CN109161495B - 一种高效降解秸秆纤维素的复合菌剂 - Google Patents

一种高效降解秸秆纤维素的复合菌剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高效降解秸秆纤维素复合菌剂，其中包含突变筛选得到的产β葡萄糖苷酶的突变黑曲霉菌株，能够水解纤维二糖，从而提高纤维素酶的活性，与产纤维素酶的芽孢杆菌协同增效。复合菌剂对玉米秸秆纤维素降解率为60.02%、半纤维素的降解率为56.87%，适用于北方寒冷天气。

Description

一种高效降解秸秆纤维素的复合菌剂
技术领域
本发明涉及一种高效降解秸秆纤维素复合菌剂，属于农业集约化生产技术，专用于降解废弃玉米秸秆生产有机肥料，实现有机废弃物的资源化利用。
背景技术
中国是一个农业大国，各类秸秆资源非常丰富，年产量近八亿吨，秸秆是一种具有非常大的利用空间的资源。但大部分秸秆资源并未合理的开发利用，绝大多数被弃置田间或被焚烧,造成资源的浪费和环境的严重污染。
纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上最为丰富的可再生资源。从可持续发展的角度出发，纤维素被彻底降解而不会对环境造成污染的一条有效途径便是利用纤维素酶的水解作用，它可使大量纤维素资源和城市纤维素废料转变成人类所需的物质，具有积极的深远意义。到目前为止，纤维素酶已广泛应用于工、农、畜、医等领域中，并取得了初步成效。我国对纤维素酶的研究虽然有几十年的历史，但由于纤维素酶的酶系组成相当复杂，活性不高，生产成本过高而导致其应用仍受到限制，选育高活性的纤维素酶是我国酶制剂研究的一项重要任务，因此产纤维素降解酶系的微生物逐渐进入我们的视线。
目前关于纤维素酶生产菌株的研究，绝大部分集中于纤维素酶系齐全且酶活力较高的木霉如绿色木霉和里氏木霉等菌株上，但木霉菌发酵产物中存在多种真菌毒素，有毒性嫌疑；另一方面β-葡萄糖苷酶活力很低，致使纤维二糖在反应体系中积累，最终影响酶解效率，因而其应用范围受到限制。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高效降解秸秆纤维素的复合菌剂。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种高效降解秸秆纤维素复合菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为下列质量百分比的原料，产纤维素酶类芽孢杆菌60％、产β-葡萄糖苷酶的突变黑曲霉菌株40％。
优选地，在上述菌剂中，所述产纤维素酶类芽孢杆菌(Bacilluscellulosilyticus)CGMCC 1.15312；该菌种可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)购买得到；
所述产β-葡萄糖苷酶的突变黑曲霉菌株(Aspergillus niger)已于2018年3月23日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址是中国武汉市武汉大学，保藏单位地址是中国武汉武市武昌区珞珈山街16号武汉大学，保藏编号是CCTCC NO:M 2018150。
本发明复合菌的制备方法，按如下步骤：
将上述产纤维素酶类芽孢杆菌按照常规方式活化、培养至菌液中活菌数达到2.0×108个 /克，活化的培养基为PDA培养基。
产β葡萄糖苷酶的突变黑曲霉菌株活化的培养基：初始pH值4.98，葡萄糖添加量14.94g/L,蛋白胨添加量14.82g/L,Mn2+添加量1g/L，秸秆粉的添加量为40g/L。
将菌液按照以下质量比混合：产纤维素酶类芽孢杆菌60％、产β葡萄糖苷酶的突变黑曲霉菌株40％，进行充分混合获得复合菌剂。
本发明具有的有益效果：
本发明突变筛选得到的产β葡萄糖苷酶的突变黑曲霉菌株，能够水解纤维二糖，从而提高纤维素酶的活性，与产纤维素酶的芽孢杆菌协同增效，本发明所述复合菌系能够在8℃下产酶活性无明显差别，具有较高的稳定性，纤维素降解率为60.02％、半纤维素的降解率为 56.87％极大的，适用于北方寒冷天气。
具体实施方式
实施例1产β葡萄糖苷酶的突变黑曲霉菌株的筛选
随机采样土壤，称1g土样加入到10mL无菌水中，摇匀，吸取1mL于液体PDA培养基(：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L)中，28℃180r/min摇床培养24h。菌株经富集培养后，稀释104-107倍，各取50μl稀释液涂布在PDA培养基上，于28℃培养3d，挑取单菌落用于菌种初筛。
初筛：黑曲霉产β-葡萄糖苷酶菌株在以P-NPG(对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、琼脂20g/L)为唯一碳源的筛选培养基，筛选显示黄色光圈明显的菌株即为目标菌株。将产β-葡萄糖苷酶菌株分离，接种于液体发酵培养基中，用于筛选高产β-葡萄糖苷酶菌株。
