CN114438144B - 利用链霉菌固态发酵处理虾壳废弃物生产氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用链霉菌固态发酵处理虾壳废弃物生产氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的方法及其应用,属于生物工程技术领域。利用链霉菌固态发酵处理虾壳废弃物生产氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的方法,包括向含有虾壳废弃物的发酵培养基中接种链霉菌种子发酵液,得到发酵液,分离得到第一上清液和第一沉淀物;制备氨基酸产物和膜分离残液、寡肽产物、几丁质和乳酸钙。本发明首次实现使用虾壳废弃物生产大量氨基酸,回收率达到61.55%,游离氨基酸浓度达到82.5g/L,氨基酸生产率达到16.5g/(L*d),必需氨基酸含量达到58.52%,是优秀的医药保健品原料、食品营养添加剂和饲料添加剂。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,特别涉及一种利用链霉菌固态发酵处理虾壳废弃物生产氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的方法及其应用。
背景技术
中国是全球最大的虾类养殖国家之一,2020年的虾养殖产量为207万吨(IMARC-Group,Research and Markets,2021)。广东省是中国的水产大省,据统计,2020年广东水产品生产总量达到880.32万吨,仅虾产量就超过100万吨,其中大部分被加工成虾仁商用。但虾的肉质部分不足总重量的45%,其余部分作为固体有机废物处理,因此,大规模的虾养殖导致了虾壳废弃物(包括虾头、虾壳、虾尾)的泛滥,而且正在以惊人的速度增长。另一方面,虾壳废弃物是很好的生物资源,如几丁质、蛋白质、矿物质等,具有很高的开发潜力。因此,如何实现对废弃虾壳的综合利用,回收其中的活性成分已经成为了研发的热点。
虾壳中含有蛋白质、几丁质、矿物质等成分,其中蛋白质含量超过40%,部分虾壳的蛋白质含量可达到55%,是以一种具有潜力的生物质资源,目前虾壳废弃物可以作为优质的蛋白源添加入饲料中,但是由于其蛋白质与几丁质、矿物质紧密结合在一起,因此其被消化吸收的比率很低,大量蛋白质通过粪便排入环境,同样造成了较大程度的资源浪费和环境污染。由于蛋白质是优良的营养物质、几丁质常被用于新型生物材料及营养保健、矿物质中含有40%的钙离子,可以用于钙的补充,所以将虾壳中的各项成分,即蛋白质、几丁质、矿物质进一步分离,可以实现虾壳废弃物的进一步利用。
几丁质是虾壳中含量最多的多糖类物质,是重要的生物资源,具有降低血浆胆固醇和甘油三酯的功能,可以抵御细菌和酵母等病原体的感染,维持正常的肠道菌群,也被制成隐形眼镜、人造皮肤和外科缝合线(Koide,1998;Mao et al.,2003;Nakajima et al.,1986;Singh et al.,2017;Xin-Yuan and Tian-Wei,2004)。目前几丁质工业常使用强碱强酸(如1M HCl和1M NaOH)来处理虾壳废弃物以回收几丁质,但是强酸强碱的使用导致该工艺对环境不友好,虾壳废弃物中矿物质大部分流失,而获得的蛋白质因消旋反应使营养下降,且盐浓度太高导致作为饲料使用适口性差,收益低,只能作为废弃物进行排放,而大量含氮废水的排放引起了水体富营养化。在此工艺处理的过程中,导致最终此工艺仅仅得到了几丁质这一种产物,废弃物利用率低。蛋白酶酶解法是一种新型的几丁质获取办法(ZL201410357993.8一种利用餐饮废弃虾壳连续生产复合氨基酸短肽螯合钙及几丁质的方法),使用蛋白酶将与几丁质紧紧缠绕的蛋白质降解为小肽,从而释放几丁质纤维,但是蛋白酶成本高,生产周期长,且料液比高导致生产效率低,对工业化生产不利。生物发酵法是处理虾壳废弃物的最有利办法,通过微生物发酵产生的蛋白酶,打开几丁质-蛋白质复合体,最终获得几丁质。但是,目前几丁质的生物发酵提取法多采用液态深层发酵,导致单位时间内几丁质产量较少,影响了工业化生产(ZL201310475664.9一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法)。使用固态发酵可以在短时间内生产出大量的几丁质产品,进一步提高几丁质的生产效率,加快虾壳废弃物的利用速度。
