CN110835610B - 一种适用于降解秸秆的复合菌剂及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种适用于降解秸秆的复合菌剂，该复合菌剂对菌株进行合理配伍，获得的菌剂配方合理有效，能够高效产生降解纤维素、半纤维素和木质素多种酶，在10℃对小麦秸秆有效降解平均提高降解时间为3‑5天。将本发明所述复合菌系培养至30代时，各代之间在10℃下小麦秸秆降解率无明显差别，具有较高的稳定性。

Description

一种适用于降解秸秆的复合菌剂及制备方法
技术领域
本发明涉及一种适用于降解秸秆的复合菌剂及制备方法，尤其涉及一种降解小麦秸秆复合菌。
背景技术
随着农作物单产提高，秸秆总量迅速增加，广大农民为赶农时、抢播种、图省事，多数地区就开始集中出现秸秆焚烧现象，农作物秸秆的处理问题一直是令广大农民和各级政府倍感头疼的问题，过去由于开发利用技术的缺乏、市场信息闭塞以及农民秋耕播种时间短暂等原因，绝大多数秸秆被废弃于河道、路旁腐烂或在田间被直接焚毁，不但堵塞河道和道路交通，而且严重污染了环境并造成资源的巨大浪费。农作物秸秆属于农业生态系统中一种十分宝贵的生物质能资源。
小麦秸秆中，纤维素约为45-46％、半纤维素32％-33％、木质素8％左右，小麦秸秆在短期内不易腐解，导致秸秆资源长期没有得到合理的开发，除少量用于垫圈、喂养牲畜、部分用于堆沤肥外，大部分都作为生活燃料烧掉了，但小麦秸秆中纤维素含量高，也存在少量木质素，在常温下性质十分稳定，因此降解非常缓慢。因此运用微生物法处理秸秆，可以大幅度提高其营养价值，与物理化学方法相比，具有许多无可比拟的优点，应用前景广阔。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种适用于降解小麦秸秆的复合菌剂。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种适用于降解秸秆的复合菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为下列质量百分比的原料，产纤维素酶类芽孢杆菌20％、产木聚糖酶链格孢菌20％、产漆酶疣孢漆斑菌20％、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌10％、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌5％、酿酒酵母菌5％、乳酸菌5％、近平滑假丝酵母5％、枯草芽孢杆菌5％、地衣芽孢杆菌5％；上述菌剂中：
所述产纤维素酶类芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus)CGMCC 1.15312；
所述产木聚糖酶链格孢菌(Alternaria humicola)CGMCC 3.2917；
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)GIM 1.16；
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌(Laceyella tengchongensis)
CCTCC AA208050Laceyella；
所述酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 2.1366；
所述乳酸菌(Lactobacillus algidus)CGMCC 1.3701；
所述近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CGMCC 2.3207；
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.7740；
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC1.519；
所述菌株均可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)和广东省微生物保藏中心(GIM)购买得到。
所述产漆酶疣孢漆斑菌为(Myrothecium verrucaria)突变菌株T2901，是本实验室从长白山采集土壤样品中分离筛选并突变得到的，其已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2017年7月5日，保藏单位地址是中国湖北省武市武昌区珞珈山街16号武汉大学，保藏号是CCTCC NO:M2017413。
上述复合菌剂的制备方法：分别在PDA培养基中接种10种菌落，于25℃摇床中200r/min,震荡培养2天，培养完毕后稀释形成菌液使浓度为每毫升菌个数2亿个，按照复合菌的质量百分比混合菌液。PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L。
