CN110317748A - 一株链霉菌菌株及其在降解羽毛中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株链霉菌菌株及其在降解羽毛中的应用。该菌株名称为链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT‑1，保藏编号为GDMCC No：60612，该菌株于2019年3月20日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心。本发明的链霉菌菌株用于降解羽毛，能在48小时内完全降解10g/L天然羽毛，羽毛角蛋白降解率达93.6％，得到的发酵羽毛粉氨基酸组成几乎无损失，粗蛋白含量高达88.14％，且包含18种氨基酸(包括全部8种必需氨基酸)，可溶性蛋白和游离氨基酸含量达124.71mg/g和224.32mg/g，为饲料行业提供了高营养的饲料添加剂甚至是饲料替代品。

Description

一株链霉菌菌株及其在降解羽毛中的应用
技术领域
本发明涉及生物高技术领域，特别涉及一株链霉菌菌株及其在降解羽毛中的应用。
背景技术
近年来，随着我国畜牧业的迅速发展，对饲料蛋白的需求量也越来越高，但当前我国主要依靠进口鱼粉来解决蛋白质资源不足的问题。因此，如何开发新的蛋白质资源是目前研究的热点。羽毛粉等一些非常规蛋白质资源已经引起世界各国的广泛关注。羽毛粉由家禽肉制品生产中的副产品羽毛加工而成，而羽毛占成年家禽体重的5～10％左右，我国禽类养殖规模巨大，每年能够产生数百万吨的废弃羽毛。羽毛含有丰富的粗蛋白，含量约为85％～90％，具有极高的饲料利用价值。但是由于羽毛中含有大量交联的二硫键以及其他分子间作用力，导致其很难被动物作为营养物质消化利用，从而导致绝大部分的禽类羽毛被丢弃，造成环境污染和疾病传播的同时也造成了羽毛这一蛋白质资源的极大浪费。现行的羽毛处理方式主要是通过高温、高压等物理化学方式，这些方式不仅会消耗大量的能源产生大量的废弃物，还会导致处理后的羽毛产物中氨基酸等营养物质被大量破坏，使得产物的利用价值大大降低。因此，开发一种新型、绿色、高效的羽毛处理方式迫在眉睫。生物法主要包含角蛋白酶处理法和微生物处理法。通过生物法处理羽毛不仅高效、环保，而且还能够减少蛋白变性和氨基酸损失，同时增加氨基酸的平衡性，提高产物的适口性和消化吸收率，因此成为近年来废弃羽毛处理的一种趋势。但是目前对羽毛的生物处理主要集中在角蛋白酶的异源表达及其酶学性质的研究，而研究表明单一角蛋白酶的方法并不能完全降解羽毛。通过微生物法处理羽毛能够大大提高羽毛的营养价值，所获得的经济收益也明显高于传统的羽毛加工方式，但现用于羽毛降解的菌株普遍降解效率偏低无法实现大规模的工业应用。因此，筛选或者对现有菌株进行改造以获取绿色高效的羽毛降解菌株具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株链霉菌菌株。
本发明的另一目的在于提供上述链霉菌菌株的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一株链霉菌菌株，名称为链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1，保藏编号为GDMCC No：60612，该菌株于2019年3月20日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心。
该菌株是发明人从广东韶关市养鸡场长期堆积羽毛的土壤中分离得到的一株链霉菌菌株。
所述的链霉菌菌株的形态学特征如下：气生菌丝发育良好，孢子链直，圆柱状，基内菌丝交织成网，有分枝、无横隔、无断裂现象；孢子球状、成熟时表面光滑。
所述的链霉菌菌株的培养特征如下：在高氏一号合成培养基上菌落突出、绒毛状、边缘不规则，气丝淡灰色至灰绿色，基内菌丝灰色，无可溶性色素；在无机盐淀粉琼脂培养基上气丝白色，基内菌丝灰白色、无可溶性色素；在牛肉膏蛋白胨培养基上气生菌丝白色，基内菌丝呈褐色，可溶性无色素产生；在牛奶琼脂平板上气生菌丝呈乳白色，基内菌丝呈白色，无可溶性色素产生，产生透明圈。
表1菌株的培养特征
所述的链霉菌菌株的生理生化特征如下：
表2菌株的生理生化特性
注：“-”表示负反应，“+”表示正反应。
所述的链霉菌菌株的16S rDNA基因特征：其16S rDNA序列如SEQ ID No.1的核苷酸序列所示，序列长度为1433bp。
所述的链霉菌菌株与现有链霉菌菌株的基因组平均核苷酸相似度(ANI)最高值为78.51％。
经形态学特征、培养特征观察和分子系统学鉴定，该链霉菌菌株不属于现有报道基因组的链霉菌的任何一个种，可能是链霉菌属的一个新菌种。
上述链霉菌菌株的筛选方法，包括如下步骤：
(1)初筛：
