CN104357364A - 一种链霉菌株及其制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法 - Google Patents

Abstract

一种链霉菌株及其制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法，涉及一种菌株及制备木聚糖酶的方法，该菌株于2012年12月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCCNo.1734。本发明菌株具有良好的极端碱性环境耐受性，其中耐寡营养、pH、NaCl的能力极为突出。本发明菌株在最适条件下生产木聚糖酶，木聚糖酶酶活最高可达68.9U/ml。该菌株能降解多种半纤维素类农业废弃物，包括玉米秸秆、菊芋秸秆、稻草、海带纤维等，在生物质能源转化、农业废弃物利用方面具有广阔的应用前景。具有良好的pH稳定性、热稳定性，且可耐受高浓度盐等特性。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于食品、饲料、酿酒、造纸、能源等工业生产中。

Description

一种链霉菌株及其制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法

技术领域

本发明涉及一种微生物菌株及制备木聚糖酶的方法，特别是涉及一种链霉菌株及其制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法。

背景技术

近年来，随着全球经济的快速增长，资源能源危机已迫在眉睫，生物质能的可再生利用备受关注，工农业废弃物的再生利用逐渐成为研究热点。木聚糖是自然界中一种丰富的再生资源，是除纤维素外，自然界中最丰富的多糖。因此，如何利用木聚糖成为目前研究的热点。

木聚糖是由D-木糖主链（以β－1,4键相连）和L-阿拉伯糖分枝（α-1,2和α-1,3相连）所组成的聚合物，与木质素和纤维素以4-O-methyl-D-glucuronic acid 键相连，形成了交联复杂的结构。正是这种复杂的结构给半纤维素的降解利用带来了很大困难。目前，工业降解木聚糖常用的方法有酸法、碱法和酶法，其中酸法、碱法应用较为广泛，但酸\碱水解液中含有较多的有毒物质，对后期微生物发酵有很强地抑制作用；另外，采用酸法或碱法生产木聚糖，环保压力很大，受到国家政策的限制，因此从长远角度来看，酶法降解木聚糖将是未来木聚糖降解的主要的方式。

木聚糖酶是木聚糖水解酶系中最关键的水解酶。木聚糖被降解时，起主要作用的酶是β-1, 4-内切木聚糖酶和β-D-木糖苷酶。β-1, 4-内切木聚糖酶以内切方式作用于木聚糖主链内部的β-1, 4木糖苷键,其主要水解产物为低聚木糖、木寡糖、木二糖等；β-D-木糖苷酶通过水解低聚木糖、木寡糖等的非还原性末端来催化释放木糖残基。

木聚糖酶在造纸工业、食品工业、饲料工业、能源工业等众多领域具有巨大的应用价值和广阔的应用前景。例如，在纸浆漂白的初始阶段，向纸浆中加入木聚糖酶可以增加纸浆的光亮度和水解度，从而减少了在后期漂白中氯化物的用量，降低了对环境的污染；在面包烘烤过程中，向面团中加入木聚糖酶，可缩短面团的发酵时间，改善面包心的弹性和硬度，增加面包的体积和比容，有效地改善面包焙烤品质；向饲料中添加木聚糖酶可以显著提高畜禽的品质性能。木聚糖酶可以通过破坏植物细胞壁结构，提高各种类型饲料的利用率，减少畜禽肠道疾病，促进畜禽健康，提高畜禽成活率；减少粘粪，降低空气中氨气和硫化物浓度，减少环境污染，减少粘粪排出和脏蛋，使畜禽体重均匀。因此，伴随着人类对于可持续性发展和环境的重视，木聚糖酶在工业上的应用日益受到人们的重视。

放线菌是自然界分布最广泛的微生物类群之一，自从Waksman和Henrici于1943年建立链霉菌属以来，链霉菌已成为种的数量最大的一个属。目前,包括出现在专利中的种已经超过3000个，至1996年已有效描述的种有464个和亚种45个。据统计，链霉菌产生的抗生素占抗生素的70％左右，占放线菌产生抗生素的90％以上，如链霉素、新生霉素等。而目前对链霉菌的研究热点主要集中于抗生素的生产，对其他代谢物的应用研究还较少，例如用冰城链霉菌生产酶制剂——木聚糖酶的研究还未见报道。冰城链霉菌选自哈尔滨化工厂内土壤，特殊的生长环境造就了其独特的代谢方式和代谢产物，这不仅确保其在极端环境中生存，也提供了产生特殊代谢产物的潜力。其代谢生产的酶一般具有与其生存环境相关的特性，例如，耐盐性，耐高温性，适冷性等，这些特性在工业极端条件下有广阔应用前景。此外，由于放线菌的遗传操作简单，便于进行遗传改造。

