CN106811438A - 一种秸秆降解酸化菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种秸秆降解酸化菌剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种秸秆降解酸化菌剂及其制备方法，属于生物技术领域，其包括里氏木霉菌(Trichoderma reesei)发酵液、绿色木霉菌(Trichoderma viride)发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液和酵母菌发酵液，所述里氏木霉菌发酵液、绿色木霉菌发酵液、醋酸杆菌发酵液和酵母菌发酵液的体积比为3:3:2:2。本发明菌剂有效利用霉菌所产生的高效水解纤维素、半纤维素的水解酶，配合酵母菌株及醋酸杆菌迅速将秸秆类物质转化为产甲烷菌可利用的乙酸等有机酸，协同进行作用提高产气速率，缩短沼气发酵时间，提高设备利用率，降低投资成本。

Description

一种秸秆降解酸化菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于秸秆生物处理技术领域，具体涉及一种秸秆降解酸化菌剂及其制备方法。
背景技术
近年来，社会对能源的需求越来越大，煤、石油等化石能源的过度开发利用不仅带来能源问题，更是带来大气污染等诸多环境问题，已严重影响人类社会的可持续发展。当前，清洁能源、绿色能源已成为全人类共同关注的热点问题和发展方向，沼气作为一种清洁的可再生能源因其原料来源广泛，易于产业化推广等优势更是备受关注。
伴随着农业废弃物的资源能源化，秸秆作为一种非常丰富的资源，我国每年秸秆产量达7亿吨，相当于3.5亿吨标准煤。但目前我国农作物秸秆的利用率低，如何充分利用这些资源而又使环境不受污染是现代农业面临的难题。利用秸秆生产沼气或生物天然气，实现其资源化，将成为缓解当今我国面临的“粮食、能源、环境”三大危机的重要途径之一。
秸秆的主要成分木质纤维素是由纤维素、半纤维素、木质素之间通过复杂的化学键紧密结合而成，不易被沼气发酵的微生物降解，致使发酵效率低下，在沼气发酵之前将秸秆有效降解酸化成小分子糖类和酸类物质，成为秸秆沼气发酵的关键所在。
目前在文献和专利中已有报道的复合菌剂在秸秆预处理生产沼气中的应用：中国发明专利CN101948752A公开了一种用于沼气发酵的复合菌剂。它包含了纤维素拟杆菌发酵液、巴氏芽孢梭菌发酵液、黑海甲烷袋状菌发酵液及马氏甲烷八叠球菌发酵液；该技术针对的是以牛粪为主要原料的沼气发酵，与秸秆沼气发酵存在不同。中国发明专利CN106148224A 公开了一种秸秆降解酸化菌剂及其制造方法，包含活性成分为产黄纤维单胞菌、产纤维二糖梭菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌的复合菌剂。其纤维素酶系组分不全、活性低，同时缺乏半纤维素降解酶严重影响秸秆原料的降解速率。中国发明专利CN104531767A公开了一种好氧酸化厌氧发酵秸秆产沼气的生产工艺，利用两相法生产秸秆沼气，但对于水解相菌株构成并未明确。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对秸秆沼气两相发酵的水解工艺，提供一种秸秆降解酸化菌剂，以提高秸秆酸化效率。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种秸秆降解酸化菌剂，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液、绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液和酵母菌发酵液，所述里氏木霉菌发酵液、绿色木霉菌发酵液、醋酸杆菌发酵液和酵母菌发酵液的体积比为3:3:2:2。
优选地，所述酸化菌剂中，所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)、所述绿色木霉菌(Trichodermaviride)、所述醋酸杆菌(Acetobacter aceti)和所述酵母菌的配比为：1~3U:100~300U:2×104～4×104CFU:1×104～2×104CFU。
优选地，所述里氏木霉菌(Trichodermareesei) 发酵液的酶活力为100~300U/ml，所述绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液的酶活力为10000~30000U/ml，所述醋酸杆菌(Acetobacter aceti)的浓度为2×106～4×106CFU/ml，所述酵母菌的浓度为1×106～2×106CFU/ml。
