CN111593042B - 一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法 - Google Patents

一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法,包括以下步骤:S1、将稻壳粉经过碱处理,得到改性稻壳粉;S2、将所述改性稻壳粉与海藻酸钠溶液、葡萄糖氧化酶溶液混合均匀,得到混合液;S3、将所述混合液缓慢滴入氯化钙溶液中,水浴加热固定化,过滤后将得到的胶珠洗涤、干燥,得到固定化葡萄糖氧化酶。本发明制得的固定化葡萄糖氧化酶具有高回收率,而且贮藏稳定性以及操作稳定性好,具有良好的应用前景。

Description

一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及固定化酶技术领域,尤其涉及一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法。
背景技术
葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)是一种氧化还原酶,对葡萄糖具有高特异性、低氧化还原电位和良好的热稳定性,能够专一性地催化β-D-葡糖生成β-D-葡萄糖酸和H2O2。葡萄糖氧化酶应用广泛,可用于纺织漂白、食品和烘焙工业、可以代替金属催化剂生产葡萄糖酸盐,还可以在葡萄糖/氧气生物燃料电池或自功率传感器中作为糖尿病管理葡萄糖传感器得到应用。但在实际应用中,温度、pH等环境因素影响着葡萄糖氧化酶的稳定性,不仅如此,未固定的葡萄糖氧化酶不具有重复使用性,也很难从反应体系分离,增加了使用的成本。
固定化酶与游离酶相比,可以重复利用,通过底物不断的参与反应,可以大大提高催化生产效率,同时,固定化酶还具有操作更稳定、易于分离和回收、操作可控等一系列优点,是目前酶研究领域的重点。用于固定化的载体材料需满足安全性、稳定性、亲水性、机械强度、生物相容性和环境友好性等的特殊要求,目前使用较多的为无机材料、有机材料和高分子材料等。随着绿色化学的发展,农业废弃物作为固定化材料的研究越来越多。农业废弃物多富含纤维素和木质素等,纤维素具有较强的吸附能力,其结构中的羟基也有利于对酶的固定化。其中,稻壳具有多孔性、低密度、耐降解等优势,且无毒无害、来源广泛,是一种具有应用前景的纤维素类酶固定化载体材料。但是,稻壳作为葡萄糖氧化酶的固定载体,还存在着固定化效率低、贮存稳定性和操作稳定性较差的问题,使其的实际应用受到限制。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题,本发明提出了一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法。
本发明提出的一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法,包括以下步骤:
S1、将稻壳粉经过碱处理,得到改性稻壳粉;
S2、将所述改性稻壳粉与海藻酸钠溶液、葡萄糖氧化酶溶液混合均匀,得到混合液;
S3、将所述混合液缓慢滴入氯化钙溶液中,水浴加热固定化,过滤后将得到的胶珠洗涤、干燥,得到固定化葡萄糖氧化酶。
优选地,所述步骤S1中,稻壳粉在碱处理之后,还包括进行超临界CO2处理,得到改性稻壳粉。
优选地,所述超临界CO2处理的具体方法为:将碱处理后的稻壳粉置于超临界CO2中,在70-130℃、15-25MPa的条件下处理10-20min,即可。
优选地,所述步骤S1中,碱处理的具体步骤为:将稻壳粉加入氢氧化钠溶液中,在室温下搅拌反应1-3h,经过洗涤、干燥,得到改性稻壳粉;稻壳粉的质量与氢氧化钠溶液的体积之比为(0.5-1.5)g:10mL;稻壳粉为40-100目;氢氧化钠溶液的浓度为5-6.5mol/L。
优选地,所述混合液中,改性稻壳粉的含量为0.03-0.08g/mL,海藻酸钠的质量浓度为1.5-2%,葡萄糖氧化酶的质量浓度为1-1.5%。
优选地,所述氯化钙溶液的质量浓度为4-8%。
优选地,所述步骤S3中,水浴加热固定化的温度为30-40℃,固定化时间为20-40min。
一种固定化葡萄糖氧化酶,由所述的制备方法制得。
本发明的有益效果如下:
