CN103571811B - 一种木聚糖酶及生产方法 - Google Patents

一种木聚糖酶及生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103571811B
CN103571811B CN201310490355.9A CN201310490355A CN103571811B CN 103571811 B CN103571811 B CN 103571811B CN 201310490355 A CN201310490355 A CN 201310490355A CN 103571811 B CN103571811 B CN 103571811B
Authority
CN
China
Prior art keywords
hours
zytase
xylanase
production method
fermentation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201310490355.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103571811A (zh
Inventor
李忠兴
杨忠义
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Fuxing Paper Co.,Ltd.
Original Assignee
YUANJIANG HUANXISHA ENZYME TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by YUANJIANG HUANXISHA ENZYME TECHNOLOGY Co Ltd filed Critical YUANJIANG HUANXISHA ENZYME TECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201310490355.9A priority Critical patent/CN103571811B/zh
Publication of CN103571811A publication Critical patent/CN103571811A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103571811B publication Critical patent/CN103571811B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2485—Xylan endo-1,3-beta-xylosidase (3.2.1.32), i.e. endo-1,3-beta-xylanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01006—Acetylesterase (3.1.1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01032—Xylan endo-1,3-beta-xylosidase (3.2.1.32), i.e. endo-1-3-beta-xylanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01037—Xylan 1,4-beta-xylosidase (3.2.1.37)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01072—Xylan 1,3-beta-xylosidase (3.2.1.72)

Abstract

本发明公开了一种不产纤维素酶，可应用于造纸工艺的木聚糖酶生产方法，其特征是它包括菌种培养、摇瓶发酵、酶液制备步骤，所述菌种即沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis），实验室编号为KERR89，保藏号：CGMCC NO：5466，所述木聚糖酶为内切型酶，不产纤维素酶，对结晶纤维素、羧甲基纤维素均没有活性；酶活力在浓度5mMol/L以下，不受Fe2+、Fe3+、Zn2+、Cu2+金属离子抑制；其酶作用pH范围为pH4.5～10.5，温度范围为40℃～75℃；本发明的酶活力高，发酵木聚糖酶液≥30000 u/ml，单位生产成本低，发酵周期短，工业化程度高，工艺过程简单易控；产品对结晶纤维素、羧甲基纤维素均没有活性，适合在造纸行业应用，可降低造纸生产成本和环境污染，同时有助提高纸的产品品质。

