CN116083405A - 一种酒糟降解酶制剂及菌酶协同生产单细胞蛋白的方法 - Google Patents

一种酒糟降解酶制剂及菌酶协同生产单细胞蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物和酶技术领域，公开一种酒糟降解酶制剂及菌酶协同生产单细胞蛋白的方法。所述酒糟降解酶制剂包括主酶系和辅助酶系，其中主酶系是里氏木霉A2H菌株液态发酵生产的纤维素酶发酵液；辅助酶系是过表达SDR脱氢酶和FAE阿魏酸酯酶基因的黑曲霉60B‑3DW的重组菌株进行发酵的发酵液。基于酒糟降解酶制剂的开发，饲用菌株里氏木霉和米曲霉通过菌酶协同作用将酒糟进行固态发酵生产单细胞蛋白。本发明对酒糟进行发酵的周期短，真正实现酒糟变废为宝，从根本上解决酿酒丢糟带来的环境污染、养殖安全问题，打造酒糟循环经济产业链。

Description

一种酒糟降解酶制剂及菌酶协同生产单细胞蛋白的方法
技术领域
本发明属于发酵酒糟饲料及生产酒糟来源的单细胞蛋白应用技术领域，涉及酒糟降解酶制剂及菌酶协同生产单细胞蛋白的方法，包括酒糟降解酶制剂，及其与饲用菌株米曲霉菌株/黑曲霉协同固态发酵中的应用。
背景技术
糟渣是酿酒发酵后产生的大量废弃物，高含水量、高含酸量的特性致使其极易腐烂变质，滋生黄曲霉素等毒素，造成二次环境污染。固态酒糟是白酒生产的主要副产物，也是白酒生产的主要污染物。据统计，酒糟的产生量是白酒产量的4至8倍，目前仅中国需处理的酒糟达5000万吨以上，由此带来的农业、工业废弃物给国家的环保工作带来巨大压力。直接烘干或制有机肥等低效粗放的传统处理方式已经不能适应酿酒工业绿色发展需求。
酿酒一般采用高粱、小麦等原料，酒糟中含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素以及各种微量元素等。另一方面，由于特殊的生产工艺，鲜酒糟含水量高，不易贮存与运输，加之酿酒厂生产的周期性与利用季节性之间存在的矛盾，酒糟易腐败变质；此外，酒糟中含有35.6%的稻壳，粗纤维含量达18.6%，严重影响了酒糟营养价值的发挥，因此，酒糟的利用率不高，大部分被废弃或者燃烧，既浪费资源，又污染环境。目前对利用酒糟开发为发酵饲料，已有不少研究。但存在酒糟中木质纤维素降解不充分，饲料粗蛋白含量不高，且发酵周期长等一系列问题，从而限制酒糟开发为绿色饲品资源的产业化进程。
目前对利用酒糟开发为发酵饲料，已有不少研究。但存在酒糟中木质纤维素降解不充分，饲料粗蛋白含量不高，且发酵周期长等一系列问题，从而限制酒糟开发为绿色饲品资源的产业化进程。
发明内容
针对这个问题，本发明专利开发酒糟发酵专用酶制剂，以此开发菌酶协同固态发酵的酒糟单细胞蛋白相关技术，酱香型、清香型、浓香型、工业酒精酒糟等来源的单细胞蛋白产品中蛋白含量>28%, 氨基酸含量>22%,营养价值高，发酵周期短，真正实现酒糟变废为宝，从根本上解决酿酒丢糟带来的环境污染、养殖安全问题，打造白酒循环经济产业链。
本发明提供一种酒糟单细胞蛋白的酒糟降解酶制剂，其包括主酶系和辅助酶系，其主酶系是里氏木霉（ Trichoderma reesei）A2H菌株液态发酵生产的纤维素酶发酵液；辅助酶系是过表达SDR脱氢酶和FAE阿魏酸酯酶基因的黑曲霉（ Aspergillus niger）60B-3DW的重组菌株进行发酵的发酵液。
优选地，主酶系：辅助酶系重量配比为7-10:1。
具体地，所述发酵液是通过对发酵后的培养液进行固液分离，收集上清液而得到。
优选地，SDR 脱氢酶氨基酸序列：NCBI登录号XP_046074751.1；FAE氨基酸序列：NCBI登录号AQQ72604.1。