将长期堆积羽毛的土壤接种于富集培养基，30～42℃、150～250rpm培养2～5天，得到培养液，将培养液划线接种于羽毛粉平板，30～42℃条件下培养5～7天，将长势旺盛且水解圈较大的菌反复划线分离，直至挑取到单菌落；
(2)复筛：
将步骤1)中得到的单菌落接种于种子培养基，30～42℃、150～250rpm培养15～30小时，得到种子液，将种子液转接于发酵培养基，30～42℃、150～250rpm培养5～7天，得到发酵液，过滤发酵液，50～70℃烘干，称量残留的羽毛质量，计算羽毛降解率，获得羽毛降解率最高的链霉菌菌株SCUT-1。
步骤(1)中所述的富集培养基(g/L)的配制：氯化铵0.5g、氯化钠0.5g、磷酸氢二钾0.3g、磷酸二氢钾0.4g、氯化镁0.1g、酵母提取物1.0g、羽毛粉10.0g、蒸馏水定容至1000mL，pH 7.5。
步骤(1)中所述的羽毛粉平板(g/L)的配制：磷酸氢二钾1.5g、七水硫酸镁0.025g、氯化钙0.025g、硫酸亚铁0.015g、羽毛粉10.0g、琼脂粉20.0g、蒸馏水定容至1000mL，pH7.5。
步骤(1)中所述的土壤接种于富集培养基之后的培养条件优选为37℃、220rpm培养3天。
步骤(1)中所述的培养菌液划线接种羽毛粉平板之后的培养温度优选为37℃。
步骤(2)中所述的种子培养基(g/L)的配制：蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水定容至1000mL，pH 7.5。
步骤(2)中所述的发酵培养基(g/L)的配制：氯化钠0.5g、磷酸二氢钾0.4g、磷酸氢二钾0.3g、羽毛10.0g、蒸馏水定容至1000mL，pH 7.5。
步骤(2)中所述的单菌落接种于种子培养基之后的培养条件优选为37℃、220rpm培养24小时。
步骤(2)中所述的种子液转接于发酵培养基之后的培养条件优选为37℃、220rpm培养5天。
步骤(2)中所述的种子液转接于发酵培养基的接种量为1％(v/v)。
步骤(2)中所述的过滤发酵液优选为采用Whatman 202中速定量滤纸过滤。
步骤(2)中所述的烘干的温度优选为65℃。
上述链霉菌菌株在降解羽毛中的应用。
所述的链霉菌菌株在降解羽毛中的应用，方法优选包括如下步骤：
(1)种子液培养：将链霉菌菌株接种于种子培养基中，培养，得到种子液；
(2)发酵：将步骤(1)中得到的种子液接种于固态发酵培养基中，搅拌均匀，发酵，得到发酵物，待发酵物中的可溶性蛋白和氨基酸含量基本恒定时停止发酵，烘干，粉碎，得到发酵羽毛粉。
步骤(1)中所述的种子培养基的配制：称取10.0g蛋白胨、5.0g酵母提取物和5.0g氯化钠，蒸馏水定容至1000mL，调节pH至7.5。
步骤(1)中所述的链霉菌菌株接种于种子培养基中，优选为将链霉菌菌株进行活化后再接种于种子培养基中。
步骤(1)中所述的培养的条件为30～42℃、150～250rpm培养15～30h；优选为37℃、220rpm培养24h。
步骤(1)中所述的培养为震荡培养，震荡采用添加15～20粒无菌玻璃珠来实现。
步骤(2)中所述的固态发酵培养基的配制：氯化钠0.5g、磷酸二氢钾0.4g、磷酸氢二钾0.3g、蒸馏水定容至1000mL，得到基础培养基，将羽毛粉和基础培养基按照1:2.5的比例混合，调节pH至10。
步骤(2)中所述的种子液的接种量为10％(v/w)。
步骤(2)中所述的发酵的温度为35～45℃；优选为40℃。
步骤(2)中所述的发酵的同时摇动，并每日充分均匀翻料一次。
一种发酵羽毛粉，通过上述链霉菌菌株在降解羽毛中的应用得到。
上述链霉菌菌株或发酵羽毛粉在制备禽畜类饲料中的应用，所述的应用是将采用所述的链霉菌菌株发酵得到的发酵羽毛粉掺入禽畜类饲料中。
一种禽畜类饲料，含有所述的链霉菌菌株和/或所述的发酵羽毛粉。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明通过大量筛选获得了一株能够高效降解天然羽毛的链霉菌新菌株SCUT-1，该菌株能够在48小时内完全降解10g/L天然羽毛(包括羽毛轴)，羽毛角蛋白降解率可达93.6％，具有极高的应用价值。
2.本发明采用链霉菌菌株SCUT-1固态发酵制备得到发酵羽毛粉，可以有效减少废液的产生，减少加工工序，降低能源消耗，同时将大量废弃羽毛进行了重新利用，变废为宝，得到高蛋白、高氨基酸的饲料，使羽毛中的营养成分被充分利用，为有效解决蛋白饲料不足对畜禽业发现的制约，缓解养殖业对粮食的消耗提供了有效的途径，同时也可以有效减轻环境污染。
3.本发明的发酵羽毛粉氨基酸组成几乎无损失，粗蛋白含量高达88.14％，且包含18种氨基酸(包括全部8种必需氨基酸)，可溶性蛋白和游离氨基酸含量可分别高达124.71mg/g和224.32mg/g，为饲料行业提供了高营养的饲料添加剂甚至饲料替代品，制备得到的禽畜类饲料安全性高。
