CN109439585A - 一株己二酸凯氏菌及其在纤维素降解中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一株己二酸凯氏菌及其在纤维素降解中的应用，属于农业资源与环境微生物领域；该菌株在35℃培养条件下5 d对滤纸的降解率可达92.30%±0.018，10 d对稻草的降解率为70.80%±0.022；该菌株为常温降解细菌，30‑37℃条件下均可快速生长，生物量较大，纤维素降解功能高效稳定，而且菌株培养及保存均较简单，可在纤维素类堆肥中用于缩短堆肥周期，促进腐熟，也可在农业作物秸秆类固体废弃物的降解和处理中发挥重要的作用，同时利于生态环境的保护和优化，具有重要的市场应用价值及潜力。

Description

一株己二酸凯氏菌及其在纤维素降解中的应用
技术领域
本发明涉及农业资源与环境微生物领域，特别是一株己二酸凯氏Ka-CW34及其在纤维素降解中的应用。
背景技术
随着社会的不断发展，人口的迅速增长，资源、环境和人口已经被国际社会公认为是影响人类可持续发展的三个关键问题。资源和环境问题是当今面临的巨大挑战，寻找再生能源替代不可再生能源是应对这一挑战的惟一途径。我国是农业大国，秸秆是我国丰富的可再生资源，但是每年大部分的秸秆被焚烧和废弃，不仅造成资源的浪费，同时也造成严重的环境污染。相较于物理化学等处理方法，微生物降解秸杆具有无二次污染、处理方式温和、能耗低等特点，因此，开发高效利用纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，具有极其重要的意义和发展前景。
目前，对纤维素的降解利用的有效手段就是采用微生物降解，利用纤维素降解菌可将纤维素转化为饲料、化工原料等，而在降解木质纤维素的微生物中，霉菌具有生长缓慢、相关酶类结构复杂且热稳定性较差、不耐碱性等缺点。真菌中有小部分酵母也具有降解木质纤维素的能力，但其降解能力较弱，放线菌在一定程度上能改变木质素的分子结构，继而分解溶解的木质素，但大多数的放线菌生长较慢，繁殖均要较长时间。细菌与上述两种菌属相比，具有来源更广、种类更多、生长更快等优点，且生长温度和适应pH值很宽，在纤维素降解方面显现了潜在的应用前景，降解效果好。目前报道的具有纤维素降解功能的细菌包括纤维单胞菌、芽孢杆菌属、纤维菌属、假单胞菌属，但这类菌株大多存在热稳定性较差、不耐碱性以及单一菌株降解能力弱等缺点。
变形杆菌属是肠杆菌科的一种兼性厌氧菌属，是我国引起食物中毒的常见菌属之一。目前，具有纤维素降解功能的变形杆菌属菌株尚未见报道。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一株己二酸凯氏菌，该菌株在常温下具有较高且稳定的纤维素降解能力。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明首先提供了一株己二酸凯氏菌(Kaistia adipata)，其保藏号为CGMCC NO：16562；该菌株在NB固体培养基上可形成凝胶状、表面较光滑、湿润、易挑取的米白色菌落。该菌株于2018年10月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center, CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。
其次，本发明还提供了保藏号为CGMCC NO：16562的己二酸凯氏菌在纤维素降解中的应用；特别是在降解秸秆或滤纸中的应用。
进一步而言，本发明所述在纤维素降解中的应用是指：将纤维素加入降解培养基中，121℃灭菌20min；然后接种保藏号为CGMCC NO：16562的己二酸凯氏菌液（含菌量1×107CFU/mL），35℃ 150 rpm摇床培养，即可实现对纤维素的降解；所述纤维素优选滤纸或秸秆。
所述己二酸凯氏菌液是这样获得的：将保藏编号为CGMCC NO：16562的己二酸凯氏菌单菌落接种于改良CMC液体培养基中过夜培养，即获得己二酸凯氏菌液（含菌量1×107CFU/mL）；
改良CMC液体培养基：CMC-Na 15.0 g，KH2PO4 1.0 g，NH4P04 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5g，酵母提取物 1.0 g，蒸馏水1000 mL，pH自然；121℃灭菌待用。