Description

一种木聚糖酶及生产方法
技术领域
本发明涉及一种生物酶制剂的工业化生产，具体地说是一种木聚糖酶及生产方法。
背景技术
木聚糖酶包括内切1.3～β～木聚糖酶（EC3.2.1.32），内切1.4～β～木聚糖酶（EC3.2.1.8），木聚糖1.3～β～木糖苷酶（EC3.2.1.72），木聚糖1.4～β～木糖苷酶（EC3.2.1.37）和乙酰木聚糖酯酶（EC3.1.1.6）五种。内切型木聚糖酶水解木聚糖生成木寡糖和木糖，外切型木聚糖酶水解木寡糖，由非还原末端切除木糖残基。
木聚糖酶可用于造纸工业中的制浆和纸浆漂白等工序，它是基于酶作用植物细胞与细胞之间相粘连的中胶层中的木聚糖，木聚糖一经分解，细胞与细胞便疏离或分开，从而使碱等化学品易于起作用，因此降低了所用化学品的用量，使造纸废水中的化学品污染物大大降低。但是，许多微生物在产木聚糖酶的同时，还产纤维素酶。这样，在应用中木聚糖酶不仅作用木聚糖，同时纤维素酶还作用纤维素，对纤维素有降解作用和对纸浆有毁坏作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种不产纤维素酶，可应用于造纸工艺的木聚糖酶及生产方法。
本发明酶活力测定方法为，用pH值为9.0，0.1mol/L的甘氨酸—氢氧化钠缓冲液为溶剂配制2﹪木聚糖（sigma来自于桦木产品）溶液。吸取0.9ml底物于15ml刻度试管中，在要求温度水浴平衡3min，加入0.1ml适当稀释酶溶液，反应10min，加入3ml  3，5～二硝基水杨酸试剂，沸水浴中显色15min，冷凉后用蒸馏水定容至15ml，分光光度计550nm波长测光吸收值。酶活力定义为，在测定条件下每小时水解底物产生1mg还原糖（以木糖计，）所需酶量定义为一个酶活力单位（u）。
本发明是采用如下技术方案实现其发明目的的，一种木聚糖酶的生产方法，它包括菌种培养、摇瓶发酵、酶液制备步骤，所述菌种即沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis），实验室编号为KERR89，保藏号：CGMCC NO：5466，其生物学特性为：革兰氏染色阳性菌，产芽孢，菌体呈短杆状，单细胞直径小于1um，以二分裂方式增殖；在本发明所述培养基上菌落呈圆形，白色、表面光滑，均一，边缘整齐，略有光泽，黏稠。
本发明的菌种是在中国宁夏采集，在菌种选育筛选过程中，采用了试管液体培养基反应DNS显色初步定性筛选和摇瓶产酶定量筛选的方法，筛选出一株实验室编号为KERR89的高产菌株，根据主要生理生化特征及16S rRNA基因序列、gyrB基因序列等实验数据综合分析鉴定为沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis），该菌种已于2011年11月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号：CGMCC NO：5466，并于同日提交了保藏存活证明。
本发明所述的菌种培养为CGMCC NO：5466菌种在如下配制的斜面上生长良好，以重量计，斜面培养基配方为：蛋白胨0.5﹪～1﹪、牛肉膏0.3﹪～0.5﹪、酵母膏0.3﹪～0.5﹪、葡萄糖0.3﹪～0.5﹪、氯化钠0.3﹪～0.5﹪、琼脂1.8﹪～2.2﹪、水94.8﹪～96.5﹪，其中所述各组分之和为100﹪，调pH值6.9～7.1，0.1MPa灭菌20分钟～30分钟，制成试管斜面，接种该菌种，32℃～35℃，培养24小时～26小时后，放入5℃冰箱中备用，或向菌斜面上注入已灭菌液体石蜡后保藏或以脱脂牛奶为载体冷冻干燥真空封口保藏。
本发明所述的摇瓶发酵为CGMCC NO：5466菌种在规定的培养条件下可产生高活性木聚糖酶，这种培养条件是：以重量计，培养基配方为麦麸5﹪～8﹪、纤维质粉1.5﹪～2﹪、葡萄糖0.3﹪～0.5﹪、硫酸铵0.3﹪～0.5﹪、玉米浆1﹪～2﹪、磷酸氢二钾0.1﹪～0.2﹪、氯化钠0.3﹪～0.5﹪、水86.3﹪～91.5﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为8.0～8.5，0.1MPa灭菌20分钟～35分钟，培养条件：33℃～35℃，摇床转速260 r/min ～280r/min，培养48小时～52小时。