一种秸秆降解酸化菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1：分别制备里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液、绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液和酵母菌发酵液；
步骤S2：将所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液、绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液及酵母菌发酵液按体积比3:3:2:2混合，即得酸化菌剂。
优选地，所述酸化菌剂中，所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)、所述绿色木霉菌(Trichodermaviride)、所述醋酸杆菌(Acetobacter aceti)和所述酵母菌的配比为：1~3U:100~300U:2×104～4×104CFU:1×104～2×104CFU。
优选地，所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液的酶活力为100~300U/ml，所述绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液的酶活力为10000~30000U/ml，所述醋酸杆菌(Acetobacter aceti)的浓度为2×106～4×106CFU/ml，所述酵母菌的浓度为1×106～2×106CFU/ml。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1）本发明提供的秸秆降解酸化菌剂，是一种由里氏木霉菌、绿色木霉菌、醋酸杆菌和酵母菌复合而成的兼性厌氧分解菌剂。酸化过程中，由里氏木霉菌和绿色木霉菌产生的水解酶类主要针对纤维素和半纤维素的分解，两者协同在较短的时间(≤2天)内，即可有效破坏木质纤维素的结构，并可以将纤维素和半纤维素分解成可利用的糖类，提高木质纤维素、纤维素和半纤维素的降解率；同时醋酸杆菌与酵母菌协同作用迅速将前述分解而成的可利用糖转化为产甲烷菌可利用的乙酸、丁酸等小分子有机酸，大幅度加快整体秸秆沼气发酵的产气速率，显著降低原料的水力停留时间。
2）本发明构建的秸秆降解酸化菌剂具有以下优势：由里氏木霉及绿色木霉提供的纤维素、半纤维素水解酶酶系齐全，酶活力高，pH适用范围广，两者协同能够快速降解木质纤维素类原料。在微量曝气条件下，小分子糖类可迅速被醋酸杆菌及酵母菌协同利用并转化为乙酸等小分子有机酸，且转化得到的乙酸含量高，乙酸为产甲烷菌能够有限利用的小分子有机酸，这样有利于提高秸秆发酵产甲烷的产量。
3）本发明酸化菌剂应用于秸秆降解，尤其是沼气发酵工艺中秸秆的酸化降解，促进秸秆快速酸化，提高酸化效率。实践表明，本发明酸化菌剂可应用于玉米、小麦、水稻等秸秆产沼气发酵工艺中的酸化降解，能够显著提高纤维素、半纤维素的降解率和挥发性有机酸的含量，使纤维素的降解率达到25%以上，半纤维素的降解率达到25%以上，挥发性有机酸含量提高1倍以上。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步清楚阐述本发明的内容，但本发明的保护内容不仅仅局限于下面的实施例。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
本发明一种秸秆降解酸化菌剂，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液、绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液和酵母菌发酵液，所述里氏木霉菌发酵液、绿色木霉菌发酵液、醋酸杆菌发酵液和酵母菌发酵液的体积比为3:3:2:2。
其中，里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液是由里氏木霉菌(Trichodermareesei)CGMCC No.9537经发酵培养获得的发酵液。其中，里氏木霉菌(Trichodermareesei)CGMCC No.9537已于2014年8月25日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.9537。该菌种已在专利CN104328057A中公布。里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液的制备方法，参见中国专利CN104328057A中公开的里氏木霉菌(Trichodermareesei)CGMCC No.9537的发酵培养方法，具体包括以下步骤：
①种子液制备：将里氏木霉菌(Trichodermareesei) CGMCC No.9537接入PDA斜面培养基，29℃，培养144h，待孢子铺满斜面，用无菌生理盐水洗下孢子，配制成107个/mL的孢子悬浮液，以10%(v/v)的接种量接入液体种子培养基中，于29℃、180r/min条件下，培养24h，制备种子液；