在一个实施方式中，里氏木霉A2H菌株培养条件为：温度为24℃~28℃，pH4.8~5.2，转速250~300 rpm，发酵液中溶氧量25~35 %(v/v)，培养24~120小时；所述培养中的培养基包含如下组分：葡萄糖20~30 g/L，玉米浆干粉2~6 g/L，KOH 1.60~1.72 g/L，(NH4)2SO42.6~3.0 g/L和MgSO40.4~0.8 g/L。
优选地，所述培养中，所述培养基包含如下组分：葡萄糖25 g/L，玉米浆干粉4 g/L，KOH 1.66 g/L，(NH4)2SO42.8 g/L和MgSO40.6 g/L。
另外的实施方式中，所述重组菌株培养条件为：温度26~30℃和转速140~200转/分的条件下培养144~182小时；培养所用的发酵培养基包含如下组分：玉米芯45~55 g/L，酵母粉4~6 g/L，麦芽提取物4~6 g/L，硫酸铵2.6~3 g/L，磷酸二氢钾3~5 g/L，结晶硫酸镁0.8~1.0 g/L，结晶氯化钙0.8~1.0 g/L，初始pH调到6.0。
本发明进一步提供所述的酒糟降解酶制剂在降解酒糟中的应用。具体地，所述酒糟选自酱香型酒糟、清香型酒糟、浓香型酒糟、工业酒精酒糟。
本发明还提供一种利用酒糟通过菌酶协同生产单细胞蛋白的方法，其在酒糟中添加1-5%所述的酒糟降解酶制剂，并接种米曲霉（ Aspergillus oryzae）A02和里氏木霉A2H，进行固态发酵培养，获得菌体蛋白。
优选地，所述酒糟选自酱香型酒糟、清香型酒糟、浓香型酒糟、工业酒精酒糟，按照料水比1:2-3加入水，作为固态发酵的培养基固态发酵是在25-32℃下培养48-96小时。
本发明是利用相关技术将酒糟制备成生物发酵饲料，对其进行大体量、规范化处理，能够真正做到酒糟的无害化与资源化利用。同时，白酒/工业酒糟富含有机物质，可以生产出的高蛋白的酒糟发酵饲料，用作饲料反哺畜牧业，真正做到酒糟资源变废为宝，实现传统农业蛋白如玉米、豆粕减量替代，减缓人畜争粮，形成“农业-酿酒-畜牧-农业”的完美生态循环。
附图说明
图1 神经网络模型预测酒糟降解需要最优酶系组成。
图2 SDR与FAE；条带1，完整的FAE 表达盒（启动子+cds+终止子区）；条带2质粒Psimple-19-Ppki-SDR-Tegl1；条带3 , 酶切后的完整的FAE 表达盒；条带4，酶切后质粒Psimple-19-Ppki-SDR-Tegl1；条带5，质粒Psimple-19-Ppki-SDR-Tegl1-pki-FAE- Tegl1。
图3 黑曲霉表达的复合酶系SDR+FAE+BG。
生物材料保藏信息
里氏木霉菌株A2H的分类命名为里氏木霉 Trichoderma reesei，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No. 21470，保藏时间为：2021年03月17日，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
黑曲霉菌株60B-3DW分类命名为黑曲霉 Aspergillus niger，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No. 22465，保藏时间为：2021年07月05日，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
米曲霉菌株A02的分类命名为米曲霉 Aspergillus oryzae，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.40043，保藏时间为：2022年1月17日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明做进一步的说明，以期对本发明有更好的理解，但并不构成对本发明的限制。
