CN109943559A - 一种固定化发酵剂体系及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种固定化发酵剂体系及其制备和应用；所述固定化发酵体系包括菌核和包覆于菌核表面的复合酶层，所述活菌和复合酶包埋于多孔载体中，经过固定，形成了一个活菌和酶的功能性环境，使得底物在固定化发酵剂体系上完成整个反应过程，其制备方法工艺简单，试剂绿色环保，应用于秸秆酶解发酵体系能显著提高反应速度和，促进反应进行完全，实用性好。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种固定化发酵体系及其制备和应用。
背景技术
秸秆是指水稻、小麦、玉米等禾本科农作物成熟脱粒后剩余的茎叶部分，中国拥有丰富的农作物秸秆物质资源，传统的焚烧处理方式不仅浪费了大量的纤维素资源，而且造成了严重的环境污染，近年来，为了合理利用纤维素资源，越来越多的技术手段被应用到秸秆的处理方式中。
秸秆的利用就必然涉及秸秆的降解，秸秆主要成分包括细胞壁的多糖成分，如纤维素、半纤维素、木质素、果胶、细胞壁蛋白等，其水解后终产物为单糖，但是水解过程通常缓慢而且不完全，其原因主要有以下几点：细胞壁多糖交织成多糖复合物，多糖难以游离出来进一步降解；秸秆在进行酶解发酵制备酸或醇的过程中，酵母菌或酶制剂相对于底物浓度低且产生抑制剂，妨碍反应的进行，因此常制成复合菌剂或复合酶，经多步反应得到产物，反应过程复杂，产物得率低，费时费力，不能连续生产。
固定化技术可以提高酶或发酵菌的性能，相对于游离的酶或发酵菌，固定化技术使其具有更好的稳定性，并且机械强度提高而且可重复使用，适于连续生产，例如，现有中国专利文献CN106480130A公开了一种应用可回收磁性纳米固定酶水解秸秆的方法，采用磁性固定化酶，可以实现酶的对此回收依然保有活力，可以实现连续生产，然而，并没有解决如上所述的水解过程缓慢且不完全的缺点。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中秸秆酶解发酵速度慢，降解不完全的技术缺陷，公开了一种固定化发酵剂体系及其制备和应用。
为此,本发明公开了一种固定化发酵剂体系，包括菌核和包覆于菌核表面的复合酶层，所述菌核包括至少一种活菌和负载所述活菌的第一载体，所述复合酶层包括至少一种功能酶和负载所述功能酶的第二载体，所述第一载体和第二载体均为多孔载体。
优选的，所述菌核包括酵母菌和包埋酵母菌的多孔载体，所述复合酶层包括α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶和纤维素酶，所述纤维素酶包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。
优选的，所述第一载体和第二载体为海藻酸钠。
优选的，所述复合酶层还包括黑曲霉菌。
优选的，还包括经氨基酸或葡萄糖酸改性的Fe3O4磁性微球，所述磁性微球的直径为300-800nm。
本发明还公开了一种上述固定化发酵剂体系的制备方法，包括以下步骤：
制备载体试剂：将海藻酸钠与水混合，加热搅拌溶解，冷却至28-35℃，制成海藻酸钠质量分数为3％-6％的载体试剂；
制备固定试剂：将葡萄糖和氯化钙溶于水中，所述葡萄糖、氯化钙和水的比例为(8-15)g:(2-5)g:100ml；
制备菌核：配置活菌菌液，取载体试剂与菌液混合，分散于固定试剂中形成菌核；
制备复合酶层：将复合酶制成酶液，与载体试剂混合，将菌核分散于载体试剂与酶液的混合液中形成混合物，再将混合物分散于固定试剂中形成包覆有复合酶层的固定化发酵剂体系。
优选的，制备载体试剂步骤中加入磁性颗粒，所述磁性颗粒与所述载体试剂的比例为(0.5-1.5)g：1000ml。
优选的，制备菌核步骤中，菌液的活菌浓度为(1.5-2.2)×1010个/ml，所述菌液与载体试剂的体积比为(3-5):1。
优选的，所述制备复合酶层步骤中，所述酶液与所述载体试剂的体积比为(3-5):1。