本发明所述的酶液制备为由茄瓶斜面到种子罐到发酵罐，二级发酵，制备标准化酶液。
本发明所述种子培养基配方为：以重量计，麦麸5﹪～8﹪、玉米粉1.5﹪～2﹪、硫酸铵0.3﹪～0.5﹪、玉米浆1﹪～2﹪、磷酸氢二钾0.1﹪～0.2﹪、氯化钠0.3﹪～0.5﹪、水86.8﹪～91.8﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为6.5～7.0，0.1MPa灭菌30分钟～35分钟，种子罐装料总体积不超过70％；培养条件：温度33℃～38℃，搅拌转速180 r/min～220 r/min，通气量以v/v 计：0小时～5小时，1：0.40～0.46，5小时以后，1：0.50～0.56，罐压0.06 MPa～0.07MPa，培养周期为7小时～9小时。
本发明所述产酶发酵罐的培养基配方为：以重量计，麦麸5﹪～8﹪、纤维质粉1.5﹪～2﹪、葡萄糖0.3～0.5﹪、硫酸铵0.3﹪～0.5﹪、玉米浆1﹪～2﹪、磷酸氢二钾0.1﹪～0.2﹪、氯化钠0.3﹪～0.5﹪、水86.3﹪～91.5﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为8.0～8.5，0.1MPa灭菌30分钟～35分钟，装料总体积不超过70﹪；培养条件：温度33℃～38℃，搅拌转速180 r/min～220 r/min，通气量以v/v 计：0小时～2小时，1：0.40 ～0.42，2小时～4小时，1:0.50～0.52，4小时～6小时，1:0.55～0.68，6小时以后1:0.60～0.62，罐压0.06 MPa～0.07MPa，发酵周期为48小时～52小时。
本发明为促进产酶，提高木聚糖酶的活力，在产酶发酵罐的培养基配方中加入0.3﹪～0.4﹪的二水合氯化钙，相应减少水的用量，其中所述各组分之和为100﹪，可显著提高木聚糖酶活力，木聚糖酶活力由对照的34000u/ml增加到38000u/ml，提高11.76﹪。
本发明在制备标准化酶液中，将产酶发酵罐的发酵醪液经过板框过滤、硅藻土除菌，经防腐处理得到在15℃密封存放三个月条件下，酶活力保持率为95﹪以上的标准木聚糖酶液。
本发明为去杂除菌，提高产品质量，发酵醪液经板框过滤后，在发酵滤液中加入十二水合磷酸氢二钠和二水合氯化钙取杂除菌，其用量分别为发酵滤液质量的2.8﹪～3.5﹪和1.0﹪～1.3﹪。
一种如上述方法生产的木聚糖酶，所述木聚糖酶为内切型酶，不产纤维素酶，对结晶纤维素、羧甲基纤维素均没有活性；酶活力在浓度5mMol/L以下，不受Fe2+ 、Fe3+ 、Zn2+、Cu2+金属离子抑制；其酶作用pH范围为pH4.5～10.5，温度范围为40℃～75℃；适宜pH范围为pH7.0～9.0，适宜温度范围为45℃～65℃；最适pH范围为pH8.5～9.0，最适温度50℃～55℃。
由于采用上述技术方案，本发明较好的实现了发明目的，其酶活力高，发酵木聚糖酶液≥30000 u/ml，单位生产成本低，发酵周期短，工业化程度高，工艺过程简单易控；产品对结晶纤维素、羧甲基纤维素均没有活性，适合在造纸行业应用，可降低造纸生产成本和环境污染，同时有助提高纸的产品品质。
具体实施方式
下面结合及实施例对本发明作进一步说明。
一种木聚糖酶的生产方法，它包括菌种培养、摇瓶发酵、酶液制备步骤，所述菌种即沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis），实验室编号为KERR89，保藏号：CGMCC NO：5466，其生物学特性为：革兰氏染色阳性菌，产芽孢，菌体呈短杆状，单细胞直径小于1um，以二分裂方式增殖；；在本发明所述培养基上菌落呈圆形，白色、表面光滑，均一，边缘整齐，略有光泽，黏稠。