4.本发明发酵羽毛粉的制备采用预先粉碎羽毛的方式，可以在菌株生长的初始阶段提供使其更容易吸收利用的碳氮源和无机离子，能够使菌体量快速增长，提高其降解羽毛的效率，减少固态发酵所需要的时间。同时，粉碎羽毛可增加固态发酵培养基之间的孔隙度，是水分和营养能够进入羽毛间隙，为好氧型细菌提供必要的水分和氧气，提高菌种的繁殖速度，提高发酵效率。
5.本发明发酵羽毛粉的制备采用链霉菌固态发酵的方法，能够发挥链霉菌菌株SCUT-1产大量菌丝，易于在固态基质生长的优势，有效提高羽毛降解的效率，提高了氨基酸和可溶性蛋白的产量，为禽畜类饲料提供更有营养的添加剂或替代品。
附图说明
图1是本发明的菌株SCUT-1在高氏一号琼脂培养基上的菌落形态照片图。
图2是本发明的菌株SCUT-1在高氏一号琼脂培养基上的菌丝形态照片图。
图3是本发明的菌株SCUT-1在高氏一号琼脂培养基上的菌丝扫描电镜照片图。
图4是依据16S rDNA序列构建的菌株SCUT-1与同源性高的10株菌株的系统发育树图。
图5是本发明的菌株SCUT-1对天然鸡羽毛的水解结果图；其中，a为对照；b(正面)和c(底面)为天然鸡羽毛经过菌株SCUT-1发酵处理48小时后的水解结果图。
图6是本发明的菌株SCUT-1制备的发酵羽毛粉与天然羽毛粉的表观状态图；其中，图A是天然羽毛粉的表观状态图，图B是实施例4制备得到的发酵羽毛粉的表观状态图。
图7是本发明的菌株SCUT-1与亲缘关系较近的三株链霉菌的羽毛降解能力比较结果图。
具体实施方式
下面将结合实施方式对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1链霉菌SCUT-1的分离
1)初筛：
从广东韶关市养鸡场长期堆积羽毛的土壤中采集样品5g，接种于富集培养基，37℃、220rpm震荡培养3天。将培养液划线接种羽毛粉平板，37℃条件下培养5～7天，将羽毛粉平板上长势旺盛且水解圈较大的细菌进行反复划线接种于羽毛粉平板，直至挑取到单菌落为止，最终得到水解角蛋白能力较强的若干菌株。
2)复筛：
将初筛所获得的若干角蛋白降解菌株进行羽毛发酵培养基复筛，分别将其接种于种子培养基中，37℃、220rpm培养24小时，将种子液转接于装有100mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，接种量为1％(v/v)，37℃、220rpm培养5～7天，用Whatman 202中速定量滤纸过滤发酵液，65℃烘干，称量残留的羽毛质量，无菌水代替菌液作为对照。羽毛降解率＝[(发酵培养基的羽毛干重量-发酵后残留羽毛的干重)/发酵培养基的羽毛干重量]×100％。复筛最终获得降解率最高的菌株，命名为SCUT-1。
富集培养基(g/L)：氯化铵0.5g、氯化钠0.5g、磷酸氢二钾0.3g、磷酸二氢钾0.4g、氯化镁0.1g、酵母提取物1.0g、羽毛粉10.0g、蒸馏水定容至1000mL，pH 7.5，灭菌后备用。
羽毛粉平板(g/L)：磷酸氢二钾1.5g、七水硫酸镁0.025g、氯化钙0.025g、硫酸亚铁0.015g、羽毛粉10.0g、琼脂粉20.0g、蒸馏水定容至1000mL，pH 7.5，灭菌后备用。
种子培养基(g/L)：蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水定容至1000mL，pH 7.5，灭菌后备用。
发酵培养基(g/L)：氯化钠0.5g、磷酸二氢钾0.4g、磷酸氢二钾0.3g、羽毛10.0g、蒸馏水定容至1000mL，pH 7.5，灭菌后备用。
实施例2链霉菌SCUT-1的鉴定
1)形态及培养特征观察
A.形态学特征
以插片法在高氏一号合成培养基上于37℃培养步骤(1)筛选得到的SCUT-1菌株10天后，肉眼观察培养基上的菌落形态(图1)，在光学显微镜下观察菌丝的形态和孢子形态(图2)，气生菌丝发育良好，孢子链直，圆柱状，基内菌丝交织成网，有分枝、无横隔、无断裂现象。在电子显微镜下观察(图3)孢子球状，成熟时表面光滑。从图1至图3可知，SCUT-1菌株在高氏一号琼脂培养基培养10天的形态学特征与链霉菌属的形态特征符合。
B.培养特征
如表1所示，SCUT-1菌株在高氏一号合成培养基上菌落突出、绒毛状、边缘不规则，气丝淡灰色至灰绿色，基内菌丝灰色，无可溶性色素；在无机盐淀粉琼脂培养基上气丝白色，基内菌丝灰白色、无可溶性色素；在牛肉膏蛋白胨培养基上气生菌丝白色，基内菌丝呈褐色，无可溶性色素产生；在牛奶琼脂平板上气生菌丝呈乳白色，基内菌丝呈白色，无可溶性色素产生，产生透明圈。
高氏一号培养基(g/L)：可溶性淀粉20.0g、氯化钠0.5g、硝酸钾1.0g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.05g、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL，pH7.5，灭菌后倒平板，备用。