复筛：将初筛得到的目标菌株，接种到初始发酵培养基中，以180r/min，28℃摇床培养。每24h取发酵液10mL于4℃，8000r/min离心10min，收集上清液，利用P-NPG法测定β-葡萄糖苷酶酶活，测定上清液中的酶活力，从中筛选酶活较高菌株。
诱变筛选：将黑曲霉菌种接种于PDA培养基上培养，将孢子浓度调整到(106～107)cfu/mL 作为诱变原液。利用常温常压(ARTP)等离子体育种机对黑曲霉进行诱变。诱变时的工作气体为氦气。按照处理功率100W，氦气流量12SLM，样品与等离子体发生器出口距离2mm，150s 诱变照射时间来处理包子混悬液。对处理后的孢子悬液稀释10-1-10-6倍，取100μL稀释液在PDA平板中涂布，置于30℃培养箱中培养到的突变株直径较大生长速度较快，进行摇瓶培养并对秸秆进行发酵，并对酶活力进行测定，所得到的一株突变菌株生长、产酶加快且酶活力稳定。
优化培养基培养：产β葡萄糖苷酶的突变黑曲霉菌株活化的培养基为初始pH值4.98，葡萄糖添加量14.94g/L,蛋白胨添加量14.82g/L,Mn2+添加量1g/L，秸秆粉的添加量为40g/L。按照此配比进行摇瓶培养，结果显示在该条件下所测得β-葡萄糖苷酶活力140.023IU/mL，得到最佳的培养条件。
实施例2复合菌剂的制备
一种高效降解秸秆纤维素复合菌剂，该菌剂的活性成分为下列质量百分比的原料：产纤维素酶类芽孢杆菌60％、产β葡萄糖苷酶的突变黑曲霉菌株40％，上述菌剂中：
所述产纤维素酶类芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus)CGMCC 1.15312；
可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)购买得到。
所述产β-葡萄糖苷酶的突变黑曲霉菌株(Aspergillus niger)已于2018年3月23日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址是中国武汉市武汉大学，保藏编号是CCTCC NO:M 2018150。
将上产纤维素酶类芽孢杆菌按照常规方式活化、培养至菌液中活菌数达到2.0×108个/ 克，活化的培养基为PDA培养基。
产β葡萄糖苷酶的突变黑曲霉菌株活化的培养基：初始pH值4.98，葡萄糖添加量14.94g/L,蛋白胨添加量14.82g/L,Mn2+添加量1g/L，秸秆粉的添加量为40g/L。
将菌液按照以下质量比混合：产纤维素酶类芽孢杆菌60％、产β葡萄糖苷酶的突变黑曲霉菌株40％，进行充分混合获得复合菌剂。
实施例3对玉米秸秆纤维素、半纤维素的降解
采用三角瓶固体发酵的方法研究菌株对普通玉米秸秆的纤维素的降解效果。每个300mL 三角瓶分装烘干的、剪碎至0.5cm宽、1-2cm长的秸秆5g，(NH4)2SO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.05g，每瓶加5mM pH 7.0的磷酸缓冲液15mL。各瓶接种0.25mL 2.0×108个/mL浓度的复合菌剂悬液，同时在对照组取等量的无菌水，混匀后置于8℃恒温培养。定期观察秸秆的形态变化，9天后洗去测定其玉米秸秆的纤维素、半纤维素的降解率。
用滤纸过滤发酵液，将残留物烘干称重，纤维素的分解率根据下式计算：(对照样品纤维素含量×样品重量-残体纤维素含量×残体重量)/(对照样品纤维素含量×样品重量)×100％，半纤维素的分解率的计算方法按照纤维素的计算方法进行。
同时采用相应酶检测平板对该菌产酶进行测定，纤维素酶和半纤维素酶刚果红平板(刚果红培养基((NH4)2SO4 2g，KH2PO4 1g，MgSO4.7H2O 0.5g，CMC-Na 20g，NaCl 0.5g，刚果红0.3g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH7.2-7.6)检测即可，测定发酵液中纤维素酶和半纤维素酶的活性，分别为96.58U/ml和89.34U/ml复合菌剂能够分泌降解纤维素和半纤维素的相关酶，而且酶活力普遍较高。表1为秸秆固体发酵后纤维素和半纤维素的降解率。
表1
纤维素％ 半纤维素％
对照组 12.52 11.07
复合菌剂组 60.02 56.87
由此可见，复合菌剂对玉米秸秆纤维素降解率为60.02％、半纤维素的降解率为56.87％，低温下也有较好的纤维素降解效果。

Claims (1)

1.一种高效降解秸秆纤维素复合菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为下列质量百分比的原料，产纤维素酶类芽孢杆菌60%、产β葡萄糖苷酶的突变黑曲霉菌株40%；在所述菌剂中：所述产纤维素酶类芽孢杆菌（Bacillus cellulosilyticus）为 CGMCC 1.15312，所述产β-葡萄糖苷酶的突变黑曲霉菌株（Aspergillus niger）的保藏编号是CCTCC NO:M2018150。
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