CN103756914B - 一种复合微生物发酵剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种复合微生物发酵剂，属于微生物饲料添加剂领域中的菌种及其混合菌发酵剂,所述复合微生物发酵剂由黑曲霉菌剂、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌组成；所述复合微生物发酵剂的重量份数组成如下：黑曲霉菌剂10-20、枯草芽孢杆菌15-20，植物乳杆菌15-25,黑曲霉（Aspergillus？niger）Li-2013-03保藏号为CGMCC？NO.7927,本发明有效的解决了青储饲料发酵中的技术难题，使用简单，便于农民大规模使用。
Description
技术领域
本发明属于微生物饲料添加剂领域中的菌种及其混合菌发酵剂。
背景技术：
我国的秸秆资源十分丰富，年产量可达到5.79亿吨。其中，玉米、小麦、和稻草秸秆三大作物秸秆产量达到了4.39亿吨，占整个秸秆产量的75.88%。采用科学的方法对秸秆进行加工调剂，广泛用于畜牧业，具有良好的生态效益社会效益和经济效益。
近年来在我国推广的氨化饲料，不仅成本高、能耗高，并且存在与农业争肥、污染环境，有些方法对于牲畜还有毒副作用。而饲料青储技术的研究与应用已有上百年的历史，目前关键的技术在于微生物优良菌株的选育、复合菌种的有效复配和发酵工艺的优化。
在这些方面，国内外学者均进行了大量的研究工作，但对于综合解决清楚饲料发酵过程中抑制腐败菌、防治二次发酵，有效控制有机酸和降解木质纤维素，降低成本，便于使用等方面仍然存在问题。
发明内容：
针对目前存在的问题，本发明的目的在于提供一种复合微生物发酵剂。
本发明生产用复合微生物发酵剂由黑曲霉菌剂、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌组成；
所述复合微生物发酵剂的重量分数组成如下：黑曲霉菌剂10-20、枯草芽孢杆菌15-20，植物乳杆菌15-25。
复合微生物发酵剂中各菌种活细胞数量范围如下：枯草芽孢杆菌为（0.1～3.0）*109个/克，植物乳杆菌数量为（0.01～20）*109个/克，黑曲霉孢子数量为（1～30）*108个/克。黑曲霉孢子的制备工艺为：
A.斜面培养方法
试管，121℃，20min灭菌后，摆斜面，冷却，接种。30℃培养到黑色孢子铺满斜面。
B.K式培养瓶孢子
取10°Brix麦芽汁加入2%琼脂，装入500mLK式培养瓶，121℃，20min灭菌后，铺斜面冷却。接入孢子悬浮液1mL，保证悬浮液接种于整个培养基表面；侧放入恒温箱，30℃培养到黑色孢子铺满斜面。
C.固态放大培养
将K式瓶孢子制成孢子悬浮液，孢子浓度大于1.0×108个/mL。取200kg固态培养基（麸皮140kg、10°Brix麦芽汁60L），充分混匀后放入浅盘，在121℃下灭菌1小时。待放凉后，接入孢子悬浮液。培养温度控制在30℃，湿度80-90%，每隔10小时翻料一次，培养时间3天；待培养料长满孢子即可结束培养
干燥粉碎：发酵结束后，将浅盘放在流化床干燥，干燥温度控制在60℃，待物料水分含量将低于10%以下时，用粉碎机将固体培养料进行粉碎，物料粉碎孔径在100目以上。
植物乳杆菌菌粉的制备工艺为：
植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌粉状菌粉生产步骤如下：将斜面菌种转接到液体培养基并逐级扩培到要求的体积；将扩培得到的菌液进行离心分离，收集沉淀菌体；向沉淀菌体中加入保护剂并进行稀释；利用干燥设备制备粉状菌剂，植物乳杆菌菌粉中活细胞数为（0.1～6.0）109个/克,复合菌粉混合时可以加入淀粉和糊精实现各菌活菌数的合适比例。
本发明中各种菌种组成比例也是经过精心试验研究得到，上述菌种的选择和配比保障了产品的良好质量。
复合菌粉混合时可以加入淀粉和糊精实现各菌活菌数的合适比例。
本发明采用的菌种如下：
微生物青储混合菌发酵剂制作青储饲料的工艺：
1)原料准备：精选无腐烂的稻草、玉米秆及豆科类杆原料或其混合物，铡至2～5cm长。
2)菌种活化：将100g复合微生物发酵剂倒入1～2°Brix麦芽汁中，混合均匀，25℃～35℃下经2～3小时即活化好。原料（稻草、玉米秆及豆科类杆原料或其混合物）的水含量应控制在70%～80%。
3)接种装料：原料分层堆积，堆积20～30cm厚时，喷洒一遍菌液。堆积总高不应超过2米。
4)好氧培养：空气中放置5～30天，春、秋两季应适当延长时间为20～30天；夏天放置5～10天。
5)厌氧培养：用塑料薄膜密封，20～90天后可以供牲畜食用，春、秋两季时间为60～90天。夏天20～30天。
有益效果：
黑曲霉、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌组成高活性发酵剂。复合微生物发酵剂使用时，将青储饲料发酵分为好氧和厌氧两个阶段。这样在好氧阶段促进了菌体的快速生长，厌氧阶段利于代谢物的快速积累，本发明有效的解决了青储饲料发酵中的技术难题，使用简单，便于农民大规模使用。