②发酵培养：将步骤①制备的种子液以8%(v/v)的接种量接入50L发酵罐(3000mL/5000mL的装液量)中，接种后0~10h，通气比1：0.6，搅拌转速200r/min，培养温度30℃；10h之后，通气比1：1.5，搅拌转速200r/min，培养温度28℃；还原糖含量为0.3%以下时开始进行补料，补料培养基的质量配比组成为乳糖15%，玉米浆2%，硫酸铵0.6%，磷酸二氢钾0.4%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.05%，吐温80 0.03%，微量元素0.2%，pH值为4.0，余量为水，其加入速率为240mL/h，溶氧量为40%(v/v)，发酵周期为6d，得到里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液；
其中，所述PDA斜面培养基的配方为：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15~20克、自来水1000毫升、自然PH。上述液体种子培养基和发酵基础培养基的质量百分比组成均为微晶纤维素1%，乳糖2%，葡萄糖0.1%，玉米浆1%，酵母粉0.5%，硫酸铵0.2%，磷酸二氢钾0.6%，氯化钙0.05%，微量元素0.05%，pH值为4.5，余量为水。
绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液是由绿色木霉菌(Trichodermaviride)CGMCC No.5832经发酵培养获得的发酵液。绿色木霉菌(Trichodermaviride)CGMCCNo.5832已于2012年3月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.5832。该菌种已在专利CN105154414A中公布。绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液的制备方法，参阅中国专利CN105154414A中公开的绿色木霉菌(Trichodermaviride)的发酵培养方法，具体包括以下步骤：
①菌种的制备及扩大培养：将绿色木霉菌株(Trichoderma viride) CGMCC No.5832转接至PDA斜面培养基上，30℃，培养7天，得到斜面孢子；然后用无菌水洗涤所述斜面孢子，得到孢子洗涤液；在无菌条件下将所述孢子洗涤液接入已灭菌的三角瓶种子培养基(121~124℃，灭菌30min)中，于220r/min，30℃条件下，培养18h，得活化菌种；将所述活化菌种以0.3体积%的接种量接入一级种子罐中，于30℃，通气比1：0.6(v/v)的条件下，培养20h，得到一级种子液；将所述一级种子液以10体积%的接种量接入二级种子罐，于30℃，通气比1： 0.6(v/v)的条件下，培养10h，得到二级种子液；
②补料发酵培养：在发酵罐F1中加入24000L发酵基础培养基(以质量百分比计，葡萄糖3.0%，乳糖0.5%，玉米浆3.0%，硫酸铵0.6%，磷酸二氢钾0.5%，硫酸镁0.1%，氯化钙0.05%，微量元素0.01%，余量为水)。调节pH值为4.5，于121~124℃，灭菌30min；待培养基温度降至30℃，在无菌条件下，以发酵培养基体积的8%的接种量接入所述二级种子液，接种后0~8h，通气比为1： 1.0，搅拌转速为110r/min，培养温度为30℃；接种8h以后，通气比1：2.0，搅拌转速150r/min，培养温度28℃；当还原糖浓度在0.3重量%以下时，开始连续流加补料培养基进行补料，补料速率为每小时补料量为发酵液体积的的1.0%，当发酵液体积达到发酵罐容积的70%时，将发酵罐F1中1/2体积的发酵液导入二级发酵罐F2，以与发酵罐F1相同的补料速率连续补料培养，剩余的1/2体积的发酵液继续连续补料培养；待F1、F2的发酵液体积分别达到发酵罐容积的80%，以0.01/h稀释率D向F1、F2流加补料培养基，同时以与补料相同的速率，由F1、F2共同向下一级发酵罐F3连续输出发酵醪液，待F3发酵液体积与F1、F2分别相等时，终止发酵，发酵周期为10天，得到绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液；
