CN109234262A - 一种载体造粒技术制备固定化酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于固定化酶制备技术领域，具体涉及一种载体造粒技术制备固定化酶的新方法。本方法利用低廉易得的载体，将酶蛋白分子吸附于载体表面得到粉末状的固定化酶；在海藻酸钠溶液的作用下，经造粒技术使固定化酶实现由粉末到颗粒的转变；再经过钙化工艺使颗粒状固定化酶表面形成硬度较强的海藻酸钙薄膜结构，保证了固定化酶颗粒结构的硬度和机械强度。本发明制备的固定化酶具有更好的稳定性、刚性及溶剂耐受性，在正己烷，甲醇等溶剂存在的条件下，重复使用十几批以后仍保留着80％以上的酶活，并且颗粒形态较好，无明显松散现象。相比于商业化固定化酶具有原料成本低廉、方法操作简单、易于产业化等优点。

Description

一种载体造粒技术制备固定化酶的方法
技术领域：
本发明属于固定化酶制备技术领域，具体涉及一种载体造粒技术制备固定化酶的新方法。
背景技术：
酶催化反应条件温和，而且具有高度的特异性，副产物少，这使得它在生物技术领域非常的重要和受欢迎。市场上的商品化的酶主要是水解酶，如蛋白酶、淀粉酶、酰胺酶和脂肪酶。事实上，据报道三分之一的生物转化是由脂肪酶来完成的，基于脂肪酶的市场价值，它被誉为是在蛋白酶和糖酶之后的第三大酶组。脂肪酶作为添加剂应用于食品、制药、医疗检测、化妆品、皮革加工、乳制品、精细加工、洗涤剂、造纸和污水处理行业等等。不同来源的脂肪酶被广泛用于催化水解反应、醇解反应、酯化反应和转酯化反应当中。但是游离酶存在催化稳定性差、重复利用率低、强酸强碱及高温条件易失活等问题，因此固定化工艺成为了研究人员提高酶活性和稳定性的重要研究方向。
载体与固定化方法的选择是固定化酶工艺的两个重要研究问题。载体材料性能与结构的选择，对固定化酶的性能影响巨大。目前公开的专利介绍以天然多孔材料、改性材料、磁性微球、各类凝胶、合成树脂等单一载体进行脂肪酶的固定化(CN201310495368.5、CN201410614900.5、CN201410263491.9、CN201410534346.X等)，取得了一定的成果，但过程也存在载体制备工艺较复杂，载体不易回收的问题。为提高游离酶活性，研究人员主要采用吸附法、包埋法、共价结合法和交联法等对游离酶进行固定。吕明等人公开了一种磁驱固定化酶，延长酶使用时间，赋予固定化酶磁释放、驱动和回收能力，可以在大水体催化反应中得到应用(CN201410114538.5)；赵仕林等人公开了一种以大孔珠状交联聚合物为载体固定化猪胰脂肪酶，该方法制备固定化时间短，固定效率高，并具有较高的稳定性和表观活性(CN200910058377.1)；杨万泰等人公开了一种聚合物基材表面固定化酶的方法，该凝胶/基材复合结构提高了交联网络的机械强度，克服了凝胶网络易被破坏的缺点(CN201210421203.9)；于洪巍等人公开了一种磁性共价固定化酶载体的制备方法，实现了载体与酶分子间的共价偶氮连接，酶装载量高达250mg/g，固定化酶几乎能100％保留原酶性(CN201110201473.4)。但是磁驱载体、大孔交联聚合物、聚合物基材等载体材料制备过程复杂，原料昂贵，不利于产业化。
因此设计和开发性能优异、符合特定需求的载体材料及固定化方法是目前固定化酶研究领域的重点和热点。
发明内容：
本发明旨在解决现有固定化酶所用载体材料制备过程复杂、原料成本高等问题，提供一种载体造粒技术制备固定化酶的新方法。本方法利用低廉易得的载体，将酶蛋白分子吸附于载体表面得到粉末状的固定化酶；在海藻酸钠溶液的作用下，经造粒技术使固定化酶实现由粉末到颗粒的转变；再经过钙化工艺使颗粒状固定化酶表面形成硬度较强的海藻酸钙薄膜结构，保证了固定化酶颗粒结构的硬度和机械强度。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案具体如下：一种载体造粒技术制备固定化脂肪酶的方法，所述制备方法包括以下步骤；
