CN102559506B - 一种草酸青霉菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明发现了一种新的青霉属真菌菌株——草酸青霉M。该菌可以在短时间内培养出大量、均一的纤维素降解酶产生菌培养液。本发明还提供了利用该菌株在液体产酶培养基中发酵培养生产内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的方法，以及利用该菌株发酵产酶糖化秸秆纤维素的方法。上述方法工艺简单、稳定、成本低廉、产量高。

Description

一种草酸青霉菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物及其应用领域，具体涉及草酸青霉(Penicillium oxalicum)M CGMCCNo.4357，以及该菌在生产纤维素降解酶方面的应用。

背景技术

利用木质纤维素生产燃料乙醇既解决能源危机，又充分利用资源、保护环境。

产木质纤维素降解酶的真菌是降解纤维素原料的主要类群。其中青霉属真菌具有木质纤维素降解酶系组成的多样性、合理性，以及酶的结构与功能的独特性。已发现的产木质纤维素降解酶系的青霉菌株有多种，其中产酶能力较高的有斜卧青霉(P.decumbens)(QuYB，etc.1984.Acta Mycol Sin.3：238-243)、微紫青霉(P.janthinellum)(Rapp P，etc.1981.Appl Environ Microbiol.41(4)：857)和绳状青霉(P.funiculosum)(Wood TM，etc.1980.Biochem J.189(1)：51-65)等。

关于产木质纤维素降解酶的草酸青霉报道比较少。Yin Li等2007年报道了一株木聚糖酶活性较高的草酸青霉菌株ZH-30，对其发酵条件进行了优化，在15L的发酵罐中发酵144h后，木聚糖酶活性最高达到16.11U/ml。(Yin Li，etc.2007.Improvement ofxylanase productionby Penicillium oxalicum ZH-30 using response surface methodology.Enzyme and MicrobialTechnology，40：1381-1388)。张倩，王宝维等2009年报道了一株产纤维素酶的草酸青霉菌株F67，将其培养条件优化后，外切葡聚糖酶活达到507.104U/ml。(Zhang Qian，Wang Baowei，etc.2009.Ferment Conditons of Goose Origin PenicUlium oxalicum Currie & Thom F67Producing Cellulase.Journal ofShenyang Agricultural University，40(1)：47-52)。

上述报道的草酸青霉菌株的培养基中各成分均使用试剂，而未利用作物秸秆等可再利用的资源。而且使用试剂会对环境造成污染。

发明内容

本发明的目的是提供一种培养周期短，易于扩大培养的纤维素降解酶生产菌；本发明的直接目的是提供一种新的草酸青霉菌株。

本发明的另一个目的是提供一种方法，利用该新的草酸青霉菌株生产纤维素降解酶，并利用此纤维素降解酶糖化秸秆纤维素。

一、本发明发现了一个新的草酸青霉菌株：

草酸青霉(Penicillium oxalicum)M，该菌株已于2010年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4357(以下简称为草酸青霉M)。

二、草酸青霉M的特征如下：

1、核糖体-DNA

发明人提取了此菌的DNA，以ITS5-ITS4为引物，扩增rDNA的ITS区域(核糖体-DNAITS)。核糖体-DNA ITS序列如SEQ ID NO：1所示。

将该序列进行BLAST比对，与草酸青霉(Penicillium oxalicum)(NRRL35183、NRRL 787)比较，鉴定符合率100％，聚类分析亲缘关系较为接近。

2、形态特征

菌株的菌落在PDA平板上起初菌落白色，后变为蓝绿色，茸毯状，一般25℃培养10天直径不超过2cm，菌落不产生黄色素。菌丝无色，0.8-1.4μm宽。分生孢子梗长，150-200μm；帚状枝不分散，分枝和间枝近于平行排列，一般长10-15μm，宽1.0-1.5μm；分生孢子梗下部分支，瓶梗多3-5个生于分生孢子梗顶端，密集，3.1-7.1×1.6-2.8μm，瓶状，近基部最宽，顶部宽0.5-1.2μm；分生孢子椭圆形，分生孢子壁光滑。