实施例1. 人工智能系统创建基于酒糟抗营养因子的结构特性计算模拟需要酶系组成
酒糟现在作为发酵饲料，普遍存在木聚糖、纤维素等难以消化的物质，不能被作为养分消化吸收，且干扰整个日粮其他营养的消化吸收和利用，阻碍奶牛、肉牛内源消化酶与细胞内营养物质的作用，降低酒糟饲料中脂肪、淀粉和蛋白质营养价值。所以亟待开发一款适合酒糟抗营养因子快速降解酶制剂，将抗营养因子转化为可利用糖。
本发明利用生物化学、生物质光谱学、表面分析以及三维成像技术分析酒糟化学组成及结构特征，纤维素含量占到33.12%，以木聚糖为主的半纤维素含量达到8.12%，淀粉含量达到14.07%。体现木质纤维素类抗营养因子结构特性的参数，如结晶度CrI达到1.03，氢键强度HBI 达到0.32。
表1 酒糟的组成及结构特性分析
前期基于30种酶系组合和88种木质纤维素结构特性建立神经网络模型，将两两糖化产糖结果输入模型，解析木质纤维素复杂自变量和酶系组成复杂因变量之间的非线性关系。
基于木质纤维素特性-酶系组成的神经网络模型（GRNN），将酒糟木质纤维素类结构特性和组成作为输入变量，通过模型模拟计算酒糟中木质纤维素降解需要酶系的种类，将纤维素和半纤维素酶解后释放的可还原糖作为输出变量，可还原糖量分为从低到高三个档次，分别为0g/L,0.25g/L, 0.3g/L。神经网络模型根据酒糟木质纤维素结构特性，预测不同酶系组合参与酒糟酶解过程中释放的可还原糖量，不同酶系组合对应的预测的可还原糖量结果如图1所示。从图1可以看出，模型预测的可还原糖产量高于0.3g/L的酶系组合有九种，分别：Main+FAE+GH61（主酶系+阿魏酸酯酶+单加氧酶）, Main+Glu（主酶系+β-葡聚糖）,Main+BG+Man（主酶系+β-葡萄糖苷酶+甘露聚糖酶）, Main+BG+BXL（主酶系+β-葡萄糖苷酶+木糖苷酶）, Main+Xyl+BG（主酶系+木聚糖酶+β-葡萄糖苷酶）, Main+BG+Pec（主酶系+β-葡萄糖苷酶+果胶酶）, Main+CDH+BG（主酶系+纤维二糖脱氢酶+β-葡萄糖苷酶）, Main+SDR+FAE+BG（主酶系+脱氢酶+阿魏酸酯酶+β-葡萄糖苷酶）,Main+BG+Gala（主酶系+β-葡萄糖甘酶+半乳糖苷酶）。
木质纤维素特性-酶系组成的神经网络模型（GRNN）预测酒糟降解最适的九款酶系组合，将酶系组合种类大大降低，缩小实验的数量。为了验证该模型预测准确率，我们利用异源表达所需的酶蛋白，人工构建多种酒糟降解酶系组合，从图1中实际实验值（图中点）确认Main+FAE+GH61, Main+Glu, Main+BG+Man, Main+BG+BXL, Main+Xyl+BG, Main+BG+Pec, Main+CDH+BG, Main+SDR+FAE+BG，Main+BG+Gala这九款酶制剂组合在降解酒糟中释放的可还原糖产量明显高的。在这九款预测酶系中酒糟释放可还原糖量最高的酶系组合是Main+SDR+FAE+BG，该款酶制剂与酒糟底物适配性最强，酒糟降解效率最好。该款酶制剂具体人工创制方法下面详细描述，实现由酒糟组成和结构特性定制降解酶系组成，从而开发的一款酒糟降解酶制剂。
实施例2. 人工定制开发酒糟降解酶制剂
通过神经网络模型预测酒糟底物适配性强的酶系组成为Main+SDR+FAE+BG；为了构建这个组成的酶制剂，我们选择里氏木霉主酶系main，以高产BG（β-葡萄糖苷酶）的黑曲霉为底盘，异源表达高酶活力的FAE和非酶协同蛋白SDR，构建SDR+FAE+BG的辅助酶系。将主酶系与辅助酶系按照不同比例混合，通过酒糟水解产糖得率选择最优的酶系比例。
1 主酶系发酵培养