其中：所述PDA斜面培养基的配方为：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15~20克、自来水1000毫升、自然PH。所述三角瓶种子培养基、一级种子罐及二级种子罐的组成均为，以质量百分比计，葡萄糖1.5%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.6%，玉米浆2%，余量为水。所述补料培养基组成为，玉米浆1.5%，硫酸铵0.7%，磷酸二氢钾0.4%，硫酸镁0.2%，氯化钙0.2%，微量元素0.1%，其余为淀粉酸解液（葡萄糖含量16重量%），调节pH值为4.4，于121~124℃下灭菌30min；所述微量元素的组成为，以质量百分比计，钼酸铵0.04%，硫酸锌0.2%，硫酸亚铁0.3%，硫酸锰0.1%，氯化钴0.15%，硫酸铜0.1%，余量为水；所述淀粉酸解液是通过如下制备方法获得的：用0.4重量%的盐酸溶液将淀粉配制成15重量%的淀粉浆，于115℃下酸解30min，酸解结束后用氢氧化钠调节pH值至4.5。
醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液是由醋酸杆菌(Acetobacter aceti) ATCCNo.15973经发酵培养获得的发酵液。其中，醋酸杆菌(Acetobacter aceti) ATCC No.15973可通过商业途径购买，例如：通过ATCC获得该菌株。醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液通过下述制备方法获得：将醋酸杆菌(Acetobacter aceti)ATCC No.15973接种于酵母粉-葡萄糖-乙醇培养基，所述酵母粉-葡萄糖-乙醇培养基的组成为：酵母粉1%，葡萄糖0.3%，无水乙醇8%，余量为水，在30℃条件下通风培养1d，收集所有的发酵液。
酵母菌发酵液是由酒精酵母经发酵培养获得的发酵液。其中，所说的酒精酵母可以是南阳五号酵母菌1300，该南阳五号酵母菌为我国酒精生产的常用酵母菌种，为公众知晓并可通过商业途径购买获得。酵母菌发酵液通过如下制备方法获得：将南阳五号酵母菌接种于麦芽汁培养基中，在32℃条件下通风培养1d，收集所有的发酵液。
将制备的上述里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液、绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液、醋酸杆菌发酵液、酵母菌发酵液经浓缩或稀释后，按体积比为3:3:2:2，配置混合菌液，混合，即得酸化菌剂；并确保该酸化菌剂中各菌的配比如下：所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)、所述绿色木霉菌(Trichodermaviride)、所述醋酸杆菌(Acetobacter aceti)和所述酵母菌的配比为：1~3U:100~300U:2～4×104CFU:1～2×104CFU。更加优选的是，上述酸化菌剂中，所述里氏木霉菌(Trichodermareesei) 发酵液的酶活力为100~300U/ml，所述绿色木霉菌(Trichodermaviride) 发酵液的酶活力为10000~30000U/ml，所述醋酸杆菌(Acetobacter aceti)的浓度为2×106～4×106CFU/ml，所述酵母菌的浓度为1×106～2×106CFU/ml。
上述秸秆降解酸化菌剂的使用方法，包括如下步骤：将秸秆粉碎为1~5cm的片段，在水解罐内配制一定固形物含量的物料浓度，添加所述酸化菌剂，间歇曝气同时低速搅拌，实现秸秆的快速降解。
实施例1
一种秸秆降解酸化菌剂，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液、绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液和南阳五号酵母菌发酵液，所述里氏木霉菌发酵液、绿色木霉菌发酵液、醋酸杆菌发酵液和酵母菌发酵液的体积比为3:3:2:2。
所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液的酶活力为100U/ml，所述绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液的酶活力为30000U/ml，所述醋酸杆菌(Acetobacter aceti) 的浓度为2×106CFU/ml，所述酵母菌的浓度为1×106CFU/ml。
所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)为里氏木霉菌(Trichodermareesei)CGMCC No.9537，所述绿色木霉菌(Trichodermaviride)为绿色木霉菌(Trichodermaviride) CGMCC No.5832，所述醋酸杆菌(Acetobacter aceti)为醋酸杆菌(Acetobacter aceti) ATCC No.15973，所述酵母菌为南阳五号酵母菌。