发明内容

本发明的目的在于提供一种链霉菌株及其制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法，本发明菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，菌株寡营养、pH、NaCl耐受性性质，耐碱耐盐木聚糖酶，发酵方法制备的木聚糖酶在45℃下长时间维持较高酶活，可降解农业废弃物中的半纤维素为单糖，供下游工艺发酵利用，产生清洁可再生能源，在能源工业中应用潜力巨大。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种链霉菌株，所述菌株为链霉菌菌属中的冰城链霉菌Streptomyces bingchenggensis，编号226541，2012年12月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC No.1734；该菌株属于放线菌门，放线菌目，链霉菌属；菌落在Bennett培养基平板，30℃生长时开始时为白色，致密，圆形，向四周扩展，2-3天后从菌落表面产生白灰色孢子，基底为墨绿色，并产生黑色色素，生长速度较快；该菌株筛选自哈尔滨太阳岛土壤样品，对极端环境有较好的耐受性，包括营养耐受性，pH耐受性，NaCl耐受性；适用于耐碱、耐盐木聚糖酶应用。

所述的一种链霉菌株，所述该菌株所产木聚糖酶酶学性质如下：最适温度为70℃，最适pH为6.0，最适底物为山毛榉木聚糖；60℃水浴中孵育60min，酶活力残留75%以上；50℃，pH 5-9 缓冲液中孵育30min，酶活力残留80%以上；当NaCl终浓度为1mol/L时，木聚糖酶酶活维持在86.6%；当NaCl终浓度为2M时，残留酶活70.4%；当NaCl终浓度为5mol/L时，残留酶活46.8%。

一种链霉菌株制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法，所述方法包括：将来源于哈尔滨精细化工厂土壤样品经富集培养后，按常规稀释后涂布于木聚糖平板上，30℃培养5-6天，挑取产生透明圈菌落在木聚糖固体培养基上划线分离，重复划线分离过程3轮，使菌株纯化，筛选到该分泌木聚糖酶的菌株，本菌株在Bennett平板上30℃下培养7天，菌落呈圆形，直径约为3-4cm，基底为墨绿色，菌落表面突起，产生白灰色孢子，释放大量黑色色素。

所述的一种链霉菌株制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法，所述提取链霉菌226541基因组DNA，及其16SrDNA的获得：

提取链霉菌226541基因组DNA：

1) 将菌株226541接种于50mL的TSB液体培养基中，在30℃下转速170rpm培养72小时，此时正处于对数生长期。收集发酵液1mL，8000r/min离心5min后弃上清液，洗涤液清洗菌体，离心后重复一次清洗；

2) 向洗涤后的菌体中加入100μL裂解液,悬浮菌体，100℃煮沸15min后冷却至室温； 

3) 加入65℃预热好的抽提液0.5mL，轻微震荡；

4) 加等体积Tris饱和酚/氯仿溶液，强烈震荡1min，10000r/min离心5min，小心吸取上清液，转移至干净的离心管；

5) 向上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻倒转混合两次，-20℃静置2小时；

6) 12000r/min离心5min，70%的乙醇洗涤一次，10000r/min离心5min，开口挥发至无醇味，干燥后溶于20μLTE缓冲液中，制得粗DNA；

16SrDNA序列的获得，16SrDNA PCR引物如下：

P1：5’一ATTCGGCACACAGAAAC一3’；

P2：5’一AGAGGAGAACCGIAGAC一3’。

所述的一种链霉菌株制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法，所述方法包括：冰城链霉菌226541在木聚糖酶产酶培养基中进行液体发酵，生产木聚糖酶；