本发明的菌种是在中国宁夏采集，在菌种选育筛选过程中，采用了试管液体培养基反应DNS显色初步定性筛选和摇瓶产酶定量筛选的方法，筛选出一株实验室编号为KERR89的高产菌株，根据主要生理生化特征及16S rRNA基因序列、gyrB基因序列等实验数据综合分析鉴定为沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis），该菌种已于2011年11月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号：CGMCC NO：5466，并于同日提交了保藏存活证明。
本发明所述的菌种培养为CGMCC NO：5466菌种在如下配制的斜面上生长良好，以重量计，斜面培养基配方为：蛋白胨0.5﹪～1﹪、牛肉膏0.3﹪～0.5﹪、酵母膏0.3﹪～0.5﹪、葡萄糖0.3﹪～0.5﹪、氯化钠0.3﹪～0.5﹪、琼脂1.8﹪～2.2﹪、水94.8﹪～96.5﹪，其中所述各组分之和为100﹪，调pH值6.9～7.1，0.1MPa灭菌20分钟～30分钟，制成试管斜面，接种该菌种，32℃～35℃，培养24小时～26小时后，放入5℃冰箱中备用，或向菌斜面上注入已灭菌液体石蜡后保藏或以脱脂牛奶为载体冷冻干燥真空封口保藏。
本实施例斜面培养基配方为：蛋白胨0.8﹪、牛肉膏0.4﹪、酵母膏0.4﹪、葡萄糖0.4﹪、氯化钠0.4﹪、琼脂2.0﹪、水96﹪，其中所述各组分之和为100﹪；用氢氧化钠调pH值7.0，0.1MPa灭菌30分钟，制成试管斜面，接种该菌种，34℃，培养24小时后，放入5℃冰箱中冷藏备用。
该斜面菌种通过摇瓶发酵检验菌种产酶能力合格后，可以作为种子扩培使用或发酵产酶使用。
本发明所述的摇瓶发酵为CGMCC NO：5466菌种在规定的培养条件下可产生高活性木聚糖酶，这种培养条件是：以重量计，培养基配方为麦麸5﹪～8﹪、纤维质粉1.5﹪～2﹪、葡萄糖0.3﹪～0.5﹪、硫酸铵0.3﹪～0.5﹪、玉米浆1﹪～2﹪、磷酸氢二钾0.1﹪～0.2﹪、氯化钠0.3﹪～0.5﹪、水86.3﹪～91.5﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为8.0～8.5，0.1MPa灭菌20分钟～35分钟，培养条件：33℃～35℃，摇床转速260 r/min ～280r/min，培养48小时～52小时。
本实施例培养基配方为麦麸6﹪、纤维质粉1.5﹪、葡萄糖0.4﹪、硫酸铵0.4﹪、玉米浆1.5﹪、磷酸氢二钾0.1﹪、氯化钠0.4﹪、水89.7﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，用1﹪碳酸钠溶液调pH值为8.0，0.1MPa灭菌25分钟，培养条件：33℃，摇床转速280 r/min，培养48小时。
本发明所述的酶液制备为由茄瓶斜面到种子罐到发酵罐，二级发酵，制备标准化酶液。
本发明所述种子培养基配方为：以重量计，麦麸5﹪～8﹪、玉米粉1.5﹪～2﹪、硫酸铵0.3﹪～0.5﹪、玉米浆1﹪～2﹪、磷酸氢二钾0.1﹪～0.2﹪、氯化钠0.3﹪～0.5﹪、水86.8﹪～91.8﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为6.5～7.0，0.1MPa灭菌30分钟～35分钟，种子罐装料总体积不超过70％；培养条件：温度33℃～38℃，搅拌转速180 r/min～220 r/min，通气量以v/v 计：0小时～5小时，1：0.40～0.46，5小时以后，1：0.50～0.56，罐压0.06 MPa～0.07MPa，培养周期为7小时～9小时。
本实施例种子培养基配方为：以重量计，麦麸6﹪、玉米粉2﹪、硫酸铵0.4﹪、玉米浆1﹪、磷酸氢二钾0.2﹪、氯化钠0.4﹪、水90.0﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为7.0，0.1MPa灭菌30分钟，种子罐装料总体积不超过70％；培养条件：温度36℃，搅拌转速220 r/min，通气量以v/v 计：0小时～5小时，1：0.40，5小时以后，1：0.50，罐压0.06 MPa～0.07MPa，培养周期为8小时。在培养4h后取样镜检，观察菌生长发育，繁殖情况。当培养到菌体细胞链70﹪断裂为单个细胞，酶活力600u/ml左右，表明种子已接近成熟，做好转罐接种的各项准备工作。