上述秸秆降解酸化菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1：分别参照上述方法制备里氏木霉菌(Trichodermareesei) CGMCC No.9537发酵液、绿色木霉菌(Trichodermaviride) CGMCC No.5832发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti) ATCC No.15973发酵液和南阳五号酵母菌发酵液；
步骤S2：将所述里氏木霉菌(Trichodermareesei) CGMCC No.9537发酵液、绿色木霉菌(Trichodermaviride) CGMCC No.5832发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti) ATCCNo.15973发酵液和南阳五号酵母菌发酵液按体积比3:3:2:2混合，即得酸化菌剂。
实施例2
一种秸秆降解酸化菌剂，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液、绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液和南阳五号酵母菌发酵液，所述里氏木霉菌发酵液、绿色木霉菌发酵液、醋酸杆菌发酵液和酵母菌发酵液的体积比为3:3:2:2。
所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液的酶活力为300U/ml，所述绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液的酶活力为10000U/ml，所述醋酸杆菌(Acetobacter aceti)的浓度为4×106CFU/ml，所述酵母菌的浓度为2×106CFU/ml。
本实施例秸秆降解酸化菌剂中各菌种类及其制备方法参阅实施例1。
实施例3
一种秸秆降解酸化菌剂，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液、绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液和南阳五号酵母菌发酵液，所述里氏木霉菌发酵液、绿色木霉菌发酵液、醋酸杆菌发酵液和酵母菌发酵液的体积比为3:3:2:2。
所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液的酶活力为150U/ml，所述绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液的酶活力为20000U/ml，所述醋酸杆菌(Acetobacter aceti)的浓度为3×106CFU/ml，所述酵母菌的浓度为1.5×106CFU/ml。
本实施例秸秆降解酸化菌剂中各菌种类及其制备方法参阅实施例1。
实施例4
一种秸秆降解酸化菌剂，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液、绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液和南阳五号酵母菌发酵液，所述里氏木霉菌发酵液、绿色木霉菌发酵液、醋酸杆菌发酵液和酵母菌发酵液的体积比为3:3:2:2。
所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液的酶活力为250U/ml，所述绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液的酶活力为26000U/ml，所述醋酸杆菌(Acetobacter aceti)的浓度为2.5×106CFU/ml，所述酵母菌的浓度为1×106CFU/ml。
本实施例秸秆降解酸化菌剂中各菌种类及其制备方法参阅实施例1。
实施例5
一种秸秆降解酸化菌剂，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液、绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液和南阳五号酵母菌发酵液，所述里氏木霉菌发酵液、绿色木霉菌发酵液、醋酸杆菌发酵液和酵母菌发酵液的体积比为3:3:2:2。
所述里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液的酶活力为200U/ml，所述绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液的酶活力为14000U/ml，所述醋酸杆菌(Acetobacter aceti)的浓度为3.5×106CFU/ml，所述酵母菌的浓度为1.5×106CFU/ml。
本实施例秸秆降解酸化菌剂中各菌种类及其制备方法参阅实施例1。
对比例1
一种秸秆降解酸化菌剂，包括绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液和酵母菌发酵液，所述绿色木霉菌发酵液、醋酸杆菌发酵液和酵母菌发酵液的体积比为3:2:2；各菌种类、浓度及其制备方法同实施例3。
