CN103820361A - 一株高温纤维素降解菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高温纤维素降解菌及其应用。本发明所提供的耐高温纤维素降解菌，能在60-80℃温度范围内生长，且在70℃时生长最快；具有稳定的纤维素降解功能，能较快的适应高温堆肥环境，快速降解纤维素等难降解有机物，加快堆肥腐熟进程。利用由该菌株制备得到的固态菌剂对园林废弃物进行堆肥相对于未接种的纤维素总降解率提高了42.2%，具有成本低、性能好等优点。

Description

一株高温纤维素降解菌及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株能在70℃快速增长的纤维素降解菌及其在园林废弃物高温堆肥中的应用。

背景技术

堆肥化是实现有机废物无害化、减量化和资源化的常用技术之一。目前堆肥仍存在发酵周期长、有机物质降解不完全、物料稳定度程度和腐熟度低的问题。为此，人们将从环境中分离出高温菌、中温菌、放线菌以及真菌等制成接种剂并应用于堆肥体系中，以达到缩短堆肥发酵时间、提高堆肥腐熟度等目的。园林废弃物包括枯枝落叶、草坪修剪物、杂草和残花等，是常见的堆肥物料，纤维素是其主要成分。由于纤维素本身结构致密而不易降解，导致其难以被微生物加以利用，因此，提高纤维素的降解程度有助于解决园林废弃物堆肥存在的上述问题。

堆肥过程中纤维素降解主要发生在高温阶段，然而，目前高温好氧堆肥过程中接种的微生物菌剂主要成分为中温菌。随着堆肥温度升高，堆体中微生物的种类和数量逐步减少，接种的嗜温性微生物的活性也大大降低，这无疑限制了纤维素的快速降解。高温菌是一类在高温条件下仍能生长并可以保持生物降解活性的微生物菌群，接种高温菌，特别是以其制成的纤维素降解菌剂，可以加快堆肥中纤维素的分解，从而提高堆肥效率。最近，耐高温纤维素降解菌的筛选已成为促进堆肥技术发展的主要议题之一。张楠等（2010）从牛粪堆肥中分离出6株能降解纤维素的高温细菌，其中活性最高的为一株枯草芽孢杆菌。薛桥丽等（2012）从堆肥中分离获得20株耐高温纤维素分解菌，其产生的纤维素分解酶在50℃具有良好的热稳定性，但随着温度增加，热稳定性呈下降趋势。

地芽孢杆菌属(Genus Geobacillus)是一类在表型特征上相似、系统发育上相近的耐高温菌群，多数能够在55℃以上的高温中生长。利用具有高温降解纤维素功能的地芽孢杆菌，并将其作为接种剂应用于有机废物的堆肥化处理过程中，将有助于弥补堆肥高温期土著菌纤维素降解能力的不足，同时也可以促进其他有机物的降解，从而加快堆肥腐熟。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有耐高温、高效降解纤维素特性的地芽孢杆菌，并将其作为微生物接种剂应用于高温堆肥体系中。

本发明的高温纤维素降解菌（Geobacillus kaustophilus. HCDM5），是从园林废弃物高温堆肥样品中分离筛选得到的一株能够在70℃条件下，降解纤维素的地芽孢杆菌菌株，于2013年11月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号为CGMCC NO：8441。

本发明菌株性质如下：

菌株具有纤维素降解酶活性，在有辅助碳源存在下可降解纤维素。可在50-85℃温度范围内生长，生长pH值范围为5.5-8.0，最适pH为6.5，在LB固体培养基上培养12h后，其菌落特征是：淡黄色，圆形，直径约2 mm，表面干燥，中央稍突起，不透明，边缘完整。其菌体细胞特征为：杆菌，长度约2-3 μm。革兰氏染色呈阳性。利用引物为（27f）：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′（SEQ ID NO:1）和（1492r）：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′（SEQ ID NO:2）经PCR扩增该菌株的16S rRNA基因序列（SEQ ID NO:3），经与EzTaxon数据库（(http://www.eztaxon.org/)）比对，结果显示与种Geobacillus kaustophilus NCIMB8547(T)的同源性最高，为99.43%。综上性质及特性，将该菌株鉴定为Geobacillus kaustophilus，并命名Geobacillus kaustophilus. HCDM5。

利用该菌株制备固态菌剂的方法是：

（1）斜面活化：取菌种斜面，在65-75℃下活化培养16-32 h；

（2）制备种子液：将步骤（1）已活化的菌接种至1-2 L的无菌LB液体培养基中，在水浴摇床上以60-70℃温度、50-200 rpm转速震荡培养24-36 h得种子液；