淀粉无机盐培养基(ISP4)(g/L)：可溶性淀粉10.0g、硫酸铵2.0g、碳酸钙2.0g、微量盐溶液1.0mL、硫酸镁1.0g、琼脂15.0g、NaCl 1.0g、蒸馏水至1000mL，pH7.5，灭菌后倒平板，备用；其中，微量盐溶液的组成FeSO4·7H2O 0.1g、MnCl2·4H2O 0.1g、ZnSO4·7H2O0.1g，蒸馏水至100mL。
牛肉膏蛋白胨培养基(g/L)：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水至1000mL，pH 7.5、灭菌后倒平板，备用。
牛奶琼脂培养基(g/L)：分别称取20g脱脂奶粉和0.02g碳酸钙，用蒸馏水完全溶解并定容至1000mL，pH7.5，灭菌后倒平板，备用。
2)生理生化特征
A.碳源的利用
碳源利用培养基(普戈二号培养基)：基本培养基：硫酸铵2.64g、硫酸亚铁0.0011g、七水硫酸锌0.0015g、氯化锰0.0079g、七水硫酸镁1.0g、磷酸二氢钾2.38g、磷酸二氢钾5.65g、硫酸铜0.0064g、碳源、蒸馏水至1000mL，pH 7.5；碳源：L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、鼠李糖、D-木糖、果糖、蔗糖、棉子糖、D-甘露糖、肌醇；将碳源过滤除菌，分别按照添加浓度为质量体积比0.2％(D-葡萄糖、D-木糖、果糖、蔗糖、棉子糖、D-甘露糖、肌醇)，稀有碳源浓度为质量体积比0.05％(L-阿拉伯糖、鼠李糖)分别加入已融化的基础培养基中，混匀，得到碳源利用培养基。接种SCUT-1菌株于碳源利用培养基中，37℃培养3～5天观察菌体生长状况。
B.明胶液化
培养基(g/L)：明胶200.0g、蛋白胨5.0g、葡萄糖20.0g、蒸馏水1000mL，灭菌后备用，将菌株SCUT-1接种于明胶表面，于37℃下培养7～10天，观察明胶液化情况。
C.牛奶凝固与胨化
将菌种SCUT-1接种于灭菌的脱脂牛奶中，37℃培养，于10天和15天分别观察牛奶的凝固与胨化情况。
D.淀粉水解
培养基(g/L)：可溶性淀粉10.0g、磷酸氢二钾0.3g、碳酸镁1g、氯化钠0.5g、硝酸钾1g、琼脂粉15g、蒸馏水1000mL，pH7.5，灭菌后备用。将菌株SCUT-1接种于上述培养基中，37℃下培养10天后，往培养基中加入碘液，以菌落周围有无透明圈来判断有无淀粉酶产生。
E.纤维素水解
培养基(g/L)：磷酸二氢钾0.5g、硫酸铵2g、硫酸镁0.25g、微晶纤维素粉2g、刚果红0.2g、琼脂粉20g、蒸馏水1000mL，灭菌后备用。将菌株SCUT-1接种于上述培养基中，37℃下培养10天，以菌落周围有无透明圈来判断有纤维素酶产生。
F.硫化氢(H2S)产生
培养基(g/L)：蛋白胨10g、柠檬酸铁0.5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，pH 7.5，灭菌后备用。将菌株SCUT-1接种于上述培养基中，37℃下培养7天，观察有无黑色硫化铁产生并作为硫化氢产生的依据。
G.硝酸盐还原
培养基(g/L)：磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁0.5g、硝酸钾1g、氯化钠0.5g、蔗糖20g、蒸馏水1000mL，pH7.5，灭菌后备用。将菌株SCUT-1接种于上述培养基中，37℃下培养3天，取1mL菌液与硝酸盐检测试剂混合，红色则表明硝酸盐还原阳性。
H.接触酶和氧化酶活性
接种环从平板挑取部分菌体于3％(v/v)过氧化氢的载玻片上，若产生气泡则为接触酶阳性；接种环从平板挑取部分菌体于滤纸条上，滴加1％(v/v)的盐酸四甲基对苯二胺，若10s内变为红色则为氧化酶阳性，10～60s为延迟，大于60s则为氧化酶阴性。
I.温度、盐度及pH耐受性
温度、盐度和pH耐受性实验均使用LB培养基，将SCUT-1菌株接种于若干LB培养基中，分别置于4℃、50℃条件培养7d，观察生长状态。同样的，将SCUT-1菌株接种于氯化钠浓度为质量体积比2％～5％的LB培养基中，37℃培养7d，观察生长状态。将SCUT-1菌株接种于pH为5～10的LB培养基中，37℃培养7d，观察生长状态。
J.革兰氏染色
按照革兰氏染色试剂盒(广东环凯微生物科技有限公司)的步骤进行。经固定、结晶紫初染、乙醇脱色、沙黄复染和镜检后，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
结果如表2所示，SCUT-1菌株的生理生化特性符合链霉菌属的特征，具有氧化酶和接触酶活性，使明胶液化、淀粉水解、牛奶胨化，能产生硫化氢，并且能分解淀粉和纤维素，不产生色素，但能还原硝酸盐为亚硝酸盐；碳源利用情况：只能利用D-葡萄糖，不能利用果糖、蔗糖、D-木糖、D-甘露糖、肌醇、L-阿拉伯糖、鼠李糖和棉子糖；耐受性方面：pH5.0～10.0均可以生长，能够耐受55℃温度生长且能够耐受浓度为质量体积比5％的盐离子。
