CN103131639B

CN103131639B - 一种长枝木霉菌株及其应用

Info

Publication number: CN103131639B
Application number: CN201110376561.8A
Authority: CN
Inventors: 顿宝庆; 田谷; 王智
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-11-23
Filing date: 2011-11-23
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2031-11-23
Also published as: CN103131639A

Abstract

本发明筛选出了一种新的可生产纤维素降解酶的长枝木霉菌株CD-6，所述长枝木霉CD-6培养方便，生长繁殖迅速；对于内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和木聚糖酶都具有较高的生产能力，且具有较高的酶活性。

Description

一种长枝木霉菌株及其应用

技术领域：

本发明涉及一种新的长枝木霉菌株CD-6，本发明还涉及所述长枝木霉在生产外切葡聚糖酶，内切葡聚糖酶和木聚糖酶方面的应用。

背景技术：

纤维素物质是地球上最丰富的，可再生的碳水化合物资源。

纤维素酶是一种复合酶产品，可将纤维素降解成为葡萄糖，以及转化为人类社会所需要的糖类，乙醇及其他化工产品。因此，开发出活性好的纤维素降解酶，就能够有效开发利用纤维素这一巨大可再生资源，对解决能源危机有着重要意义。

木霉是纤维素酶产业的主要产生菌种之一，生存能力极强，产孢量多，生产纤维素酶系齐全，产酶效率高，特别是里氏木霉已成为纤维素酶生产菌株的最主要研究对象。所以木霉在生产纤维素酶领域有着很好的实用性与应用前景。

长枝木霉属于木霉的一种，具有木霉作为纤维素酶生产菌株的所有优点，但现有技术中报道的长枝木霉均是涉及生物防治等方面或其发酵生产的纤维素酶组合物在去污、纺织品生产、饲料添加剂等其它领域方面的应用。至今为止长枝木霉作为纤维素酶生产菌的相关研究报道极少。

发明内容：

本发明的目的是筛选出一种新的可生产纤维素降解酶(包括外切葡聚糖酶，内切葡聚糖酶和木聚糖酶)的菌株，具有培养周期短，易于扩大培养的优点，可用于实际生产纤维素降解酶。

本发明的另一个目的是提供一种利用上述新的菌株生产外切葡聚糖酶，内切葡聚糖酶和木聚糖酶的方法。

本发明人从取自海南的土壤样品中分离筛选到了一种新的长枝木霉菌株，命名为长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)CD-6，该菌株已于2011年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5395。

1、长枝木霉CD-6的菌学特性如下：

1)形态学特性：在PDA平板上，菌落生长迅速，气生菌丝体从接种点向外呈辐射状，初呈白色，72h后开始转为浅绿色，最后逐渐变成灰绿色，平板上有“脓泡”状结构，背面呈黄绿色或黄色。

2)培养特性：30℃在复筛培养基中生长繁殖速度快，可以在短时间内培养出大量、均一的纤维素降解酶液。且酶活效率高。可利用玉米等作物的秸秆作为培养基碳源。

3)生理特性：菌落在PDA上黑暗培养，25-30℃培养3d，菌落直径65-70mm，在30-40℃培养的情况下，24h内分生孢子出现，在30-35℃大量出现。在PDA上35℃黑暗培养4-5d，分生孢子布满平板表面，分生孢子梗在由粗大的主轴自伸出点一直到顶部，单个瓶梗，次级分枝塔状分布，对生。瓶梗直接着生在次级分枝上。分生孢子梗的主轴宽度为(1.2-)2.2-3.2(-4.7)μm。见图1～3

4)代谢特性(功能特性)：将上述长枝木霉CD-6接种到液体产酶培养基中培养可在短期内(2-3天)形成大量分生孢子(见实施例2)，得到内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和木聚糖酶。

2、长枝木霉CD-6的分类鉴定

发明人提取了此菌的DNA，以ITS5-ITS4为引物，扩增rDNA的ITS区域(核糖体-DNA ITS)。

长枝木霉CD-6的核糖体-DNA ITS序列如SEQ ID NO：1所示。将该序列进行BLAST比对，发现与长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)相似性大于99％。

3、利用长枝木霉CD-6生产纤维素降解酶的方法

将上述长枝木霉CD-6接种到液体产酶培养基中培养，得到内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和木聚糖酶；所述液体产酶培养基包括碳源、氮源、无机盐和水。