(1)酶与载体的吸附：将脂肪酶充分溶解在缓冲溶液中，按游离酶粉和载体的质量比为1：5～1：3加入粉末状载体，在摇床中吸附固定0.5h～6h，离心晾干，得到粉末状固定化酶；
进一步地，所述载体为天然纤维素类材料，如稻草、稻壳、秸秆、竹粉、芦苇、木屑等；
进一步地，所述载体为无机固定化载体，如硅藻土、活性炭等；
进一步地，所述载体为有机固定化载体，如凝胶、树脂等；
进一步地，所述缓冲溶液的pH为6.0～8.0；
优选地，吸附固定的温度为20℃～55℃；摇床转速为150rpm～220rpm；
(2)粉末状固定化酶的造粒：将步骤(1)得到的粉末状固定化酶加入海藻酸钠溶液，经造粒得到颗粒状的固定化酶；
所述造粒的方法包括但不限于湿法造粒和挤出造粒技术；
优选地，所述海藻酸钠溶液浓度为：0.5％～4％；
(3)颗粒状固定化酶的钙化：将步骤(2)得到的固定化酶颗粒加入到氯化钙溶液中，在摇床中反应10min～120min后取出晾干，得到钙化的固定化酶颗粒；
优选地，氯化钙浓度为0.1％～2％；钙化温度为20℃～55℃；摇床转速为150rpm～220rpm；
(4)固定化酶颗粒的筛分；对步骤(3)得到的钙化固定化酶过筛网进行筛分，取合适孔径规格的固定化酶即为成品固定化酶；
优选地，酶颗粒筛分范围为5目～100目。
有益效果：
本发明提供了一种载体造粒技术制备固定化酶的新方法，采用该方法制备的固定化酶具有吸附效果好，稳定性强、重复利用率较高、催化适用性广等优点。
(1)本发明运用造粒技术制备固定化酶，该方法制备的固定化酶具有多孔结构，比表面积大，促进了酶与底物的接触，有助于提高反应速率及最终转化率。
(2)本发明运用造粒技术制备固定化酶，载体表面形成了一种耐水耐有机试剂的薄膜，并且海藻酸钙的形成极大地提高了固定化酶的硬度和机械强度，最大限度的保留酶的原有形貌及活性，提高了酶的稳定性和重复利用率。
(3)本发明运用造粒技术制备固定化酶，该固定化酶催化体系较广，在油脂水解、酯化及转酯化工艺中均有较好的应用效果。
(4)本发明运用造粒技术制备固定化酶，通过氢键等分子间作用力对酶进行吸附固定，工艺操作简单，同时使用载体材料成本低，易于产业化。
(5)本发明所选载体为天然纤维素类材料时，天然载体相比现有技术中酸碱预处理后的载体而言，在固定化效果上差异不大，本发明直接选用天然材料作为载体，节约成本，减少环境污染。
(6)本技术制备的颗粒状固定化酶便于回收，且固定化酶的钙化工艺极大地提高了固定化酶的硬度、机械强度、表面多孔结构和稳定性，进而增加脂肪酶的重复使用批次；增强了固定化酶在催化高水含量及有机溶剂反应体系的耐受性，故而适用于更多的反应体系。除此之外，本专利涉及的载体选择性广泛，当使用纤维素类天然生物材料作为载体时，效果尤为突出，天然载体材料量大易得，不仅符合绿色化学的追求，并且经济成本低，利于产业化生产。
附图说明：
图1本发明制备的固定化酶结构示意图。
具体实施方式：
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了解决现有固定化酶所用载体材料制备过程复杂、原料成本高等问题，本发明提供一种载体造粒技术制备固定化脂肪酶的新方法，本方法利用低廉易得的载体，将酶蛋白分子吸附于载体表面得到粉末状的固定化酶；在海藻酸钠溶液的作用下，经造粒技术使固定化酶实现由粉末到颗粒的转变，便于酶的回收利用；再经过钙化工艺使颗粒状固定化酶表面形成硬度较强的海藻酸钙薄膜结构，保证了固定化酶颗粒结构的硬度和机械强度。本发明制备的固定化酶结构示意图见附图1，首先酶蛋白以氢键等分子作用力与粉末状的载体结合，然后加入一定浓度的海藻酸钠溶液，利用造粒技术实现固定化酶由粉末状到颗粒状的转变，待颗粒状固定化酶风干后，置于一定浓度的氯化钙溶液中进行钙化，在颗粒状固定化酶表面形成一层海藻酸钙薄膜。