本发明还公开了一种上述固定化发酵剂体系或上述固定化发酵剂体系制备方法制备的固定化发酵剂体系在秸秆酶解发酵领域的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明所述固定化发酵剂体系包括从里到外依次为菌核和包覆于菌核表面的至少一个复合酶层，所述菌核包括至少一种活菌和包埋活菌的多孔载体，所述复合酶层包括至少一种功能酶，经过固定，形成了一个活菌和酶的功能性环境，使得底物在固定化发酵剂体系上完成整个反应过程，反应完全而且速度快，使得功能酶和中间的活菌活性稳定，机械强度更好，可以被回收，实现连续生产。
2.本发明所述固定化发酵剂体系所述的菌核包括酵母菌和包埋酵母菌的多孔载体，所述复合酶层还包括α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶和纤维素酶，所述纤维素酶包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，在秸秆的发酵过程中，纤维素酶可以降解秸秆中的纤维素多糖，配合α-淀粉酶、糖化酶和酸性蛋白酶，将秸秆细胞壁中的多糖物质转化为单糖，降解部分蛋白质和脂肪，生成的单糖可以在酵母菌的作用下进一步发酵生成需要的产物，提高局部的底物浓度和酶活性，使反应速度加快，反应进程完全，抑制性物质生成少；由于大分子的多糖复合物难以进入多孔载体的孔径，因此复合酶层包覆于菌核的外层，与大分子多糖复合物接触好，生成的小分子单糖可以通过多孔载体的孔径接近内部的活菌，或者活菌生成的降解因子可以穿过多孔载体的孔径与外部的底物接触发生进一步的降解。
3.本发明所述固定化发酵剂体系所述复合酶层还包括黑曲霉，所述黑曲霉可以分泌果胶酶和阿魏酸酯酶，使得秸秆细胞壁中交织的多糖-多糖复合物、多糖-木质素复合物降解为游离的多糖和木质素，有利于后续的纤维素酶降解反应进行。
4.本发明所述固定化发酵剂体系中还包括经氨基酸或葡萄糖酸改性的磁性颗粒，经氨基酸和葡萄糖酸改性后的磁性颗粒在固定化发酵体系中分散性好。
5.本发明所述固定化发酵体系制备方法包括制备载体试剂、制备固定试剂、制备菌核、制备复合酶层步骤，工艺简单，试剂安全绿色环保，实用性好。、6.本发明所述固定化发酵体系制备方法可用于秸秆酶解发酵体系，能显著提高反应速度，促进反应进行完全，实用性好。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
本实施例提供了一种固定化发酵体系的具体实施方式，具体包括以下步骤：
取8g海藻酸钠与200ml蒸馏水混合，加热搅拌溶解，冷却至30℃，制成载体试剂；
以比例为400g:100g:4000ml将葡萄糖、氯化钙和水混合搅拌溶解制成固定试剂；
取酵母菌剂，与蒸馏水混合，制成活菌菌液，菌液的活菌浓度为1.8×1010个/ml，将400ml菌液与100ml载体试剂混合，将混合液滴在2L固定试剂中，浸泡20min，形成直径为2-3mm的菌核；
取α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，溶于纯水制成酶液，酶液中各酶的浓度均为8×105U/ml,将400ml酶液与100ml载体试剂混合，将上述步骤得到的菌核分散于酶液和载体试剂的混合液中，再将得到的混合物滴加到2L固定试剂中形成直径为3-5mm的球状固定化发酵剂体系。
实施例2
本实施例提供了一种固定化发酵体系的具体实施方式，具体包括以下步骤：
取8g海藻酸钠与200ml蒸馏水混合，加热搅拌溶解，冷却至30℃，再加入1.5g直径为300-500nm经葡萄糖酸改性的Fe3O4磁性颗粒搅拌均匀，制成载体试剂；
以比例为400g:100g:4000ml将葡萄糖、氯化钙和水混合搅拌溶解制成固定试剂；
取酵母菌剂，与蒸馏水混合，制成活菌菌液，菌液的活菌浓度为1.8×1010个/ml，将400ml菌液与100ml载体试剂混合，将混合液滴在2L固定试剂中，浸泡20min，形成直径为2-3mm的菌核；
取α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，溶于纯水制成酶液，酶液中各酶的浓度均为8×105U/ml,将400ml酶液与100ml载体试剂混合，将上述步骤得到的菌核分散于酶液和载体试剂的混合液中，再将得到的混合物滴加到2L固定试剂中形成直径为3-5mm的球状固定化发酵剂体系。
实施例3
本实施例提供了一种固定化发酵体系的具体实施方式，具体包括以下步骤：
取8g海藻酸钠与200ml蒸馏水混合，加热搅拌溶解，冷却至30℃，再加入0.5g直径为500-800nm的经氨基酸改性的Fe3O4磁性颗粒搅拌均匀，制成载体试剂；
以比例为400g:100g:4000ml将葡萄糖、氯化钙和水混合搅拌溶解制成固定试剂；
取酵母菌剂，与蒸馏水混合，制成活菌菌液，菌液的活菌浓度为1.8×1010个/ml，将400ml菌液与100ml载体试剂混合，将混合液滴在2L固定试剂中，浸泡20min，形成直径为2-3mm的菌核；
取α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶、和黑曲霉菌剂，溶于纯水制成酶液，酶液中各酶的浓度均为8×105U/ml,黑曲霉菌剂的活菌浓度为1.5×106个/ml，将400ml酶液与100ml载体试剂混合，将上述步骤得到的菌核分散于酶液和载体试剂的混合液中，再将得到的混合物滴加到2L固定试剂中形成直径为3-5mm的球状固定化发酵剂体系。
实施例4
本实施例提供了一种固定化发酵体系的具体实施方式，具体包括以下步骤：
取6g海藻酸钠与200ml蒸馏水混合，加热搅拌溶解，冷却至28℃，再加入1g径为300-500nm经葡萄糖酸改性的Fe3O4磁性颗粒搅拌均匀，制成载体试剂；
以比例为320g:80g:4000ml将葡萄糖、氯化钙和水混合搅拌溶解制成固定试剂；
取酵母菌剂，与蒸馏水混合，制成活菌菌液，菌液的活菌浓度为1.5×1010个/ml，将300ml的菌液与100ml载体试剂混合，将混合液滴在固定试剂中，浸泡10min，形成直径为1-3mm的菌核；
取α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶、和黑曲霉菌剂，溶于纯水制成酶液，酶液中各酶的浓度均为5×105U/ml,黑曲霉菌剂的活菌浓度为1×106个/ml，将300ml酶液与100ml载体试剂混合，将菌核分散于酶液和载体试剂的混合液中，再将得到的混合物滴加到2L固定试剂中形成直径为2-5mm的球状固定化发酵剂体系。
实施例5
本实施例提供了一种固定化发酵体系的具体实施方式，具体包括以下步骤：
取12g海藻酸钠与200ml蒸馏水混合，加热搅拌溶解，冷却至35℃，再加入1g直径为300-500nm经葡萄糖酸改性的Fe3O4磁性颗粒搅拌均匀，制成载体试剂；
以比例为为600g:200g:4000ml将葡萄糖、氯化钙和水混合搅拌溶解制成固定试剂；
取酵母菌剂，与蒸馏水混合，制成活菌菌液，菌液的活菌浓度为2.2×1010个/ml，将500ml的菌液与100ml载体试剂混合，将混合液滴在固定试剂中，浸泡30min，形成直径为3-5mm的菌核；
取α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶、和黑曲霉菌剂，溶于500ml纯水制成酶液，酶液中各酶的浓度均为10×105U/ml，黑曲霉菌剂的活菌浓度为2×106个/ml，将500ml酶液与100ml载体试剂混合，将菌核分散于酶液和载体试剂的混合液中，再将得到的混合物滴加到固定试剂中形成直径为5-8mm的球状固定化发酵剂体系。
对比例1
本对比例提供了一种固定化发酵体系的具体实施方式，具体包括以下步骤：
取12g海藻酸钠与200ml蒸馏水混合，加热搅拌溶解，冷却至35℃，再加入1g直径为300-500nm经葡萄糖酸改性的Fe3O4磁性颗粒搅拌均匀，制成载体试剂；
以比例为600g:200g:4000ml将葡萄糖、氯化钙和水混合搅拌溶解制成固定试剂；
取酵母菌剂，与蒸馏水混合，制成活菌菌液，菌液的活菌浓度为2.2×1010个/ml；
取α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶、和黑曲霉菌剂，溶于500ml纯水制成酶液，酶液中各酶的浓度均为10×105U/ml，黑曲霉菌剂的活菌浓度为2×106个/ml；
将500ml的菌液、500ml酶液与100ml载体试剂混合形成混合液，再将得到的混合液滴加到4L固定试剂中形成直径为5-8mm的球状固定化发酵剂体系。
对比例2
本对比例提供了一种固定化发酵体系的具体实施方式，具体包括以下步骤：
取酵母菌剂，与蒸馏水混合，制成活菌菌液，菌液的活菌浓度为2.2×1010个/ml；
取α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶、和黑曲霉菌剂，溶于500ml纯水制成酶液，酶液中各酶的浓度均为10×105U/ml，黑曲霉菌剂的活菌浓度为2×106个/ml；
将500ml的菌液与500ml作为发酵剂体系使用。
实验例1
将50kg玉米秸秆粉，10kg蔗糖，40kg纯水混合，分别加入实施例1-7，对比例1-2所述的发酵剂体系，于发酵罐中混合均匀，密封，保持温度为25-35℃分别在发酵3天、7天、10天、15天、30天和180天时检测乙醇质量百分数，检测所得乙醇的含量如下表1所示。
表1实施例1-5，对比例1-2所述发酵剂体系发酵过程监测结果。
上述实施方式仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种固定化发酵剂体系，其特征在于，包括菌核和包覆于菌核表面的复合酶层，所述菌核包括至少一种活菌和负载所述活菌的第一载体，所述复合酶层包括至少一种功能酶和负载所述功能酶的第二载体，所述第一载体和第二载体均为多孔载体。
2.根据权利要求1所述的固定化发酵剂体系，其特征在于，所述菌核包括酵母菌和包埋酵母菌的多孔载体，所述复合酶层包括α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶和纤维素酶，所述纤维素酶包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。
3.根据权利要求1或2所述的固定化发酵剂体系，其特征在于，所述第一载体和第二载体为海藻酸钠。
4.根据权利要求1-3任一项所述的固定化发酵剂体系，其特征在于，所述复合酶层还包括黑曲霉菌。
5.根据权利要求1-4任一项所述的固定化发酵剂体系，其特征在于，还包括经氨基酸或葡萄糖酸改性的Fe3O4磁性微球，所述磁性微球的直径为300-800nm。
6.一种权利要求1-5任一项所述固定化发酵剂体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备载体试剂：将海藻酸钠与水混合，加热搅拌溶解，冷却至28-35℃，制成海藻酸钠质量分数为3-6％的载体试剂；
制备固定试剂：将葡萄糖和氯化钙溶于水中，所述葡萄糖、氯化钙和水的比例为(8-15)g:(2-5)g:100ml；
制备菌核：配置活菌菌液，取载体试剂与菌液混合，分散于固定试剂中形成菌核；
制备复合酶层：将复合酶制成酶液，与载体试剂混合，将菌核分散于载体试剂与酶液的混合液中形成混合物，再将混合物分散于固定试剂中形成包覆有复合酶层的固定化发酵剂体系。
7.根据权利要求6所述的固定化发酵剂体系的制备方法，其特征在于，制备载体试剂步骤中加入磁性颗粒，所述磁性颗粒与所述载体试剂的比例为(0.5-1.5)g：1000ml。
8.根据权利要求6或7所述的固定化发酵剂体系的制备方法，其特征在于，制备菌核步骤中，菌液的活菌浓度为(1.5-2.2)×1010个/ml，所述菌液与载体试剂的体积比为(3-5):1。
9.根据权利要求6-8任一项所述的固定化发酵剂体系的制备方法，其特征在于，所述制备复合酶层步骤中，所述酶液与所述载体试剂的体积比为(3-5):1。
10.一种权利要求1-5任一项所述的固定化发酵剂体系或权利要求6-9任一项所述固定化发酵剂体系制备方法制备的固定化发酵剂体系在秸秆酶解发酵领域的应用。
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