CN105567612A - 一种园林废弃物降复合解菌剂制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有在高温条件下能高效降解纤维素功能的复合菌剂，包括五种放线菌：高温紫链霉菌(<i>Streptomyces</i><i>？thermoviolaceus</i>)，嗜热淀粉酶链霉菌(<i>Streptomyces</i><i>？thermodiastaticus</i>)，嗜热一氧化碳链霉菌(<i>Streptomyces</i><i>？thermocarboxydus</i>)，微白黄链霉菌(<i>Streptomyces</i><i>？albidoflavus</i>)和热普通链霉菌(<i>Streptomyces</i><i>？thermovulgaris</i>)，及一种细菌：波茨坦短芽孢杆菌(<i>Brevibacillus</i><i>？borstelensis</i>)。本发明解决了由于纤维素的难降解限制造成园林废弃物堆肥化速度慢、周期长的问题，可在堆肥过程中使纤维素降解加速，缩短发酵周期，提高转化效率，在园林废弃物堆肥化处理及资源化利用等方面具有广阔的应用前景。

Description

一种园林废弃物降复合解菌剂制备及应用

技术领域

本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一种园林废弃物高温降解纤维素的复合菌剂的制作备及其应用。

背景技术

园林废弃物指园林植物自然凋落或人工修剪所产生的枯枝、落叶、草屑、残花、树木与灌木剪枝及其它植物残体等，主要成分为难降解的纤维素和半纤维素。近年来，我国园林废弃物每年8%-10%的速度递增，给城市绿色化进程带来了巨大阻力，目前我国处理园林废弃物的方式主要为焚烧和填满，这两种处理方式不仅浪费了可再生资源还造成了严重的环境污染。利用生物堆肥降解园林废弃物是目前最为绿色环保、无害的方法。

园林废弃物中含有大量的木质素、纤维素等难降解的物质，导致堆肥效率低、周期长，大大限制了园林废弃物的再利用价值。仅靠自身堆肥发酵，是一个长期且较难实现的（BernabéG.A.,KobelnikM.,AlmeidaS.,etal.Thermalbehaviorofligninandcellulosefromwastecompostingprocess．JournalofThermalAnalysisandCalorimetry,2013,111(1):589-595.）。堆肥中园林废弃物的降解是在微生物代谢过程中产生的一系列酶的共同作用下完成的。所以接种外源降解纤维素的菌株或菌剂在堆肥进程中显得尤为重要。纤维素降解菌能完全水解纤维素，自然界中，纤维素主要是被微生物降解，主要是细菌、真菌和放线菌。真菌主要在中温条件下，酶活最大，如木霉、青霉属、曲霉属、根霉属等。细菌和放线菌的研究和应用均较少。堆肥过程中纤维素降解主要发生在高温期，而真菌主要在中温条件下，酶活最大，随着堆肥过程温度的上升，真菌活菌数量及其产生的酶活性大大降低，这就限制了产纤维素酶霉菌在堆肥中的利用。耐高温纤维素降解菌的筛选和应用是解决上述问题的有效措施。很多纤维素降解菌都是针对玉米秸秆、稻草、麦秸等农业废弃物，很少有专门针对园林废弃物纤维素材料的降解菌的筛选和利用研究。中国专利申请“一株高温纤维素降解菌及其应用”（专利申请号：201410018582.6）公布了一株从园林废弃物高温期堆肥样品中分离的高温纤维素降解菌地芽孢杆菌，纤维素酶活性仅为7.8U/ml，该菌为细菌。关于从园林废弃物堆肥中分离耐高温纤维素降解放线菌的报道较少。

有观点认为单一菌株与混合菌剂相比，纤维素酶活低很多。因为纤维素酶是一系列酶系共同作用的结果（MartinezAT,SPeranzaM,Ruiz-DuenasFJ,etal.Biodegradationoflignocellulosics:microbial,chemical,andenzymaticaspectsofthefungalattackoflignin[J].IntMicrobiol,2005,8(3):195-204.）。史玉英（史玉英,沈其荣.纤维素分解菌群的分离和筛选[J].南京农业大学学报.1996,19(3):59-62.）等最早把筛选到的纤维素降解菌混合培养，并对单一菌株和混合菌株的酶活进行了比较，结果混合菌株纤维素酶或比任何一个单一菌株都要高；崔宗均等（崔宗均,李美丹,朴哲,等.一组高效稳定纤维素分解菌复合系MC1的筛选及功能[J].环境科学,2002,23(3):36-39.）在前人研究的基础上首次把酸碱菌株进行混合，得到pH在适宜范围内的混合菌株。上述学者的研究表明，几种高效纤维素降解菌株混合培养所产生的纤维素酶活力要比单一菌株酶活高。