本发明所述产酶发酵罐的培养基配方为：以重量计，麦麸5﹪～8﹪、纤维质粉1.5﹪～2﹪、葡萄糖0.3～0.5﹪、硫酸铵0.3﹪～0.5﹪、玉米浆1﹪～2﹪、磷酸氢二钾0.1﹪～0.2﹪、氯化钠0.3﹪～0.5﹪、水86.3﹪～91.5﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为8.0～8.5，0.1MPa灭菌30分钟～35分钟，装料总体积不超过70﹪；培养条件：温度33℃～38℃，搅拌转速180 r/min～220 r/min，通气量以v/v 计：0小时～2小时，1：0.40 ～0.42，2小时～4小时，1:0.50～0.52，4小时～6小时，1:0.55～0.68，6小时以后1:0.60～0.62，罐压0.06 MPa～0.07MPa，发酵周期为48小时～52小时。
本实施例产酶发酵罐的培养基配方为：以重量计，麦麸6﹪、纤维质粉1.5﹪、葡萄糖0.4﹪、硫酸铵0.4﹪、玉米浆1﹪、磷酸氢二钾0.2﹪、氯化钠0.4﹪、水90.1﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为8.0，0.1MPa灭菌30分钟，装料总体积不超过70﹪；培养条件：温度35℃，搅拌转速220 r/min，通气量以v/v 计：0小时～2小时，1：0.40，2小时～4小时，1:0.50，4小时～6小时，1:0.55，6小时以后1:0.60，罐压0.06 MPa，发酵周期为48小时。前16h每隔4h取一次样，16h后每隔2h取一次样。镜检观察菌生长状态，测定pH、还原糖和酶活力。其木聚糖酶活力最高可达到36000u/ml，平均水平可达31000u/ml以上。
放罐条件：罐温不再上升，酶活力不再增加；pH8.5左右；细胞95%以上出现芽孢，并有部分自溶。将发酵醪液pH调至7.0左右。滤液酶活力32000u/ml。
本发明为促进产酶，提高木聚糖酶的活力，在产酶发酵罐的培养基配方中加入0.3﹪～0.4﹪的二水合氯化钙（本实施例为0.3﹪），相应减少水的用量，其中所述各组分之和为100﹪，可显著提高木聚糖酶活力，木聚糖酶活力由对照的34000u/ml增加到38000u/ml，提高11.76﹪。
本发明在制备标准化酶液中，将产酶发酵罐的发酵醪液经过板框过滤、硅藻土除菌，经防腐处理得到在15℃密封存放三个月条件下，酶活力保持率为95﹪以上的标准木聚糖酶液。
本发明为去杂除菌，提高产品质量，发酵醪液经板框过滤后，在发酵滤液中加入十二水合磷酸氢二钠和二水合氯化钙取杂除菌，其用量分别为发酵滤液质量的2.8﹪～3.5﹪（本实施例为3.2﹪）和1.0﹪～1.3﹪（本实施例为1.2﹪）。
本发明也可使用其它无机盐组合替代，例如硫酸钠与二水合氯化钙组合。
本发明所述的CGMCC NO：5466菌种可利用多种碳、氮源产酶。所述的碳源如麦麸、玉米轴粉、玉米秸秆粉、稻草粉、玉米油渣、纤维质粉、花生外壳粉等，可单独或混合用。所述的氮源如无机氮中的硫酸铵、磷酸氢二铵、氯化铵等生理酸性盐，硝酸钠生理碱性盐，硝酸铵生理中性盐；尿素、玉米浆、玉米浆粉、玉米蛋白粉、大豆蛋白粉、大豆蛋白胨、鱼蛋白胨、酵母膏、酵母粉、牛肉膏等有机氮，可单独或混合用。
一种如上述方法生产的木聚糖酶，所述木聚糖酶为内切型酶，不产纤维素酶，对结晶纤维素、羧甲基纤维素均没有活性；酶活力在浓度5mMol/L以下，不受Fe2+ 、Fe3+ 、Zn2+、Cu2+金属离子抑制；其酶作用pH范围为pH4.5～10.5，温度范围为40℃～75℃；适宜pH范围为pH7.0～9.0，适宜温度范围为45℃～65℃；最适pH范围为pH8.5～9.0，最适温度50℃～55℃。
现有文献报道，铜对酶活性的抑制是强烈的。而本发明木聚糖酶的酶活性不受浓度高达5mmol/L的CU2+所抑制。
同时，本发明木聚糖酶不含纤维素酶活性，酶活力高，产酶时还可产生少量过氧化氢酶，其作用温度和pH适合在造纸行业应用，可降低造纸生产成本和环境污染，有助提高纸的产品品质。