3、功能

30℃在复筛培养基中生长繁殖速度快，可以在短时间内培养出大量、均一的纤维素降解酶液。

4、培养基

可利用玉米等作物的秸秆作为培养基碳源。

三、草酸青霉M具有生产纤维素降解酶的用途

草酸青霉M具有生产纤维素降解酶的用途，可在短期内(1-2天)形成大量分生孢子(见实施例2)。

四、用草酸青霉M可以生产纤维素降解酶

用草酸青霉M生产纤维素降解酶的方法特征是，将上述草酸青霉M接种到液体产酶培养基中培养，得到内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶；所述液体产酶培养基包括碳源、氮源、无机盐和水。

优选的碳源、氮源、无机盐及它们的终浓度分别为：碳源(玉米秸秆粉23g/L)、氮源(硫酸铵2.6g/L)、无机盐(KH₂PO₄3.0g/L、MgSO₄0.06g/L、CaCO₃0.4g/L)和蒸馏水1000ml。

所述草酸青霉M的接种量无特别限制，一般为10⁵～10⁷个孢子/mL培养基。

所述培养温度是25～32℃，优选28～30℃。所述培养方式是：可以160～200rpm的转速振荡培养2～7天，也可静置培养3～14天。

五、用草酸青霉M可进行秸秆纤维素的糖化

利用本发明的草酸青霉M的纤维素降解酶可以进行秸秆纤维素的糖化，方法是将草酸青霉M的纤维素降解酶液水解秸秆纤维素，使秸秆纤维素糖化。

所述反应液包括40目经超声波碱预处理后的玉米秸秆和pH6.0，0.05mol/L磷酸缓冲液。

所述纤维素降解酶液是草酸青霉M生产纤维素降解酶的培养液上清。

所述水解反应温度是50℃，反应方式是160rpm转速振荡培养96小时。

六、草酸青霉M的发酵制品

由草酸青霉M发酵上述培养基得到的发酵制品也属于本产品的保护范围。

所述发酵制品可为发酵产品本身、经稀释过的发酵产品或经纯化的发酵产品；所述发酵制品包括颗粒、粉末、片剂等固体制品或液体、糊状、胶状等流体性状的制品。

本发明的草酸青霉M的优点如下：

1、生长繁殖迅速，可在短期内(1-2天)形成大量分生孢子；

2、较高的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的生产能力；

3、发酵工艺简单、稳定；

4、产酶快(摇床培养5天即可达到产酶高峰)，内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶酶活性分别达到228.17IU/ml、109.90IU/ml和81.45IU/ml。

5、有效地糖化秸秆纤维素；

6、成本低廉。可利用玉米秸秆为草酸青霉M的培养基碳源，充分利用废弃资源，减少对环境的污染。

因此，草酸青霉M菌株是理想的研究、改造应用的出发材料菌株。利用草酸青霉M生产纤维素降解酶能够节省时间和能源消耗，降低生产成本，具有实现其工业化生产的极大可能，并具有广阔的工农业应用和市场前景。

附图说明：

图1草酸青霉M分生孢子梗形态图；

图2、3、4为草酸青霉M菌株产酶进程，图中横座标为培养天数，纵座标分别为酶活。

图5为在草酸青霉M的发酵培养液对秸秆纤维素的糖化反应中，不同反应时间分别所得的糖浓度变化曲线。图中横坐标为反应时间，纵坐标为糖浓度。

图6为在草酸青霉M的发酵培养液对秸秆纤维素的糖化反应中，不同浓度的玉米秸秆粉分别所得的糖浓度变化曲线。横坐标为反应时间，纵坐标为糖浓度。

在四条所示出的糖浓度变化曲线中，从上到下，玉米秸秆粉四种浓度依次为(W/V)12％，9％，6％，3％。

图7为在草酸青霉M的发酵培养液对秸秆纤维素的糖化反应中，纤维素酶六种不同添加量分别所得的糖浓度变化曲线。横坐标为反应时间，纵坐标为糖浓度。图中示出的六个纤维素酶用量换算为浓度分别为：(V/V)10％，20％，30％，40％，50％，60％。

