根据权利要求1所述的一种基于固定化方法的以离子交换树脂为载体的脂肪酶固定方法，其特征是：所述的脂肪酶是指黑曲霉、米曲霉、扩展青霉或洋葱假单胞菌产生的脂肪酶。
5.一种基于固定化方法的以离子交换树脂为载体的脂肪酶在阿魏酸酯化反应中的应用，其特征是阿魏酸酯化反应采用双有机试剂异辛烷/丁酮或以纯离子液1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐为溶剂。
6.根据权利要求5所述的基于固定化方法的以离子交换树脂为载体的脂肪酶在阿魏酸酯化反应中的应用，其特征是当以双有机试剂异辛烷/丁酮为溶剂时，异辛烷/丁酮的混合体积比为85∶15，阿魏酸用量3.0mg-20.0mg，油醇用量98mg，异辛烷/丁酮用量10mL，分子筛100mg，大孔吸附树脂固定化脂肪酶用量30-300mg，酯化反应温度65℃，摇床转速150rpm，酯化反应8天。
7.根据权利要求5所述的基于固定化方法的以离子交换树脂为载体的脂肪酶在阿魏酸酯化反应中的应用，其特征是当以纯离子液为溶剂时，加入阿魏酸用量3.0-20.0mg，纯离子液用量1.5mL、油醇用量45mg、固定化脂肪酶用量为30-200mg，酯化反应温度75℃，摇床转速为300rpm，反应6天。
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