首先，划线接种菌株226541于Bennett固体培养基上，在30℃下培养3-5天，待孢子生长良好时，用1000μL的枪头尾圆端取4块菌落接种于TSB液体培养基中，于30℃下转速170rpm培养48h，进行种子培养，吸取培养好的种子培养基，以5%的接种量接入50mL木聚糖酶产酶培养基中，在转速为170rpm，温度为30℃条件下培养， 菌株226541液体发酵生产木聚糖酶结果，发酵7天后木聚糖酶产量达到最高，酶活约为68.9 U/mL。

本发明提供一种性质优良，适应多种工业极端环境，例如高温、高酸碱、高盐等新的木聚糖酶。本发明人从哈尔滨化工厂样品中筛选到一种天然菌株，它所生产的木聚糖酶适合于在造纸、饲料、食品、酿酒以及能源工业中使用。经16SrDNA序列测定，其与Streptomyces sp. A4R2 (S34)具有较高的相似性(99.52%)，因此确定该菌株为冰城链霉菌。该菌株于2005年12月9日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101），其保藏号为：CGMCC No. 1734。

本发明菌株226541在Bennett固体培养基上生长时，菌落为圆形，致密，经过2-3天菌落表面生长出白灰色孢子，基底为墨绿色，产生黑色色素，生长速度较快。该菌株具有较好的寡营养性、pH耐受性和NaCl耐受性，在pH11的极端碱性条件下，菌株依然生长良好；在1%NaCl条件下，生长状况最佳。本发明菌株可在以木聚糖为唯一碳源的培养基中生长，所产生的发酵液具有降解木聚糖的能力。发酵7天时发酵酶活最高，可达68.9 U/ml。

本发明菌株226541所生产的木聚糖酶同时具有较好的pH稳定性、NaCl耐受性和热稳定性等特性。本发明筛选到的冰城链霉菌226541所生产的木聚糖酶，其最适pH值为6.0，在pH5-9的范围内维持80%以上的酶活性；最适温度为70℃，在45℃下处理60min，酶活性维持在88%以上；在60℃下处理60min，酶活性维持在在75%以上；本发明中的木聚糖酶最适底物为山毛榉木聚糖，无纤维素酶活性；该木聚糖酶具有很好的NaCl耐受性，当NaCl终浓度为1mol/L时，木聚糖酶酶活维持在86.6%；当NaCl终浓度为2M时，残留酶活70.4%；当NaCl终浓度为5mol/L时，残留酶活46.8%。

本发明中菌株226541所生产的木聚糖酶可降解多种农业废弃物，对菊芋秸秆的降解效果最佳。此外，对海洋来源的海带纤维也具有较好的降解性能，表明该木聚糖酶在海洋副产品加工生产方面有应用价值。

本发明的木聚糖酶在pH为9时，残留酶活为最大酶活性的83.3%，表现了较好的耐碱性，且在60℃下保持较高的酶活力，能够满足造纸中的生物漂白工艺，一定程度上水解纸浆中的半纤维素，使纸张成色、硬度、质量有所提高。更重要的是，代替或部分降低了氯化物的使用量，减少对环境的污染。本发明中木聚糖酶还可应用于酿酒工业，降低物料粘度，提高淀粉的利用率，增加酒精的产率。本发明中的木聚糖酶在能源工业中也显示出巨大的应用潜力，该酶在45℃下可长时间维持较高酶活，与目前同步糖化工艺温度一致，且可降解农业废弃物中的半纤维素为单糖，供下游工艺发酵利用，产生清洁可再生能源。