基于此，本发明通过对园林废弃物堆肥高温期样品进行富集培养，筛选出一系列高温微生物，主要是高温放线菌和耐高温细菌，并将其混合制作成腐熟剂，接种于以园林废弃物为主要材料的堆肥中，有助于弥补堆肥高温期土著菌纤维素降解能力的不足，从而加快园林废弃物堆肥腐熟进程。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种能加速堆肥处理园林废弃物降解过程的功能复合菌剂，解决园林废弃物由于纤维素的难降解性造成堆肥周期长的问题，可在堆肥过程中使纤维素降解加速，缩短发酵周期，提高转化效率。

本发明提供的技术方案是：一种具有在高温条件下能高效降解纤维素功能的复合菌剂，所述复合菌剂包括放线菌和细菌，其中放线菌为高温紫链霉菌(Streptomycesthermoviolaceus)，嗜热淀粉酶链霉菌(Streptomycesthermodiastaticus)，嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomycesthermocarboxydus)，微白黄链霉菌(Streptomycesalbidoflavus)和热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)，保藏号分别为CGMCCNo.12133、CGMCCNo.12134、CGMCCNo.12135、CGMCCNo.12136和CGMCCNo.12137，细菌为波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillusborstelensis)，保藏号为CGMCCNo.12138，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，所述复合菌剂由各菌株种子液分别等体积混合后进行发酵获得。

本发明所述复合菌剂中高温紫链霉菌(Streptomycesthermoviolaceus)，嗜热淀粉酶链霉菌(Streptomycesthermodiastaticus)，嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomycesthermocarboxydus)，微白黄链霉菌(Streptomycesalbidoflavus)，热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)和波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillusborstelensis)分别编号为ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、FHM1，均已于2016年2月18日为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC所保藏（保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101），其保藏号分别为CGMCCNo.12133、CGMCCNo.12134、CGMCC.12135No、CGMCCNo.12136、CGMCCNo.12137、CGMCCNo.12138，经检测均存活。

本发明还提供所述复合菌剂的制备方法，其步骤如下：

（1）菌株活化：取本发明微生物4℃保存斜面，5株放线菌分别接种至高氏I号固体平板培养基，1株细菌接种到LB固体平板培养基，在50℃的恒箱中培养3d实现菌株活化；

（2）种子液制备：将步骤（1）中经斜面活化的菌种平板，5株放线菌分别转接到1L无菌ISP2液体培养基中（成分：酵母浸粉4g/L，麦芽糖10g/L，葡萄糖4g/L，琼脂16g/L），1株细菌转接到1L无菌LB液体培养基中（成分：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，Nacl10g/L），pH7.2-7.4，50℃、150rpm摇床条件下培养，高温紫链霉菌，嗜热淀粉酶链霉菌，热普通链霉菌和波茨坦短芽孢杆菌培养12h，嗜热一氧化碳链霉菌和微白黄链霉菌培养72h，获得种子液；

（3）液体发酵复合菌剂的制备：上述种子液按6-10%（v/v）的接种量接种至已灭菌的发酵罐中，进行扩大发酵培养，在温度50℃、振荡频率120rpm的条件下，高温紫链霉菌，嗜热淀粉酶链霉菌，热普通链霉菌和波茨坦短芽孢杆菌培养24h，嗜热一氧化碳链霉菌和微白黄链霉菌培养72h，上述菌液混合均匀，即得到液体发酵复合菌剂。

进一步地，本发明还提供固态复合菌剂的制备方法：将麦麸与玉米面按照2:1质量比混合后作为菌液吸附剂，与步骤（3）中制得的菌液，按菌液与吸附剂体积质量比1:1混合，制作成固态复合菌剂，堆置1-2周，期间翻动1-2次，即获得固态复合菌剂，可用于以园林废物为主要材料的高温堆肥。