所述碳源选自下述化合物中的一种或几种：玉米秸秆，小麦秸秆，高粱秸秆，甘蔗渣，微晶纤维素，羧甲基纤维素钠，蔗糖，麦麸，稻草粉。

所述氮源选自下述化合物中的一种或几种：硫酸铵，尿素，酵母膏，硝酸铵，氯化铵。

所述无机盐选自KH₂PO₄、MgSO₄和CaCO₃.其终浓度分别为：KH₂PO₄ 3.5g/L，MgSO₄0.04g/L，CaCO₃ 0.5g/L。

优选的碳源、氮源、无机盐及它们的终浓度分别为：碳源(玉米秸秆粉25g/L)、氮源(硫酸铵2.7g/L)、无机盐(KH₂PO₄ 3.5g/L，MgSO₄ 0.04g/L，CaCO₃ 0.5g/L)和蒸馏水1000ml。

所述长枝木霉CD-6的接种量无特别限制，一般为10⁴～10⁶个孢子/ml培养基。

所述培养温度是25～32℃，优选28～30℃。所述培养方式是：可以160～200rpm的转速振荡培养2～7天，也可静置培养3～15天。

本发明的长枝木霉CD-6不仅具备了木霉所有的优点，而且还具有以下优点：

1、培养方便，生长繁殖迅速。

2、对于内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和木聚糖酶都具有较高的生产能力。

3、所生产的多种酶都具有较高的酶活性。

4、所产生的酶均为胞外酶，易于提取。

5、发酵工艺简单、稳定。

6、产酶快(摇床培养5-6天即可达到产酶高峰)，内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和木聚糖酶酶活性分别达到105.09IU/ml、50.65IU/ml和172.62IU/ml。

7、成本低廉。可直接利用玉米秸秆等废弃资源为长枝木霉CD-6的培养基碳源，减少对环境的污染。

因此，长枝木霉CD-6菌株是理想的研究、改造应用的出发材料菌株。利用长枝木霉CD-6生产纤维素降解酶能够节省时间和能源消耗，降低生产成本，具有实现其工业化生产的极大可能，并具有广阔的工农业应用和市场前景。

附图说明

图1长枝木霉CD-6在PDA培养基上生长的菌落形态图；

图2长枝木霉CD-6分生孢子梗形态图；

图3长枝木霉CD-6分生孢子；

图4、5、6分别为长枝木霉CD-6菌株产外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和木聚糖酶的进程，图中横座标为培养天数，纵座标分别为酶活。

图7、8、9分别为长枝木霉CD-6菌株以小麦、高粱、蔗渣为产酶主要底物产外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和木聚糖酶的进程，图中横座标为培养天数，纵座标分别为酶活。

生物材料保藏信息

名称：长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)CD-6

保藏编号：CGMCC No.5395

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏时间：2011年10月26日。

实施例1长枝木霉CD-6的分离纯化、筛选和菌株分类

一、分离纯化

1、分离样品取自海南某土壤样品，对采集的土壤样品采用初筛及复筛相结合的方法进行分离纯化。取少量样品置无菌三角瓶中，加入10倍体积无菌水，充分打散。取1mL-5mL(按2％-10％的接种量)悬液加入盛有50mL富集培养基的无菌三角瓶中，28℃，150r/min培养1-2d。将富集培养后的样品做10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6梯度稀释。取0.1mL分别涂布到复筛培养基上，28℃倒置培养3-5d。分离能够旺盛生长的菌株。

2、将得到的纯菌种转移接种到斜面培养基(PDA综合培养基)上，4℃保存。

以上所述的PDA综合培养基制备方法是：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，KH₂PO₄ 3g，Mg SO₄ 1.5g，VB1 10mg，琼脂20g，水1000ml，pH自然(不控制pH值)。新鲜马铃薯去皮后切成边长0.5cm的小方块，加水1000ml，煮沸后再加热10分钟，然后，用四层纱布过滤，得土豆营养液，添加除VB1外的其他成分，补足水至1000ml，121℃灭菌20min，VB1单独配成溶液用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后加入，使其终浓度为10mg/L，混匀后铺平板或制作斜面培养基。

上述富集培养基：CMCNa 1％；K₂HPO₄ 0.1％；Na₂CO₃ 0.5％；MgSO₇H₂O 0.01％；FeSO₄·7H₂O 0.015％；MnSO₄ 5×10^-5％；蛋白胨1.0％；酵母膏1.0％，121℃灭菌20min。

上述复筛培养基：CMCNa 1％；(NH₄)₂SO₄ 0.5％；K₂HPO₄ 0.3％；MgSO₄·7H₂O 0.01％；蛋白胨0.1％；酵母膏1.0％；琼脂粉1.5％，121℃灭菌20min。灭菌后铺平板。