本申请制备的固定化酶相比于文献报道固定化酶具有更好的稳定性、刚性及溶剂耐受性，在正己烷，甲醇等溶剂存在的条件下，重复使用十几批以后仍保留着80％以上的酶活，并且颗粒形态较好，无明显松散现象。相比于商业化固定化酶具有原料成本低廉、方法操作简单、易于产业化等优点。
以下将对本发明提供的固定化酶技术进行进一步地说明：
一种载体造粒技术制备固定化酶的新方法，所述制备方法包括以下步骤；
(1)酶与载体的吸附：将脂肪酶充分溶解在缓冲溶液中，按游离酶粉和载体的质量比为1：5～1：3加入粉末状载体，在摇床中吸附固定0.5h～6h，离心晾干，得到粉末状固定化酶；
本步骤的目的是将蛋白通过氢键等分子间作用力稳定吸附在载体表面；
本发明所使用的载体为天然纤维素类材料，如稻草、稻壳、秸秆、竹粉、芦苇、木屑等；将上述材料用高速组织捣碎机以8000rpm/min的速度间歇捣碎6min，得到颗粒直径为0.05mm～0.074mm的粉末状载体，以备使用。
本发明还可以使用无机固定化载体，如硅藻土、活性炭等；或有机固定化载体，如凝胶、树脂等；
溶解脂肪酶所使用的缓冲液可以为Tris-HCl、巴比妥钠-HCl、硼酸-硼砂、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸盐缓冲液中的一种或多种，缓冲溶液的pH为6.0～8.0；
固定化温度均为20℃～55℃；摇床转速为150rpm～220rpm；
本申请所使用的脂肪酶可以来源于动物、植物或微生物，可选脂肪酶如动物脂肪酶：猪胰脂肪酶；如植物脂肪酶：GDSL脂肪酶，GxSxG脂肪酶；如原核微生物脂肪酶：来自Pseudomonas aeruginosa lipase、Pseudomonas fluorescens lipase、Bacillussubtilis lipase、Serratiamarcescens lipase等菌类脂肪酶；如真核微生物脂肪酶：来自ThermomycesLanuginosu lipase、Rhizomucormiehei lipase、Candida AntarcticalipaseB、Candida rugose lipase、Yarrowialipolytica lipase 2等真菌脂肪酶。
(2)粉末状固定化酶的造粒：将步骤(1)得到的粉末状固定化酶，加入到0.5％～4％浓度的海藻酸钠溶液中，经造粒得到颗粒状的固定化酶；海藻酸钠溶液的添加量视浓度而定，标准是颗粒成型，一般是1g酶中加7～9ml的海藻酸钠溶液；
本步骤目的是加入海藻酸钠对吸附固定化酶粉进行包埋，利用造粒技术完成固定化酶由粉末到颗粒的转变；
本发明所采用的造粒技术包括但不限于湿法造粒和挤出造粒技术；
湿法造粒：固体饮料常用凝聚造粒方法之一，其原理是：加水将粉体粒子表面湿润，使粉体互相粘结，而后过筛干燥形成固体颗粒。本专利采用湿法造粒技术实现了不同领域技术的迁移，完成了固定化酶的制备。
挤出造粒技术：利用压力使固体物料进行团聚的干法造粒过程，固体物料在受到挤压时，首先排除粉粒间的空气使粒子重新排列，以消除物料间的空隙。
(3)颗粒状固定化酶的钙化：将步骤(2)得到的固定化酶颗粒加入到氯化钙溶液中，在摇床中反应10min～120min后取出晾干，得到钙化的固定化酶颗粒；
本步骤的目的是使固定化酶表面的海藻酸钠分子转变为高硬度的网状海藻酸钙分子，提高了固定化酶的机械强度，增加该固定化酶对水和有机试剂的耐受性，进而提高酶的稳定性及使用寿命；
所采用的氯化钙浓度可以为0.1％～2％；钙化温度均为20℃～55℃；摇床转速为150rpm～220rpm；
(4)固定化酶颗粒的筛分；对步骤(3)得到的钙化固定化酶过筛网进行筛分，取合适孔径规格的固定化酶即为成品固定化酶；