本发明具有以下有益效果：

本发明涉及菌种是从园林废弃物与动物粪便混合材料高温堆肥期样品中分离而来的一系列高温放线菌和细菌，具有耐高温、高效降解纤维素特性的混合菌剂，对园林废弃物的降解有更好的适应性。本发明中高温紫链霉菌，嗜热淀粉酶链霉菌，嗜热一氧化碳链霉菌，微白黄链霉菌，热普通链霉菌和波茨坦短芽孢杆菌菌株间没有拮抗作用且具有良好的协同作用，这种协同作用可有效的加速堆肥化的进程。本发明菌剂中的微生物种群间具有良好的协同作用，不仅对高温条件下园林废弃物具有高效稳定的降解能力，而且对不同环境的适应能力强，菌剂可加速园林废弃物的堆肥化进程，提高发酵效率，缩短堆肥时间，降低处理成本。

将本发明所述复合菌剂应用于园林废弃物高温堆肥体系中，该混合菌群能在40-70℃高温内大量产纤维素酶酶，活性可达76U/ml。本发明制得的复合菌剂接种于以园林废弃物为主要材料的堆肥中，与不接种的对照相比，能够提高堆肥进入高温期的时间、延长高温期持续时间已经高温期温度，降低堆肥C/N比，从而加快堆肥腐熟进程。

本发明解决了由于纤维素的难降解限制造成园林废弃物堆肥化速度慢、周期长的问题，可以在堆肥过程中使纤维素降解加速，缩短发酵周期，提高转化效率，而且对不同环境的适应能力强，以期能达到有效提高园林废弃物的堆肥效率，从而为园林废弃物变废为宝，城市绿色化的进程中提供依据，在园林废弃物堆肥化处理及资源化利用等方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1混合菌群与单一菌株产酶活性比较。

图26株菌株系统发育树。

图3堆肥过程中堆体温度变化。

图4堆肥过程中碳氮比（C/N比）变化。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1高温纤维素降解菌种的筛选和鉴定

从北京昌平区某苹果园园林废弃物堆肥高温初期、高温中期、高温后期材料、北京延庆平原造林地区园林绿化废弃物堆积物中采集样品；称取上述新鲜样品10g放于装有10粒玻璃珠、并盛有90ml无菌水的锥形瓶中，置于30℃150rpm的摇床中摇30min，使样品充分散开，50℃下静置富集培养24h。用无菌吸管吸取1ml上清液加入到含有9ml无菌水的试管中，此即为10^-1样品稀释液，再从10^-1样品中取1ml加入到9ml无菌水中，此即为10^-2样品稀释液，以此类推，得到10^-3、10^-4、10^-5、10^-6样品稀释液，然后用移液器吸取100μl的10^-3、10^-4、10^-5、10^-6样品稀释液于纤维素刚果红培养基上（培养基组成为：K₂HPO₄0.5g，微晶纤维素1.88g，MgSO₄0.25g，明胶2.0g，刚果红0.5g，琼脂16g，蒸馏水1000ml，pH7.0），用涂布器把稀释液均匀涂布于整个平板，并置于50℃培养箱中培养3天。挑选在纤维素刚果红平板上有明显透明圈的菌落，进行编号，再进行反复划线分离纯化获得纯种菌株，将分离后的菌种接到斜面上，4℃保存进行后续实验。

将保藏于4℃的纯菌株转接到CMC-Na培养基（培养基成分：CMC-Na15.0g，NH₄NO₃1.0g，酵母膏1.0g，MgSO₄·7H₂O0.5g，KH₂PO₄1.0g，蒸馏水1000ml，琼脂16g，pH7.0）平板上，50℃下活化培养，然后挑起平板上的单菌落转接到纤维素刚果红平板上，置于50℃培养箱中培养，72h后测量菌落直径d和透明圈直径D，计算其比值H，即H=D/d，H值越大，值较大表示该菌株分解纤维素的能力越强。按照纤维素刚果红鉴定培养基上形成透明圈的大小初步确定其产纤维素酶活性。

通过上述操作，获得多株纤维素降解菌，其中在北京昌平区某苹果园园林废弃物堆肥高温初期采集的样品中分离的菌种，编号为FHM1的，在北京昌平区某苹果园园林废弃物堆肥高温中期采集的样品中分离的菌种，编号分别为ST1、ST2、ST3、ST4、ST5，并于2016年2月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC（单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），FHM1、ST1、ST2、ST3、ST4、ST5保藏编号分别为CGMCCNo.12138、CGMCCNo.12133、CGMCCNo.12134、CGMCCNo.12135、CGMCCNo.12136、CGMCCNo.12137。对上述菌株进行16SrDNA分子鉴定，FHM1菌株为波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillusborstelensis)，ST1菌株为高温紫链霉菌(Streptomycesthermoviolaceus)，ST2菌株为嗜热淀粉酶链霉菌(Streptomycesthermodiastaticus)，ST3菌株为嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomycesthermocarboxydus)，ST4菌株为微白黄链霉菌(Streptomycesalbidoflavus)，ST5菌株为热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)。