（3）发酵种子液的制备：取步骤（2）中种子液按5%-20%（v/v）的接种量接种至已灭菌的发酵罐中，进行扩大发酵培养，培养条件：温度为60-70℃，转速为100-200 rpm，培养时间36-60 h；

（4）制备固体菌剂：将麦麸与玉米面混合后，接种上述发酵种子液，接种量为培养基总重量的0.5%-3.5%，调节含水率至45%-55%范围内，自然堆置一至两周后，将堆体摊开陈化使含水率下降至30%以下，即得固态菌剂。

利用上述制备得到的固态菌剂进行堆肥，方法如下：

将上述制备的固体菌剂按干重比5%-10%与堆肥主料即园林废弃物混合，并添加适量的新鲜鸡粪作为辅料，使得混合物料碳氮比为25-35：1、含水率55-60%，即可开始高温堆肥过程。

本发明的有益效果是：

本发明所提供的耐高温纤维素降解菌，能在60-80℃温度范围内生长，且在70℃时生长最快；具有稳定的纤维素降解功能，能较快的适应高温堆肥环境，快速降解纤维素等难降解有机物，加快堆肥腐熟进程。同时，以有机废物作为本发明菌株的载体，具有成本低、性能好等优点。接种了本发明所提供的固态微生物接种剂的堆肥相对于未接种的纤维素总降解率提高了42.2%，堆肥高温期（≥50℃）达到10d，在第7天达到最高温度67℃，而未接种菌剂的堆肥高温持续时间仅为7d，在第8天才达到最高温度60℃。与未接种菌剂对比，接种微生物菌剂的堆肥提早10d达到腐熟（发芽指数≥80%），在发酵30d之后堆肥物料发芽指数达到了85%以上，而未接种堆肥则在发酵40d以后才达到腐熟。接种后的堆肥比未接种的堆肥从第20d起，发芽指数均提高在10%以上，最高达17%。

附图说明

图1：堆肥温度变化曲线；

图2：堆肥过程中纤维素降解率变化曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1：耐高温纤维素降解菌的筛选与鉴定

称取10 g高温期园林废弃物堆肥样品置于装有10粒玻璃珠、盛有90 ml无菌水的锥形瓶中，在200 rpm的摇床上摇30 min，使样品充分散开，70℃下静置富集培养12h。用无菌吸管吸取1 ml上清液转至赫其逊培养液中，70℃静置培养约30天。取10 ml驯化液转接至新的赫其逊培养液中，继续驯化培养，如此传代3次。

上述赫其逊培养基成分为：磷酸二氢钾1.0g，氯化钠0.1g，硝酸钠2.5g，硫酸镁0.3g，三氯化铁0.01g，氯化钙0.1g，无淀粉滤纸条10g，去离子水1000ml，pH 7.2。

分别取驯化后的菌悬液1 mL，加入到9 mL无菌水中，以梯度稀释法制成10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7的稀释度，取0.1mL平板涂布到纤维素-刚果红培养基上，每个稀释度做三个平行样。取1mL的无菌水进行同样的操作，作为对照处理。在70℃下恒温培养2天，选择菌落分散较好、菌落周围出现明显降解圈的平板，挑取生长旺盛的单菌落，反复划线分离纯化3次，再将形态一致的菌落制片，进行简单染色，在油镜多视野下观察菌体细胞形态，确认菌体形态一致后，接种至LB斜面培养至丰厚，在4℃下保存，备用。

菌株在LB平板上的菌落特征是：单菌落为淡黄色，圆形，直径约2 mm，表面干燥，中央稍突起，不透明，边缘完整。菌体细胞特征为：杆菌，长度约2-3μm。革兰氏染色呈阳性。

将分离得到的纯菌在LB斜面上活化培养12h后，点接于纤维素刚果红培养基上，在70℃下培养至菌落丰厚，观察有无降解圈及降解圈的大小，并用游标卡尺测定降解圈直径（D）和菌落直径（d）。降解能力大小按公式Up=(D/d)²来判断，单位为毫米（mm），Up越大，表示水解能力越大。在降解培养基上传代培养4代，计算与分析每代菌的Up情况，淘汰降解能力不稳定菌株，得到降解能力大且稳定的菌株，从中选出Up值较大的10株菌，并编号为HCDM1- HCDM10。

上述LB培养基成分为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，植物凝胶10g，蒸馏水1000ml，pH 7.2-7.4。

上述纤维素刚果红培养基的配方是：磷酸二氢钾0.5g，硫酸铵0.25g，羧甲基纤维素钠1.88g，刚果红0.2g，明胶2g，琼脂15g，植物凝胶10g，去离子水1000ml，pH值为7.0。