3)分子水平鉴定
A.基因组的提取与测序
将羽毛降解菌株SCUT-1接种于LB液体培养液中，37℃培养24h，收集菌体。使用细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)进行基因组DNA抽提，具体步骤见该试剂盒说明书。随后将初步检验合格的基因组样品送广州基迪奥生物科技公司进行菌株SCUT-1基因组三代测序。
B.系统发育树构建
将测序获得的SCUT-1菌株16S rDNA序列在GeneBank上进行序列比对，随后下载相似性较高的模式菌株序列，使用MEGA7.0对该菌株进行初步的系统发育树构建。
C.平均核苷酸相似性(ANI)分析
从NCBI获取现有报道的所有链霉菌基因组序列，从基因组水平对所筛选的链霉菌进行平均核苷酸相似性分析，使用OrthoANIu工具对ANI值进行计算，进一步对该菌株进行鉴定。
测序得到SCUT-1菌株的16S rDNA序列如下所示：
acccgggcggcgtgcttacacatgcaagtcgaacggtgaagcccttcggggtggatcagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgccctgcactctgggacaacccggggaaacccgggctaataccggatacgaccctccagggcatcttggggggtggaaagctccggcggtgcaggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtggggtgatggcccaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgcaagtgacggtacctgcagaagaagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcgcgtcggtcgtgaaagcccggggcttaaccccgggtctgcggtcgatacgggcaggctagagttcggtaggggagatcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatctctgggccgatactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgttgggaactaggtgtgggcgacattccacgtcgtccgtgccgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagaggcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatacaccggaaactggcagagatgtcagcccccttgtggtcggtgtacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgttctgtgttgccagcatgcccttcggggtgatggggactcacaggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtcttgggctgcacacgtgctacaatggccggtacaatgagctgcgataccgcgaggtggagcgaatctcaaaaagccggtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagtctctagtaatcgcagatcagcattgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcacgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcccaaccccttgtgggagggagtcgtcgaaggtgaaccgggct
将基因组测序获得的SCUT-1菌株的16S rDNA序列与GeneBank中相关序列进行BLAST相似性分析，以同源性高的10株菌株采用MEGA7.0软件以邻接法构建系统发育树(图4)。结果表明，SCUT-1属于链霉菌属(Streptomyces)，与热线链霉菌Streptomycesthermolineatus strain A1484T(NR026529.1)的序列同源性高达99％，且系统进化树处于同一分支。
从基因组水平通过OrthoANIu工具计算现有链霉菌基因组平均核苷酸相似性，结果表明SCUT-1菌株与现有链霉菌放的基因组平均核苷酸相似度(ANI)最高值为78.51％，说明SCUT-1菌株不属于现有报道基因组的链霉菌的任何一个种，可能是链霉菌属的一个新菌种。