实施例2菌株之间拮抗作用研究

将上述六株纤维素降解菌株在羧甲基纤维素培养基上两两划线但不相交，50℃，培养3d。两菌交叉处如形成无菌区，说明两菌之间产生了抑菌圈，两菌彼此拮抗，不能组合到一起，如果两菌间没有形成无菌区，则说明两菌不彼此拮抗，可以组合。从结果来看，各个菌株之间没有拮抗作用，不会互相干扰，影响菌种生长，因此可以制作为复合菌剂。

实施例3混合菌群产纤维素酶能力

将筛选得到的6株高温高效纤维素降解菌分别接种于CMC-Na的液体培养基中，并于50℃，转速为150rpm/min的恒温摇床中培养，高温紫链霉菌，嗜热淀粉酶链霉菌，热普通链霉菌和波茨坦短芽孢杆菌培养12h，嗜热一氧化碳链霉菌和微白黄链霉菌培养72h，分别将各培养液的浊度OD600调至0.2，然后这6株菌菌悬液按照等量体积的比例混合均匀，即得到混合菌液。将混合菌液与各单一菌株以相同的接种量，在相同的发酵条件下进行发酵产酶培养，比较混合菌群和单一菌株的产酶能力，见图1。由图1可见，单一菌株产酶能力大小顺序为ST2>ST1>ST3>ST5>ST4>FHM1，ST2产酶能力相对最高，酶活力达60U/ml；混合菌群产酶能力最强，产酶活力达76U/ml，是单一菌株产酶能力的1.3-3.8倍，比组成它的任何单一菌株产酶能力都强。

实施例4混合菌群对不同纤维素材料的降解能力

用5g纤维素材料（秸秆、树叶、园林修剪枝条）为唯一碳源，秸秆剪成2cm长、树叶直接加入、园林修剪枝条剪成1cm长，以10%的接种量接入复合菌剂，50℃，150rmp摇床培养，7d后，将菌体过滤后烘干纤维素材料，采用失重法研究复合菌剂对纤维素材料的降解能力。结果表明，混合菌群对秸秆和树枝有明显的降解能力，秸秆降解率达65%，树叶降解率达54%，木屑降解率达35%。

实施例5复合菌剂的制备

（1）菌株活化：取本发明微生物4℃保存斜面，5株放线菌分别接种至高氏I号固体平板培养基，1株细菌接种到LB固体平板培养基，在50℃的恒箱中培养3d实现菌株活化。

（2）种子液制备：将（1）步骤中经斜面活化的菌种平板，5株放线菌分别转接到1L无菌ISP2液体培养基中（成分：酵母浸粉4g/L，麦芽糖10g/L，葡萄糖4g/L，琼脂16g/L），1株细菌转接到1L无菌LB液体培养基中（成分：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，Nacl10g/L），pH7.2-7.4，50℃、150rpm摇床条件下培养，高温紫链霉菌，嗜热淀粉酶链霉菌，热普通链霉菌和波茨坦短芽孢杆菌培养12h，嗜热一氧化碳链霉菌和微白黄链霉菌培养72h，获得种子液。

（3）液体发酵复合菌剂的制备：上述种子液按6-10%（v/v）的接种量接种至已灭菌的发酵罐中，进行扩大发酵培养。在温度50℃、振荡频率120rpm的条件下，高温紫链霉菌，嗜热淀粉酶链霉菌，热普通链霉菌和波茨坦短芽孢杆菌培养24h，嗜热一氧化碳链霉菌和微白黄链霉菌培养72h，上述菌液混合均匀，即得到液体发酵复合菌剂。

（4）固态复合菌剂的制备：将麦麸与玉米面按照2:1质量比混合后作为菌液吸附剂，与步骤（3）中制得的菌液，按菌液与吸附剂体积质量比1:1混合，制作成固态复合菌剂，堆置1-2周，期间翻动1-2次，即获得固态复合菌剂，可用于以园林废物为主要材料的高温堆肥。