具体实施方式：下面通过具体的实施方案叙述本发明中利用复合微生物发酵剂。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的培养剂组分、含量、培养条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
1)黑曲霉孢子的制备工艺为：
A.斜面培养方法
试管，121℃，20min灭菌后，摆斜面，冷却，接种。30℃培养到黑色孢子铺满斜面。
B.K式培养瓶孢子
取10°Brix麦芽汁加入2%琼脂，装入500mLK式培养瓶，121℃，20min灭菌后，铺斜面冷却。接入孢子悬浮液1mL，保证悬浮液接种于整个培养基表面；侧放入恒温箱，30℃培养到黑色孢子铺满斜面。
C.固态放大培养
将K式瓶孢子制成孢子悬浮液，孢子浓度大于1.0×108个/mL。取200kg固态培养基（麸皮140kg、10°Brix麦芽汁60L），充分混匀后放入浅盘，在121℃下灭菌1小时。待放凉后，接入孢子悬浮液。培养温度控制在30℃，湿度80-90%，每隔10小时翻料一次，培养时间3天；待培养料长满孢子即可结束培养
干燥粉碎：发酵结束后，将浅盘放在流化床干燥，干燥温度控制在60℃，待物料水分含量将低于10%以下时，用粉碎机将固体培养料进行粉碎，物料粉碎孔径在100目以上。
本发明提供的黑曲霉AspergillusnigerLi-2013-03是由天津工业大学实验室保藏的一株产纤维素酶的黑曲霉AspergillusnigerLi-2010经亚硝基胍多轮诱变筛选，然后对优良菌株经发酵性能测试筛选得到产高活力纤维素酶的黑曲霉菌株AspergillusnigerLi-2013-03。
本发明提供的产高活力纤维素酶的菌株具体为黑曲霉AspergillusnigerLi-2013-03。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101），保藏号为CGMCCNO.7927。
本发明黑曲霉菌株AspergillusnigerLi-2013-03(CGMCCNo.7927)具有以下微生物学特征：
1、形态学特征：
黑曲霉菌株CGMCCNo.7927，生物学形态为包括分生孢子、胞梗、顶囊、产胞结构等几部分。分生孢子头球形至辐射形，直径150-450μm，分生孢子梗发生于基质。胞梗茎1000-3000(长度)×12-20(直径)μm，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近似球形，直径45-75μm，表面全面可育；产胞结构双层，梗基10-20(长度)×4.5-7.0(直径)μm，瓶梗6-10(长度)×2.5-3.5(直径)μm，分生孢子球形或近球形，直径3-4.5μm，褐色，壁粗糙。
2、培养学特征：
菌株在麦芽汁琼脂培养基上生长迅速，28℃4天孢子可铺满斜面；质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，无渗出液；菌落反面略带黄色。
3、生理生化特征：
黑曲霉菌株CGMCCNo.7927可在玉米秸秆、稻草、木屑、马铃薯、玉米粉、可溶性淀粉、糖蜜等碳源上生长，最适pH范围5-6，最适生长温度范围28-33℃，最适产酶温度范围28-30℃。
本发明黑曲霉菌株CGMCCNo.7927的筛选技术路线为：出发菌株→斜面培养→孢子悬液的制备→诱变处理→平板分离→初筛→复筛→遗传稳定性测定→扩大实验（发酵性能测定）。
按诱变筛选方案，对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选，得到一株高产酶性能菌株黑曲霉菌AspergillusnigerLi-2013-03，发酵96小时后纤维素酶的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL。
28℃发酵4天直径75mm，发酵液纤维素酶的的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL，分别比出发菌株提高了9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。
产高活力纤维素酶菌株的筛选方法，包括以下步骤：
1)斜面培养：将原始黑曲霉菌株AspergillusnigerLi-2010划线接种斜面培养基，30℃培养2～3d，直至菌丝体成熟、产大量黑色孢子。所述斜面培养基组成如下：12°Brix麦芽汁l000mL，pH值自然，121℃灭菌20min；
2)孢子悬液制备（以下步骤均在无菌条件下操作）：向试管斜面加入15mL无菌水，把孢子刮下，用滤纸过滤，将滤过液倒入已灭菌、并加有5-10粒无菌玻璃珠的150mL三角瓶中，将三角瓶放入摇床振荡10-15min，使孢子分散。
3)亚硝基胍（NTG）诱变
A.用无菌水将孢子悬浮液调节为稀释成106-107个/mL。
B.取10mL菌悬液转移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成终浓度为10mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