二、筛选产生纤维素降解酶能力的菌株-长枝木霉CD-6

采用刚果红平板脱色法，根据菌株在培养过程中纤维素降解酶类的产生情况，从中筛选出产酶快，酶活高的菌种。具体操作步骤为：

将培养适当时间的平板，用0.1％的刚果红水溶液浸染一段时间后，再用1mol/L的NaCl水溶液脱色，刚果红将未被降解CMCNa染成红色，而对已被降解的小分子低聚糖类无作用，因此在产CMCase的菌落周围留下了清晰地透明圈。在刚果红染色、NaCl脱色后可以观察到菌落周围有明显透明水解圈的菌株为纤维素分解菌。

长枝木霉CD-6在培养2天后即产生了明显的脱色圈。CD-6不仅生长迅速，而且具有迅速强力的纤维素分解能力，说明该菌种具有快速产生较高活力的纤维素酶力，是纤维素降解酶生产的理想菌种。

三、菌种分类地位的鉴定

对筛选出的CD-6菌株的表型特征和核酸特征进行系统地鉴定，结果如下：

提取此菌的DNA，以ITS5-ITS4为引物，PCR扩增rDNA的ITS区域(核糖体-DNAITS)，得到的目的片段大小约为660bp并进行测序分析。测序结果在NCBI上进行BLAST比较，与Trichoderma longibrachiatum鉴定符合率大于99％。序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2长枝木霉CD-6的发酵培养——纤维素酶生产(一)

1、长枝木霉CD-6的孢子培养

产孢培养基：酵母浸粉10g，葡萄糖20g，水1000ml，pH自然，121℃灭菌20min。

用接种铲从斜面挖取一块边长为0.5cm左右的菌丝块接种于产孢培养基平板中，30℃培养2～3天，即可产生大量灰绿色孢子。

2、发酵生产纤维素降解酶

用无菌水将按步骤1培养的孢子洗下，用血球计数法计数后用无菌水调整孢子浓度，然后接种孢子悬液于50mL产酶培养基中(装在250mL三角瓶中)，使接种的孢子终浓度在10⁴～10⁶个孢子/mL培养基范围内，30℃，200rpm振荡培养6-7天。每24h测定发酵液的酶活性，最终测得的纤维素酶酶活性表明：内切葡聚糖酶CMCase最高活性为105.09IU/ml，外切葡聚糖酶FPA最高活性为50.65IU/ml，木聚糖酶最高活性为172.62IU/ml。如图4、5、6所示。

上述产酶培养基(/L)：玉米秸秆粉25g/L，KH₂PO₄ 3.5g/L，MgSO₄ 0.04g/L，CaCO₃0.5g/L，121℃灭菌20min，自然pH值。

上述三种酶的酶活测定方法如下：

A内切葡聚糖酶活性的测定方法

DNS法：取50μl适当稀释的CD-6菌株的发酵培养液与150μlpH6.0的0.5％羧甲基纤维素钠溶液，50℃恒温水浴准确反应30min。加入50μl 1mol/L NaOH溶液终止反应。加入150μl DNS试剂，同时于沸水浴中准确反应5min。用流动的冷水终止反应。加850μl离子水，于540nm处测定光吸收值。

对照标准曲线后测算酶活力。在上述条件下，酶活力按国际单位规定：定义每分钟催化纤维素水解生成1μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位IU(IU/ml)。

B外切葡聚糖酶活性的测定方法

DNS法：在容积为1.5ml的离心管中，加入1cm×1cm的whatman NO.1滤纸条和50μL的0.05M pH4.8柠檬酸缓冲液。加入25μL适当稀释的CD-6菌株的发酵培养液，在50℃恒温水浴中反应1h。加入150μL DNS试剂，同时于沸水浴中准确反应5min.用流动的冷水终止反应。去离子水定容至1250μL，于OD540nm处测定光吸收值，对照葡萄糖标准曲线后测算酶活力。对照为灭活酶液，三次重复。

在上述条件下，酶活力按国际单位规定：定义每分钟催化纤维素水解生成1umoL葡萄糖的酶量为一个酶活力单位IU(IU/mL)。

C木糖酶活的测定方法

取四支容积为1500μL的离心管各加入100μL中性木聚糖底物，与适当稀释的CD-6菌株的发酵培养液一起在50℃恒温水浴中预热5min。在第一、二、三离心管中加入100μL待测酶液，50℃恒温水浴中准确反应15min。在四支离心管中各加入600μL的DNS试剂，然后在第四试管中加入100μL待测酶液。震荡混匀四支离心管后，在沸水浴中煮5min。用流动的冷水终止反应后，将显色液(包括空白)以4000hr/min离心5min。取上清液以第四支离心管为对照在OD540nm下测第一、二、三离心管样品的吸光值。对照木糖标准曲线后测算酶活力。