Claims (10)

1.一种木聚糖酶的生产方法，其特征是它包括菌种培养、摇瓶发酵、酶液制备步骤，所述菌种即沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis），实验室编号为KERR89，保藏号：CGMCC NO：5466，其生物学特性为：革兰氏染色阳性菌，产芽孢，菌体呈短杆状，单细胞直径小于1μm，以二分裂方式增殖；在本发明所述培养基上菌落呈圆形，白色、表面光滑，均一，边缘整齐，略有光泽，黏稠。
2.根据权利要求1所述的一种木聚糖酶的生产方法，其特征是所述的菌种培养为CGMCC NO：5466菌种在如下配制的斜面上生长良好，以重量计，斜面培养基配方为：蛋白胨0.5﹪～1﹪、牛肉膏0.3﹪～0.5﹪、酵母膏0.3﹪～0.5﹪、葡萄糖0.3﹪～0.5﹪、氯化钠0.3﹪～0.5﹪、琼脂1.8﹪～2.2﹪、水94.8﹪～96.5﹪，其中所述各组分之和为100﹪，调pH值6.9～7.1，0.1MPa灭菌20分钟～30分钟，制成试管斜面，接种该菌种，32℃～35℃，培养24小时～26小时后，放入5℃冰箱中备用，或向菌斜面上注入已灭菌液体石蜡后保藏或以脱脂牛奶为载体冷冻干燥真空封口保藏。
3.根据权利要求1所述的一种木聚糖酶的生产方法，其特征是所述的摇瓶发酵为CGMCC NO：5466菌种在规定的培养条件下可产生高活性木聚糖酶，这种培养条件是：以重量计，培养基配方为麦麸5﹪～8﹪、纤维质粉1.5﹪～2﹪、葡萄糖0.3﹪～0.5﹪、硫酸铵0.3﹪～0.5﹪、玉米浆1﹪～2﹪、磷酸氢二钾0.1﹪～0.2﹪、氯化钠0.3﹪～0.5﹪、水86.3﹪～91.5﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为8.0～8.5，0.1MPa灭菌20分钟～35分钟，培养条件：33℃～35℃，摇床转速260 r/min ～280r/min，培养48小时～52小时。
4.根据权利要求1所述的一种木聚糖酶的生产方法，其特征是所述的酶液制备为由茄瓶斜面到种子罐到发酵罐，二级发酵，制备标准化酶液。
5.根据权利要求4所述的一种木聚糖酶的生产方法，其特征是种子培养基配方为：以重量计，麦麸5﹪～8﹪、玉米粉1.5﹪～2﹪、硫酸铵0.3﹪～0.5﹪、玉米浆1﹪～2﹪、磷酸氢二钾0.1﹪～0.2﹪、氯化钠0.3﹪～0.5﹪、水86.8﹪～91.8﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为6.5～7.0，0.1MPa灭菌30分钟～35分钟，种子罐装料总体积不超过70％；培养条件：温度33℃～38℃，搅拌转速180 r/min～220 r/min，通气量以v/v 计：0小时～5小时，1：0.40～0.46，5小时以后，1：0.50～0.56，罐压0.06 MPa～0.07MPa，培养周期为7小时～9小时。