本步骤的目的是制备一定规格的固定化酶颗粒，粒度大的固定化酶可以粉碎再筛分，粒度小的颗粒可以进行再次造粒钙化工艺，实现固定化酶的二次制备。
筛分设备可选择振动筛、惯性筛、胶辊筛、共振筛等，酶颗粒筛分范围为5目～100目。
上述方法制备的固定化酶应用体系包括：水解反应体系、酯化体系和转酯化体系，如大豆油水解工艺、月桂酸正辛酯合成工艺、蜡酯合成工艺、脂肪酸合成生物柴油工艺等、地沟油底物合成生物柴油工艺、结构脂OPO合成工艺等。
下文将结合具体实施例以进一步详细阐述本发明的载体造粒技术制备固定化酶的新方法。
实施例1：一种以凝胶为载体经湿法造粒技术制备固定化酶的方法
(1)称取1g游离脂肪酶粉(5000U/g)Yarrowialipo lytica lipase 2充分溶解在pH＝6.5的磷酸盐缓冲溶液中，再加入3g凝胶混合均匀，于30℃，180rpm摇床中吸附固定化3h，然后在8000rpm，4℃的条件下离心10min，取出下层沉淀晾干，得到粉末状固定化酶；
(2)将步骤(1)得到的粉末状固定化酶在电动搅拌机的作用下加入1％的海藻酸钠溶液(7.5mL)造粒，搅拌桨转速为450rpm，固定化酶由粉末状变为颗粒状，将得到的酶颗粒晾干，得到固定化酶颗粒；
(3)将步骤(2)得到的固定化酶颗粒浸泡在1％的氯化钙溶液中，于30℃，180rpm摇床中反应30min，取出晾干，过40目筛网，得到颗粒大小均匀的固定化酶成品。
固定化酶大豆油水解工艺催化性能的验证：
在100mL具塞锥形瓶中加入15g大豆油，3mL 0.05M PBS缓冲液(pH＝7.0)，于40℃摇床预热5min，加入0.6g的上述固定化酶，在40℃，160rpm的条件下反应30h。取样进气相色谱，分析产物(脂肪酸)的组分含量，由结果可知，单批转化率最高达91.49％，且重复使用十批后，转化率仍维持在70％以上。
实施例2：一种以稻壳为载体经湿法造粒技术制备固定化酶的方法
(1)称取1g游离脂肪酶粉(5000U/g)Yarrowia lipolytica lipase 2充分溶解在pH＝6的磷酸盐缓冲溶液中，再加入5g稻壳粉末混合均匀，于20℃，150rpm摇床中吸附固定化0.5h，然后在8000rpm，4℃的条件下离心10min，取出下层沉淀晾干，得到粉末状固定化酶；
(2)将步骤(1)得到的粉末状固定化酶在电动搅拌机的作用下加入0.5％的海藻酸钠溶液(7mL)造粒，搅拌桨转速为450rpm，固定化酶由粉末状变为颗粒状，将得到的酶颗粒晾干，得到固定化酶颗粒；
(3)将步骤(2)得到的固定化酶颗粒浸泡在0.1％的氯化钙溶液中，于55℃，220rpm摇床中反应10min，取出晾干，过40目筛网，得到颗粒大小均匀的固定化酶成品。
固定化酶大豆油水解工艺催化性能的验证：
在100mL具塞锥形瓶中加入15g大豆油，3mL 0.05M PBS缓冲液(pH＝7.0)，于40℃摇床预热5min，加入0.6g的上述固定化酶，在40℃，160rpm的条件下反应30h。取样进气相色谱，分析产物(脂肪酸)的组分含量。由结果可知，单批转化率最高达85.27％，且重复使用十批后，转化率仍维持在65％以上。
实施例3：一种以木屑为载体经湿法造粒技术制备固定化酶的方法
(1)称取1g游离脂肪酶粉(6500U/g)Candida Antarctica lipase B充分溶解在pH＝7的磷酸盐缓冲溶液中，再加入4g木屑粉末混合均匀，于30℃，180rpm摇床中吸附固定化2h，然后在8000rpm，4℃的条件下离心10min，取出下层沉淀晾干，得到粉末状固定化酶；
(2)将步骤(1)得到的粉末状固定化酶在电动搅拌机的作用下加入1.5％的海藻酸钠溶液(8mL)造粒，搅拌桨转速为300rpm，固定化酶由粉末状变为颗粒状，将得到的酶颗粒晾干，得到固定化酶颗粒；