对照标准曲线后测算酶活力。在上述条件下，酶活力按国际单位规定：定义每分钟催化木聚糖水解生成1μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位IU(IU/ml)。

以下实施例3～6中，长枝木霉CD-6的孢子培养方法，以及内切葡聚糖酶活性、外切葡聚糖酶活性、木聚糖酶活性的测定方法同实施例2。

实施例3长枝木霉CD-6的发酵培养——纤维素酶生产(二)

产酶培养基配方同实施例2。

按实施例2的方法和浓度接种孢子悬液入200ml产酶培养基中，30℃，200rpm培养6-7天，测定发酵液中CMCase的最高活性为50.65IU/ml，FPA的最高活性为105.09IU/ml，木聚糖酶最高活性为172.62IU/ml。

实施例4长枝木霉CD-6的发酵培养——纤维素酶生产(三)

产酶培养基(/L)：小麦秸秆粉25g/L，KH₂PO₄ 3.5g/L，MgSO₄ 0.04g/L，CaCO₃ 0.5g/L，121℃灭菌20min，自然pH值。

按实施例2的方法和浓度接种孢子悬液入200ml产酶培养基中，30℃，200rpm培养6-7天，测定发酵液中CMCase的最高活性为101.03IU/ml，FPA的最高活性为53.5IU/ml，木聚糖酶最高活性为174.3IU/ml(图7)。

实施例5长枝木霉CD-6的发酵培养——纤维素酶生产(四)

产酶培养基(/L)：高粱秸秆粉25g/L，KH₂PO₄ 3.5g/L，MgSO₄ 0.04g/L，CaCO₃ 0.5g/L，121℃灭菌20min，自然pH值。

按实施例2的方法和浓度接种孢子悬液入200ml产酶培养基中，30℃，200rpm培养6-7天，测定发酵液中CMCase的最高活性为98.02IU/ml，FPA的最高活性为48.23IU/ml，木聚糖酶最高活性为167.51IU/ml(图8)。

实施例6长枝木霉CD-6的发酵培养——纤维素酶生产(五)

产酶培养基(/L)：蔗渣25g/L，KH₂PO₄ 3.5g/L，MgSO4 0.04g/L，CaCO₃ 0.5g/L，121℃灭菌20min，自然pH值。

按实施例2的方法和浓度接种孢子悬液入200ml产酶培养基中，30℃，200rpm培养6-7天，测定发酵液中CMCase的最高活性为98.91IU/ml，FPA的最高活性为48.73IU/ml，木聚糖酶最高活性为167.45IU/ml(图9)。

Claims

1.长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）CD-6，其保藏编号为CGMCC No.5395，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.根据权利要求1所述的长枝木霉，其特征在于其菌株的核糖体-DNA ITS序列如SEQ ID NO:1所示。

3.用权利要求1或2所述的长枝木霉生产外切葡聚糖酶，内切葡聚糖酶和木聚糖酶的用途。

4.一种生产外切葡聚糖酶，内切葡聚糖酶和木聚糖酶的方法，将产酶菌种接种到液体产酶培养基中培养，其特征是所用的菌种是权利要求1所述的长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）CD-6，所述液体产酶培养基包括碳源、氮源、无机盐和水，所述长枝木霉的接种量为10⁴～10⁶个孢子/ml培养基，培养温度最适28～30℃，振荡培养2～7天或静置培养3～14天。

5.根据权利要求4所述的方法，所述碳源为玉米秸秆，小麦秸秆，高粱秸秆，甘蔗渣，微晶纤维素，羧甲基纤维素钠，蔗糖，麦麸，稻草粉中的一种或几种；所述氮源为硫酸铵，尿素，酵母膏，硝酸铵，氯化铵中的一种或几种；所述无机盐为KH₂PO₄、MgSO₄和CaCO₃。

6.根据权利要求4所述的方法，所述碳源为玉米秸秆，小麦秸秆，高粱秸秆，甘蔗渣，微晶纤维素，羧甲基纤维素钠，蔗糖，麦麸，稻草粉中的一种或几种，其终浓度为25g/L；所述氮源为硫酸铵，尿素，酵母膏，硝酸铵，氯化铵中的一种或几种，其终浓度为2.7g/L。

7.根据权利要求4所述的方法，所选择无机盐的终浓度分别为：KH₂PO₄3.5g/L，MgSO₄0.04g/L，CaCO₃0.5g/L。