降解培养基：KH2PO4 2 g，(NH4)2PO4 1.4 g，Mg-SO4·7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3 g，酵母提取物 1.0 g，FeSO4·7H2O 5 mg，MnSO41.6 mg，ZnCl2 1.7 mg，CoCl2 1.7 mg，蒸馏水1000 mL，pH 自然；121℃灭菌待用。
NB液体培养基：营养肉汤粉（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，编号：HB0108） 18.0g，蒸馏水1000 mL，PH自然；121℃灭菌待用。
NB固体培养基：营养肉汤粉18.0g，琼脂 15.0g，蒸馏水1000 mL，PH自然；121℃灭菌后冷却至60℃倒平板待用。
申请人于中药渣堆肥中筛选获得一株己二酸凯氏菌，对该菌株进行16srRNA测定及序列比对与MEGA 7.0分子进化树分析，确定其为变形杆菌属己二酸凯氏菌，与己二酸凯氏菌Chj404（Kaistia adipata Chj404）亲缘关系最近，序列相似性为99.85%。申请人将该菌株自命名为Ka-CW34，该菌株生长快速，35℃ 过夜培养即可在改良CMC液体及固体平板上长出大量的菌落，生物量大。且其可以在CMC-Na为唯一碳源的平板上快速生长。
本发明提供的己二酸凯氏菌Ka-CW34具有显著较高的纤维素酶活力，该菌株在3-5d使滤纸条降解为半清状，在5 d对0.2 g滤纸降解率可达92.30% ± 0.018；10 d对0.5 g稻草的降解率可达70.80% ± 0.022；酶活力测定表明该菌株具有较高的CMC及Fpase酶活力，最高值分别为55.285 U/mL和81.434 U/mL。经测定，该菌株CMC酶活力和Fpase 酶活力的最高值分别为55.285 U/mL和81.434 U/mL。此菌株分泌的CMC酶活力与Fpase酶活力与目前已有的关于纤维素降解细菌酶活力的报道相比，均处于高水平，为现有报道细菌菌株纤维素酶活力的1.5-2倍。该菌株在NB液体培养基上生长迅速且在常温下短时间内对滤纸和稻草秸秆进行高效降解，因此在常温纤维素的降解及固体废弃物的处理及应用中可发挥重要作用，同时也可在有效缩短纤维素类（稻草、小麦、玉米等秸秆）堆肥腐熟周期及城乡秸秆降解及处理中具有重要的应用价值，对生态环境的保护和优化均具有重要的意义。特别是该菌株为常温菌 (30-37℃)，适用范围更为广泛，更具有巨大的市场应用价值和潜力。
附图说明
图1为中药渣堆肥样品中，菌悬液梯度稀释后涂布改良CMC固体培养基后的生长情况图片。
图2为在改良CMC固体培养基上对菌落进行划线纯化培养图片。
图3为菌株Ka-CW34试管滤纸条实验对比示意图。与对照相比，Ka-CW34菌株在3 d即可将滤纸条基本降解为半清状。
图4为菌株Ka-CW34在NB固体培养基上生长的菌落图片。
图5为菌株Ka-CW34 16srRNA序列测定后MEGA 7.0 分子进化树分析示意图。
图6为菌株Ka-CW34 CMC酶与滤纸糖化酶（Fpase）酶活力测定示意图。
图7为菌株Ka-CW34在50 ml摇瓶培养中对滤纸的降解情况示意图。
图8为菌株Ka-CW34在50 ml摇瓶培养中对稻草秸秆的降解情况示意图。
具体实施方式
以下实施例所涉及的培养基：
改良CMC液体培养基：CMC-Na 15.0 g，KH2PO4 1.0 g，NH4P04 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5g，酵母提取物 1.0 g，蒸馏水1000 mL，pH自然；121℃灭菌20 min待用。
改良CMC固体培养基：CMC-Na 15.0 g，KH2PO4 1.0 g，NH4P04 1.0 g，MgSO4·7H2O0.5 g，酵母提取物 1.0 g，蒸馏水1000 mL，琼脂 15.0g，pH自然；121℃灭菌20 min待用。
产酶发酵培养基：CMC-Na 10g，KH2PO4 2 g，(NH4)2PO4 1.4 g，Mg-SO4·7H2O 0.3g，CaCl2 0.3 g，酵母提取物 1.0 g ，FeSO4·7H2O 5 mg，MnSO41.6 mg，ZnCl2 1.7 mg，CoCl21.7 mg，蒸馏水 1000 mL，pH 自然；121℃灭菌20 min待用。