对比例2
一种秸秆降解酸化菌剂，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液和酵母菌发酵液，所述里氏木霉菌发酵液、醋酸杆菌发酵液和酵母菌发酵液的体积比为3:2:2；各菌种类、浓度及其制备方法同实施例3。
对比例3
一种秸秆降解酸化菌剂，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液、绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液和酵母菌发酵液，所述里氏木霉菌发酵液、绿色木霉菌发酵液和酵母菌发酵液的体积比为3:3:2；各菌种类、浓度及其制备方法同实施例3。
对比例4
一种秸秆降解酸化菌剂，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液、绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液和醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液，所述里氏木霉菌发酵液、绿色木霉菌发酵液和醋酸杆菌发酵液的体积比为3:3:2，各菌种类、浓度及其制备方法同实施例3。
对比例5
一种秸秆降解酸化菌剂，包括里氏木霉菌(Trichodermareesei)发酵液、绿色木霉菌(Trichodermaviride)发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液和南阳五号酵母菌发酵液，所述里氏木霉菌发酵液、绿色木霉菌发酵液、醋酸杆菌发酵液和酵母菌发酵液的体积比为1：1：1：1。各菌种类、浓度及其制备方法同实施例3。
对比例6
一种秸秆降解酸化菌剂，包括产纤维二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)发酵液、产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液和南阳五号酵母菌发酵液；
其中，产纤维二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ACCC No .00522。产纤维二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)发酵液的制备方法参阅公开号为CN106148224 A的专利，具体为：将产纤维二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum) ACCC No .00522接种于蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基中，在室温(30℃)条件下静止培养1d，收集所有的发酵液；将经活化的菌种发酵液接种于蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基中，在培养温度为30℃的发酵罐中静止逐级扩大培养，扩大过程按5%的比例转接，当发酵液中的有效活菌数达到109个/mL时终止培养，得到产纤维二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum) ACCC No .00522发酵液；
产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为DSM No .11055；产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)发酵液的制备方法参阅公开号为CN106148224 A的专利，具体为：将产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena) ACCC No. 11055接种于蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基中，在室温(30℃)条件下静止培养1d，收集所有的发酵液；将经活化的菌种发酵液接种于蛋白胨纤维素培养液(PCS)改良培养基中，在培养温度为30℃的发酵罐中静止逐级扩大培养，扩大过程按5%的比例转接，当发酵液中的有效活菌数达到109个/mL时终止培养，得到产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena) ACCC No .11055发酵液；
醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液和南阳五号酵母菌发酵液的制备方法参阅本发明上述记载的对应方法，所述醋酸杆菌(Acetobacter aceti)的浓度为3×106CFU/ml，所述酵母菌的浓度为1.5×106CFU/ml。
