CN105349519A - 脂肪酶固定化载体及其酶固定方法及提高拆分性能的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脂肪酶固定化载体及其固定脂肪酶的方法以及一种利用固定化脂肪酶提高手性拆分性能的方法,所述的脂肪酶固定化载体由分子结构上引入氨基的高分子载体材料与胆汁酸或胆汁酸盐脱水缩合制得。本发明所述的脂肪酶固定化载体通过胆汁酸与脂肪酶产生疏水性作用,诱导脂肪酶活性部位“盖子”打开,并与脂肪酶“盖子”内侧疏水部分作用诱使脂肪酶固定在改性高分载体材料表面,继而既提高了固定化脂肪酶的稳定性,也保证了脂肪酶的催化活性。
Description
技术领域
本发明涉及固定化脂肪酶催化手性拆分技术领域,具体涉及一种脂肪酶固定化载体及其固定脂肪酶的方法以及一种利用固定化脂肪酶提高手性拆分性能的方法。
背景技术
脂肪酶因其具有多功能性、特异选择性等特征作为生物型催化剂而广泛应用于工业生产中。然而游离型脂肪酶在有机溶剂中不稳定、易聚集结块状而失活,同时经过大批量催化生产后,后期产物分离提纯过程复杂,经济费用较高。因此为改善自由酶的催化性能,通常通过固定化技术将脂肪酶固定在载体材料表面,如硅土、陶瓷、碳纳米管材料、高分子聚合物及树脂上,继而克服脂肪酶在催化过程中存在的稳定性、重复使用性差以及产物与催化剂不易分离的问题。脂肪酶本身相对疏水,在适当的疏水性载体表面简单的物理性吸附是有效的固定化方法。脂肪酶界面吸附在疏水性载体上可引起其构象发生变化而超活化。
目前,许多报道关于对载体材料表面进行不同功能化基团改性,主要是在一些合成高分子材料表面接枝疏水性基团。如Guisan等人将多种脂肪酶固定在四种改性的疏水性载体上(丁基、辛基琼脂糖和己基、丁基树脂)水解拆分外消旋2-丁酰苯乙酸,比较各载体上脂肪酶对映体选择率E值大小;Parshad等人将Arthrobactersp脂肪酶固定在不同疏水程度的烷基化环氧丙基树脂大孔隙共聚物催化拆分外消旋乙基-3-羟基-3-苯丙酸,其对映体选择性及催化活性比自由酶均有明显提高。
胆汁酸来源于生物体内,是良好的生物型表面活性剂,根据其特殊的平面两亲性结构特征以及含羧基端的烃基长链,因此通过胆汁酸羧基端与聚合物高分子表面基团反应很容易接枝达到改性目的,并且胆汁酸其疏水面提供了与脂肪酶疏水性相互作用,诱导脂肪酶活性部位“盖子”打开,与脂肪酶“盖子”内侧疏水部分作用诱使脂肪酶固定在改性聚合物表面;其亲水面羟基团通过与底物氢键作用以及胆汁酸甾醇族骨架本身含有手性识别特征,与脂肪酶在手性拆分效果中能达成一定程度上的协调效果。基于这一因素,本发明将采用胆汁酸或胆汁酸盐作为载体改性材料制备手性选择功能载体用于脂肪酶固定化以及催化拆分外销旋化合物反应。
发明内容
为了解决有机溶剂中固定化脂肪酶稳定性差、重复使用性差、催化活性低、对映体选择率低等问题,本发明提供了一种可有效提高有机相中游离脂肪酶催化活性及稳定性的脂肪酶固定化载体。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是:一种脂肪酶固定化载体,所述的脂肪酶固定化载体由分子结构上引入氨基的高分子载体材料与胆汁酸或胆汁酸盐脱水缩合制得。
由于胆汁酸具有含羧基端或磺酸基端的烃基长链,因此其很容易通过羧基或磺酸基与分子表面含有氨基基团的高分子载体材料反应,实现接枝改性的目的。
本发明所述高分子载体材料分子表面氨基基团的引入,可采用现有技术中常用的胺基化方式。
作为优选,所述高分子载体材料为聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲脂、纤维素、尼龙、壳聚糖、海藻酸钠或硅凝胶中的至少一种。