(3)将步骤(2)得到的固定化酶颗粒浸泡在1.5％的氯化钙溶液中，于30℃，180rpm摇床中反应60min，取出晾干，过20目筛网，得到颗粒大小均匀的固定化酶成品。
固定化酶在催化脂肪酸合成生物柴油工艺中酯化性能的验证：
在100mL具塞锥形瓶中加入12g实施例1中水解提纯的脂肪酸，等摩尔量的甲醇在3h内分四次流加到反应瓶中，加入0.12g的上述固定化酶，在40℃，200rpm的条件下反应6h。取样进气相色谱，分析产物(脂肪酸甲酯)的组分含量。由结果可知，单批转化率最高达95.39％，且重复使用十批后，转化率仍维持在85％以上。
实施例4：一种以木屑为载体经湿法造粒技术制备固定化酶的方法
(1)称取1g游离脂肪酶粉(6500U/g)Candida Antarctica lipase B充分溶解在pH＝8的磷酸盐缓冲溶液中，再加入4g木屑粉末混合均匀，于55℃，220rpm摇床中吸附固定化6h，然后在8000rpm，4℃的条件下离心10min，取出下层沉淀晾干，得到粉末状固定化酶；
(2)将步骤(1)得到的粉末状固定化酶在电动搅拌机的作用下加入4％的海藻酸钠溶液(9mL)造粒，搅拌桨转速为300rpm，固定化酶由粉末状变为颗粒状，将得到的酶颗粒晾干，得到固定化酶颗粒；
(3)将步骤(2)得到的固定化酶颗粒浸泡在2％的氯化钙溶液中，于20℃，150rpm摇床中反应120min，取出晾干，过20目筛网，得到颗粒大小均匀的固定化酶成品。
固定化酶在催化脂肪酸合成生物柴油工艺中酯化性能的验证：
在100mL具塞锥形瓶中加入12g实施例1中水解提纯的脂肪酸，等摩尔量的甲醇在3h内分四次流加到反应瓶中，加入0.12g的上述固定化酶，在40℃，200rpm的条件下反应6h。取样进气相色谱，分析产物(脂肪酸甲酯)的组分含量。由结果可知，单批转化率最高达92.46％，且重复使用十批后，转化率仍维持在83％以上。
实施例5：一种以秸秆为载体经湿法造粒技术制备固定化酶的方法
(1)称取1g游离酶粉(5000U/g)Candida Antarctic lipaseB充分溶解在pH＝7.5的磷酸盐缓冲溶液中，再加入5g秸秆粉末混合均匀，于30℃，180rpm摇床中吸附固定化6h，然后在8000rpm，4℃的条件下离心10min，取出下层沉淀晾干，得到粉末状固定化酶；
(2)将步骤(1)得到的粉末状固定化酶在电动搅拌机的作用下加入2％的海藻酸钠溶液(8.2mL)造粒，搅拌桨转速为400rpm，固定化酶由粉末状变为颗粒状，将得到的酶颗粒晾干，得到固定化酶颗粒；
(3)将步骤(2)得到的固定化酶颗粒浸泡在0.75％的氯化钙溶液中，于30℃，180rpm摇床中反应90min，取出晾干，过30目筛网，得到颗粒大小均匀的固定化酶成品。
固定化酶蜡酯合成工艺中的酯化性能验证：
在50ml具塞锥形瓶中加入10g油酸，8.58g十六醇，于55℃摇床体系中预热5min，加入1g的上述固定化酶，在55℃，200rpm的条件下反应10h。取样进气相色谱，分析产物(蜡酯)的组分含量。由实验结果可知，单批转化率最高达96.27％，且重复使用十五批后，转化率仍维持在85％以上。
实施例6：一种以竹粉(未处理)为载体经湿法造粒技术制备固定化酶的方法
(1)称取1g游离酶粉(5000U/g)Yarrowialipo lytica lipase 2充分溶解在pH＝7的磷酸盐缓冲溶液中，再加入3g粉末状竹粉混合均匀，于30℃，180rpm摇床中吸附固定化3h，然后在8000rpm，4℃的条件下离心10min，取出下层沉淀晾干，得到粉末状固定化酶；
(2)将步骤(1)得到的粉末状固定化酶在电动搅拌机的作用下加入1％的海藻酸钠溶液(7.5mL)造粒，搅拌桨转速为300rpm，固定化酶酶由粉末状变为颗粒状，将得到的酶颗粒晾干，得到固定化酶颗粒；