生物材料保藏信息：

名称：草酸青霉(Penicillium oxalicum)M

保藏编号：CGMCC No.4357

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏时间：2010年11月22日。

具体实施方式

以下实施例仅用于举例说明本发明的方法，并不限制本发明的范围。

实施例1草酸青霉M的分离纯化

培养基

PDA综合培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，KH₂PO₄3g，MgSO₄1.5g，VB1 10mg，琼脂20g，水1000ml，pH自然(不控制pH值)。新鲜马铃薯去皮后切成边长0.5cm的小方块，加水1000ml，煮沸后再加热10分钟，然后，用四层纱布过滤，得土豆营养液，添加除VB1外的其他成分，补足水至1000ml，121℃灭菌20min，VB1单独配成溶液用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后加入，使其终浓度为10mg/L，混匀后铺平板或制作斜面培养基。

复筛培养基：CMCNa 1％；(NH₄)₂SO₄ 0.5％；K₂HPO₄ 0.3％；MgSO₄·7H₂O 0.01％；蛋白胨0.1％；酵母膏1.0％；琼脂粉1.5％，121℃灭菌20min。灭菌后铺平板。

草酸青霉M的分离纯化步骤

一、分离纯化

1、草酸青霉M的分离样品取自我实验室被污染的培养基，对污染培养基的杂菌采用平板划线的方法进行分离纯化。直到得到纯种。

2、将得到的纯菌种转移接种到斜面培养基(PDA综合培养基)上，4℃保存。

二、纤维素降解酶产生能力的筛选

1、采用刚果红平板脱色法，根据菌株在培养过程中纤维素降解酶类的产生情况，从中筛选出产酶快，酶活高的菌种。

刚果红平板脱色法：将培养适当时间的平板，用0.1％的刚果红水溶液浸染一段时间后，再用1mol/L的NaCl水溶液脱色，刚果红将未被降解CMCNa染成红色，而对已被降解的小分子低聚糖类无作用，因此在产CMCase的菌落周围留下了清晰地透明圈。在刚果红染色、NaCl脱色后可以观察到菌落周围有明显透明水解圈的菌株为纤维素分解菌。

M在培养2天后即产生了明显的脱色圈。说明M不仅生长迅速，而且具有迅速强力的纤维素分解能力，说明该菌种具有快速产生较高活力的纤维素酶力，是纤维素降解酶生产的理想菌种。

三、菌种分类地位的鉴定

对筛选出的M菌株的表型特征和核酸特征进行系统地鉴定，结果如下：

培养特征和形态特征为：菌株的菌落在PDA平板上起初菌落白色，后变为蓝绿色，茸毯状，生长缓慢，一般25℃培养10天直径不超过2cm，菌落不产生黄色素。菌丝无色，0.8-1.4μm宽。分生孢子梗长，150-200μm；帚状枝不分散，分枝和间枝近于平行排列，一般长10-15μm，宽1.0-1.5μm；分生孢子梗下部分支，瓶梗多3-5个生于分生孢子梗顶端，密集，3.1-7.1×1.6-2.8μm，瓶状，近基部最宽，顶部宽0.5-1.2μm；分生孢子椭圆形，分生孢子壁光滑。分生孢子形态如图1所示。

提取此菌的DNA，以ITS5-ITS4为引物，扩增rDNA的ITS区域(核糖体-DNA ITS)。序列进行BLAST比较，与Penicillium oxalicum鉴定符合率100％，聚类分析亲缘关系较为接近。序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2草酸青霉M的发酵培养——纤维素酶生产