实施例6复合菌剂的堆肥效果试验

以园林废弃物为主要堆肥原料，添加动物粪便和水，使混合物料碳氮比为25-40:1、含水率50-60%，固态复合菌剂按物料重量的2.5%比例接种到堆肥物料中，进行高温堆肥，以不加复合菌剂的材料为对照，当堆体温度上升到50℃时，开始翻堆，高温期每2天翻堆一次，降温期每周翻堆一次，当温度下降到40℃后不在翻堆。堆肥过程中，通过测定堆体每天的温度变化、堆肥材料碳氮（C/N）比变化，考察添加复合菌剂对园林废弃物堆肥腐熟进度的影响。

堆肥过程中堆体温度变化如图3所示。由图3可知，接种复合菌剂的堆肥处理在堆肥2d温度即上升到50℃，之后温度继续上升，而且50℃以上的高温期持续22d，之后温度开始下降。而未接种的堆肥处理温度在堆肥第4d才上升到50℃以上，比接种的处理推迟2天到达50℃以上高温期，而且50℃以上高温期持续时间是12d，比接种的处理少了10d，接种处理的堆体高温期的最高温度也高于未接种处理，之后堆体开始降温，到40d后，温度下降到30℃以下，并稳定下来。由此说明接种复合菌剂后能够加快堆肥进入高温期时间，以及高温期持续时间，这有助于有害微生物的杀灭以及加快堆肥的腐熟进程。堆肥过程中C/N变化如图4所示。由图4可知，随着堆肥的进行，接种复合菌剂和不接种的处理C/N比均持续降低，而接种的处理下降程度高于未接种处理，由此进一步说明，添加本菌制得的复合菌剂可以加快堆肥进程，提高园林废弃物堆肥的腐熟效果。

Claims (5)

1.一种具有在高温条件下能高效降解纤维素功能的复合菌剂，所述复合菌剂包括放线菌和细菌，其中放线菌为高温紫链霉菌(Streptomycesthermoviolaceus)，嗜热淀粉酶链霉菌(Streptomycesthermodiastaticus)，嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomycesthermocarboxydus)，微白黄链霉菌(Streptomycesalbidoflavus)和热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)，保藏号分别为CGMCCNo.12133、CGMCCNo.12134、CGMCCNo.12135、CGMCCNo.12136和CGMCCNo.12137，细菌为波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillusborstelensis)，保藏号为CGMCCNo.12138，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，所述复合菌剂由各菌株种子液分别等体积混合后进行发酵获得。

2.一种如权利要求1所述的复合菌剂制备方法，包括如下制备步骤：

（1）菌株活化：取本发明微生物4℃保存斜面，5株放线菌分别接种至高氏I号固体平板培养基，1株细菌接种到LB固体平板培养基，在50℃的恒箱中培养3d实现菌株活化；

（2）种子液制备：将步骤（1）中经斜面活化的菌种平板，5株放线菌分别转接到1L无菌ISP2液体培养基中，1株细菌转接到1L无菌LB液体培养基中，pH7.2-7.4，50℃、150rpm摇床条件下培养，高温紫链霉菌，嗜热淀粉酶链霉菌，热普通链霉菌和波茨坦短芽孢杆菌培养12h，嗜热一氧化碳链霉菌和微白黄链霉菌培养72h，获得种子液；

（3）液体发酵复合菌剂的制备：上述种子液按6-10%（v/v）的接种量接种至已灭菌的发酵罐中，进行扩大发酵培养，在温度50℃、振荡频率120rpm的条件下，高温紫链霉菌，嗜热淀粉酶链霉菌，热普通链霉菌和波茨坦短芽孢杆菌培养24h，嗜热一氧化碳链霉菌和微白黄链霉菌培养72h，上述菌液混合均匀，即得到液体发酵复合菌剂。

3.如权利要求1所述的复合菌剂制备方法，其特征在于：进一步地，将麦麸与玉米面按照2:1质量比混合后作为菌液吸附剂，与步骤（3）中制得的菌液，按菌液与吸附剂体积质量比1:1混合，制作成固态复合菌剂，堆置1-2周，期间翻动1-2次，即获得固态复合菌剂。

4.如权利要求1所述复合菌剂在以园林废物为主要材料的高温堆肥中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：以园林废弃物为主要堆肥原料，添加动物粪便和水，使混合物料碳氮比为25-40:1、含水率50-60%，固态复合菌剂按物料重量的2.5%比例接种到堆肥物料中，进行高温堆肥。