作为优选,所述胆汁酸为胆酸、脱氧胆酸、鹅去氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺熊胆酸或甘氨胆酸中的至少一种。其中,胆酸可用缩写符号:CA表示;脱氧胆酸可用缩写符号:DCA表示;鹅去氧胆酸可用缩写符号:CDCA表示;石胆酸可用缩写符号:LCA表示;牛磺胆酸可用缩写符号:TCA表示;牛磺脱氧胆酸可用缩写符号:TDCA表示。
作为优选,所述胆汁酸盐为胆酸钠、脱氧胆酸钠、鹅去氧胆酸钠、石胆酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、牛磺熊胆酸钠或甘氨胆酸钠中的至少一种。其中,胆酸钠可用缩写符号:NaC表示;脱氧胆酸钠可用缩写符号:NaDC表示;鹅去氧胆酸钠可用缩写符号:NaCDC表示;石胆酸钠可用缩写符号:NaLC表示;牛磺胆酸钠可用缩写符号:NaTC表示;牛磺脱氧胆酸钠可用缩写符号:NaTDC表示。
基于上述的脂肪酶固定化载体材料,本发明包括一种固定化脂肪酶的制备方法,该方法为:将脂肪酶与所述的脂肪酶固定化载体按照1:1.8-1:10的比例,放置于pH为4-8的缓冲溶液中,在温度为15-60℃下反应3-20小时后,用缓冲溶液洗涤,并将制备得到固定化脂肪酶真空冷冻干燥。制备所得的固定化脂肪酶,由于改性高分子载体材料的作用,可以稳定且均匀地分散在有机溶剂中,且脂肪酶的活性部位处于打开状态。
作为优选,所述的缓冲溶液为硼酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或三羟甲基甲烷缓冲溶液中的至少一种。
作为优选,所述的脂肪酶为胰脂肪酶,所述的胰脂肪酶为猪胰脂肪酶(PPL)或柱状假丝酵母脂肪酶(CRL),所述的猪胰脂肪酶(PPL)或柱状假丝酵母脂肪酶(CRL)来源于根霉、曲霉、青霉、毛霉、假单胞菌、猪胰或牛胰中的至少一种。
基于上述的固定化脂肪酶,本发明还包括一种提高脂肪酶手性拆分性能的方法,该方法为:将利用上述方法制备所得的固定化脂肪酶加入有机溶剂中,再加入底物(R,S)-手性醇以及乙酸乙烯酯或乙酸异丙烯酯,混合均匀后,在10-55℃下,反应10-72小时,利用HPLC检测R型和S型手性醇脂的生成量,确定固定化脂肪酶的对映体选择率。
本发明利用固定化脂肪酶催化拆分手性化合物的反应机理如下式所示:以手性醇R,S-1-苯乙醇为例:在有机溶剂环己烷中,将R,S-1-苯乙醇与脂肪酶、乙酸乙烯酯混合并反应,得到产物为R型乙酸苯乙酯和S型苯乙醇,将R型乙酸苯乙酯水解即可得到R型苯乙醇。
作为优选,所述的底物(R,S)-手性醇为1-苯乙醇、薄荷醇、泛醇、雌马醇、烯唑醇、戊唑醇、己唑醇或氨基醇中的任一种。
作为优选,所述的有机溶剂为为丁烷、戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、苯、甲苯或乙苯中的至少一种。
本发明同现有技术相比具有以下优点及效果:
1、本发明所述的脂肪酶固定化载体通过胆汁酸与脂肪酶产生疏水性作用,诱导脂肪酶活性部位“盖子”打开,并与脂肪酶“盖子”内侧疏水部分作用诱使脂肪酶固定在改性高分载体材料表面,继而既提高了固定化脂肪酶的稳定性,也保证了脂肪酶的催化活性。
2、本发明所述的固定化脂肪酶中,胆汁酸具有特殊的平面两亲性结构,其亲水面羟基团通过与手性底物产生氢键作用以及胆汁酸甾醇族骨架本身含有手性识别特征,与脂肪酶在手性拆分效果中能达成一定程度上的协调效果,继而可以有效提高对手性化合物的拆分活性。