降解培养基：KH2PO4 2 g，(NH4)2PO4 1.4 g，Mg-SO4·7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3 g，酵母提取物 1.0 g，FeSO4·7H2O 5 mg，MnSO41.6 mg，ZnCl2 1.7 mg，CoCl2 1.7 mg，蒸馏水1000 mL，pH 自然；121℃灭菌20 min待用。
改良试管滤纸条培养基：向直径 1.5 cm、长 15 cm 试管中加入降解培养基5 mL，加 1条6 cm× 1 cm滤纸条直立于试管中，121℃ 20 min灭菌待用。
改良摇瓶滤纸培养基：向锥形瓶中加入50 ml降解培养基，同时在其中加入0.2 g滤纸，121℃ 20 min灭菌待用。
改良摇瓶稻草秸秆培养基：向锥形瓶中加入50 ml降解培养基，同时在其中加入0.5g稻草秸秆，121 ℃ 20 min灭菌待用。
实施例中的滤纸为Whatman新华双圈定量滤纸(直径11cm)，购自于通用电气生物科技（杭州）有限公司，其主要成分为纤维素，灰分为0.01%，自行裁剪为统一规格为（6 cm×1 cm）的滤纸条。
实施例1 己二酸凯氏菌Ka-CW34的筛选及CMC平板培养与划线纯化
不同采样时期的中药渣堆肥样品（来源于江苏省连云港市东海县中药渣堆肥），取5 g加入50 ml 灭菌超纯水中混匀，35 ℃ 150 rpm 30 min，取1 ml 悬浊液，用灭菌后的超纯水依次梯度稀释，稀释后的悬液取100µl 涂布于改良CMC固体培养基上，35 ℃培养箱中培养1 d（图1），将改良CMC固体培养基上的菌落进行单菌株划线纯化（图2）。
菌悬液梯度稀释后涂布改良CMC固体培养基35 ℃培养箱中培养1 d的生长情况如图1所示，图1中，A、B、C依次为将菌液稀释至10-3、10-4、10-5进行涂布后菌落生长图片。
图2为在改良CMC固体培养基上对菌落进行划线纯化培养的培养皿图片，图2中，A、B、C三个培养皿为图1对应的A、B、C不同梯度稀释平板所生长的菌落中挑选单菌落划线纯化后的生长图片。
挑取菌落形态、颜色、大小不一的单菌落进行划线纯化培养，以能在改良CMC平板上快速生长，生物量较大的菌落为优。然后将纯化培养后的单菌落分别接种于改良试管滤纸条培养基中，并以不加菌液的滤纸条作为对照（K），与初筛温度相同条件培养，观察滤纸条的溃烂情况，筛选出可使滤纸条明显崩解的菌株即为具有纤维素降解功能菌株。
申请人筛选到一株表现明显的滤纸条崩解能力的菌株，其在3 d即可将滤纸条基本降解为半清状（如图3所示），申请人将该菌株自命名为Ka-CW34；菌株Ka-CW34在NB固体培养基上生长形成的菌落如图4所示。
菌株Ka-CW34 3 d可使滤纸条基本崩解为乳白色半清状液体。申请人对该菌株进行16srRNA测定及序列比对与MEGA 7.0 分子进化树分析，确定其为变形杆菌属己二酸凯氏菌，与己二酸凯氏菌Chj404 （Kaistia adipata Chj404）亲缘关系最近，序列相似性为99.85%，其分子进化树分析如图5所示。申请人将该菌株于2018年10月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture CollectionCenter, CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。
实施例2 己二酸凯氏菌Ka-CW34酶活力测定
将实施例1筛选获得的菌株Ka-CW34在产酶发酵培养基中培养，35℃，150 r/min 培养14 d，在1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 d时取菌株上清液进行纤维素酶活力测定。
酶活力检测方法如下： CMCase测定：取0.5ml 粗酶液于容量瓶中，加入1.5ml含0.5%CMC-Na 的0.5mol/L、ｐＨ5.0的柠檬酸缓冲液，于50℃水浴锅中准确作用30min，再加入1.5ml 3,5－二硝基水杨酸（DNS）溶液，沸水浴5min后立即用流水冷却。测其在540nm处的OD值，并通过萄萄糖标准曲线求葡萄糖含量。空白对照为于100℃水浴锅中灭活10min的粗酶液。
FPase测定；将新华1号滤纸条（1cmｘ6cm）折成M型，放入盛有1.5ml（0.05mol/L,PH5.0）HAC-NaAC缓冲液的试管底部，加入0.5ml粗酶液后充分摇匀，使落液完全浸泡滤纸。于50℃水浴锅中准确作用60 min，按DNS法测还原糖。