说明书附图

图1，本发明菌株226541寡营养耐受性结果；

图2，本发明菌株226541pH耐受性结果；

图3，本发明菌株226541NaCl耐受性结果；

图4，本发明菌株226541液体发酵生产木聚糖酶结果；

图5，本发明菌株226541木聚糖酶最适温度结果；

图6，本发明菌株226541木聚糖酶热稳定性结果；

图7，本发明菌株226541木聚糖酶最适pH结果；

图8，本发明菌株226541木聚糖酶pH稳定性结果；

图9，本发明菌株226541木聚糖酶NaCl耐受性结果。

具体实施方式

实验材料和试剂：

1.      菌株：菌株226541由本发明人从哈尔滨精细化工厂土壤样品中分离获得。

2. 生化试剂：

木聚糖：山毛榉木聚糖、桦木木聚糖、燕麦木聚糖（美国SIGMA公司）；

海带纤维购自（陕西慈缘生物技术有限公司）

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（Solarbio公司）；

测序由大连宝生物工程有限公司完成；

TaKaRa rTaq（大连宝生物工程有限公司）；

10xPCR Buffer（大连宝生物工程有限公司）；

dNTP Mixture（大连宝生物工程有限公司）。

提取菌株基因组DNA试剂：

洗涤液：50mmol/L Tris, 25mmol/L EDTA, 0.1%PVP, pH=8.0。

裂解液：50mmol/L Tris, 25mmol/L EDTA, 1.2%PVP, 3%SDS。

抽取液：10mmol/L Tris, 1mmol/L EDTA, 0.3mmol/L NaAC, pH=8.0。

提取液：苯酚：氯仿：异戊醇=25:24:1。

TE缓冲液：50mmol/L Tris，pH=8.0。

DNS试剂配方：

甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2 mL 10%的NaOH 中，用蒸馏水稀释至69 mL，再加入6.9g NaHSO₃；

乙液：称取255g 酒石酸钾钠，加入至300 mL 10% NaOH中，再向其中加入880 mL1%3,5-二硝基水杨酸溶液；

将甲乙两液相混即得到黄色DNS试剂，贮存于棕色试剂瓶中。在常温下，放置7-10天后使用，半年内有效。

3.      培养基

Bennett固体培养基：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉1g，牛肉膏1g，琼脂20g,

pH7.0。

木聚糖固体培养基：山毛榉木聚糖10g，NH₄NO₃ 4g，K₂HPO₄·3H₂O 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.3g，琼脂 20g，pH6.5-7.0。

富集培养基：（NH₄）₂SO₄ 5g, KH₂PO₄ 1g, MgSO₄·7H₂O 0.5g, FeSO₄·7H₂O 0.01g, CaCl₂ 0.2g, 山毛榉木聚糖 10g，pH 7.0。

TSB液体培养基：胰蛋白胨 17g，大豆蛋白胨 3.0g，葡萄糖 2.5g，K₂HPO₄·3H₂O 2.5g，NaCl 5g，pH 7.0。

木聚糖酶产酶培养基：K₂HPO₄·3H₂O 1.11g，KH₂PO₄ 3.65g，(NH₄)₂NO₃ 3g，MgSO₄·7H₂O 2.2g，CaCl₂ 0.3g，葡萄糖1.5g，蛋白胨2.5g，牛肉膏3g，山毛榉木聚糖10g，pH 6.5。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：本发明菌株的获得。

将来源于哈尔滨精细化工厂土壤样品经富集培养后，按常规稀释后涂布于木聚糖平板上，30℃培养5-6天，挑取产生透明圈菌落在木聚糖固体培养基上划线分离，重复划线分离过程3轮，使菌株纯化。通过此方法筛选到该分泌木聚糖酶的菌株。

本发明菌株在Bennett平板上30℃下培养7天，菌落呈圆形，直径约为3-4cm，基底为墨绿色，菌落表面突起，产生白灰色孢子，释放大量黑色色素。其最适pH为7.0-9.0，最适温度为30℃。该冰城链霉菌226541，于2005年12月9日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101），其保藏号为：CGMCC No. 1734。

实施例2：提取链霉菌226541基因组DNA，以及其16SrDNA的获得。

提取链霉菌226541基因组DNA：

1) 将菌株226541接种于50mL的TSB液体培养基中，在30℃下转速170rpm培养72小时，此时正处于对数生长期。收集发酵液1mL，8000r/min离心5min后弃上清液，洗涤液清洗菌体，离心后重复一次清洗。

2) 向洗涤后的菌体中加入100μL裂解液,悬浮菌体，100℃煮沸15min后冷却至室温。 

3) 加入65℃预热好的抽提液0.5mL，轻微震荡。

4) 加等体积Tris饱和酚/氯仿溶液，强烈震荡1min，10000r/min离心5min，小心吸取上清液，转移至干净的离心管。

5) 向上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻倒转混合两次，-20℃静置2小时。

6) 12000r/min离心5min，70%的乙醇洗涤一次，10000r/min离心5min，开口挥发至无醇味，干燥后溶于20μLTE缓冲液中，制得粗DNA。

16SrDNA序列的获得：

16SrDNA PCR引物如下：

P1：5’一ATTCGGCACACAGAAAC一3’