上述复合菌在降解秸秆中的应用。
本发明具有如下有益效果：
本发明的复合菌剂对菌株进行合理配伍，获得的菌剂配方合理有效，特别适合用于对小麦秸秆的分解降解，在10℃左右本发明所提供的复合菌剂不仅对对小麦秸秆具有较好的腐熟效果，平均提高降解时间为3-5天。在研究过程中，保证了对小麦秸秆在低温下有较高降解率，但其复合菌的稳定性总是不太理想，经过大量筛选研究得到本发明配伍菌株，将本发明所述复合菌系培养至30代时，各代之间在10℃下小麦秸秆降解率无明显差别，具有较高的稳定性，本发明复合菌非常适合生产中大量应用。
具体实施方式
实施例1疣孢漆斑菌的诱变筛选
(1)形态鉴定及筛选
采集长白山自然保护区林区土壤，常规方法在PDA培养基上培养，菌株菌丝起初呈现白色絮状，向外周发散生长，菌落近似不规则圆形，在平板上生长5d后有分生孢子座出现，分生孢子最初呈现墨绿色，培养8d后，分生孢子颜色继续加深，并出现胶點团；培养10d后，菌落呈同心轮纹状，分生孢子胶點团呈现黑色，菌落背面出现淡褐色发射状褶皱。
用打孔器打取直径为1cm的菌块，接种到苯胺蓝选择培养基上，于需氧培养箱中30℃条件下培养10d，观察苯胺蓝褪色情况，挑选褪色速率快，能力强的菌株为候选菌株。
同时为了定向性筛选降解木质素的菌株，设计培养基以木质素为唯一碳源的液体发酵培养基，通过单一碳源的限定，测定木质素的去除率，选择在木质素培养基中涨势良好，且对木质素有一定去除能力的菌株进行后续玉米秸秆的预处理试验。
(2)菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子分类
在确定性状稳定后将菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，鉴定结果此种菌株为疣孢漆斑菌T2901。
(3)菌株的诱变及筛选
突变株的制备主要采用的是常压室温等离子体诱变(ARTP)法，用疣孢漆斑菌T2901 制备孢子悬浊液。而后进行稀释，调整孢子浓度为107/mL，取10μL稀释好的菌悬液滴于 ARTP的载片上，进行诱变，用ARTP诱变育种系统4mm射距照射，最佳诱变时间为75s。
将稀释的菌悬液均匀涂布到愈创木酚选择性培养基(愈创木酚浓度为0.4％加入PDA培养基中)上，于需氧培养箱中30℃条件下培养10d，观察变色圈情况，挑选变色圈的大的菌株为候选菌株。正向突变株T2901漆酶活力较野生型菌株提升约50％，经多次传代培养，菌株T2901可稳定遗传。
(4)木质素降解效果
用多功能酶标仪测定各菌种发酵液木质素吸光度，再根据绘制出的木质素标准曲线来换算出培养液中木质素的含量，最后根据以下公式计算出菌株木质素降解率。计算公式如下所示：
木质素降解率＝(C1-C2)/C1*100％
其中：C1是未添加菌液的木质素溶液的吸光度
C2是菌株降解后木质素溶液的吸光度
本研究中涉及的菌种采用固态发酵的形式进行玉米秸秆的固态发酵，以去除玉米秸秆中的木质素。经测定，在固态发酵过程中可同时分泌与木质素降解相关的三种酶，其漆酶、木质素过氧化物酶及锰过氧化物酶的活力分别为8.02U/g、1.23U/g和1.46U/g生物质。发酵后玉米秸秆中的木质素含量下降了43.24％，且无纤维素及半纤维素等糖类的损失。经预处理后的玉米秸秆中纤维素的转化率较未处理的玉米秸秆提高了132.51％，证明该菌对秸秆的降解提供了一种新途径。
实施例2复合菌剂的制备
一种适用于降解秸秆的复合菌剂，该菌剂的活性成分为下列质量百分比的原料：产纤维素酶类芽孢杆菌20％、产木聚糖酶链格孢菌20％、产漆酶疣孢漆斑菌20％、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌10％、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌5％、酿酒酵母菌5％、乳酸菌5％、近平滑假丝酵母5％、枯草芽孢杆菌5％、地衣芽孢杆菌5％，上述菌剂中：
所述产纤维素酶类芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus)CGMCC 1.15312；
所述产木聚糖酶链格孢菌(Alternaria humicola)CGMCC 3.2917；
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)GIM 1.16；
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌(Laceyella tengchongensis)
CCTCC AA208050Laceyella；
所述酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 2.1366；
所述乳酸菌(Lactobacillus algidus)CGMCC 1.3701；
所述近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CGMCC 2.3207；