Main代表主酶系为来源于里氏木霉（ Trichoderma reesei）菌株A2H液态发酵生产的纤维素酶发酵液，里氏木霉菌株A2H保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No. 21470，保藏时间为：2021年03月17日，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。里氏木霉菌株A2H由里氏木霉 RUT-C30诱变得到。
通过下述方法进行培养：
培养条件为：温度为26℃，pH5.0，发酵液中溶氧量30% (v/v)。所述培养中的培养基包含如下组分：葡萄糖25 g/L，玉米浆干粉4 g/L，KOH 1.66 g/L，(NH4)2SO42.8 g/L和MgSO40.6 g/L。培养72小时后，将培养得到的发酵液进行固液分离，收集上清液得到发酵液，即为主酶系。
2 辅助酶系人工创制
采用高产BG的黑曲霉菌株60B-3DW作为底盘细胞，黑曲霉菌株60B-3DW被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No. 22465，保藏时间为：2021年07月05日。
将SDR脱氢酶和FAE阿魏酸酯酶基因进行过量表达，先将SDR基因通过双酶切连接到Psimple-19-Ppki-Tegl1质粒上，从而先构建Psimple-19-Ppki-SDR-Tegl1，然后将阿魏酸酯酶的表达盒串联在SDR表达盒后，得到质粒Psimple-19-Ppki-SDR-Tegl1-pki-FAE-Tegl1。该质粒通过原生质体转化，获得SDR+FAE+BG高效表达的黑曲霉菌株60B-SDR+FAE+BG。
其中，SDR 脱氢酶氨基酸序列：NCBI登录号XP_046074751.1；FAE氨基酸序列：NCBI登录号AQQ72604.1。
通过下述方法培养黑曲霉菌株60B-SDR+FAE+BG：
发酵培养基包含如下组分：玉米芯50 g/L，酵母粉5 g/L，麦芽提取物5 g/L，硫酸铵2.8 g/L，磷酸二氢钾4 g/L，结晶硫酸镁0.9 g/L，结晶氯化钙0.9 g/L，初始pH调到6.0。
将所述菌株的孢子接种到发酵培养基中于温度28℃和转速160转/分的条件下培养164小时；将培养得到的发酵液进行固液分离，收集上清液得到发酵液。所述发酵液通过SDS-PAGE检测，结果如图3所示，其中明显可以分辨出β-葡萄糖苷酶BG，阿魏酸酯酶FAE，脱氢酶SDR。
3 复配预测酶系构建酒糟降解酶制剂
以里氏木霉A2H深层液态发酵生产纤维素酶制剂作为主酶系，以黑曲霉菌株60B-SDR+FAE+BG液态发酵液作为辅助酶系，按照主酶系：辅助酶系分别为9.5:1，9:1，8.5:1，8:1，7.5:1进行复配混合构成降解酶制剂（表2），以5%酒糟为底物，酶用量按照20FPU/g底物进行添加，水解酒糟48h后，测定酒糟水解释放的还原糖量。当主酶系：辅助酶系=8.5:1时，酒糟释放的还原糖量最多，选择最优的复配比例，将该款生产酶制剂定位为酒糟降解酶制剂。
表2
实施例3. 酒糟菌酶协同的固态发酵产单细胞蛋白
依托根据酒糟结构特性定制开发的酒糟降解酶制剂，借助饲用菌与酒糟降解酶制剂的协同作用，通过酒糟固态发酵技术开发酒糟单细胞蛋白产品。
分别取不同酒糟原料（酱香型酒糟、清香型酒糟、浓香型酒糟、工业酒精酒糟），按照料水比1:2.5加入水，作为固态发酵的培养基。酒糟降解酶制剂添加量为3%，米曲霉A02种子液与里氏木霉A2H种子液均按照10%接种量（固液比）添加至酒糟固态发酵的培养基表面，30℃下培养72小时取发酵后酒糟烘干后，测定固体粗蛋白含量和氨基酸含量。粗蛋白质GB/T 6432-1994《饲料中粗蛋白的测定方法》。氨基酸含量测定采用A200型amino Nova氨基酸分析仪参照中华人民共和国国家标准GB/T 18246-2000《饲料中氨基酸的测定》进行测定。按照粗蛋白=固体总氮含量*6.25，计算发酵后酒糟粗蛋白含量。测定其总氮含量、粗蛋白含量和氨基酸含量如表3所示。