P2：5’一AGAGGAGAACCGIAGAC一3’

PCR反应条件如表1所示： 

                           表1 PCR反应条件

PCR反应体系如表2所示： 

                   表2 PCR反应体系

PCR反应体系	体积
		10xPCR buffer	5μL
dNTP Mixture（2.5mM）	4μL
		引物F（10μM）	2μL
引物R（10μM）	2μL
		DNA模板	50ng
TaKaRa rTaq	0.5μL
		DMSO（1%）	0.5μL
ddH2O	up to 50μL

实施例3：冰城链霉菌226541的寡营养耐受性，pH耐受性和NaCl耐受性的测定。

将Bennett固体培养基稀释1、2、3、5倍，用以测定本发明菌株226541的寡营养耐受性；调节Bennett固体培养基pH为5、7、9、11，以测定菌株226541的pH耐受性；向Bennett固体培养基中加入0%、1%、2%、3%NaCl，以测定菌株226541的NaCl耐受性。取50μL孢子溶液（浓度约为10⁶个/mL）分别均匀涂布于上述各个平板，于30℃下培养6天，观察菌落生长状态。结果（图1-3）表明菌株在稀释5倍的Bennett平板上生长良好，说明其较好的寡营养性耐受性；菌株226541在pH5的平板上生长较差，在pH11的平板上仍能正常生长，说明本发明菌株耐碱性较强，最适生长pH为7-9；菌株在1%NaCl平板上生长最佳，色素产量最多，表明本发明菌株具有较好的耐盐性。

图1. 菌株226541的寡营养耐受性结果。a. 对照；b. 稀释2倍；c. 稀释3倍；d. 稀释5倍。

图2. 菌株226541的pH耐受性结果。a. pH=5；b. pH=7；c. pH=9；d. pH=11。

图3. 菌株226541的NaCl耐受性结果。a对照；b. 1%NaCl；c. 2%NaCl；d. 3%NaCl。

实施例4：冰城链霉菌226541在木聚糖酶产酶培养基中进行液体发酵，生产木聚糖酶。

划线接种菌株226541于Bennett固体培养基上，在30℃下培养3-5天。待孢子生长良好时，用1000μL的枪头尾圆端取4块菌落接种于TSB液体培养基中，于30℃下转速170rpm培养48h，进行种子培养。吸取培养好的种子培养基，以5%的接种量接入50mL木聚糖酶产酶培养基中，在转速为170rpm，温度为30℃条件下培养。结果（图4）表明， 菌株226541液体发酵生产木聚糖酶结果。发酵7天后木聚糖酶产量达到最高，酶活约为68.9 U/mL。

实施例5：测定发酵液中木聚糖酶酶活。

将实施例3中的发酵液于8000rpm下离心10min，收集上清液作为粗酶液。粗酶液经过适当稀释，精确吸取粗酶液0.2 mL（每个样品3支平行试管），加底物（1%山毛榉木聚糖）1.8 mL。混合后于60℃水浴中反应5 min，反应结束后迅速加入DNS液3.0 mL终止反应，然后在沸水中煮沸5 min，取出后冷却至室温。加入蒸馏水至25 mL，摇匀。于540nm下测定OD值，根据木糖标准曲线换算木糖含量。空白对照，底物1.8 mL于60℃水浴中处理5 min后加入DNS试剂3.0 mL，再向其中加入0.2mL稀释后的粗酶液，其它处理与样品一致。以空白对照为参比测定样品吸光度A。1个酶活单位（U）定义为在上述的条件下，每分钟释放出1μmol木糖所需的酶量。

实施例6：冰城链霉菌226541木聚糖酶的酶学性质的测定。

1. 木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定。

木聚糖酶的最适温度的测定为在磷酸盐缓冲液（pH6.0）体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶分别在45、60、70℃下处理10-60min，冷却至室温后，再在60℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果（图5）表明，菌株226541木聚糖酶最适温度结果。其最适温度为70℃。木聚糖酶的热稳定性实验结果表明（图6），菌株226541木聚糖酶热稳定性结果。在45℃下处理60min后，酶活均保持在88%以上；在60℃下处理60min后，酶活残留75%以上。