3、本发明建立了一种在非水相中提高固定化脂肪酶催化拆分外消旋化合物的方法,实现了让脂肪酶除在水环境中水解反应外的酯交换、转酯化等众多其它反应方式,充分利用脂肪酶作为生物催化剂的优点,并且手性功能载体材料作为自由酶吸附材料改善了脂肪酶在有机相中分布混乱、生成物与催化剂难以分离的缺陷。同时手性功能载体材料易合成,价格适宜,酶吸附在手性载体上,不仅热力学稳定性提高,催化拆分效果也得到了增强,并且可重复多次利用,满足了低成本、高收率的产业化模式生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为经6种胆汁酸或胆汁酸盐改性后的高分子载体材料聚丙烯腈膜ATR-IR图谱。
图2为6种脂肪酶固定化载体对猪胰脂肪酶或柱状假丝酵母脂肪酶吸附值数值图。
图3为自由酶与6种不同固定化脂肪酶对映体选择率数值图。
符号及英文翻译:PAN为聚丙烯腈;PAN-NH2为氨基聚丙烯腈;PAN-CA为胆酸改性聚丙烯腈;PAN-DCA为脱氧胆酸改性聚丙烯腈;PAN-LCA为石胆酸改性聚丙烯腈;PAN-TCA为牛磺胆酸改性聚丙烯腈;PAN-TCDA为牛磺脱氧胆酸改性聚丙烯腈;PPL为猪胰脂肪酶;CRL为柱状假丝酵母脂肪酶;freelipase自由脂肪酶。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明,以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1:
本实施例1以高分子载体材料聚丙烯腈(PAN)为例。
一种脂肪酶固定化载体,所述的脂肪酶固定化载体由分子结构上引入氨基基团的聚丙烯腈与胆汁酸盐或胆汁酸通过酸胺缩合的方式制备得到。
具体制备步骤如下:
S1:称取一定质量的聚丙烯腈加入到2mol/LNaOH溶液中,在65℃下水浴振荡2h,洗净调pH酸化,烘干,得羧基化聚丙烯腈;
S2:称取一定质量步骤S1制备得到羧基化聚丙烯腈加入无水四氢呋喃溶液中,再加入氯化亚砜,50℃油浴回流反应24h,反应毕,旋干得酰氯化聚丙烯腈,再将酰氯化聚丙烯腈加入无水四氢呋喃中,加入乙二胺,在冰水浴反应48h,洗涤烘干,得胺基化聚丙烯腈;
S3:称取0.3g胆酸用40ml无水四氢呋喃溶解,加入1g干燥的胺基化聚丙烯腈,加入0.6gDCC(N,N-二环烷基碳酰亚胺)用于脱水,冰水浴搅拌48h,取出洗净,50℃真空干燥48h,即得胆酸改性聚丙烯腈。
实施例2:一种脂肪酶固定化载体,与实施例1的区别在于,在步骤S3中,称取0.3g脱氧胆酸用40ml无水四氢呋喃溶解,加入1g干燥的胺基化聚丙烯腈,加入0.6gDCC(N,N-二环烷基碳酰亚胺)用于脱水,冰水浴搅拌48h,取出洗净,50℃真空干燥48h,即得脱氧胆酸改性聚丙烯腈。
实施例3:一种脂肪酶固定化载体,与实施例1的区别在于,在步骤S3中,称取0.3g鹅去氧胆酸用40ml无水四氢呋喃溶解,加入1g干燥的胺基化聚丙烯腈,加入0.6gDCC(N,N-二环烷基碳酰亚胺)用于脱水,冰水浴搅拌48h,取出洗净,50℃真空干燥48h,即得鹅去氧胆酸改性聚丙烯腈。
实施例4:一种脂肪酶固定化载体,与实施例1的区别在于,在步骤S3中,称取0.3g石胆酸用40ml无水四氢呋喃溶解,加入1g干燥的胺基化聚丙烯腈,加入0.6gDCC(N,N-二环烷基碳酰亚胺)用于脱水,冰水浴搅拌48h,取出洗净,50℃真空干燥48h,即得石胆酸改性聚丙烯腈。
实施例5:一种脂肪酶固定化载体,与实施例1的区别在于,在步骤S3中,称取牛磺胆酸0.5g加入30ml四氢呋喃溶解,滴加0.7ml氯化亚砜,50℃下反应2h,常温下搅拌15h。反应完全后,旋蒸除溶剂级氯化亚砜,加入干燥溶剂洗涤2次旋干加入70ml无水四氢呋喃溶解粘稠状牛磺胆酰氯,加入1g干燥的胺基化聚丙烯腈,50℃反应24h,反应毕,用四氢呋喃及清水洗涤,置于50℃下真空干燥,即得牛磺胆酸改性聚丙烯腈;