C.在30℃下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤数次，中止反应。
D.适当稀释将孢子浓度调节为103个/mL，取最后稀释度的菌液0.2mL，稀释涂布于纤维素-刚果红平板筛选培养基上。在30℃培养2～3天后挑取透明圈/菌落直径较大的菌株200支。（所述纤维素-刚果红平板筛选培养基组成如下：纤维素粉10g、刚果红0.2g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、明胶2g、琼脂20g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min）。
E.复筛：将获得的200株菌分别用无菌牙签接种于斜面培养基，30℃培养至孢子铺满斜面。分别将孢子以无菌水洗下接种于装有50mL复筛培养基的250mL三角瓶中进行发酵，接种量10％（v/v），30℃、100r/min培养96h，分别测定各菌株的纤维素酶活性。（所述复筛培养基组成如下：纤维素粉50g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min）。选取纤维素酶酶活力最高的菌株进行放大实验。
4)遗传稳定性试验
将Li-2013-03菌株在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。
5)放大试验
①种子培养：将纤维素酶酶活力最高的菌株AspergillusnigerLi-2013-03接入500mL三角瓶中，种子培养基装量100毫升，30℃、150rpm摇床培养72-96h。
③种子罐培养：将种子液以10%（v/v）接种量接入装有7.5L发酵液的10L发酵罐中，控制pH值恒定为6.0±0.2，培养温度30±0.1℃，搅拌速度300rpm，通风量（v/v）1:0.8-1.2,培养时间96h，溶解氧20-30%。所述发酵培养基组成为：纤维素粉100g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min。
发酵结束后，取发酵上清液（粗酶液）进行酶活力检测经测定，菌株AspergillusnigerLi-2013-03的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL，分别比出发菌株AspergillusnigerLi-2010提高了9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。
枯草芽孢杆菌采用CICC10089.
植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）为CGMCC.No.1.2158。
实施例1：
所述复合微生物发酵剂由黑曲霉菌剂、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌组成；所述复合微生物发酵剂的重量份数组成如下：黑曲霉菌剂15、枯草芽孢杆菌17，植物乳杆菌20。
所述复合微生物发酵剂中各菌种活细胞数量范围如下：枯草芽孢杆菌为2.0*109个/克，植物乳杆菌数量为10*109个/克，黑曲霉孢子数量为10*108个/克。
微生物青储混合菌发酵剂制作青储饲料的工艺：
6)原料准备：精选无腐烂的稻草、玉米秆及豆科类杆原料或其混合物，铡至2～5cm长。
7)菌种活化：将100g复合微生物发酵剂倒入1～2°Brix麦芽汁中，混合均匀，30℃～35℃下经3小时即活化好。原料（稻草、玉米秆及豆科类杆原料或其混合物）的水含量应控制在70%～80%。
8)接种装料：原料分层堆积，堆积20～30cm厚时，喷洒一遍菌液。堆积总高不应超过2米。
9)好氧培养：夏天放置8天。
10)厌氧培养：用塑料薄膜密封，30天后可以供牲畜食用。
Claims (3)
1.一种复合微生物发酵剂，所述复合微生物发酵剂由黑曲霉菌剂、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌组成；所述复合微生物发酵剂的重量份数组成如下：黑曲霉菌剂10-20、枯草芽孢杆菌15-20，植物乳杆菌15-25,黑曲霉为黑曲霉(Aspergillusniger)2013-03,保藏号为CGMCCNO.7927。
2.根据权利要求1所述一种复合微生物发酵剂，其特征在于，所述复合微生物发酵剂中各菌种活细胞数量范围如下：枯草芽孢杆菌为(0.1～3.0)*109个/克，植物乳杆菌数量为(0.01～20)*109个/克，黑曲霉孢子数量为(1～30)*108个/克。
3.根据权利要求1所述一种复合微生物发酵剂，其特征在于，所述复合微生物发酵剂由黑曲霉菌剂、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌组成；所述复合微生物发酵剂的重量份数组成如下：黑曲霉菌剂15、枯草芽孢杆菌17，植物乳杆菌20。
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