将上述操作得到的HCDM1-HCDM10菌株分别接种至纤维素发酵培养基中，70℃培养3d后，取发酵液经5000r/min离心10min，取上清液即为待测粗酶液，用DNS法测定菌株的纤维素酶活性。得到纤维素酶活较高的五株菌HCDM5、HCDM4、HCDM7、HCDM1、HCDM10。

上述纤维素发酵培养基成分为：磷酸二氢钾3g，硫酸铵2g，七水合硫酸镁0.5g，七水合硫酸亚铁0.01g，玉米面2g，麸皮0.5g，蛋白胨5g，碳酸钙0.5g，去离子水1000ml，pH值为7.0

将HCDM5、HCDM4、HCDM7、HCDM1、HCDM10五株菌分别接种到赫其逊培养液中，用锡箔纸封口，70℃静置培养14d后，用稀盐酸与稀硝酸混合液及去离子水反复洗涤滤纸条数次，于70℃烘至恒重，称量，计算滤纸条降解率。计算公式如下：

降解率(%)=(滤纸原重-烘干滤纸重量)/滤纸原重×100

上述赫其逊培养基成分为：磷酸二氢钾1.0g，氯化钠0.1g，硝酸钠2.5g，硫酸镁0.3g，三氯化铁0.01g，氯化钙0.1g，无淀粉滤纸条10g，去离子水1000ml，pH 7.2。

纤维素酶活测定结果和滤纸降解率结果见表1。

表1 纤维素酶活测定结果和滤纸降解率结果

注：- 表示未测定

由表1知，纤维素酶活较高的五株菌HCDM5、HCDM4、HCDM7、HCDM1、HCDM10中，滤纸降解率最高的为菌株HCDM5，降解率为18.8%。因此，选择HCDM5作为目标菌株制备固体微生物接种剂。

以该菌株的DNA为模板，PCR扩增其16S rRNA序列，引物为（27f）：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′（SEQ ID NO:1）和（1492r）：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′（SEQ ID NO:2）。PCR反应程序为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，53℃退火45 s，72℃延伸90 s，30个循环，72℃延伸10 min。扩增产物经电泳检测其纯度后测序，测序结果如序列表SEQ ID NO:3所示。获得的16S rDNA基因 序列通过EzTaxon 数据库进行比对，结果显示与Geobacillus kaustophilus NCIMB8547(T)的同源性最高，为99.43%。把该菌株命名为Geobacillus kaustophilus. HCDM5，于2013年11月7日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为Geobacillus kaustophilus.，保藏编号为CGMCC NO：8441。

实施例2：固体菌剂的制备

（1）斜面活化：取本发明微生物4℃保存斜面接种至LB固体斜面培养基，在70℃的恒温箱中培养18h实现斜面活化。

（2）制备种子液：将（1）步骤中经斜面活化的菌种斜面1支接种至1 L无菌LB液体培养液中，在水浴摇床上震荡培养，培养温度70℃，振荡频率为100 rpm，培养30 h后得种子液。

（3）发酵种子液的制备：上述种子液按10%（v/v）的接种量接种至已灭菌的发酵罐中，进行扩大发酵培养。在温度70℃、振荡频率120 rpm的条件下，培养48h后得发酵种子液。

（4）制备固体菌剂：将麦麸与玉米面按照1:1质量比混合后，接种发酵种子液，接种量约为总重量的2.5%，调节含水率在45%-55%范围内，堆置一至两周（期间翻堆1-2次）后，将堆体摊开陈化一段时间，使其含水率下降至30%以下，即得固态菌剂。

实施例3：应用于高温堆肥的效果试验

以园林废弃物作为堆肥主料，辅以新鲜鸡粪，使得混合物料碳氮比为25-35：1、含水率55-60%。当堆肥最高温度上升到55℃时将实施例2中制得的固体菌剂按照总物料的15%的比例接种到堆肥物料中，调节碳氮比为35：1，含水率55%，进行为期50d的堆肥。同时以不添加本发明微生物接种剂为对照，进行试验。

堆体温度检测：前15d每天测定一次，之后5d测定一次。间隔5d翻堆一次，待堆温达到70℃时翻堆，保持高温阶段堆体温度维持在50-70℃之间。

每隔10d测定堆体的发芽指数。

堆肥过程中纤维素降解率计算方法：采用硝酸-乙醇纤维素测定方法测得原料中纤维素含量为C₀，堆肥过程中某一时间点的纤维素含量为C*；原料中的灰分含量为A₀，堆肥过程中某一时间点的灰分含量为A*；堆肥原料质量为m₀，堆肥过程中某一时间的堆体质量为m*。

根据灰分守恒m₀ A₀= m* A* => m*/m₀=A₀/A*      (1)