表3 不同酒糟固态发酵前后粗蛋白和氨基酸含量比较
由此可知，混和发酵不同酒糟原料后，单细胞蛋白中粗蛋白含量均超过28%，氨基酸含量均超过22%，均可以比酒糟发酵前蛋白含量提升9.12-10.87%，实现酒糟资源变废为宝，一方面能够避免因利用不当造成的环境污染和资源浪费，有利于打造酒糟循环经济产业链；另一方面实现传统农业蛋白如玉米、豆粕减量替代，减缓人畜争粮，实现节粮养殖。

Claims (11)

1.一种酒糟降解酶制剂，其包括主酶系和辅助酶系，其特征在于，主酶系是里氏木霉（Trichoderma reesei）A2H菌株液态发酵生产的纤维素酶发酵液；辅助酶系是过表达SDR脱氢酶和FAE阿魏酸酯酶基因的黑曲霉（Aspergillus niger）60B-3DW的重组菌株进行发酵培养的发酵液。
2.如权利要求1所述的酒糟降解酶制剂，其特征在于，主酶系：辅助酶系重量配比为7-10:1。
3.如权利要求1所述的酒糟降解酶制剂，其特征在于，所述发酵液是通过对发酵后的培养液进行固液分离，收集上清液而得到。
4.如权利要求1所述的酒糟降解酶制剂，其特征在于，SDR 脱氢酶氨基酸序列：NCBI登录号XP_046074751.1；FAE氨基酸序列：NCBI登录号AQQ72604.1。
5.如权利要求1所述的酒糟降解酶制剂，其特征在于，里氏木霉A2H菌株培养条件为：温度为24℃~28℃，pH4.8~5.2，转速250~300 rpm，发酵液中溶氧量25~35 %(v/v)，培养24~120小时；所述发酵培养中用到的培养基包含如下组分：葡萄糖20~30 g/L，玉米浆干粉2~6 g/L，KOH 1.60~1.72 g/L，(NH4)2SO4 2.6~3.0 g/L和MgSO4 0.4~0.8 g/L。
6.如权利要求5所述的酒糟降解酶制剂，其特征在于，里氏木霉A2H菌株培养条件为：温度为26℃，pH5.0，发酵液中溶氧量30% (v/v)；所述培养基包含如下组分：葡萄糖25 g/L，玉米浆干粉4 g/L，KOH 1.66 g/L，(NH4)2SO4 2.8 g/L和MgSO4 0.6 g/L。
7.如权利要求1所述的酒糟降解酶制剂，其特征在于，所述重组菌株培养条件为：温度26~30℃和转速140~200转/分的条件下培养144~182小时；培养所用的发酵培养基包含如下组分：玉米芯45~55 g/L，酵母粉4~6 g/L，麦芽提取物4~6 g/L，硫酸铵2.6~3 g/L，磷酸二氢钾3~5 g/L，结晶硫酸镁0.8~1.0 g/L，结晶氯化钙0.8~1.0 g/L，初始pH调到6.0。
8.如权利要求1至7任一项所述的酒糟降解酶制剂在降解酒糟中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述酒糟选自酱香型酒糟、清香型酒糟、浓香型酒糟、工业酒精酒糟。
10.一种通过菌酶协同生产单细胞蛋白的方法，其特征在于，在酒糟中添加1%至5%如权利要求1至7任一项所述的酒糟降解酶制剂，并接种米曲霉（Aspergillus oryzae）A02菌株和里氏木霉A2H菌株，进行固态发酵培养，获得单细胞蛋白。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述酒糟选自酱香型酒糟、清香型酒糟、浓香型酒糟、工业酒精酒糟，按照料水比1:2-3加入水，作为固态发酵的培养基固态发酵是在25-32℃下培养48-96小时。
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