实施例6:一种脂肪酶固定化载体,与实施例1的区别在于,在步骤S3中,称取牛磺脱氧胆酸0.355g,二环己基碳二亚胺0.6g,用无水甲醇溶解,加入1g胺基化聚丙烯腈,冰水浴搅拌48h。反应毕,取出纤维,用四氢呋喃及去离子水洗涤,50℃下真空干燥48h,即得牛磺脱氧胆酸改性聚丙烯腈。
本发明实施例1中的胆酸、实施例2中的脱氧胆酸、实施例3中的鹅去氧胆酸、实施4中的石胆酸、实施例5中的牛磺胆酸、实施例6中的牛磺脱氧胆酸均可用其钠盐的形式替换,经过6种胆汁酸改性的聚丙烯腈膜的红外谱图如图1所示。
本发明所述的胆汁酸还可以为牛磺熊胆酸或甘氨胆酸,所述的牛磺熊胆酸或甘氨胆酸可替换为牛磺熊胆酸钠或甘氨胆酸钠。
本发明实施例1-6中的高分子载体材料还可选自:聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲脂、纤维素、尼龙、壳聚糖、海藻酸钠或硅凝胶中的至少一种。上述的高分子载体材料分子结构上引入氨基的方式可参有机合成领域常用的胺基化方式,此处不再赘述。
实施例7:一种固定化脂肪酶的制备方法,包括如下步骤:
S1:称取一定质量的猪胰脂肪酶或柱状假丝酵母脂肪酶于烧杯中加入一定体积pH=7.4的缓冲液配制成18mg/ml的脂肪酶溶液,置于磁力搅拌器中室温搅拌30min,后取出倒入离心管中,离心(转速10000r/min,5min),取上清液;
S2:取实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6制备好的胆汁酸改性聚丙烯腈载体0.1g于6个样品瓶反应容器中,以不加胺基化聚丙烯腈为空白对照组,用移液管移取3ml酶溶液,分别加入上述7个样品反应容器中,置于室温水浴振荡物理吸附12h,取出用缓冲液冲洗2次,而后将固定化的含脂肪酶酶纤维真空冷冻干燥10h,得到6种以胆酸改性聚丙烯腈为固定化载体的固定化脂肪酶。
本实施例7中,猪胰脂肪酶或柱状假丝酵母脂肪酶与胆汁酸改性聚丙烯腈载体的放置比例最佳选择范围为:1:1.8-1:10,反应温度在15-60℃内较为合适,反应时间范围为3-20小时,并不限于本实施例中的具体数值。
在本发明实施例7中,所述的缓冲溶液可选自:硼酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或三羟甲基甲烷缓冲溶液中的至少一种。
本发明实施例7中,所述的猪胰脂肪酶或柱状假丝酵母脂肪酶来源于根霉、曲霉、青霉、毛霉、假单胞菌、猪胰或牛胰中的至少一种。
在发明本实施例7中,6种胆汁酸改性聚丙烯腈对脂肪酶的吸附值如图2所示。
实施例8:一种提高脂肪酶手性拆分性能的方法,在实施例7制备得到的含有不同固定化脂肪酶的6个样品瓶反应容器中,移入无水环己烷2ml浸没纤维,并依次将1mmol(R,S)-1-苯乙醇及2mmol乙酸乙烯酯或2mmol乙酸异丙烯酯加入6个样品瓶反应容器中,混合均匀,密封置于37℃的恒温水浴振荡器中反应15h,转数140-150r/min;反应完成后,取出各小反应器加入5ml无水环己烷稀释反应液,后继续振荡5min,后取出静置10min,过滤反应液吸取0.2ml,经无水环己烷再次稀释5倍,高效液相色谱法(HPLC)测定R型和S型手性醇脂的生成量,确定6种固定化脂肪酶的对映体选择率,如图3所示。
在本发明实施例8中,有机溶剂环己烷可替换为:丁烷、戊烷、己烷、、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、苯、甲苯或乙苯中的至少一种。
本发明实施例8中的手性底物还可选自:薄荷醇、泛醇、雌马醇、烯唑醇、戊唑醇、己唑醇或氨基醇中的任一种。
本发明实施例8中反应温度选择范围为:10-55℃,反应时间的选择范围为:10-72小时。