本发明通过将稻壳经过碱处理,使稻壳的纤维组织完全溃散成膨松状态,紧紧包围在纤维素外面的木质素全部被撕裂而脱落,并且稻壳中的纤维素、蛋白质等的结构被破坏,暴露出-OH基团。GOD作为同型二聚体分子,酶分子中的-COOH可以与改性稻壳暴露出的活性基团-OH产生结合,从而实现GOD在改性稻壳上的固定化。本发明以改性稻壳和海藻酸钠凝胶为载体,制得的固定化葡萄糖氧化酶具有高回收率,而且贮藏稳定性以及操作稳定性好,具有良好的应用前景。
超临界CO2处理是利用超临界CO2零表面张力、低黏度和高扩散系数的性质使大量CO2分子在压力作用下渗透到纤维素的结构中,并产生溶胀作用。在一定温度下保持一段时间后,快速泄压,瞬时产生的物理爆破作用会显著破坏稻壳内部致密结构,可以大大增加致密坚硬的稻壳粉的比表面积。本发明采用超临界CO2对碱处理后的稻壳粉进行处理,使得酶能够更好接近改性稻壳中的活性基团,提高改性稻壳粉与葡萄糖氧化酶的结合稳定性,不仅能提高葡萄糖氧化酶的活力回收率,还有利于进一步提高固定化葡萄糖氧化酶的贮藏稳定性以及操作稳定性。
附图说明
图1为未改性稻壳与本发明实施例3中的改性稻壳的电镜图像,图中左边为未改性稻壳,右边为本发明实施例3中的改性稻壳。
图2为未改性稻壳与本发明实施例3中的改性稻壳的红外分析图。
图3为本发明固定化酶的制备过程示意图。
具体实施方式
下面,通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法,包括以下步骤:
S1、将2g 40目的稻壳粉加入40mL浓度为5mol/L的氢氧化钠溶液中,在室温下搅拌反应1h,经过洗涤、干燥,得到改性稻壳粉;
S2、将所述改性稻壳粉与海藻酸钠溶液、葡萄糖氧化酶溶液混合均匀,得到混合液,混合液中改性稻壳粉的含量为0.03g/mL,海藻酸钠的质量浓度为1.5%,葡萄糖氧化酶的质量浓度为1%;
S3、将所述混合液缓慢滴入质量浓度为4%的氯化钙溶液中,在30℃水浴加热固定化20min,过滤后将得到的胶珠洗涤、干燥,得到固定化葡萄糖氧化酶。
实施例2
一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法,包括以下步骤:
S1、将6g 100目的稻壳粉加入40mL浓度为6.5mol/L的氢氧化钠溶液中,在室温下搅拌反应3h,经过洗涤、干燥,得到改性稻壳粉;
S2、将所述改性稻壳粉与海藻酸钠溶液、葡萄糖氧化酶溶液混合均匀,得到混合液,混合液中改性稻壳粉的含量为0.08g/mL,海藻酸钠的质量浓度为2%,葡萄糖氧化酶的质量浓度为1.5%;
S3、将所述混合液缓慢滴入质量浓度为8%的氯化钙溶液中,在40℃水浴加热固定化40min,过滤后将得到的胶珠洗涤、干燥,得到固定化葡萄糖氧化酶。
实施例3
一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法,包括以下步骤:
S1、将4g 80目的稻壳粉加入40mL浓度为6mol/L的氢氧化钠溶液中,在室温下搅拌反应2h,经过洗涤、干燥,得到改性稻壳粉;
S2、将所述改性稻壳粉与海藻酸钠溶液、葡萄糖氧化酶溶液混合均匀,得到混合液,混合液中改性稻壳粉的含量为0.05g/mL,海藻酸钠的质量浓度为1.58%,葡萄糖氧化酶的质量浓度为1.34%;
S3、将所述混合液缓慢滴入质量浓度为6%的氯化钙溶液中,在35℃水浴加热固定化30min,过滤后将得到的胶珠洗涤、干燥,得到固定化葡萄糖氧化酶。
实施例4
一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法,包括以下步骤:
S1、将4g 80目的稻壳粉加入40mL浓度为6mol/L的氢氧化钠溶液中,在室温下搅拌反应2h,经过洗涤、干燥后,将碱处理后的稻壳粉置于超临界CO2中,在100℃、20MPa的条件下处理15min,得到改性稻壳粉;
S2、将所述改性稻壳粉与海藻酸钠溶液、葡萄糖氧化酶溶液混合均匀,得到混合液,混合液中改性稻壳粉的含量为0.05g/mL,海藻酸钠的质量浓度为1.58%,葡萄糖氧化酶的质量浓度为1.34%;
S3、将所述混合液缓慢滴入质量浓度为6%的氯化钙溶液中,在35℃水浴加热固定化30min,过滤后将得到的胶珠洗涤、干燥,得到固定化葡萄糖氧化酶。
试验例
(1)酶活力回收率的测定
取6U葡萄糖氧化酶,分别按照实施例3、实施例4的方法制作固定化葡萄糖氧化酶,测定酶活;酶活的测定方法为:取待测酶加入试管中,加入4.0mL葡萄糖溶液,在pH为3.9、温度为37℃的条件下水浴保温10min。吸取1.0mL上述反应液于试管中,再分别加入3.0mL乙酸-乙酸钠缓冲液和1.3mL的靛蓝胭脂红溶液,沸水浴加热13min后,流水冷却5min,稀释至25mL,在波长615nm处,以蒸馏水作参比,测定其吸光度。计算酶活力回收率,计算方法为:酶活力回收率=(固定化酶的活性/添加的总酶活性)×100%。测试结果显示,实施例3固定化葡萄糖氧化酶的酶活力回收率为91.89%,实施例4固定化葡萄糖氧化酶的酶活力回收率为93.22%。
