CN103409383B - 一种增强米曲霉固态发酵中木质素降解的技术 - Google Patents

Abstract

本发明一种增强米曲霉固态发酵中木质素降解的技术，涉及生物工程领域。是秸秆经过粉碎、用含有适量过氧化氢的等预处理工艺，然后接入降解木质素的黄孢原毛平革菌菌种，可以增强固态发酵降解秸秆木质素的降解，而纤维素在此过程中很少降解。此技术工艺简便，不会对环境造成污染，也不会对资源造成浪费。采用此方法加工的秸秆可用做制备生物乙醇和丁醇的原料以及作为生物饲料，而有助于提高秸秆的利用价值。

Description

一种增强米曲霉固态发酵中木质素降解的技术

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特指用过氧化氢预处理未经高温、高压处理的秸秆，增强米曲霉固态发酵秸秆木质素降解，抑制纤维素降解的技术。

背景技术

能源是经济和社会发展的重要物质基础。工业革命以来，世界化石能源资源消耗迅速，生态环境不断恶化，特别是温室气体排放导致日益严峻的全球气候变化，人类社会的可持续发展受到严重威胁。上世纪70年代以来，可持续发展思想逐步成为国际社会共识，可再生能源开发利用受到世界各国高度重视，许多国家将开发利用可再生能源作为能源战略的重要组成部分，提出了明确的可再生能源发展目标，制定了鼓励可再生能源发展的法律和政策，可再生能源得到迅速发展。目前，我国已成为世界能源生产和消费大国，但人均能源消费水平还很低。随着经济和社会的不断发展，我国能源需求将持续增长。增加能源供应、保障能源安全、保护生态环境、促进经济和社会的可持续发展，是我国经济和社会发展的一项重大战略任务。可再生能源是我国重要的能源资源，在满足能源需求、改善能源结构、减少环境污染、促进经济发展等方面已发挥了重要作用。其中生物质能的开发是可再生能源的一个重要方面。而以纤维质原料发酵生产燃料乙醇或其他生物燃料是生物质能开发的一个重要方面。然而纤维质原料中存在含量仅次于纤维素含量的木质素，它以晶体形式包裹在纤维素周围，保护纤维素不容易被微生物或酶制剂降解，因此以纤维质原料发酵生产生物燃料的存在的最主要的问题是如何破坏纤维质原料中的木质素。

目前破坏秸秆中木质素的主要方法有蒸汽汽爆预处理、硫酸预处理、氢氧化钠预处理、氨水预处理和生物预处理等5种方法。这些方法普遍由于投资大、成本高、二次污染等问题，而难以工业化生产。近年来利用生物降解秸秆木质素的专利及论文已有大量的报道如专利（申请号/专利号:200810064332）介绍了强化白腐真菌分泌锰过氧化物酶方法，此方法比现有的白腐真菌发酵锰过氧化物酶的方法提前了三天，发酵周期缩短了一半，酶产量高于900U/L；专利（申请号：200680022879）目标是增加白腐担子菌生产胞外漆酶和锰过氧化物酶的产量，并降低成本，此方法相对于现有培养技术，可使漆酶和锰过氧化物酶产量显著增加；专利（申请号：200910079781）介绍了另一种锰过氧化物酶产生菌——哈茨木霉，该菌可在短期内（4-5天）形成大量分生孢子，其形成分生孢子的速度比黄孢原毛平革菌快约一周时间，且产孢子能力可以达到黄孢原毛平革菌的10倍，而黄孢原毛平革菌则是担子菌中生长和产孢子能力较强的菌种；专利（申请号：200610109413）的目的在于克服目前白腐真菌降解木质素的不足之处，而提供一种新型的降解木质素的微生物菌剂以及利用上述菌剂降解木质纤维素的方法。