此外,需要说明的是,本说明书中所描述的具体实施例,其零、部件的形状、所取名称等可以不同。凡依本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效或简单变化,均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代,只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围,均应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种脂肪酶固定化载体,其特征在于,所述的脂肪酶固定化载体由分子结构上引入氨基的高分子载体材料与胆汁酸或胆汁酸盐脱水缩合制得。
2.根据权利要求1所述的脂肪酶固定化载体,其特征在于,所述高分子载体材料为聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲脂、纤维素、尼龙、壳聚糖、海藻酸钠或硅凝胶中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的脂肪酶固定化载体,其特征在于,所述胆汁酸为胆酸、脱氧胆酸、鹅去氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺熊胆酸或甘氨胆酸中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的脂肪酶固定化载体,其特征在于,所述胆汁酸盐为胆酸钠、脱氧胆酸钠、鹅去氧胆酸钠、石胆酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、牛磺熊胆酸钠或甘氨胆酸钠中的至少一种。
5.一种利用权利要求1-4所述的脂肪酶固定化载体进行固定脂肪酶的方法,其特征在于,将脂肪酶与所述的脂肪酶固定化载体按照1:1.8-1:10的比例,放置于pH为4-8的缓冲溶液中,在温度为15-60℃下反应3-20小时后,用缓冲溶液洗涤,并将制备得到固定化脂肪酶真空冷冻干燥。
6.根据权利要求5所述的固定脂肪酶的方法,其特征在于,所述的缓冲溶液为硼酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或三羟甲基甲烷缓冲溶液中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的固定脂肪酶的方法,其特征在于,所述的脂肪酶为猪胰脂肪酶或柱状假丝酵母脂肪酶,所述的猪胰脂肪酶或柱状假丝酵母脂肪酶来源于根霉、曲霉、青霉、毛霉、假单胞菌、猪胰或牛胰中的至少一种。
8.一种提高脂肪酶手性拆分性能的方法,其特征在于,将权利要求5-7中任一种制备所得的固定化脂肪酶加入有机溶剂中,再加入底物(R,S)-手性醇以及乙酸乙烯酯或乙酸异丙烯酯,混合均匀后,在10-55℃下,反应10-72小时,利用HPLC检测R型和S型手性醇脂的生成量,确定固定化脂肪酶的对映体选择率。
9.根据权利要求8所述的提高脂肪酶手性拆分性能的方法,其特征在于,所述的底物(R,S)-手性醇为1-苯乙醇、薄荷醇、泛醇、雌马醇、烯唑醇、戊唑醇、己唑醇或氨基醇中的任一种。
10.根据权利要求9所述的提高脂肪酶手性拆分性能的方法,其特征在于,所述的有机溶剂为为丁烷、戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、苯、甲苯或乙苯中的至少一种。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160224 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |