CN112322525B - 一种用于纤维素降解的东方醋酸菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于纤维素降解的东方醋酸菌及应用，所述的东方醋酸菌菌株为东方醋酸菌(Acetobacter orientalis)XJC‑C，在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏编号为CGMCC NO：19592。经实验验证，本发明所述的东方醋酸菌XJC‑C具有高效的纤维素酶和木质素酶活性，能够降解纤维素和木质素，可用于降解含有纤维素和木质素的各类工业和农业肥料，将其用于副产品再利用和微生物肥料，对废弃物处理及微生物资源的高效利用具有友好的实用价值。

Description

一种用于纤维素降解的东方醋酸菌及应用

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种用于纤维素降解的东方醋酸菌及应用。

背景技术

如今，地球上的各种资源在使用过程中被大量浪费。因此，寻找可替代的可再生能源物质是众多科学家致力解决的问题。世界上最丰富的再生资源是植物，植物的主要组成成分为纤维素，纤维素在植物干组织中的含量约为 30～50％。在植物当中，秸秆作为其中一种具有代表性的能源物质。大多作物秸秆的处理方式是直接焚烧，不但造成严重的环境污染，而且严重浪费资源。如果可以将纤维素有效地转化利用，不仅可以从根源上解决焚烧农作物秸秆所产生的环境污染问题，而且可以将其能量转化为能源为人类利用。因为纤维素是一种高分子化合物，含有大量高能氢键，难以被降解和水解，所以现纤维素的资源化利用程度较低。处理纤维素有三种方法：物理、化学和生物法。物理法需要大量的能量，化学法容易造成环境污染，利用微生物产生的纤维素酶来降解纤维素的生物法能够安全无污染处理纤维素，因此最值得提倡，是众多科学家研究的一个重点方向。

纤维素被认为是地球上最丰富的生物聚合物，是农业残留物的主要成分，可被内切葡聚糖酶、纤维二水解酶和β-葡萄糖苷酶等纤维素酶降解为葡萄糖。酶法降解纤维素对农业废弃物的可持续利用具有重要意义。因此，生产高效、经济的纤维素酶，包括纤维素酶、半纤维素酶和木聚糖酶受到了广泛关注。研究者对纤维素的开发和利用已经有多年，在纤维素和纤维素酶的理论研究和具体实践方面也已取得了很大进步，但其利用效率不到2％，还存在很大的研究进步空间。目前，产纤维素酶微生物的分离筛选成为研究热点，研究者从微生物的纤维素酶活性、生物转化和实际生产利用等几方面着手，进行解纤维素菌的研究。

纤维素作为木质纤维素的主要成分，是地球上最丰富的生物聚合物，分子量为5×10⁴～2.5×10⁶，化学分子式是(C₆H₁₀O₅)_n，n是聚合度，代表的是葡萄糖基的个数，其数量用来指示纤维素分子量的大小。在室温下，纤维素不溶于水、稀酸和一般有机溶剂，如醇、乙醚、丙酮等。纤维素属于链状高分子化合物，它是以D-葡萄糖为单元，由β-1，4糖苷键以C1椅式构象联结形成。在室温下，纤维素不溶于水、稀酸和一般有机溶剂，如醇、乙醚、丙酮等。

纤维素分为结晶区和非结晶区。结晶区含有大量的羟基基团，分子间形成氢键，使晶体结构稳定，相对致密，不易降解。这就是纤维素难以被生物酶和化学试剂降解的主要原因。非结晶区是由游离的羟基组成，在液体中，游离的羟基可以与水形成氢键从而膨胀。降解纤维素的主要重点在于如何破坏分子间的氢键。

纤维素的水解主要由三种类型的纤维素酶催化：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)，三种纤维素酶具有协同作用。

内切葡聚糖酶(endo-β-1,4-D-glucanases，EC 3.2.1.4)，在细菌中简称为Cen，也可称为Cx酶、CMC酶。在真菌中简称为EG。内切葡聚糖酶主要作用在纤维素的非结晶区，随机水解β-1，4糖苷键，能够打断纤维素大分子的长链，释放纤维素小分子。内切葡聚糖酶的酶活力在一般条件下高于其他类型的纤维素酶。

外切葡聚糖酶(exo-β-1,4-D-glucanases)，在细菌汇总简称Cex，也可称为 C1酶。在真菌中简称为CBH。外切葡聚糖酶主要作用于纤维素大分子长链的末端，释放出游离末端，水解生成纤维二糖。底物主要是微晶纤维素，所以也称为微晶纤维素酶。

β-葡萄糖苷酶(β-1,4-D-glucosidases，EC 3.2.1.21)，简称BG。β-葡萄糖苷酶可以完全水解纤维二糖生成葡萄糖，它也称为纤维二糖酶。随着反应生成的葡萄糖浓度不断升高，该酶的水解能力会逐渐降低。

产纤维素素酶的微生物主要为细菌、真菌和放线菌。目前研究热门是木霉属。木霉属中的曲霉、木霉、根霉和青霉，在多种产纤维素酶菌中，木霉属活性较强，典型代表分别是绿色木霉、哈茨木霉和康氏木霉。在产纤维素酶微生物中，细菌普遍高于真菌和放线菌，如生孢纤维粘菌属、纤维杆菌属和梭菌属等，均具有较强的纤维素酶活性。研究表明，细菌的解纤维素酶主要分泌在胞内，真菌和放线菌主要在胞外产生解纤维素酶。目前，人们主要研究方向是寻找可以产生高效解纤维素酶的菌种，并且优化其产酶条件。有的学者对微生物菌株进行基因诱变，通过特定的筛选方式，培养出产高效解纤维素酶的菌种，并且取得巨大成功。还有学者通过人为改变土壤的肥沃程度，从而提高土壤中解纤维素菌的产酶效率，这对农业生产与环境保护都产生了巨大作用。

纤维素是自然界中最广泛的可再生资源。据统计，天然合成植物的年总量约为10¹¹t,其中纤维素占植物总量的30～50％。在农业中，每年大量作物秸秆被直接焚烧，在工业中，每年纤维素废弃物能达数百万吨。这样传统的处理方式，使大量的纤维素资源得不到高效利用。主要原因之一是缺乏高效降解纤维素的菌株。所以，纤维素的高效利用是作为废弃物资源化研究的一个重要方向。

发明内容

本发明采用透明圈法筛选出产解纤维素酶的菌株，并根据16s rDNA序列分析，结合形态学、培养学、生理生化特性，确定了该菌株的分类地位，及对发酵上清液中纤维素酶、外葡聚糖酶、内葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性进行了测定。进而探讨不同农副产品对新分离的东方醋酸菌(Acetobacter orientalis) XJC-C产纤维素酶和木质素酶的影响。本研究的主要目的是发现微生物资源，并将其用于副产品再利用和微生物肥料，对废弃物处理及微生物资源的高效利用具有友好的实用价值。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种东方醋酸菌菌株，所述的醋酸杆菌菌株为东方醋酸菌(Acetobacterorientalis)XJC-C，在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏编号为 CGMCCNo.19592。

上述东方醋酸菌XJC-C在制备产纤维素酶的制剂上的应用。

上述东方醋酸菌XJC-C在制备产木质素酶的制剂上的应用。

上述东方醋酸菌XJC-C在制备降解纤维素的制剂上应用。

上述东方醋酸菌XJC-C在制备降解木质素的制剂上的应用。

一种降解纤维素的微生物方法，采用上述的东方醋酸菌XJC-C降解纤维素。

进一步，将纤维素和/或含有纤维素的底物，与所述的东方醋酸菌XJC-C 一起进行固态发酵。

一种降解木质素的微生物方法，采用上述的东方醋酸菌XJC-C降解木质素。

进一步，将木质素和/或含有木质素的底物，与所述的东方醋酸菌XJC-C 一起进行固态发酵。

进一步，所述的底物为豆粕、玉米皮、麦麸、椰子壳和/或香蕉秸秆。

进一步，所述的固态发酵，具体操作为：将底物干燥制得基质，基质调节含水率为70％，接入所述的东方醋酸菌XJC-C，30℃条件下发酵5-20天，即得。

进一步，所述的底物在50-60℃下干燥24小时；所述的基质在121℃蒸压 20分钟；接入的东方醋酸菌XJC-C为培养48小时的菌株悬浮液，接种量为每 5g干燥底物接入0.5mL浓度为10⁸CFU mL^-1的菌株悬浮液。

本发明的有益效果：

本发明所述的东方醋酸菌XJC-C从海南省南海永新岛 (112°20′22"E,16°49′53"N)软珊瑚中分离获得的，并且于2020年04月 20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号。经实验验证，本发明所述的东方醋酸菌XJC-C具有高效的纤维素酶和木质素酶活性，能够降解纤维素和木质素，可用于降解含有纤维素和木质素的各类工业和农业肥料，将其用于副产品再利用和微生物肥料，对废弃物处理及微生物资源的高效利用具有友好的实用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为菌株XJC-C解纤维素透明圈；

图2为电镜观察下菌株XJC-C的形态特征；

图3为菌株XJC-C系统发育树；

图4发酵及酶活性测定；

图5不同底物对酶活性的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1.材料与方法

1.1试验材料

1.1.1软珊瑚分离材料

供试菌株从南海软珊瑚中分离获得，保藏在中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南省热带微生物资源重点实验室，于-20℃保藏备用。

1.1.2主要试剂及溶液

本实验中用到的主要试剂及溶液，如下表1

表1主要试剂及溶液

表2标准葡萄糖溶液

1.1.3主要培养基

本实验所用主要培养基配方，如表3所示。

表3主要培养基及其配方

1.1.4主要仪器

本实验所用主要仪器设备，如表4所示。

表4设备仪器及产品信息

1.2试验方法

1.2.1解纤维素菌的初筛

实验室原有的132株细菌样品，用点接法在同一个纤维素刚果红培养基上点2个点作为菌株样品，将这66个培养基盖好密封放在恒温箱中设置30℃恒温培养七天之后取出，观察每个培养基的两个菌落周围是否有产生透明圈，如果有产生透明圈的菌株，则表明该菌株可以产生解纤维素酶。

1.2.2解纤维素菌的复筛

将初筛产生的透明圈的十株菌株样品分别用点接法在同一个纤维素刚果红培养基上点4个点作为细菌样品，将这十个培养基盖好密封放在恒温箱中设置30℃恒温培养五天之后取出，观察并记录每个平板上的4个透明圈直径(D) 和菌落直径(d)的数值，每个透明圈上的D值用游标卡尺换三次方向共计量三次，得到的数值取平均值。d值同理。根据D/d(EAI)的比值取平均值。EAI 大小可以反映菌株产生纤维素酶的活力大小。选取EAI最大的菌株进行菌株分类鉴定及降解纤维素特性研究。

1.2.3菌株分类鉴定

(1)形态特征

采用结晶紫法对细菌进行染色。在灭菌干燥的载玻片上滴加5μl的无菌水，用灭菌干燥的牙签从固体细菌培养基上挑取少量培养两天的菌株，在无菌水中均匀涂抹；在室温中自然风干，再用酒精灯的外焰快速烘烤载玻片两次；滴加结晶紫染液染色1min，用无菌水冲洗直至滴水无色；滴加碘液覆盖细菌1min，用无菌水冲洗直至滴水无色；用95％乙醇溶液冲洗染色细菌进行脱色，直至滴水无色；滴加番红染液染色2min，用无菌水冲洗直至滴水无色。自然风干载玻片，在电镜下观察细菌形态及颜色。革兰氏阳性菌电镜观察为蓝色，革兰氏阴性菌电镜观察为红色。

(2)生理生化特征

根据东秀珠等于2001编写的《常见细菌系统鉴定手册》对筛选出来的解纤维素菌株进行生理生化特征的鉴定。

①碳源利用试验

配制碳源利用基础培养基，将不同碳源按照0.5％的浓度加入基础培养，接入待测菌株，在30℃恒温培养七天，观察记录菌种的繁殖情况。碳源种类如下：肌醇、木聚糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、木糖、无水乳糖、α- 乳糖、鼠李糖、蜜二糖、可溶性淀粉等。基础培养基：磷酸氢二铵2.64g，磷酸二氢钾2.38g，磷酸氢二钾5.65g，五水硫酸铜0.0064g，硫酸镁晶体1g，七水硫酸锌0.0015g，四氯化锰0.0079g，硫酸亚铁晶体0.0011g，蒸馏1000 mL，琼脂20g，pH 7.2～7.4。

②氮源利用试验

配制氮源利用基础培养基，将不同氮源按照0.5％的浓度加入基础培养基培养，接入待测菌株，在30℃恒温培养七天，观察记录菌种的繁殖情况。不同氮源按照0.5％的浓度加入基础培养。氮源种类如下：天门冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、酪氨酸、精氨酸、氯化铵、硝酸铵、甲硫氨酸、硫酸铵、四水合钼酸铵、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、草酸铵、乙酸铵、甘氨酸。基础培养基：葡萄糖10.00g、硫酸镁晶体0.5g、氯化钠0.05g、硫酸亚铁晶体0.001g、磷酸二氢钾0.01g、蒸馏水1000mL，琼脂20g，pH 7.2。

③盐耐受试验

配制具有不同NaCl浓度的Bennett琼脂培养基，将待测菌株接入培养基，恒温35℃培养七天，观察并记录菌种在不同NaCl浓度培养基的生长情况。 NaCl浓度分别为0、1％、3％、5％、7％、9％、11％、13％、15％。培养基：葡萄糖10g，酶水解酪素2g，牛肉浸膏1g，酵母浸膏1g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。pH 7.0。

④pH耐受试验

将待测菌株接入不同pH值得培养基摇床30℃恒温培养七天，观察并记录菌种在不同pH值培养基的生长情况。A液：磷酸二氢钾27.218g，蒸馏水1000 ml。B液：磷酸二氢钾45.644g，蒸馏水1000ml。不同pH溶液配比如表5所示。

表5 pH试验不同浓度配比

⑤硝酸盐还原试验

酸盐还原培养基：KNO₃ 1g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄ 0.5g，NaCl 0.5g，蔗糖20g，蒸馏水1000ml，pH 7.2。将待测菌种接入硝酸盐培养基中培养七天后，测定硝酸盐还原情况。有些细菌可以使硝酸盐还原成亚硝酸盐、氨和氮等，当在接种细菌的培养液中加入格里氏试剂时，溶液会呈现粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等。

⑥H₂S产生试验

柴斯纳培养基：蛋白胨10g，柠檬酸铁0.5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。 pH 7.0。将待测菌种接入柴斯纳培养基中培养七天后，如果培养基产生黑色素，则证明有H₂S的产生。由于H₂S和柠檬酸铁反应会产生FeS，所以培养基会变成黑色。

⑦淀粉水解实验

粉水解培养基：可溶性淀粉10g，MgCO 31g，K₂HPO₄ 0.3g，KNO₃1 g， NaCl 0.5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。碘液的制备：碘片1g，碘化钾2g，蒸馏水1000ml，pH 7.2～7.4。将待测菌株用点接法接种于淀粉水解琼脂平板上，接种直径不超过5mm。30℃恒温培养七天后，在培养基上喷加碘液。如菌落产生淀粉酶，则菌落周围会产生透明圈。

⑧明胶液化试验

明胶液化培养基：蛋白胨5g，葡萄糖20g，明胶200g，蒸馏水1L，pH 7.2-7.4。将待测菌种接入明胶液化培养基中培养七天后，观察培养基情况。此实验主要测定菌株是否可以产生蛋白酶。因为30℃下的明胶呈现液态，20℃以下明胶呈现固态。如果菌株可以产生明胶酶，则可以使明胶培养基在20℃以下也呈现液态。

⑨脂酶试验

脂酶基础培养基：蛋白胨1g，CaCl₂·7H₂0 0.1g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水100ml。pH 7.4。底物分别加入1g的吐温-20，吐温-40，吐温-80。将待测菌株用点接法接种于培养基平板上。30℃恒温培养一周后，观察菌落周围是否产生模糊透明圈，有模糊圈产生则为阳性，无模糊圈产生则实验为阴性。

⑩脲酶试验

脲酶培养基：V-P培养基：蛋白胨1g，葡萄糖1g，KH2PO4 2g，酚红0.012 g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。PH 6.8～6.9(微黄)，30g的尿素使用乙醚和培养基分开消毒。当高温灭菌后的培养基冷却至55℃后再将无菌尿素加入培养基。此实验是检测菌株是否具有产生尿素酶的能力。

V-P试验

V-P培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，K₂HPO₄ 5g，蒸馏水1000ml。V-P 试剂：肌酸0.3g，蒸馏水100ml。氢氧化钠溶液：氢氧化钠40g,蒸馏水100ml。将待测菌株接种于V-P培养基中，摇床培养一周。取3ml培养液加入3ml氢氧化钠溶液，再加入一滴肌酸，10min后若溶呈现红色，则证明实验为阳性反应。反之为阴性反应。有些菌株分解葡萄糖产生的丙酮酸，可以进一步脱羧生成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性下氧化形成二乙酰，可以与蛋白胨里的精氨酸反应，生成红色化合物，即可显示V-P试验为阳性。

MR(甲基红)试验

MR培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，K₂HPO₄ 5g，蒸馏水1000ml。甲基红试剂：甲基红0.1g，95％乙醇200ml，蒸馏水200ml。将待测菌株接种于MR培养基中，摇床培养一周，然后在培养基中加入一滴甲基红试剂，如果培养基呈现红色则为阳性反应，呈现黄色为阴性反应。细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，再进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸，使培养基PH降低至4.5以下，甲基红试剂会呈现红色。若细菌分解葡萄糖产生醛、酮、水等，则培养基 PH会在5.4以上，甲基红试剂会呈现橘黄色。

(3)16S rDNA序列分析

选用细菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′) 和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACT-3′)建立PCR扩增体系进行扩增，如表6。然后送去生工公司测序，等待测序结果分析序列信息。产物经纯化后测定基因序列；采用EzTaxon与GenBank搜索序列相似性，选取相似性较高的模式菌株序列，用MEGA7.0中Neighbor-Joining法比较同源性，构建系统发育树。

表6 PCR反应条件

1.2.4酶活性测定

1.2.4.1纤维素酶和木质素酶生产及分析测定

根据Meng et al.(2018)方法测定了外葡聚糖酶、内葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶的活性。酶活性单位(U)定义为每毫升发酵上清液释放1μmol·min^-1 (β-葡萄糖苷酶为2μmol)的还原糖(以葡萄糖计)的酶量。根据参考文献(Mei et al.2020)测定木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的活性。所有实验进行三次生物学重复。

1.2.5固体废弃物发酵及产酶特性

以豆粕、玉米皮、麦麸、椰子壳和香蕉秸秆为底物进行固态发酵。未经处理的基质在烘箱中干燥24小时(60℃)，研磨并筛分以获得基质。固态发酵在含有5g干底物的150ml锥形烧瓶中进行，在121℃蒸压20分钟。用无菌蒸馏水调节水分含量，将48h的老株XJC-C悬浮液(0.5mL of 10⁸CFU mL^-1)接种到底物中。在30℃下发酵10天。然后，以5:1(v/v)的比例用蒸馏水提取酶，在30℃下摇动(150转/分)搅拌1小时。然后在8000转/分下离心10分钟(4℃)。然后用干净吸管吸取上清液，即为粗酶的提取物，用于测定产生的纤维素酶和木质素酶的活性。

2结果与分析

2.1解纤维素菌筛选

在纤维素酶把纤维素的多糖降解成葡萄糖的时候，多聚糖-刚果红复合物中的刚果红会脱落，形成透明圈。酶的活性越高，透明圈即越大。因此对照各菌株透明圈的大小可以初步判段纤维素酶活性的大小(黄慰情，2014)。通过对 132株菌株样品进行初筛和复筛，选取纤维素降解指数最大的菌株XJC-C，EAI 为5.39(显著性P<0.05)。

2.2菌株分类鉴定

2.2.1形态特征

经电子显微镜可观察到，菌株XJC-C在30℃细菌基础培养基上生长良好，经过结晶紫法检测可知，菌株XJC-C属于革兰氏阴性菌。

2.2.2生理生化特征

参照《常见细菌系统鉴定手册》对XJC-C菌株进行生理生化分析，结果显示：菌株XJC-C可利用碳源有肌醇、木聚糖、麦芽糖、甘露糖、松三糖、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、木糖、D-半乳糖、无水乳糖、山梨糖、α-乳糖、蜜二糖、D-果糖、可溶性淀粉、D-甘露糖，不可利用碳源有鼠李糖；可利用氮源有天门冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、草酸铵，不可利用氮源有酪氨酸、精氨酸、氯化铵、硝酸铵、硫酸铵、四水合钼酸铵、乙酸铵、甘氨酸；可以使硝酸盐还原、淀粉水解、明胶液化，不能产生硫化氢、尿素酶、脂酶，V-P反应和MR反应都呈现阴性；菌株XJC-C适宜生长的温度范围15-70℃，pH范围在5.0～9.5，耐盐性在13％以下。

表7菌株XJC-C生理生化指标

“+”代表实验结果为阳性；“－”代表实验结果为阴性。

2.2.3系统发育树及同源性分析

选用细菌16S rRNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3′)和 1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)建立PCR扩增体系进行扩增，如表4。产物经纯化后测定基因序列，将菌株的序列分别在GeneBank和 EzBioCloud数据库中进行同源性的比对，应用MEGA5.1软件的相关功能构建邻接距离矩阵法系统发育关系进化树(图3)。结果显示，菌株XJC-C与醋酸杆菌属(Acetobacter)的同源性均较高，大多数的序列聚集在同一节点处，并且具有较近的遗传距离，XJC-C和Acetobacter orientalis序列在同一节点进行聚集，并且具有较近的遗传距离，表明这些序列为同一个属的，与此同时和其他属遗传距离则较远，进化树所得出的结果与序列比对的种属关系所得出的结果相一致，并将生理生化等方面与其模式菌进行对比后，可将XJC-C鉴定为东方醋酸菌，并将其命名为东方醋酸菌(Acetobacterorientalis)XJC-C。

2.4酶活性测定

在外葡聚糖酶、内葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、滤纸纤维素酶的分析中，根据上清液释放的还原糖的酶量；在木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶的分析中，产生单一吸光度差异的酶的数量；在蛋白酶中用DNS方法测定纤维素酶的活性(图4)。结果表明，菌株XJC-C均具有以上6种酶的活性，说明该菌株能有效降解纤维素和半纤维素。培养10d后，酶活性最高，外葡聚糖酶活性为10.95U·mL^-1，内葡聚糖酶活性为5.02U·mL^-1，β-葡萄糖苷酶活性为3.20 U·mL^-1，木质素降解酶活性也较高，木质素过氧化物酶活性1.22U·mL^-1显著高于其它酶(p＜0.5)。锰过氧化物酶活性为0.73U·mL^-1，漆酶活性为0.22U·mL^-1。结果表明，菌株XJC-C不仅能降解纤维素和半纤维素，还能降解木质素。

2.5不同底物对产酶量的影响

在许多情况下，各类工业和农业废料被视为废弃物。将菌株XJC-C应用于固态发酵过程中，以该类原料为发酵底物，研究在降低生产成本的同时获得所需酶的可能性。

不同底物被用作固体发酵，如图5显示，菌株XJC-C在香蕉秸秆和豆粕中培养时，其纤维素酶、木质素酶活性均最高，外葡聚糖酶活性分别为12.94U·g^-1和11.78U·g^-1，内葡聚糖酶活性分别为5.76U·g^-1和4.72U·g^-1，β-葡萄糖苷酶活性分别为3.73U·g^-1和3.35U·g^-1，木质素过氧化物酶活性分别为1.34U·g^-1和1.11U·g^-1，锰过氧化物酶活性分别为0.79U·g^-1和0.66U·g^-1，漆酶活性均为 0.26U·g^-1。这一结果的原因是豆粕具有较高的蛋白质含量(约45％)和碳水化合物含量(35-40％)以及约1％的残油。目前大多数碳水化合物是果胶(约15％)，但它还含有约10％的游离糖、约8％的纤维素和约1％的淀粉。蛋白质和果胶通过浸出或化学降解而流失，可能影响了酶合成的调节机制，因为大量研究表明，果胶酶的产生容易受到产物抑制，需要果胶来诱导酶的产生。高浓度的纤维素和半纤维素(约20％纤维素和约50％半纤维素)似乎对酶的产生和分泌有抑制作用。

3.结论

将菌株的序列分别在GeneBank和EzBioCloud数据库中，进行同源性的比对。利用MEGA 7.0软件的相关功能构建系统发育树(邻接距离矩阵法)。如图3结果显示，菌株XJC-C与标准株Acetobacter orientalis(东方醋酸菌)的同源性最高高，归属同一个分支，具有较近的遗传距离。再结合形态特征和生理生化特征，可以确定XJC-C归属于假芽孢杆菌，命名为东方醋酸菌 (Acetobacter orientalis)XJC-C。

(1)对132株海洋珊瑚共附生细菌，根据透明圈直径和菌落直径的比值当中选出比值最高的菌株XJC-C，纤维酶活力最高，纤维素降解指数最高，EAI为 5.39。通过16S rDNA序列分析和同源性比对手段，结合生理生化特征，初步鉴定菌株XJC-C为Acetobacterorientalis XJC-C。

(2)菌株XJC-C具有明显的解纤维素和木质素活性，在图4可得，外葡聚糖酶活性为10.95U·mL^-1，内葡聚糖酶活性为5.02U·mL^-1，β-葡萄糖苷酶活性为 3.20U·mL^-1，木质素过氧化物酶活性1.22U·mL^-1，锰过氧化物酶活性为0.73 U·mL^-1，漆酶活性为0.22U·mL^-1。

(3)菌株XJC-C不同底物中培养时，其纤维素酶、木质素酶均表现出活性。如图5所示，在香蕉秸秆和豆粕中培养时，其纤维素酶、木质素酶活性均最高，外葡聚糖酶活性分别为12.94U·g^-1和11.78U·g^-1，内葡聚糖酶活性分别为5.76 U·g^-1和4.72U·g^-1，β-葡萄糖苷酶活性分别为3.73U·g^-1和3.35U·g^-1，木质素过氧化物酶活性分别为1.34U·g^-1和1.11U·g^-1，锰过氧化物酶活性分别为0.79 U·g^-1和0.66U·g^-1，漆酶活性均为0.26U·g^-1。

综上所述，东方醋酸菌XJC-C具有高效的纤维素酶和木质素酶活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

参考文献

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[3]黄慰情.高温纤维素降解菌的筛选、鉴定及产酶条件研究[D].浙江大学,2014。

Claims (13)

1.一种东方醋酸菌 (Acetobacter orientalis)XJC-C，其保藏编号为CGMCCNo.19592。

2.如权利要求1所述的东方醋酸菌XJC-C在制备产纤维素酶和/或木质素酶的制剂上的应用。

3.如权利要求1所述的东方醋酸菌XJC-C在制备降解纤维素和/或木质素的制剂上应用。

4.一种降解纤维素的微生物方法，其特征在于：采用权利要求1所述的东方醋酸菌XJC-C降解纤维素。

5.如权利要求4所述的一种降解纤维素的微生物方法，其特征在于：将纤维素和/或含有纤维素的底物，与所述的东方醋酸菌XJC-C一起进行固态发酵。

6.如权利要求5所述的降解纤维素的微生物方法，其特征在于：所述的底物为豆粕、玉米皮、麦麸、椰子壳和/或香蕉秸秆。

7.如权利要求5所述的降解纤维素的微生物方法，其特征在于：所述的固态发酵，具体操作为：将底物干燥制得基质，基质调节含水率为70%，接入所述的东方醋酸菌XJC-C，30℃条件下发酵5-20天，即得。

8.如权利要求7所述的降解纤维素的微生物方法，其特征在于：所述的底物在50-60℃下干燥24小时；所述的基质在121℃蒸压20分钟；接入的东方醋酸菌XJC-C为培养48小时的菌株悬浮液，接种量为每5g干燥底物接入0.5 mL浓度为10⁸ CFU mL^-1的菌株悬浮液。

9.一种降解木质素的微生物方法，其特征在于：采用权利要求1所述的东方醋酸菌XJC-C降解木质素。

10.如权利要求9所述的一种降解木质素的微生物方法，其特征在于：将木质素和/或含有木质素的底物，与所述的东方醋酸菌XJC-C一起进行固态发酵。

11.如权利要求10所述的降解木质素的微生物方法，其特征在于：所述的底物为豆粕、玉米皮、麦麸、椰子壳和/或香蕉秸秆。

12.如权利要求10所述的降解木质素的微生物方法，其特征在于：所述的固态发酵，具体操作为：将底物干燥制得基质，基质调节含水率为70%，接入所述的东方醋酸菌XJC-C，30℃条件下发酵5-20天，即得。

13.如权利要求12所述的降解木质 素的微生物方法，其特征在于：所述的底物在50-60℃下干燥24小时；所述的基质在121℃蒸压20分钟；接入的东方醋酸菌XJC-C为培养48小时的菌株悬浮液，接种量为每5g干燥底物接入0.5 mL浓度为10⁸ CFU mL^-1的菌株悬浮液。

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