1、草酸青霉M的孢子培养

产孢培养基：酵母浸粉10g，葡萄糖20g，水1000ml，pH自然，121℃灭菌20min。

用接种铲从斜面挖取一块边长为0.5cm左右的菌丝块接种于产孢培养基平板中，30℃培养2～3天，即可产生大量蓝绿色孢子。

2、发酵生产纤维素降解酶

产酶培养基(/L)：玉米秸秆粉2.3％，(NH₄)₂SO₄ 0.26％，KH₂PO₄ 0.3％，MgSO₄·7H₂O 0.06％，CaCO₃ 0.4％，121℃灭菌20min，自然pH值。

内切葡聚糖酶活性的测定

DNS法：取50μl适当稀释的M菌株的发酵培养液与150μlpH6.0的0.5％羧甲基纤维素钠溶液，50℃恒温水浴准确反应30min。加入50μl 1mol/LNaOH溶液终止反应。加入150μlDNS试剂，同时于沸水浴中准确反应5min。用流动的冷水终止反应。加850μl离子水，于540nm处测定光吸收值。

对照标准曲线后测算酶活力。在上述条件下，酶活力按国际单位规定：定义每分钟催化纤维素水解生成1μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位IU(IU/ml)。

外切葡聚糖酶活性的测定

pNPC法：在1.5mlEP管中加入100μl适当稀释的M菌株的发酵培养液与50μl pH5.5的1mg/ml的pNPC溶液，50℃恒温水浴反应30min，加入150μl浓度为1mol/L的Na₂C0₃溶液终止反应。于410nm处测定光吸收值。

对照标准曲线后测算酶活力。在上述条件下，酶活力按国际单位规定：定义每分钟催化pNPC水解生成1μmol pNP的酶量为一个酶活力单位IU(IU/ml)。

β-葡萄糖苷酶活性的测定

pNPG法：在1.5mlEP管中加入50μl适当稀释的M菌株的发酵培养液与200μl pH4.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，50℃恒温水浴反应10min，加入在50℃已经预热10min的250μl浓度为5m mol/L的pNPG溶液，50℃恒温水浴反应10min，加入250μl浓度为1mol/L的Na₂CO₃溶液终止反应。于410nm处测定光吸收值。

对照标准曲线后测算酶活力。在上述条件下，酶活力按国际单位规定：定义每分钟催化pNPG水解生成1μmol pNP的酶量为一个酶活力单位IU(IU/ml)。

按步骤1培养孢子，用无菌水将孢子洗下，用血球计数法计数后用无菌水调整孢子浓度，使每毫升孢子悬液中含有约0.87×10⁷个孢子，然后接种0.5mL孢子悬液入50mL产酶培养基中(装在250mL三角瓶中)，使接种的孢子终浓度0.87×10⁵个/mL培养基，30℃振荡培养7天。发酵结束后测定发酵液中内切葡聚糖酶活性为228.17IU/ml，外切葡聚糖酶活性为109.90IU/ml，β-葡萄糖苷酶活性为81.45IU/ml。如图2、3、4所示。

实施例3草酸青霉M对秸秆纤维素的糖化——最适反应时间的确定

实验材料及方法：

1、草酸青霉M的发酵培养液

收集按实施例2方法发酵培养的酶液。

2、水解反应时间对酶反应效率的影响

在250mL三角瓶摇瓶中，加入浓度为(W/V)为6％的40目经微波碱预处理后的玉米秸秆粉和pH6.0，0.05mol/L磷酸缓冲液至50mL，加入15mL草酸青霉M纤维素降解酶液，充分摇匀，于50℃、160rpm条件下反应，每12h取1mL酶解液测定溶液中还原糖，如图5。根据公式：糖化率＝还原糖量×0.9×100/玉米秸秆粉总糖量，计算糖化率。

结果：如图5所示，糖浓度随着时间的增加而增加，反应60小时左右时，糖浓度可达39.0lmg/mL，经计算糖化率为65.97％。之后糖浓度趋于稳定，糖化率几乎稳定。