通过对SCUT-1菌株进行形态学特征、培养特征、生理生化特性和16S rDNA序列，表明菌株SCUT-1具有热线链霉菌的模式菌株Streptomyces thermolineatus strain A1484T(NR026529.1)的典型特征，两者的序列同源性为99％，但是热线链霉菌并没有报道基因组，因此无法确定是否放入热线链霉菌。综合上述分析结果，SCUT-1菌株属于链霉菌属，命名为链霉菌Streptomyces sp.SCUT-1，保藏编号为GDMCC No：60612，该菌株于2019年3月20日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心。
实施例3链霉菌SCUT-1羽毛降解能力评估
1)种子培养基和发酵培养基的配制同实施例1，备用。
2)将实施例1的菌株SCUT-1接种于装有20mL种子培养基的250mL的锥形瓶中，加入15～20粒无菌玻璃珠，37℃、220rpm培养24h，获得SCUT-1种子液。
3)将1mL SCUT-1种子液接种于装有100mL发酵培养基的500mL锥形瓶中，37℃、220rpm培养2天。
4)通过观察羽毛降解情况和失重法测定降解率评估羽毛降解能力。
结果显示，羽毛发酵培养基中的羽毛随时间的推移，羽毛小枝逐渐脱落，然后羽毛梗逐渐断裂，培养基逐渐变得浑浊，2天后羽毛基本降解，培养基成为均一的乳白色混悬液(图5)。根据残渣重量的变化测定羽毛角蛋白降解率，培养48h后，羽毛角蛋白降解率可达93.6％。
实施例4发酵羽毛粉的制备
将实施例3步骤2)中获得的种子液按照10％的比例(v/m，种子液体积/培养基中干物质的重量)接种于固态发酵培养基中充分搅拌均匀，采用摇动和定时翻料结合的方式在40℃下进行发酵。发酵过程中，每天充分均匀翻料一次并取样检测发酵物中的可溶性蛋白和氨基酸含量，当二者含量基本恒定时停止发酵，烘干和粉碎，获得最终的发酵羽毛粉，发酵前后羽毛粉形态及颜色如图6所示。对发酵羽毛粉中的可溶性蛋白和氨基酸含量分别按照Takara蛋白测定试剂盒和茚三酮比色法进行测定，并对氨基酸的种类进行分析。氨基酸的种类和含量的测定仪器采用华南理工大学分析测试中心的氨基酸分析仪A-300。
基础培养基(g/L)：氯化钠0.5g、磷酸二氢钾0.4g、磷酸氢二钾0.3g、蒸馏水定容至1000mL，充分溶解。
固态发酵培养基：将羽毛粉和基础培养基按照1:2.5的比例充分混合，调节pH至10，高温湿热灭菌后备用。
实施例5发酵羽毛粉参数的测定
准确称量2.0g实施例4制备得到的发酵羽毛粉于250mL锥形瓶中，加入50mL蒸馏水，于摇床中220rpm充分浸提1小时，过滤后取发酵羽毛粉浸提液，进行可溶性蛋白和氨基酸含量的测定，并将未发酵的天然羽毛粉、实施例4制备得到的发酵羽毛粉和本实施例的发酵羽毛粉浸提液送至华南理工大学大学城分析测试中心进行氨基酸组分和含量的测定。实施例4制备得到的固态发酵羽毛粉包含18种氨基酸(包括全部的8种必需氨基酸)，且与未发酵的天然羽毛粉相比可溶性的蛋白和氨基酸含量明显增加，可溶性蛋白和游离氨基酸含量高达124.71mg/g和224.32mg/g。发酵羽毛粉浸提前后总蛋白含量几乎无损失且高达88.14％。发酵羽毛粉浸提前后的氨基酸组分和含量见表3。
表3固态发酵羽毛粉浸提前后各组分氨基酸组成及含量
对比例1四种链霉菌羽毛降解能力的比较
从进化树中选取与SCUT-1菌株亲缘关系较近的三种链霉菌，氟氏链霉菌(Streptomycesfradiae，编号为ATCC 10745)、卡特利链霉菌(Streptomyces cattleya，编号为ATCC 35852)和热线链霉菌(Streptomyces thermolineatus，编号为ATCC 51534)，对其羽毛降解能力进行比较。分别在浓度为5％(v/v)的实施例3的羽毛发酵培养基中加入SCUT-1和亲缘关系较近的三株链霉菌，37℃、220rpm培养2天，取样，对羽毛发酵培养基上清中可溶性蛋白和氨基酸含量进行测定，将其作为降解能力的指标进一步评估SCUT-1菌株与其他菌株羽毛降解能力的差异。
结果表明链霉菌SCUT-1与三株链霉菌降解能力存在明显的差异，且与亲缘关系最近的Streptomyces thermolineatus的羽毛降解能力差异性最大，结果见图7，进一步表明筛选的链霉菌SCUT-1属于一种新菌株，具有明显较强的羽毛降解能力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一株链霉菌菌株及其在降解羽毛中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1433
<212> DNA