6.根据权利要求4所述的一种木聚糖酶的生产方法，其特征是产酶发酵罐的培养基配方为：以重量计，麦麸5﹪～8﹪、纤维质粉1.5﹪～2﹪、葡萄糖0.3～0.5﹪、硫酸铵0.3﹪～0.5﹪、玉米浆1﹪～2﹪、磷酸氢二钾0.1﹪～0.2﹪、氯化钠0.3﹪～0.5﹪、水86.3﹪～91.5﹪，其中所述各组分之和为100﹪，灭菌前，调pH值为8.0～8.5，0.1MPa灭菌30分钟～35分钟，装料总体积不超过70﹪；培养条件：温度33℃～38℃，搅拌转速180 r/min～220 r/min，通气量以v/v 计：0小时～2小时，1：0.40 ～0.42，2小时～4小时，1:0.50～0.52，4小时～6小时，1:0.55～0.68，6小时以后1:0.60～0.62，罐压0.06 MPa～0.07MPa，发酵周期为48小时～52小时。
7.根据权利要求6所述的一种木聚糖酶的生产方法，其特征是在产酶发酵罐的培养基配方中加入0.3﹪～0.4﹪的二水合氯化钙，相应减少水的用量，其中所述各组分之和为100﹪。
8.根据权利要求4所述的一种木聚糖酶的生产方法，其特征是在制备标准化酶液中，将产酶发酵罐的发酵醪液经过板框过滤、硅藻土除菌，经防腐处理得到在15℃密封存放三个月条件下，酶活力保持率为95﹪以上的标准木聚糖酶液。
9.根据权利要求8所述的一种木聚糖酶的生产方法，其特征是发酵醪液经板框过滤后，在发酵滤液中加入十二水合磷酸氢二钠和二水合氯化钙取杂除菌，其用量分别为发酵滤液质量的2.8﹪～3.5﹪和1.0﹪～1.3﹪。
10.一种根据权利要求1所述方法生产的木聚糖酶，其特征是所述木聚糖酶为内切型酶，不产纤维素酶，对结晶纤维素、羧甲基纤维素均没有活性；酶活力在浓度5mmol/L以下，不受Fe2+ 、Fe3+ 、Zn2+、Cu2+金属离子抑制；其酶作用pH范围为pH4.5～10.5，温度范围为40℃～75℃；适宜pH范围为pH7.0～9.0，适宜温度范围为45℃～65℃；最适pH范围为pH8.5～9.0，最适温度50℃～55℃。
CN201310490355.9A 2013-10-19 2013-10-19 一种木聚糖酶及生产方法 Active CN103571811B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310490355.9A CN103571811B (zh) 2013-10-19 2013-10-19 一种木聚糖酶及生产方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310490355.9A CN103571811B (zh) 2013-10-19 2013-10-19 一种木聚糖酶及生产方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103571811A CN103571811A (zh) 2014-02-12
CN103571811B true CN103571811B (zh) 2015-04-22