(3)将步骤(2)得到的固定化酶颗粒浸泡在0.1％的氯化钙溶液中，于30℃，180rpm摇床中反应30min，取出晾干，过40目筛网，得到颗粒大小均匀的固定化酶成品。
固定化酶月桂酸正辛酯合成工艺中的酯化性能验证：
在50mL具塞锥形瓶中加入0.2g月桂酸，316μL正辛醇，9.5mL正己烷，于40℃摇床预热5min，加入0.1g的上述固定化酶，在40℃，160rpm的条件下反应2h。取样进气相色谱，分析产物(月桂酸正辛酯)的组分含量。由实验结果可知，单批转化率最高达92.035％，且重复使用十三批后，转化率仍维持在82％以上。
实施例7：一种以酸液预处理后竹粉为载体经湿法造粒技术制备固定化酶的方法
(1)将竹粉与0.75％的硫酸按1g/10mL的料液比混合，在室温下于高压灭菌锅中120℃的条件下预处理1h，然后4000r/min离心15min，弃去上清，固体残渣水洗至中性后于烘箱烘干待用；
(2)称取1g游离酶粉(5000U/g)Yarrowialipo lytica lipase 2充分溶解在pH＝7的磷酸盐缓冲溶液中，再加入3g酸处理后竹粉混合均匀，于30℃，180rpm摇床中吸附固定化3h，然后在8000rpm，4℃的条件下离心10min，取出下层沉淀晾干，得到粉末状固定化酶；
(3)将步骤(2)得到的粉末状固定化酶在电动搅拌机的作用下加入1％的海藻酸钠溶液(7.5mL)造粒，搅拌桨转速为300rpm，固定化酶酶由粉末状变为颗粒状，将得到的酶颗粒晾干，得到固定化酶颗粒；
(4)将步骤(3)得到的固定化酶颗粒浸泡在0.1％的氯化钙溶液中，于30℃，180rpm摇床中反应30min，取出晾干，过40目筛网，得到颗粒大小均匀的固定化酶成品。
固定化酶月桂酸正辛酯合成工艺中的酯化性能验证：
在50mL具塞锥形瓶中加入0.2g月桂酸，316μL正辛醇，9.5mL正己烷，于40℃摇床预热5min，加入0.1g的上述固定化酶，在40℃，160rpm的条件下反应2h。取样进气相色谱，分析产物(月桂酸正辛酯)的组分含量。由实验结果可知，单批转化率最高达94.245％，且重复使用十三批后，转化率仍维持在83％以上。
实施例8：一种以碱液预处理竹粉为载体经湿法造粒技术制备固定化酶的方法
(1)将竹粉与0.1M的氢氧化钠按1g/20mL的料液比混合，在室温条件下于高压蒸汽灭菌锅120℃的条件下预处理1h，然后4000r/min离心15min，弃去上清，固体残渣水洗至中性后于烘箱烘干待用。
(2)称取1g游离酶粉(5000U/g)Yarrowialipo lytica lipase 2充分溶解在pH＝7的磷酸盐缓冲溶液中，再加入3g碱处理过的上述竹粉混合均匀，于30℃，180rpm摇床中吸附固定化3h，然后在8000rpm，4℃的条件下离心10min，取出下层沉淀晾干，得到粉末状固定化酶；
(3)将步骤(2)得到的粉末状固定化酶在电动搅拌机的作用下加入1％的海藻酸钠溶液(7.5mL)造粒，搅拌桨转速为300rpm，固定化酶酶由粉末状变为颗粒状，将得到的酶颗粒晾干，得到固定化酶颗粒；
(4)将步骤(3)得到的固定化酶颗粒浸泡在0.1％的氯化钙溶液中，于30℃，180rpm摇床中反应30min，取出晾干，过40目筛网，得到颗粒大小均匀的固定化酶成品。
固定化酶月桂酸正辛酯合成工艺中的酯化性能验证：
在50mL具塞锥形瓶中加入0.2g月桂酸，316μL正辛醇，9.5mL正己烷，于40℃摇床预热5min，加入0.1g的上述固定化酶，在40℃，160rpm的条件下反应2h。取样进气相色谱，分析产物(月桂酸正辛酯)的组分含量。由实验结果可知，单批转化率最高达93.261％，且重复使用十三批后，转化率仍维持在82.76％以上。
实施例6、7、8的对比数据说明，在本发明中，对天然纤维素类材料的载体来说，是否对载体进行酸、碱预处理，对于固定化酶产品的活性以及使用寿命并无明显影响。