该对比例秸秆降解酸化菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1：分别参照上述方法制备产纤维二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)发酵液、产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液和南阳五号酵母菌发酵液；
步骤S2：将所述产纤维二糖梭菌(Clostridium cellulolyticum)发酵液、产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液和南阳五号酵母菌发酵液按体积比3:3:2:2混合，即得酸化菌剂。
实施例6 秸秆降解酸化菌剂应用于玉米秸秆酸化处理
实验设计在100L酸解罐中进行，设计试验组、对照组和空白组：
试验组：设置3组，使用实施例1~3制备的秸秆降解酸化菌剂；
对照组：设置6组，分别使用对比例1~6制备的秸秆降解酸化菌剂；
空白组：不添加任何菌剂。
实施方法：将玉米秸秆粉碎为2~3cm的片段，每立方米酸解体系接种秸秆降解酸化菌剂10公斤(酸化菌剂添加量为酸解罐装料量的1%)，其余体积由自来水补充，水力停留时间为2天，连续运行20天。每天进料玉米秸秆3Kg(以干重计)。检测每天的纤维素、半纤维素和挥发性有机酸的含量，并计算降解率。其中，纤维素、半纤维素测定依据美国国家可再生能源实验室(NREL)方法，挥发性有机酸的检测方法参照Q/YZJ10-03-02-2000。
纤维素降解率＝已分解纤维素量×100%/总纤维素量，半纤维素降解率＝已分解半纤维素量×100%/总半纤维素量。
连续运行10天后，使用菌剂的处理，经过2天的预处理，玉米秸秆的纤维素降解率、半纤维素降解率和挥发性有机酸含量如表1所示。
表1 玉米秸秆的纤维素降解率、半纤维素降解率和挥发性有机酸含量
由表1可以看到，采用本发明实施例1~3秸秆降解酸化菌剂较空白组效果明显，纤维素降解率提高2.4~2.9倍，半纤维素降解率提高2.6~3.2倍，挥发性有机酸含量提高1.0~1.3倍。对照组较空白组虽然在纤维素、半纤维素降解率及其挥发性有机酸含量方面均有所提高，但是较试验组仍然差异明显。对照组中，对比例1~4制备的酸化菌剂用于降解玉米秸秆，所检测玉米秸秆的纤维素降解率、半纤维素降解率及挥发性有机酸含量较试验组而言均有不同程度地明显降低，可以看到本发明所使用酸化菌剂在玉米秸秆的降解过程中发挥了很好地协同作用，相互配合获得显著的降解效果。对比例5改变各菌种的有效含量，结果其对纤维素以及半纤维素的降解性能下降。对比例6采用已知的应用于秸秆酸化菌剂制备的两种菌替代本发明的两种菌，发现其对纤维素、半纤维素的降解率虽然较空白组有所提高，但是与试验组结果相比，差异显著。
实施例7 秸秆降解酸化菌剂应用于小麦秸秆酸化处理
实验设计于100L酸解罐进行，设计试验组、对照组和空白组：
试验组：设置3组，使用实施例1~3制备的秸秆降解酸化菌剂；
对照组：设置6组，分别使用对比例1~6制备的秸秆降解酸化菌剂；
空白组：不添加任何菌剂。
实施方法：将小麦秸秆粉碎为1~2cm的片段，按每立方米酸解体系接种秸秆降解酸化菌剂10公斤(菌剂添加量为酸解罐装料量的1%)，其余体积由自来水补充，水力停留时间为2天，连续运行30天。每天进料小麦秸秆3.5Kg(以干重计)。检测每天的纤维素、半纤维素和挥发性有机酸的含量，并计算降解率。
连续运行15天后，使用菌剂的处理，经过3天的预处理，小麦秸秆的纤维素降解率、半纤维素降解率和挥发性有机酸含量如表2所示。
表2 小麦秸秆的纤维素降解率、半纤维素降解率和挥发性有机酸含量
由表2可以看到，采用本发明实施例1~3秸秆降解酸化菌剂较空白组效果明显，纤维素降解率提高2.1~2.5倍，半纤维素降解率提高1.6~2.1倍，挥发性有机酸含量提高1.3~1.7倍。对照组较空白组虽然在纤维素、半纤维素降解率及其挥发性有机酸含量方面均有所提高，但是较试验组仍然差异明显。对照组中，对比例1~4制备的酸化菌剂用于降解小麦秸秆，所检测小麦秸秆的纤维素降解率、半纤维素降解率及挥发性有机酸含量较试验组而言均有不同程度的降低，可以看到本发明所使用酸化菌剂在小麦秸秆的降解过程中发挥了很好地协同作用，相互配合获得显著的降解效果。对比例5改变各菌种的有效含量，结果其对小麦纤维素以及半纤维素的降解性能下降。对比例6采用已知的应用于秸秆酸化菌剂制备的两种菌替代本发明的两种菌，发现其对小麦纤维素、半纤维素的降解率虽然较空白组有所提高，但是与试验组结果相比，差异显著。
实施例8 秸秆降解酸化菌剂应用于水稻秸秆酸化处理
实验设计于100m3酸解罐进行，设计试验组、对照组和空白组：
试验组：设置3组，使用实施例1~3制备的秸秆降解酸化菌剂；
对照组：设置6组，分别使用对比例1~6制备的秸秆降解酸化菌剂；