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.7740；
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC1.519；
所述菌株均可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)和广东省微生物保藏中心(GIM)购买得到。
所述产漆酶疣孢漆斑菌T2901(Myrothecium verrucaria)突变菌株T2901，保藏号是CCTCC NO:M2017413。
将上述10种菌按照常规方式活化、培养至菌液中活菌数达到2.0×108个/克。活化的培养基为PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L。
将菌液按照以下质量比混合：产纤维素酶类芽孢杆菌20％、产木聚糖酶链格孢菌20％、产漆酶疣孢漆斑菌20％、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌10％、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌5％、酿酒酵母菌5％、乳酸菌5％、近平滑假丝酵母5％、枯草芽孢杆菌5％、地衣芽孢杆菌5％，进行充分混合获得复合菌剂。
实施例3对小麦秸秆的降解
采用三角瓶固体发酵的方法研究菌株对普通小麦秸秆的降解效果。每个300mL三角瓶分装烘干的、剪碎至0.5cm宽、1-2cm长的秸秆5g，(NH4)2SO4 0.2g，MgSO 4·7H 2O0.05g，每瓶加5mM pH 7.0的磷酸缓冲液15mL。各瓶接种0.25mL 2.0×108个/mL浓度的复合菌剂悬液，同时在对照组取等量的无菌水，混匀后置于10℃恒温培养。定期观察小麦秸秆的形态变化，7天后洗去测定其小麦秸秆的失重率以及纤维素、半纤维素和木质素的降解率。
用滤纸过滤发酵液，将残留物烘干称重，用减重法计算出麦秸失重率。纤维素的分解率根据下式计算：(对照样品纤维素含量×样品重量-残体纤维素含量×残体重量)/(对照样品纤维素含量×样品重量)×100％，半纤维素和木质素的分解率的计算方法按照纤维素的计算方法进行。表1为小麦秸秆固体发酵后、秸秆、纤维素、半纤维素和木质素的降解率。
表1
小麦秸秆％ 纤维素％ 半纤维素％ 木质素％
对照组 26.92 31.02 18.34 12.49
复合菌剂组 63.12 59.22 57.09 46.67
此可见，复合菌剂的添加增加了小麦秸秆的降解速度，小麦秸秆的降解率为63.12％、纤维素的降解率为59.22％、半纤维素的降解率为57.09％、木质素的降解率为46.67％，并使降解腐熟速度提高了3-5天，复合菌剂在10℃培养的情况下，仍能有优异的降解效果。同时将上述复合菌系培养至30代时，各代之间在10℃下小麦秸秆降解率无明显差别，具有较高的稳定性。

Claims (1)

1.一种适用于降解秸秆的复合菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为下列质量百分比的原料，20%产纤维素酶解纤维素芽孢杆菌（Bacillus cellulosilyticus）CGMCC1.15312、20%产木聚糖酶链格孢菌（Alternaria humicola ）CGMCC 3.2917、20%产漆酶疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）突变菌株T2901，保藏编号是CCTCC NO:M 2017413、10%产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus Krassilnikov）GIM 1.16、5%产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌（Laceyella tengchongensis ）CCTCC AA 208050、5%酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae） CGMCC 2.1366 、5%低温乳酸菌（Lactobacillus algidus）CGMCC 1.3701、5%近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）CGMCC 2.3207、5%枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CGMCC 1.7740、5%地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCC1.519。
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