上述酶活定义：每min每ml酶液催化底物水解生成１µg葡萄糖的酶量，为1个酶活为单位U。
上述检测方法也可参见文献“纤维素降解细菌的筛选及其酶活测定，蒋明星等，中国农学通报，2015，31（36）：161-164”中公开的方法。
检测如图6所示，可见，该菌株的CMC酶活力在11 d时达到最高值，为55.285 U/mL，Fpase 酶活力在7d时最大，为和81.434 U/mL。
实施例3 己二酸凯氏菌Ka-CW34对滤纸纤维素的降解能力检测
将实施例1筛选获得的己二酸凯氏菌Ka-CW34单菌落接种于改良CMC液体培养基中，35℃ 150 rpm摇床中过夜培养后，次日分别转接1 ml菌液（其含菌量约为1×107CFU/mL）于50ml 改良摇瓶滤纸培养基中，同时设立不加菌液的对照组（K），培养5d后，降解结果如图7所示。
图7中，A、B为同一对照组/St-GW2组不同角度的图片，可见，菌株Ka-CW34在50 ml摇瓶中对滤纸进行降解，5 d可将 0.2 g滤纸基本降解完毕，滤纸培养基中液体变为乳白色半清状，对照组（K）基本无变化。
将摇瓶中的滤纸降解物过20目及60目网纱，过滤后的样品在35℃的烘箱中进行烘干24 h，烘干后的样品用万分之一天平进行称量，计算降解率：降解率=（滤纸初始质量-（烘干后20目网纱上滤纸过滤物的质量）/滤纸初始质量+烘干后60目网纱滤纸过滤物的质量/滤纸初始质量）。经过计算可得：Ka-CW34菌株对滤纸降解率为92.30% ± 0.018。
实施例4 己二酸凯氏菌Ka-CW34在稻草秸秆降解中的应用
将实施例1筛选获得的菌株Ka-CW34单菌落接种于改良CMC液体培养基中，35℃ 150rpm摇床中过夜培养后，次日转接1 ml菌液于50 ml 改良摇瓶稻草秸秆培养基中，同时设立不加入菌液的对照组（K），继续培养10 d后，降解结果如图8所示。
图8为35℃ 150rpm培养10 d后对照组（K）与Ka-CW34摇瓶图片，图8中，A、B为同一对照组/St-GW2组不同角度的图片可见，菌株Ka-CW34对稻草秸秆也具有明显的降解能力，稻草摇瓶培养基中的绝大多数稻草已经变为细碎的粉末状，瓶底存在很多稻草粉末，培养基变为浑浊褐色液体，而对照组基本无变化。
将摇瓶中的稻草降解物过20目及60目网纱，过滤后的网纱在55℃的烘箱中进行烘干24 h，烘干后的样品用万分之一天平进行称量，计算降解率，计算得该菌株对稻草降解率为70.80% ± 0.022。

Claims (6)

1.一株己二酸凯氏菌(Kaistia adipata)，其保藏编号为CGMCC NO：16562。
2.如权利要求1所述己二酸凯氏菌在纤维素降解中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述纤维素包括滤纸或秸秆中的至少一种。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述应用是指：将纤维素加入降解培养基，灭菌后接种二酸凯氏菌液；然后于35℃、150rpm 摇床培养，即可实现对纤维的降解；
所述降解培养基配方如下：H2PO4 2 g，(NH4)2PO4 1.4 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3g，酵母提取物 1.0 g，FeSO4·7H2O 5 mg，MnSO41.6 mg，ZnCl2 1.7 mg，CoCl2 1.7 mg，蒸馏水 1000 mL，pH 自然。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述己二酸凯氏菌液是这样获得的：将保藏编号为CGMCC NO：16562的己二酸凯氏菌接种于改良CMC液体培养基中过夜培养，即获得己二酸凯氏菌液；
所述改良CMC培养基配方如下：CMC-Na 15.0 g，KH2PO4 1.0 g，NH4P04 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母提取物 1.0 g，蒸馏水1000 mL，PH自然；121℃灭菌待用。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述己二酸凯氏菌液含菌量为1×107 CFU/mL。
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