<213> 链霉菌SCUT-1（Streptomyces sp.）
<220>
<223> SCUT-1菌株16S rDNA序列
<400> 1
acccgggcgg cgtgcttaca catgcaagtc gaacggtgaa gcccttcggg gtggatcagt 60
ggcgaacggg tgagtaacac gtgggcaatc tgccctgcac tctgggacaa cccggggaaa 120
cccgggctaa taccggatac gaccctccag ggcatcttgg ggggtggaaa gctccggcgg 180
tgcaggatga gcccgcggcc tatcagcttg ttggtggggt gatggcccac caaggcgacg 240
acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300
ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcgc aagcctgatg cagcgacgcc 360
gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca gcagggaaga agcgcaagtg 420
acggtacctg cagaagaagc accggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 480
gtgcgagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagagctcg taggcggctt gtcgcgtcgg 540
tcgtgaaagc ccggggctta accccgggtc tgcggtcgat acgggcaggc tagagttcgg 600
taggggagat cggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc agatatcagg aggaacaccg 660
gtggcgaagg cggatctctg ggccgatact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga 720
acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgttg ggaactaggt gtgggcgaca 780
ttccacgtcg tccgtgccgc agctaacgca ttaagttccc cgcctgggga gtacggccgc 840
aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag aggcggagca tgtggcttaa 900
ttcgacgcaa cgcgaagaac cttaccaagg cttgacatac accggaaact ggcagagatg 960
tcagccccct tgtggtcggt gtacaggtgg tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1020
atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgttct gtgttgccag catgcccttc 1080
ggggtgatgg ggactcacag gagactgccg gggtcaactc ggaggaaggt ggggacgacg 1140
tcaagtcatc atgcccctta tgtcttgggc tgcacacgtg ctacaatggc cggtacaatg 1200
agctgcgata ccgcgaggtg gagcgaatct caaaaagccg gtctcagttc ggattggggt 1260
ctgcaactcg accccatgaa gtcggagtct ctagtaatcg cagatcagca ttgctgcggt 1320
gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacgtc acgaaagtcg gtaacacccg 1380
aagccggtgg cccaacccct tgtgggaggg agtcgtcgaa ggtgaaccgg gct 1433

Claims (10)

1.一株链霉菌菌株，其特征在于：名称为链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1，保藏编号为GDMCC No：60612，该菌株于2019年3月20日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心。