2. 木聚糖酶的最适pH和pH稳定性测定。

将实施例3中稀释的粗酶液在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。山毛榉木聚糖用不同pH的酶反应缓冲液配置，50mM柠檬酸盐缓冲液4.0-6.0，50mM磷酸盐缓冲液6.0-8.0，50mM Tris-HCl缓冲液8.0-9.0。在60℃下进行木聚糖酶酶活测定。结果（图7）表明，菌株226541木聚糖酶最适pH结果。本发明菌株所产木聚糖酶的最适pH为6.0，在pH5-8的范围内，酶活性均稳持在最大酶活性的40%以上。粗酶液于上述各种不同pH的缓冲液中50℃处理30min，冷却至室温后酸碱滴定调节pH至6.0，再在pH6.0缓冲液体系中60℃下测定酶活性，以研究木聚糖酶的pH稳定性。结果（图8）表明，菌株226541木聚糖酶pH稳定性结果。木聚糖酶在pH5-9的范围内稳定，在pH为9的环境下，残留木聚糖酶酶活在最大酶活性的83.3%，说明此酶具有较好的耐碱性。

3. 木聚糖酶的最适底物及不同金属离子和化学试剂对酶活的影响。

分别以1%的山毛榉木聚糖、桦木木聚糖、燕麦木聚糖、滤纸为底物，在pH6.0、温度60℃体系下测定木聚糖酶活。结果（表3）表明，本发明菌株所产木聚糖酶的最适底物为山毛榉木聚糖，对农业废弃物玉米芯木聚糖也具有很好的降解性，该木聚糖酶无纤维素酶活性。在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1 mmol/L和10mmol/L。在60℃，pH6.0条件下测定酶活性。结果（表4）表明，低浓度的Mn²⁺、SDS和EDTA对木聚糖酶酶活有一定的抑制作用；高浓度的Zn²⁺和EDTA对酶活有一定的抑制作用，高浓度的Cu²⁺、Fe²⁺和SDS对酶活有强烈的抑制作用。高浓度的其他离子对酶活影响不大。

4. 木聚糖酶的NaCl耐受性。

向酶促反应体系中加入NaCl，终浓度为0.5-5mol/L，研究其对木聚糖酶酶活的影响，在60℃，pH6.0条件下测定酶活性。结果（图9）表明，菌株226541木聚糖酶NaCl耐受性结果。当NaCl终浓度为1mol/L时，木聚糖酶酶活维持在86.6%；当NaCl终浓度为2M时，残留酶活70.4%；当NaCl终浓度为5mol/L时，残留酶活46.8%。在极端高盐环境下，本发明菌株226541所产木聚糖酶依然保持较高酶活力，说明该木聚糖酶具有较好的NaCl耐受性。

5. 木聚糖酶对农业废弃物的降解。

将菊芋秸秆，玉米秸秆，稻草经粉碎后过60目筛，以固液比1:12用4%稀硫酸在121℃下处理1h，冷却至室温后用去离子水反复冲洗至pH为中性。过夜干燥后，分别称取1g上述物料与海带纤维溶于20mL50mM磷酸盐缓冲液（pH6.0）。60℃预热30min后，以50U/g比例加入粗酶液，60℃下反应1h，反应结束后吸取上清液，按实施例4中方法测定还原糖浓度。结果（表5）表明，本发明菌株所产木聚糖酶对菊芋秸秆和海带纤维有较好的降解性。海洋来源的海带纤维中含有一定比例的NaCl，本发明中的木聚糖酶具有较好的NaCl耐受性，依然可以高效降解海带纤维。说明本发明中的木聚糖酶在农业废弃物的转化利用方面有广阔的应用前景。

表3. 菌株226541木聚糖酶最适底物结果

底物	菌株226541（%）
		山毛榉木聚糖	100±2.77
桦木木聚糖	88.80±2.70
		燕麦木聚糖	89.14±3.63
玉米芯木聚糖	96.69±1.21
		滤纸	0±0.33

附：以山毛榉木聚糖为底物时的酶活为100%。

 