纤维素降解率=(m₀C₀-m*C*)/m₀C₀=1- m*C*/ m₀C₀   (2)

由(1)、(2)式得，堆体中纤维素降解率=1- A₀C*/ A*C₀

堆肥过程中温度变化如图1所示：由图1可知，接种处理的和未接种的堆肥温度变化趋势相同，都呈现先急剧升高，达到最高温度后又迅速降低，之后温度缓缓降至室温。与未接种菌剂对比，接种微生物菌剂的堆肥在第2d温度达到了50℃，高温持续时间为10d，在第7天达到最高温度67℃；而未接种菌剂的堆肥从第3d才达到50℃以上，高温持续时间仅为7d，在第8天才达到最高温度60℃。该试验说明接种处理后的堆肥，能够迅速进入堆肥高温阶段，高温持续时间长达10 d，从而达到无害化效果。

堆肥过程中发芽指数变化如表2所示：

表2 堆肥过程中发芽指数变化

由表2可知，堆肥物料对种子发芽指数的影响在发酵初期10d左右抑制作用最明显，之后逐渐减弱。与未接种菌剂对比，接种微生物菌剂的堆肥提早10d达到腐熟（发芽指数≥80%），在发酵30d之后堆肥物料发芽指数达到了85%以上，而未接种堆肥则在发酵40d以后才达到腐熟。接种后的堆肥比未接种的堆肥从第20d起，发芽指数均提高在10%以上，最高达17%。

堆肥过程中纤维素降解情况结果如图2所示：由图2可知，无论接种与否，纤维素降解均主要发生在前20d，其中在前10d堆料高温阶段降解最快。在第10d接种处理的比未接种的纤维素降解率分别为18.3%和14.2%，前者相对后者的纤维素降解率提高28.9%。接种处理和未接种的纤维素总降解率分别为32%和22.5%，前者相对后者纤维素降解率提高42.2%。说明接种微生物菌剂对于堆肥中纤维素的降解具有促进作用。

试验结果显示，接种了微生物固体菌剂堆肥比未接种堆肥，升温速度快、高温阶段持续时间长、纤维素降解率高。

<110>  深圳市铁汉生态环境股份有限公司

 

<120>  一株高温纤维素降解菌及其应用

 

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<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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agagtttgat cctggctcag                                                   20

 

 

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<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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ggttaccttg ttacgactt                                                    19

 

 

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<212>  DNA

<213>  Geobacillus kaustophilus. HCDM5

 

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tccctgtccc actttcggcg gctggctccc gtaagggtta ccgcaccgac ttcgggtgtt       60

 

gcaagctctc gtggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc      120

 

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tagcactcat cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgtttg ctccccacgc      720

 

tttcgcgcct cagcgtcagt tgcaggccag agagccgcct tcgccactgg tgttcctcca      780

 

catctctacg catttcaccg ctacacgtgg aattccgctc tcctctcctg cactcaagtc      840

 

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ttactcaccc gtccgccgct gaccaaatca gagcaagctc cgatttggtc cgctcgactt     1440

 

gctatgtatt aggcaacacg aaattcca                                        1468

Claims (8)

1.一株高温纤维素降解菌，名称为Geobacillus kaustophilus. HCDM5，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：8441。

2.权利要求1所述的高温纤维素降解菌在降解纤维素中的应用。

3.权利要求1所述的高温纤维素降解菌在制备堆肥中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述堆肥的主料为园林废弃物。

5.一种用于降解纤维素的固体菌剂，由权利要求1所述的保藏编号为CGMCC NO：8441的高温纤维素降解菌制备得到。

6.根据权利要求5所述的固体菌剂，其特征在于，制备方法如下：

（1）斜面活化：取菌种斜面，在65-75℃下活化培养16-32 h；

（2）制备种子液：将步骤（1）已活化的菌接种至无菌LB液体培养基中，在水浴摇床上以60-70℃温度、50-200 rpm转速震荡培养24-36 h得种子液；

（3）发酵种子液的制备：取步骤（2）中种子液按5%-20%（v/v）的接种量接种至已灭菌的发酵罐中，进行扩大发酵培养,培养条件：温度为60-70℃，转速为100-200 rpm，培养时间36-60 h；

（4）制备固体菌剂：将麦麸与玉米面混合后，接种上述发酵种子液，接种量为培养基总重量的0.5%-3.5%，调节含水率至45%-55%范围内，自然堆置一至两周后，将堆体摊开陈化使含水率下降至30%以下，即得固态菌剂。

7.权利要求5或6所述的固体菌剂在制作堆肥中应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述堆肥的主料为园林废弃物。

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