结论：草酸青霉M对秸秆纤维素糖化的最适反应时间是50～70小时。

实施例4草酸青霉M对秸秆纤维素的糖化——秸秆纤维素的最适添加浓度确定

实验材料及方法：

1、草酸青霉M的发酵培养液

收集按实施例2方法发酵培养的酶液。

2、秸秆纤维素的添加量对酶反应效率的影响

在250mL三角瓶摇瓶中，分别加入不同量的40目经微波碱预处理后的玉米秸秆粉(3％、6％、9％、12％)(W/V)和pH6.0，0.05mol/L磷酸缓冲液至50mL，加入15mL草酸青霉M纤维素降解酶液，充分摇匀，于50℃、160rpm条件下反应96h，每12h取1mL酶解液测定溶液中还原糖，如图6。根据公式：糖化率＝还原糖量×0.9×100/玉米秸秆粉总糖量，计算糖化率。

结果：如图6所示，糖浓度随着秸秆纤维素浓度的增加而增加，秸秆纤维素浓度达到9％时，糖浓度可达63.70mg/mL，经计算糖化率为71.82％。而12％秸秆纤维素浓度的糖浓度虽然为83.12mg/mL，比9％时的糖浓度高，但糖化率为70.28％。其余秸秆纤维素浓度为3％和6％时的糖浓度最高分别为16.79mg/mL和39.25mg/mL，糖化率分别为56.79％和66.38％。

结论：用草酸青霉M对秸秆纤维素的糖化时，秸秆纤维素的最适用量为9％(W/V)。

实施例5草酸青霉M对秸秆纤维素的糖化——纤维素酶最适浓度确定

实验材料及方法：

1、草酸青霉M的发酵酶液

收集按实施例2方法发酵培养的酶液。

2、纤维素酶的添加量对酶反应效率的影响

在250mL三角瓶摇瓶中，加入浓度为(W/V)9％的40目经微波碱预处理后的玉米秸秆粉和pH6.0，0.05mol/L磷酸缓冲液至50mL，分别加入不同量的草酸青霉M纤维素酶液(5mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL)后充分摇匀，于50℃、160rpm条件下反应96h，每12h取1mL酶解液测定溶液中还原糖，如图7。根据公式：糖化率＝还原糖量×0.9×100/玉米秸秆粉总糖量，计算糖化率。

结果：如图7所示，酶量添加为5mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL时，其糖浓度最高分别为17.85mg/mL、33.63mg/mL、63.42mg/mL、71.99mg/mL、78.22mg/mL、77.34mg/mL，计算其糖化率分别为20.12％、37.91％、71.50％、81.16％、88.18％、87.19％。

结论：用草酸青霉M对秸秆纤维素的糖化时，纤维素酶的最适添加量为25ml，即纤维素酶的最适使用浓度为50％(V/V)。

Claims (7)

1.一种草酸青霉，其名称为：草酸青霉（Penicilliumoxalicum）M，保藏编号是：CGMCC No.4357。 

2.用权利要求1所述的草酸青霉生产纤维素降解酶的用途。 

3.一种生产纤维素降解酶的方法，其特征在于，将权利要求1所述的草酸青霉接种到液体产酶培养基中培养，得到内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶；所述液体产酶培养基包括碳源、氮源、无机盐和水。 

4.权利要求3所述的方法，所述草酸青霉的接种量为10⁵～10⁷个孢子/mL培养基，培养温度是25℃～32℃，振荡培养2～7天或静置培养3～14天。 

5.一种糖化秸秆纤维素的方法，其特征在于，包括下述步骤：用权利要求3所述方法得到纤维素降解酶，再用所述纤维素降解酶使秸秆纤维素发生水解反应，从而使秸秆纤维素糖化；反应液中含有pH为6.0，0.05mol/L磷酸缓冲液。 

6.权利要求5所述的方法，所述水解反应温度是50℃，操作方式是在160rpm转速下振荡反应96小时。 

7.利用权利要求1所述的草酸青霉所得到的发酵培养制品。 

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