(2)固定化葡萄糖氧化酶的操作稳定性
取6U葡萄糖氧化酶,分别按照实施例3、实施例4的方法制作固定化葡萄糖氧化酶,然后将实施例3、实施例4制作的固定化葡萄糖氧化酶分成2组,分别测定各组的初始酶活,然后按照以下条件进行7次反应:加入4.0mL葡萄糖溶液,在pH为3.9、温度为37℃的条件下水浴保温10min。测定各组反应后的酶活,计算酶活保持率。酶活保持率的计算方法为:酶活保持率=(反应后的酶活/初始酶活)×100%。测试结果显示,实施例3固定化葡萄糖氧化酶的酶活保持率为51.12%,实施例4固定化葡萄糖氧化酶的酶活保持率为63.87%。
(3)固定化葡萄糖氧化酶的贮藏稳定性
取6U葡萄糖氧化酶,分别按照实施例3、实施例4的方法制作固定化葡萄糖氧化酶,然后将游离葡萄糖氧化酶以及实施例3、实施例4制作的固定化葡萄糖氧化酶分成3组,分别测定各组的初始酶活,然后在4℃冰箱中贮藏20天,测定各组贮藏后的酶活,计算酶活保持率。酶活保持率的计算方法为:酶活保持率=(贮藏20天后的酶活/初始酶活)×100%。测试结果如表1所示:
表1各组酶活保持率
实施例3 实施例4 游离酶
酶活保持率(%) 75.92 81.76 46.27
稻壳改性前后的扫描电镜观察结果和红外光谱分析结果见图1和图2。由图1可知,天然稻壳结构致密,表面木质素排列整齐;稻壳经过NaOH处理后,稻壳的纤维组织完全溃散成膨松状态,并使紧紧包围在纤维素外面的木质素全部被撕裂而脱落。由图2的红外对比分析图可知,3400cm-1附近的-OH吸收峰明显变强,说明改性处理使得稻壳中的纤维素、蛋白质等的结构被破坏,暴露出-OH基团。而GOD是同型二聚体分子,酶分子中的-COOH可以与改性稻壳暴露出的活性基团-OH产生结合,实现GOD在改性稻壳上的固定化。本发明以改性稻壳和海藻酸钠凝胶为载体,制得的固定化葡萄糖氧化酶具有高回收率,而且贮藏稳定性以及操作稳定性好,具有良好的应用前景。
进一步地,本发明采用超临界CO2对碱处理后的稻壳粉进行处理,使得酶能够更好接近改性稻壳中的活性基团,提高改性稻壳粉与葡萄糖氧化酶的结合稳定性,不仅能提高葡萄糖氧化酶的活力回收率,还有利于进一步提高固定化葡萄糖氧化酶的贮藏稳定性以及操作稳定性。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、将稻壳粉经过碱处理,得到改性稻壳粉;
S2、将所述改性稻壳粉与海藻酸钠溶液、葡萄糖氧化酶溶液混合均匀,得到混合液;所述混合液中,改性稻壳粉的含量为0.03-0.08g/mL,海藻酸钠的质量浓度为1.5-2%,葡萄糖氧化酶的质量浓度为1-1.5%;
S3、将所述混合液缓慢滴入氯化钙溶液中,水浴加热固定化,过滤后将得到的胶珠洗涤、干燥,得到固定化葡萄糖氧化酶;
所述步骤S1中,碱处理的具体步骤为:将稻壳粉加入氢氧化钠溶液中,在室温下搅拌反应1-3h,经过洗涤、干燥,得到改性稻壳粉;稻壳粉的质量与氢氧化钠溶液的体积之比为(0.5-1.5)g:10mL;稻壳粉为40-100目;氢氧化钠溶液的浓度为5-6.5mol/L。
2.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制备方法,其特征在于,所述步骤S1中,稻壳粉在碱处理之后,还包括进行超临界CO2处理,得到改性稻壳粉;
所述超临界CO2处理的具体方法为:将碱处理后的稻壳粉置于超临界CO2中,在70-130℃、15-25MPa的条件下处理10-20min,即可。
3.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制备方法,其特征在于,所述氯化钙溶液的质量浓度为4-8%。
4.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制备方法,其特征在于,所述步骤S3中,水浴加热固定化的温度为30-40℃,固定化时间为20-40min。
5.一种固定化葡萄糖氧化酶,其特征在于,由权利要求1-4任一项所述的制备方法制得。
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