实施例9：一种以硅藻土为载体经湿法造粒技术制备固定化酶的方法
(1)称取15g游离酶粉(5000U/g)Pseudomonas fluorescens lipase充分溶解在pH＝7的磷酸盐缓冲溶液中，再加入45g硅藻土混合均匀，于30℃，180rpm摇床中吸附固定化2h，然后在8000rpm，4℃的条件下离心10min，取出下层沉淀晾干，得到粉末状固定化酶；
(2)将步骤(1)得到的粉末状固定化酶在电动搅拌机的作用下加入1.2％的海藻酸钠溶液(7.6mL)造粒，搅拌桨转速为350rpm，固定化酶由粉末状变为颗粒状，将得到的酶颗粒晾干，得到固定化酶颗粒；
(3)将步骤(2)得到的固定化酶颗粒浸泡在0.5％的氯化钙溶液中，于30℃，180rpm摇床中反应30min，取出晾干，过40目筛网，得到颗粒大小均匀的固定化酶成品。
固定化酶催化地沟油合成生物柴油工艺的转酯化性能验证：
在10L搅拌式反应罐中加入5L酸价为112mgKOH/g的地沟油(购自上海绿铭科技环保股份有限公司)，并以柱塞泵向反应罐中流加723mL甲醇，甲醇经20h流加完，加水量3％(W水/W油)，添加50g制备的上述固定化酶，控制搅拌式反应罐在温度40℃、220rpm条件下反应30h，取样进气相色谱，分析产物(长链脂肪酸甲酯)的组分含量。由实验结果可知，单批转化率最高达90.61％，且重复使用8批后，转化率仍维持在72％以上。
实施例10：一种以竹粉为载体利用吸附法制备固定化酶的方法
称取1g游离酶粉(5000U/g)猪胰脂肪酶充分溶解在pH＝8的磷酸盐缓冲溶液中，再加入3g竹粉混合均匀，于30℃，180rpm摇床中吸附固定化4h，然后在8000rpm，4℃的条件下离心10min，取出下层沉淀晾干，得到粉末状固定化酶；
固定化酶在结构脂OPO合成工艺中的转酯化性能验证：
在50mL具塞锥形瓶中加入三棕榈酸甘油酯(PPP)20g，同时称取60g油酸乙酯，放置于70℃水浴锅中加热溶解。底物溶解后放入转速为200rpm、50℃的摇床中，待反应底物温度恒定后向锥形瓶中添加2g的上述固定化脂肪酶，转酯化反应24h后，单批OPO结构脂的产率单批转化率达39.28％，但由于此时的固定化酶仍为粉末状，难于回收再利用。
实施例11：一种以竹粉为载体利用包埋法制备固定化酶的方法：
称取1g游离酶粉(5000U/g)猪胰脂肪酶充分溶解在pH＝8的磷酸盐缓冲溶液中，再加入1％海藻酸钠混合均匀，将混合液用注射器注入浓度为1％的氯化钙溶液中，得到球状的固定化酶。
固定化酶在结构脂OPO合成工艺中的转酯化性能验证：
在50mL具塞锥形瓶中加入三棕榈酸甘油酯(PPP)20g，同时称取60g油酸乙酯，放置于70℃水浴锅中加热溶解。底物溶解后放入转速为200rpm、50℃的摇床中，待反应底物温度恒定后向锥形瓶中添加2.5g的上述固定化脂肪酶，转酯化反应24h后，单批OPO结构脂的产率最高达35.28％，且重复使用5批后，OPO产率仍维持在30％以上。
实施例12：一种以竹粉为载体经挤出造粒技术制备固定化酶的方法：
(1)称取1g游离酶粉(5000U/g)猪胰脂肪酶充分溶解在pH＝8的磷酸盐缓冲溶液中，再加入3g竹粉混合均匀，于30℃，180rpm摇床中吸附固定化4h，然后在8000rpm，4℃的条件下离心10min，取出下层沉淀晾干，得到粉末状固定化酶；
(2)将步骤(1)得到的粉末状固定化酶加入1％的海藻酸钠溶液进行混合，混匀后缓慢挤压混合物使其通过40目孔径的筛网，同时快速切割过网的柱状酶载体，使固定化酶由粉末状变为颗粒状，将得到的酶颗粒晾干，得到固定化酶颗粒；
(3)将步骤(2)得到的固定化酶颗粒浸泡在1％的氯化钙溶液中，于30℃，180rpm摇床中反应60min，取出晾干，过40目筛网，得到颗粒大小均匀的固定化酶成品。
固定化酶在结构脂OPO合成工艺中的转酯化性能验证：