Family

ID=50044525

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310490355.9A Active CN103571811B (zh) 2013-10-19 2013-10-19 一种木聚糖酶及生产方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103571811B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103937721B (zh) * 2014-04-24 2016-04-27 烟台大境生态环境科技有限公司 沙福芽孢杆菌及微生物菌剂和它们的应用
CN115287215A (zh) * 2022-05-30 2022-11-04 内蒙古农业大学 一种秸秆降解菌hxb11及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101952437A (zh) * 2007-10-03 2011-01-19 维莱尼姆公司 木聚糖酶、编码它们的核酸以及其制备和应用方法
KR20120046933A (ko) * 2010-11-03 2012-05-11 주식회사 그린에프아이에스 천연항생제
CN103014099A (zh) * 2012-12-27 2013-04-03 山东大学 一种促进水解木质纤维素的方法
WO2013153159A1 (en) * 2012-04-13 2013-10-17 Chr. Hansen A/S Antibiotic sensitive bacillus strains having antimicrobial effect against e. coli and clostridium perfringens and having high sporulation capacity

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101952437A (zh) * 2007-10-03 2011-01-19 维莱尼姆公司 木聚糖酶、编码它们的核酸以及其制备和应用方法
KR20120046933A (ko) * 2010-11-03 2012-05-11 주식회사 그린에프아이에스 천연항생제
WO2013153159A1 (en) * 2012-04-13 2013-10-17 Chr. Hansen A/S Antibiotic sensitive bacillus strains having antimicrobial effect against e. coli and clostridium perfringens and having high sporulation capacity
CN103014099A (zh) * 2012-12-27 2013-04-03 山东大学 一种促进水解木质纤维素的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bacillus pumilus WL-11木聚糖酶A的纯化、鉴定及其底物降解方式;许正宏等;《生物工程学报》;20050523;第21卷(第03期);第407-413页 *
Genetic and functional diversity of Bacillus strains in the soils long-term irrigated with paper and pulp mill effluent;Yadav,Subhash等;《Journal of General and Applied Microbiology》;20110831;第57卷(第4期);第183-195页 *
一株产生内切β-1,4-木聚糖酶的菌株的分离、鉴定及其酶学特性研究;肖竞等;《浙江农业学报》;20030425;第15卷(第02期);第55-61页 *
用于生产低聚木糖的木聚糖酶菌株筛选;蔡爱华等;《广西科学》;20041115;第11卷(第04期);第339-342页 *
短芽孢杆菌耐碱性木聚糖酶(xylB)的分子生物学研究;胡春霞等;《食品与生物技术学报》;20090115;第28卷(第01期);摘要 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103571811A (zh) 2014-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Updegraff Utilization of cellulose from waste paper by Myrothecium verrucaria
CN102559506B (zh) 一种草酸青霉菌及其应用
CN103540581B (zh) 麦草、稻草造纸制浆用复合酶液的生产方法及应用
CN102127514B (zh) 一株强稳定性中温中性α-淀粉酶高产菌及其酶学性质
Omojasola et al. Cellulase production by Trichoderma longi, Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae cultured on waste materials from orange
CN108118020A (zh) 纤维素降解微生物的培养基、制备及其应用
CN102533889B (zh) 一种赖氨酸连续发酵的方法
CN110317748A (zh) 一株链霉菌菌株及其在降解羽毛中的应用
CN101855973B (zh) 一种漆酶产生真菌菌株白耙齿菌及其培养方法和应用
CN103555700B (zh) 蔗渣造纸制浆用复合酶液的生产方法及应用
Kumar et al. Isolation, characterization and purification of xylanase producing bacteria from sea sediment
CN103444988A (zh) 米曲霉降解秸秆生产蛋白饲料的方法
CN104789492A (zh) 巨大芽孢杆菌菌株及其应用
CN103571811B (zh) 一种木聚糖酶及生产方法
CN101705217B (zh) 一种联产木聚糖酶和纤维素酶的方法
Ezeonu et al. Enhanced availability of biofuel and biomass components in Aspergillus niger and Aspergillus fumigatus treated rice husk
CN104789491A (zh) 地衣芽孢杆菌菌株及其应用
CN103131639B (zh) 一种长枝木霉菌株及其应用
Rajoka Production of single cell protein through fermentation of a perennial grass grown on saline lands with Cellulomonas biazotea
CN103540580B (zh) 一种甘露聚糖酶及生产方法
Turaeva et al. Isolation and identification of bacteria with cellulolytic activity from the microflora of animal juice
Fadel et al. Clean production of xylanase from white corn flour by Aspergillus fumigates F-993 under solid state fermentation
CN101880634A (zh) 以玉米浸泡水生产饲料酵母的方法
CN102559511B (zh) 高产嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的肉座菌及其应用
CN101818136A (zh) 一种纤维素酶的固体发酵生产方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20201222

Address after: 224600 Xiangshui Coastal Economic Development Zone, Yancheng City, Jiangsu Province

Patentee after: Jiangsu Fuxing Paper Co.,Ltd.

Address before: Room 401, Aisino building, high tech Development Zone, Nanjing, Jiangsu Province, 210000

Patentee before: Jiangsu Bo thinking enterprise management Co.,Ltd.

Effective date of registration: 20201222

Address after: Room 401, Aisino building, high tech Development Zone, Nanjing, Jiangsu Province, 210000

Patentee after: Jiangsu Bo thinking enterprise management Co.,Ltd.

Address before: Yinyuan new village, huangmaozhou Town, Yiyang City, Hunan Province

Patentee before: YUANJIANG HUANXISHA ENZYME TECHNOLOGY Co.,Ltd.