但是这些专利技术都有一个共性问题就是生物在降解木质素时，如何控制纤维素的降解，因为纤维素是生物发酵乙醇的主要原料，只有在生物预处理过程中控制纤维素的降解才能提高生物乙醇、丁醇等燃料的得率。

本发明人经过深入的研究，摸索出一种以秸秆为主要原料，通过米曲霉固体培养降解秸秆中木质素的方法。该方法与过去的方法不同之处在于所使用的菌种是被美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料公定协会(AAFCO)、 我国农业部认定的可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂的米曲霉菌种，采用秸秆作为主要原料，通过固态发酵降解秸秆中木质素，同时控制纤维素的降解。

发明内容

本发明一个目的是提供了一种以米曲霉为菌种，通过固态发酵降解秸秆木质素的同时控制纤维素的降解技术，采用此技术发酵秸秆所得到的发酵物用于发酵生物燃料，如乙醇和丁醇，可以极大的提高生物燃料的得率。

一种增强米曲霉固态发酵中木质素降解的技术，以米曲霉为出发菌株，进行试管扩大培养、液体摇瓶培养、一级种子培养和固体发酵培养，得到含有锰过氧化物酶的米曲霉固体发酵物。

本发明所用的菌种是米曲霉（Aspergillus oryzae），任何一种菌种，如中国普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心 (CICC)、中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)、国家兽医微生物菌种保藏中心 (CVCC)和抗生素菌种保藏管理中心等等保藏的菌种。

本发明所使用的原料是任意一种秸秆，如玉米秸秆、稻草秸秆、麦秸秆、高粱秸秆、大豆秸秆、棉花秸秆等等所有含有木质素的农作物秸秆，秸秆首先经过粉碎，过20～100目的筛。

本发明所述的一级菌种培养基为：麸皮与水按1：0.5～3（质量比）比例混匀， pH自然，分装500mL三角瓶，每瓶80～200g，110～135℃灭菌30～180分钟。

二级扩大菌种培养基为玉米芯与水按1：0.5～4（质量比）比例混匀，然后加入玉米芯和水总重量的0～5％黄豆饼粉，0～5％玉米浆（质量比），混合均匀，pH自然，110～130℃灭菌30～180分钟。

其中所述的固态培养基为：秸秆，过氧化氢和水按1:0.2～1：0.5～4（质量比）混合均匀，反应3～24小时，加入玉米芯、过氧化氢和水总重量（质量比）的0～5％黄豆饼粉，0～5％玉米浆，即为发酵培养基。

其中所述的一级菌种培养工艺为，接种一环米曲霉试管斜面孢子于装有20～100g一级菌种培养基的250mL三角瓶中，20～50℃，静置培养24～120小时；其中所述的二级菌种扩大培养工艺为一级菌种按1：5～100的比例（菌种与二级扩大菌种培养基重量比）接种二级扩大菌种培养基上，混合均匀，平铺于固态发酵床上培养，培养料厚度4～40cm，料宽0.5～2米，长度不限，通气量为0.3～1.5：1（气体体积/发酵培养基重量）/分钟，培养时间为3～23天，中途翻料1～2次； 其中所述的控制纤维素降解的秸秆木质素降解发酵工艺为：二级菌种按1：5～100的比例（菌种与固体发酵培养基重量比）接种到固体发酵培养基上，混合均匀，平铺于固态发酵床上培养，培养料厚度4～40cm，料宽0.5～2米，长度不限，通气量为0.3～1.5：1（气体体积/发酵培养基重量）/分钟，培养时间为10天～60天，中途翻料1～5次。采用此工艺采用固态发酵，并且原材料不经高温高压处理，这样不会给环境造成污染，也不会浪费资源。木质素降解率可以达到75～98％，纤维素降解率0～2％。