在50mL具塞锥形瓶中加入三棕榈酸甘油酯(PPP)20g，同时称取60g油酸乙酯，放置于70℃水浴锅中加热溶解。底物溶解后放入转速为200rpm、50℃的摇床中，待反应底物温度恒定后向锥形瓶中3g的上述固定化脂肪酶，转酯化反应24h后，单批OPO结构脂的产率最高达48.35％，且重复使用10批后，OPO产率仍维持在38％以上。
实施例10、11、12的对比数据说明(注：三个实施例中加入了等效价的固定化酶)，在本发明中，吸附和包埋法相结合而制备得的固定化酶性能要优于单独使用吸附法和包埋法制备的固定化酶性能。在吸附操作中，酶蛋白通过氢键结合在载体上，在保留较高酶活的基础上实现了游离酶粉的固定化；包埋操作解决了吸附步骤酶蛋白与载体结合不牢固，易脱落的弊端，钙化形成的海藻酸钙薄膜一方面减少了酶蛋白的泄露，另一方面也提高了固定化酶的机械强度，从而提高了固定化酶的使用寿命。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种载体造粒技术制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤；
(1)酶与载体的吸附：将脂肪酶溶解在缓冲溶液中，按游离酶粉和载体的质量比为1：5～1：3加入粉末状载体，吸附固定0.5h～6h，离心晾干，得到粉末状固定化酶；
(2)粉末状固定化酶的造粒：将步骤(1)得到的粉末状固定化酶加入海藻酸钠溶液，经造粒得到颗粒状的固定化酶；
(3)颗粒状固定化酶的钙化：将步骤(2)得到的固定化酶颗粒加入到氯化钙溶液中，在摇床中反应10min～120min后取出晾干，得到钙化的固定化酶颗粒；
(4)固定化酶颗粒的筛分；对步骤(3)得到的钙化固定化酶过筛网进行筛分，取合适孔径规格的固定化酶即为成品固定化酶。
2.如权利要求1所述的一种载体造粒技术制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述载体为天然纤维素类材料。
3.如权利要求2所述的一种载体造粒技术制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述天然纤维素类材料为稻草、稻壳、秸秆、竹粉、芦苇或木屑。
4.如权利要求1所述的一种载体造粒技术制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述载体为无机固定化载体或有机固定化载体。
5.如权利要求4所述的一种载体造粒技术制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述载体为硅藻土、活性炭、凝胶或树脂。
6.如权利要求1所述的一种载体造粒技术制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于，步骤(1)吸附固定的温度为20℃～55℃；采用摇床吸附固定的摇床转速为150rpm～220rpm。
7.如权利要求1所述的一种载体造粒技术制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于，步骤(2)所述造粒的方法为湿法造粒或挤出造粒。
8.如权利要求1所述的一种载体造粒技术制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于，步骤(2)中海藻酸钠溶液浓度为0.5％～4％。
9.如权利要求1所述的一种载体造粒技术制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于，步骤(3)中氯化钙溶液浓度为0.1％～2％；钙化温度为20℃～55℃；摇床转速为150rpm～220rpm。
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