2.权利要求1所述的链霉菌菌株的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)初筛：
将长期堆积羽毛的土壤接种于富集培养基，30～42℃、150～250rpm培养2～5天，得到培养液，将培养液划线接种于羽毛粉平板，30～42℃条件下培养5～7天，将长势旺盛且水解圈较大的菌反复划线分离，直至挑取到单菌落；
(2)复筛：
将步骤1)中得到的单菌落接种于种子培养基，30～42℃、150～250rpm培养15～30小时，得到种子液，将种子液转接于发酵培养基，30～42℃、150～250rpm培养5～7天，得到发酵液，过滤发酵液，50～70℃烘干，称量残留的羽毛质量，计算羽毛降解率，获得羽毛降解率最高的链霉菌菌株SCUT-1；
步骤(1)中所述的富集培养基的配制：氯化铵0.5g、氯化钠0.5g、磷酸氢二钾0.3g、磷酸二氢钾0.4g、氯化镁0.1g、酵母提取物1.0g、羽毛粉10.0g、蒸馏水定容至1000mL，pH7.5；
步骤(1)中所述的羽毛粉平板的配制：磷酸氢二钾1.5g、七水硫酸镁0.025g、氯化钙0.025g、硫酸亚铁0.015g、羽毛粉10.0g、琼脂粉20.0g、蒸馏水定容至1000mL，pH7.5；
步骤(2)中所述的种子培养基的配制：蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水定容至1000mL，pH7.5；
步骤(2)中所述的发酵培养基的配制：氯化钠0.5g、磷酸二氢钾0.4g、磷酸氢二钾0.3g、羽毛10.0g、蒸馏水定容至1000mL，pH7.5。
3.根据权利要求2所述的链霉菌菌株的筛选方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的土壤接种于富集培养基之后的培养条件为37℃、220rpm培养3天；
步骤(1)中所述的培养菌液划线接种羽毛粉平板之后的培养温度为37℃；
步骤(2)中所述的单菌落接种于种子培养基之后的培养条件为37℃、220rpm培养24小时；
步骤(2)中所述的种子液转接于发酵培养基的接种量为1％(v/v)；
步骤(2)中所述的种子液转接于发酵培养基之后的培养条件为37℃、220rpm培养5天；
步骤(2)中所述的种子培养基的配制：蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水定容至1000mL，pH7.5；
步骤(2)中所述的过滤发酵液为采用Whatman 202中速定量滤纸过滤；
步骤(2)中所述的烘干的温度为65℃。
4.权利要求1所述的链霉菌菌株在降解羽毛中的应用。
5.根据权利要求4所述的链霉菌菌株在降解羽毛中的应用，其特征在于方法包括如下步骤：
(1)种子液培养：将链霉菌菌株接种于种子培养基中，培养，得到种子液；
(2)发酵：将步骤(1)中得到的种子液接种于固态发酵培养基中，搅拌均匀，发酵，得到发酵物，待发酵物中的可溶性蛋白和氨基酸含量基本恒定时停止发酵，烘干，粉碎，得到发酵羽毛粉。
6.根据权利要求5所述的链霉菌菌株在降解羽毛中的应用，其特征在于：
步骤(2)中所述的固态发酵培养基的配制：氯化钠0.5g、磷酸二氢钾0.4g、磷酸氢二钾0.3g、蒸馏水定容至1000mL，得到基础培养基，将羽毛粉和基础培养基按照1:2.5的比例混合，调节pH至10；
步骤(1)中所述的种子培养基的配制：称取10.0g蛋白胨、5.0g酵母提取物和5.0g氯化钠，蒸馏水定容至1000mL，调节pH至7.5；
步骤(1)中所述的培养的条件为30～42℃、150～250rpm培养15～30h；
步骤(2)中所述的发酵的温度为35～45℃。
7.根据权利要求6所述的链霉菌菌株在降解羽毛中的应用，其特征在于：
步骤(1)中所述的链霉菌菌株接种于种子培养基中，为将链霉菌菌株进行活化后再接种于种子培养基中；
步骤(1)中所述的培养的条件为37℃、220rpm培养24h；
步骤(1)中所述的培养为震荡培养，震荡采用添加15～20粒无菌玻璃珠来实现；
步骤(2)中所述的种子液的接种量为10％(v/w)；
步骤(2)中所述的发酵的温度为40℃；
步骤(2)中所述的发酵的同时摇动，并每日充分均匀翻料一次。
8.一种发酵羽毛粉，其特征在于：通过权利要求4～7任一项所述的链霉菌菌株在降解羽毛中的应用得到。
9.权利要求1所述的链霉菌菌株或权利要求8所述的发酵羽毛粉在制备禽畜类饲料中的应用，其特征在于：所述的应用是将采用所述的链霉菌菌株发酵得到的发酵羽毛粉掺入禽畜类饲料中。
10.一种禽畜类饲料，其特征在于：含有权利要求1所述的链霉菌菌株和/或权利要求8所述的发酵羽毛粉。
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