空白组：不添加任何菌剂。
实施方法：将水稻秸秆粉碎为4~5cm的片段，按每立方米酸解体系接种秸秆降解酸化菌剂10公斤(菌剂添加量为酸解罐装料量的1%)，其余体积由自来水补充，水力停留时间为3天，连续运行30天。每天进料水稻秸秆300Kg(以干重计)。检测每天的纤维素、半纤维素和挥发性有机酸的含量，并计算降解率。
连续运行15天后，使用菌剂的处理，经过3天的预处理，水稻秸秆的纤维素降解率、半纤维素降解率和挥发性有机酸含量如表3所示。
表3 水稻秸秆的纤维素降解率、半纤维素降解率和挥发性有机酸含量
由表3可以看到，采用本发明实施例1~3秸秆降解酸化菌剂较空白组效果明显，纤维素降解率提高2.0~2.5倍，半纤维素降解率提高1.7~1.9倍，挥发性有机酸含量提高1.2~1.4倍。对照组较空白组虽然在纤维素、半纤维素降解率及其挥发性有机酸含量方面均有所提高，但是较试验组仍然差异明显。对照组中，对比例1~4制备的酸化菌剂用于降解水稻秸秆，所检测水稻秸秆的纤维素降解率、半纤维素降解率及挥发性有机酸含量较试验组而言均有不同程度的降低，可以看到本发明所使用酸化菌剂在水稻秸秆的降解过程中发挥了很好地协同作用，相互配合获得显著的降解效果。对比例5改变各菌种的有效含量，结果其对水稻纤维素以及半纤维素的降解性能下降。对比例6采用已知的应用于秸秆酸化菌剂制备的两种菌替代本发明的两种菌，发现其对水稻纤维素、半纤维素的降解率虽然较空白组有所提高，但是与试验组结果相比，差异显著。
综上可知，本发明秸秆酸化菌剂并非随意搭配获得，而且各菌种种类及活性对所得酸化菌剂降解秸秆的效率均存在显著的影响，相互协同增强秸秆水解酸化过程中纤维素和半纤维素的降解率以及挥发性有机酸含量，进而提高甲烷的产量。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.一种秸秆降解酸化菌剂，其特征在于：包括里氏木霉菌(Trichoderma reesei)发酵液、绿色木霉菌(Trichoderma viride)发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液和酵母菌发酵液，所述里氏木霉菌发酵液、绿色木霉菌发酵液、醋酸杆菌发酵液和酵母菌发酵液的体积比为3:3:2:2。
2.如权利要求1所述的秸秆降解酸化菌剂，其特征在于：所述酸化菌剂中，所述里氏木霉菌(Trichoderma reesei)、所述绿色木霉菌(Trichoderma viride)、所述醋酸杆菌(Acetobacter aceti)和所述酵母菌的配比为：1~3U:100~300U:2×104～4×104CFU:1×104～2×104CFU。
3.如权利要求2所述的秸秆降解酸化菌剂，其特征在于：所述里氏木霉菌(Trichoderma reesei)发酵液的酶活力为100~300U/ml，所述绿色木霉菌(Trichoderma viride)发酵液的酶活力为10000~30000U/ml，所述醋酸杆菌(Acetobacter aceti)的浓度为2×106～4×106CFU/ml，所述酵母菌的浓度为1×106～2×106CFU/ml。
4.一种秸秆降解酸化菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤S1：分别制备里氏木霉菌(Trichoderma reesei)发酵液、绿色木霉菌(Trichoderma viride)发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液和酵母菌发酵液；
步骤S2：将所述里氏木霉菌(Trichoderma reesei)发酵液、绿色木霉菌(Trichoderma viride)发酵液、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵液及酵母菌发酵液按体积比3:3:2:2混合，即得酸化菌剂。
5.如权利要求4所述的秸秆降解酸化菌剂的制备方法，其特征在于：所述酸化菌剂中，所述里氏木霉菌(Trichoderma reesei)、所述绿色木霉菌(Trichoderma viride)、所述醋酸杆菌(Acetobacter aceti)和所述酵母菌的配比为：1~3U:100~300U:2×104～4×104CFU:1×104～2×104CFU。
6.如权利要求5所述的秸秆降解酸化菌剂的制备方法，其特征在于：所述里氏木霉菌(Trichoderma reesei)发酵液的酶活力为100～300U/ml，所述绿色木霉菌(Trichoderma viride)发酵液的酶活力为10000～30000U/ml，所述醋酸杆菌(Acetobacter aceti)的浓度为2×106～4×106CFU/ml，所述酵母菌的浓度为1×106～2×106CFU/ml。
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