采用该工艺技术降解秸秆木质素后的发酵物可以用于发酵乙醇、丁醇等生物燃料的原料。

为了进一步阐述本发明的技术方案所涉及的材料及工艺，给出了以下实施例，但是这些实施例不以任何形式限制本发明的范围。

具体实施方式

木质素含量的测定参见杨胜主编《饲料分析及饲料质量检测技术》（第1版）第四章纤维素的分析测定。木质素降解率计算按Tsang 等的方法：

实施例1

1、试管斜面菌种的制作

在新配置的马铃薯蔗糖培养基（诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页）中接入一环米曲霉菌种（中国普通微生物菌种保藏管理中心CCGMC3.5232），26℃，培养时间50小时；4℃保存备用。

2、一级菌种制作

麸皮与水按1：0.5（质量比）比例混匀， pH自然，分装500mL三角瓶，每瓶200g， 135℃灭菌30分钟；冷却后接种一环米曲霉试管斜面孢子， 21℃，静置培养115小时。

3、二级扩大菌种制备

玉米芯与水按1：0.5（质量比）比例混匀，然后加入玉米芯和水总重量的5％黄豆饼粉， 5％玉米浆（质量比），混合均匀，pH自然，110℃灭菌170分钟；按1：5的比例（菌种与二级扩大菌种培养基重量比）接种一级菌种，混合均匀，平铺于固态发酵床上培养，培养料厚度38cm，料宽0.5米，长度不限，通气量为1.45：1（气体体积/发酵培养基重量）/分钟，培养时间为22天，中途翻料2次。

4、固态发酵降解秸秆木质素

秸秆，过氧化氢和水按1:0.2：3.9（质量比）混合均匀，反应23小时，加入玉米芯、过氧化氢和水总重量的4.8％黄豆饼粉，0.1％玉米浆（质量比），即为发酵培养基；二级菌种按1：98的比例（菌种与固体发酵培养基重量比）接种到固体发酵培养基上，混合均匀，平铺于固态发酵床上培养，培养料厚度39cm，料宽0.5米，长度不限，通气量为0.32：1（气体体积/发酵培养基重量）/分钟，培养时间为9天，中途翻料1次。

5、发酵结束后，分析木质素和纤维素含量，以及发酵过程中的失重率，经过计算得到木质素降解率可以达到76％，纤维素降解率0.2％。

实施例2

1、试管斜面菌种的制作

在新配置的马铃薯蔗糖培养基（诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页）中接入一环米曲霉菌种（中国农业微生物菌种保藏管理中心ACCC30155），26℃，培养时间50小时；4℃保存备用。

2、一级菌种制作

麸皮与水按1：1.8（质量比）比例混匀， pH自然，分装500mL三角瓶，每瓶132g，124℃灭菌117分钟；冷却后接种一环米曲霉试管斜面孢子， 36℃，静置培养68小时。

3、二级扩大菌种制备

玉米芯与水按1：2.6（质量比）比例混匀，然后加入玉米芯和水总重量的2.3％黄豆饼粉，2.2％玉米浆（质量比），混合均匀，pH自然，124℃灭菌100分钟；按1：48的比例（菌种与二级扩大菌种培养基重量比）接种一级菌种，混合均匀，平铺于固态发酵床上培养，培养料厚度24cm，料宽1.2米，长度不限，通气量为0.8：1（气体体积/发酵培养基重量）/分钟，培养时间为12天，中途翻料2次。

4、固态发酵降解秸秆木质素

秸秆，过氧化氢和水按1:0.6：2.6（质量比）混合均匀，反应13小时，加入玉米芯、过氧化氢和水总重量的2.5％黄豆饼粉，2.8％玉米浆（质量比），即为发酵培养基；二级菌种按1：58的比例（菌种与固体发酵培养基重量比）接种到固体发酵培养基上，混合均匀，平铺于固态发酵床上培养，培养料厚度25cm，料宽1.3米，长度不限，通气量为1.8：1（气体体积/发酵培养基重量）/分钟，培养时间为38天，中途翻料3次。

5、发酵结束后，分析木质素和纤维素含量，以及发酵过程中的失重率，经过计算得到木质素降解率可以达到85％，纤维素降解率1.12％。

实施例3

1、试管斜面菌种的制作

在新配置的马铃薯蔗糖培养基（诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页）中接入一环米曲霉菌种（中国工业微生物菌种保藏管理中心 CICC2001），26℃，培养时间50小时；4℃保存备用。

2、一级菌种制作

麸皮与水按1：2.9比例混匀， pH自然，分装500mL三角瓶，每瓶83g，110℃灭菌170分钟；冷却后接种一环米曲霉试管斜面孢子， 48℃，静置培养25小时。

3、二级扩大菌种制备

玉米芯与水按1：3.9（质量比）比例混匀，然后加入玉米芯和水总重量的0％黄豆饼粉，0％玉米浆（质量比），混合均匀，pH自然，130℃灭菌32分钟；按1：97的比例（菌种与二级扩大菌种培养基重量比）接种一级菌种，混合均匀，平铺于固态发酵床上培养，培养料厚度4.5cm，料宽1.8米，长度不限，通气量为0.4：1（气体体积/发酵培养基重量）/分钟，培养时间为3天，中途翻料1次。

4、固态发酵降解秸秆木质素

秸秆，过氧化氢和水按1:0.9：0.5（质量比）混合均匀，反应4小时，加入玉米芯、过氧化氢和水总重量的0.1％黄豆饼粉，4.5％玉米浆（质量比），即为发酵培养基；二级菌种按1：6的比例（菌种与固体发酵培养基重量比）接种到固体发酵培养基上，混合均匀，平铺于固态发酵床上培养，培养料厚度4cm，料宽2米，长度不限，通气量为1.5：1（气体体积/发酵培养基重量）/分钟，培养时间为56天，中途翻料5次。

5、发酵结束后，分析木质素和纤维素含量，以及发酵过程中的失重率，经过计算得到木质素降解率可以达到98％，纤维素降解率2％。

Claims (1)

1. 一种增强米曲霉固态发酵中木质素降解的方法，其特征在于按照下述步骤进行

（1）试管斜面菌种的制作

在新配置的马铃薯蔗糖培养基中接入一环米曲霉菌种CGMCC3.5232，26℃，培养时间50小时；4℃保存备用；

（2）一级菌种制作

麸皮与水按质量比1：0.5比例混匀， pH自然，分装500mL三角瓶，每瓶200g， 135℃灭菌30分钟；冷却后接种一环米曲霉试管斜面孢子， 21℃，静置培养115小时；

（3）二级扩大菌种制备

玉米芯与水按质量比为1：0.5比例混匀，然后加入玉米芯和水总重量的5％黄豆饼粉，按照质量比为5％玉米浆，混合均匀，pH自然，110℃灭菌170分钟，即为二级扩大菌种培养基；按菌种与二级扩大菌种培养基重量比为1：5的比例接种一级菌种，混合均匀，平铺于固态发酵床上培养，培养料厚度38cm，料宽0.5米，长度不限，通气量以气体体积/发酵培养基重量计为（1.45：1）/分钟，培养时间为22天，中途翻料2次；

（4）固态发酵降解秸秆木质素

玉米芯，过氧化氢和水按质量比为1:0.2：3.9混合均匀，反应23小时，加入玉米芯、过氧化氢和水总重量的4.8％黄豆饼粉，质量比为0.1％的玉米浆，即为固体发酵培养基；二级菌种按菌种与固体发酵培养基重量比为1：98的比例接种到固体发酵培养基上，混合均匀，平铺于固态发酵床上培养，培养料厚度39cm，料宽0.5米，长度不限，通气量以气体体积/发酵培养基重量计为（0.32：1）/分钟，培养时间为9天，中途翻料1次；

（5）发酵结束后，分析木质素和纤维素含量，以及发酵过程中的失重率，经过计算得到木质素降解率达到76％，纤维素降解率0.2％。