表4. 金属离子和化学试剂对菌株226541木聚糖酶的影响结果

附：以未加入离子处理的样品酶活为100%。

表5. 菌株226541对农业废弃物的降解结果

底物	相对降解率（%）
		菊芋秸秆	100±10.24
海带纤维	95.96±4.22
		玉米秸秆	66.82±7.08
稻草	63.16±9.30

附：以菌株226541木聚糖酶对菊芋秸秆的降解率为100%。

Claims (5)

1.一种链霉菌株，其特征在于，所述菌株为链霉菌菌属中的冰城链霉菌Streptomyces bingchenggensis，编号226541，2012年12月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC No.1734；该菌株属于放线菌门，放线菌目，链霉菌属；菌落在Bennett培养基平板，30℃生长时开始时为白色，致密，圆形，向四周扩展，2-3天后从菌落表面产生白灰色孢子，基底为墨绿色，并产生黑色色素，生长速度较快；该菌株筛选自哈尔滨太阳岛土壤样品，对极端环境有较好的耐受性，包括营养耐受性，pH耐受性，NaCl耐受性；适用于耐碱、耐盐木聚糖酶应用。

2.根据权利要求1所述的一种链霉菌株，其特征在于，所述该菌株所产木聚糖酶酶学性质如下：最适温度为70℃，最适pH为6.0，最适底物为山毛榉木聚糖；60℃水浴中孵育60min，酶活力残留75%以上；50℃，pH 5-9 缓冲液中孵育30min，酶活力残留80%以上；当NaCl终浓度为1mol/L时，木聚糖酶酶活维持在86.6%；当NaCl终浓度为2M时，残留酶活70.4%；当NaCl终浓度为5mol/L时，残留酶活46.8%。

3.一种链霉菌株制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法，其特征在于，所述方法包括：将来源于哈尔滨精细化工厂土壤样品经富集培养后，按常规稀释后涂布于木聚糖平板上，30℃培养5-6天，挑取产生透明圈菌落在木聚糖固体培养基上划线分离，重复划线分离过程3轮，使菌株纯化，筛选到该分泌木聚糖酶的菌株，本菌株在Bennett平板上30℃下培养7天，菌落呈圆形，直径约为3-4cm，基底为墨绿色，菌落表面突起，产生白灰色孢子，释放大量黑色色素。

4.根据权利要求3所述的一种链霉菌株制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法，其特征在于，所述提取链霉菌226541基因组DNA，及其16SrDNA的获得：

提取链霉菌226541基因组DNA：

1) 将菌株226541接种于50mL的TSB液体培养基中，在30℃下转速170rpm培养72小时，此时正处于对数生长期；收集发酵液1mL，8000r/min离心5min后弃上清液，洗涤液清洗菌体，离心后重复一次清洗；

2) 向洗涤后的菌体中加入100μL裂解液,悬浮菌体，100℃煮沸15min后冷却至室温； 

3) 加入65℃预热好的抽提液0.5mL，轻微震荡；

4) 加等体积Tris饱和酚/氯仿溶液，强烈震荡1min，10000r/min离心5min，小心吸取上清液，转移至干净的离心管；

5) 向上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻倒转混合两次，-20℃静置2小时；

6) 12000r/min离心5min，70%的乙醇洗涤一次，10000r/min离心5min，开口挥发至无醇味，干燥后溶于20μLTE缓冲液中，制得粗DNA；

16SrDNA序列的获得，16SrDNA PCR引物如下：

P1：5’一ATTCGGCACACAGAAAC一3’；

P2：5’一AGAGGAGAACCGIAGAC一3’。

5.根据权利要求3所述的一种链霉菌株制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法，其特征在于，所述方法包括：冰城链霉菌226541在木聚糖酶产酶培养基中进行液体发酵，生产木聚糖酶；

首先，划线接种菌株226541于Bennett固体培养基上，在30℃下培养3-5天，待孢子生长良好时，用1000μL的枪头尾圆端取4块菌落接种于TSB液体培养基中，于30℃下转速170rpm培养48h，进行种子培养，吸取培养好的种子培养基，以5%的接种量接入50mL木聚糖酶产酶培养基中，在转速为170rpm，温度为30℃条件下培养， 菌株226541液体发酵生产木聚糖酶结果，发酵7天后木聚糖酶产量达到最高，酶活约为68.9 U/mL。