虾壳废弃物中含有大量的蛋白质,此类蛋白质的组成中含有大量必需氨基酸,因此虾壳废弃物是氨基酸生产的优良来源。氨基酸在食品、医药、保健行业均有重要作用,2020年全球氨基酸市场规模为241.5亿美元,常用的氨基酸生产方法多为发酵法,需要大量的玉米等粮食作物提供碳源,消耗大量的耕地。目前几丁质工业常使用强碱强酸(如1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠)来处理虾壳废弃物以回收几丁质,导致蛋白质中的氨基酸被强酸强碱破坏,出现消旋、分解、脱氨等问题,影响营养,且盐浓度高导致适口性差,只能作为废弃物排放。酶法是目前使用的新型虾壳处理方法,通过几丁质酶(专利ZL2011102588936一株几丁质降解菌株及其制备几丁寡糖的方法)或壳聚糖酶(ZL200610080091.X几丁寡糖制备方法)等进行处理,只可以蛋白水解物,但无法大量得到氨基酸,同时还存在酶生产昂贵、料液比低、生产效率低、干燥成本高等问题;生物发酵法是目前最具潜力的虾壳废弃物处理法,但是目前的生物发酵法多依托于产酸菌去除矿物质及蛋白质(专利ZL201910795983.5一株乳酸球菌Lactococcus garvieae LGHK2及其应用)、蛋白酶产生菌-产酸菌两步发酵去除矿物质及蛋白质(ZL201911100671.4一种产蛋白酶深海微小杆菌突变株及其用途),均为通过液态发酵处理虾壳,只能得到分子量较大的蛋白质,无法直接得到氨基酸,需进一步处理才能得到游离氨基酸,同时依然存在料液比高的问题。Jianan Sun等人使用枯草芽孢杆菌液态发酵南极磷虾可收获到游离氨基酸,但是氨基酸产物浓度仅有3.47g/L,浓度低产量少,导致生产成本高(Jianan-Sun and Xiangzhao-Mao,2016)。如何提高生物发酵法的料液比,减少处理环节,提高降解产物产率,降低干燥成本,增加产物商业价值是目前虾壳废弃物处理的关键问题,因此,一种使用固态发酵,实现固态发酵处理虾壳,直接收获氨基酸等高价值产物是目前虾壳废弃物处理及其产业化的关键技术。
虾壳是天然无污染的优良钙源,以往虾壳废弃物的利用往往只使用化学法提取其中的几丁质,但矿物质作为废弃物被浪费。虾壳可以磨成粉添加入饲料(ZL201711471260.7一种鱼虾蟹饲料配方)、宠物食品(ZL201610696871.0一种补钙狗粮的制作方法)中作为补钙剂,但是由于其结构的紧密性,使钙元素而难以直接消化利用,直接作为补钙剂效果较差;使用酶-酸碱二次脱蛋白脱矿法可以得到补钙剂柠檬酸钙,但是同样需要用到强酸强碱溶液,对设备要求高,成本昂贵(ZL201310450776.9二次脱钙制备几丁聚糖的方法)。使用生物法,将虾壳废弃物中蛋白质去除,同时保留矿物质,而后使用有机酸溶解可以得到更加优良的补钙剂。
固态发酵是一种适合诸如虾壳废弃物等固态有机废弃物的处理方式,具有原料前处理少、较少产生污水、耗能低、生物转化率高等优势通常情况下认为料液比固态发酵的料液比在1:5~1:1之间。迄今为止大多数固态发酵使用菌种为丝状真菌,Chee Kuan Ooi等人使用黑曲霉固态发酵虾壳废弃物生产蛋白酶,虽然蛋白酶的售价较高(90000元/千克),但是在此过程中虾壳废弃物仅充当碳、氮源,利用率低,造成了虾壳的浪费,生产成本高,生产得到的蛋白酶酶活仅有3.5U/mL,导致产物价值低(Chee-Kuan-Ooi et al.,2021)。最近也有越来越多的链霉菌等细菌菌种成功地用于固态发酵(Abu Yazid et al.,2017;Mitchellet al.,2011)。将固态发酵利用于虾壳废弃物处理,是一种新颖的方法,Andi Setiawan等人使用来自海绵的放线菌Pseudonocardia carboxydivorans 18A13O1固态发酵虾壳废物产生生物活性代谢物,是一种布拉尼霉素B(Branimycin B)结构类似物,有一定的抗菌活性,但是产物得率低,分离复杂,工业化生产成本较高(Andi Setiawan et al.,2021)。因此,选取一株可以高效处理虾壳的菌株,通过相应的工艺获得高值产物,同时兼顾固态发酵的高转化、分离的低成本、产物的高利润,是一种虾壳废弃物处理的合理策略。
综上,从虾壳废弃物中回收大分子量蛋白质(大于10kDa)、几丁质已有人报道。但是,大分子量虾壳蛋白质与氨基酸、寡肽相比,售价不高(约6000元/吨),需要进一步酸水解、碱水解或酶水解成为寡肽或氨基酸方可提高其价值,此过程对设备要求高,工艺繁琐,成本高昂。虾壳中含有大量的矿物质,而现有技术往往无法将其进行有效回收而造成浪费。目前,尚未见有可以从虾壳废弃物中同时回收得到氨基酸、多肽、乳酸钙、几丁质的相关报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种利用链霉菌固态发酵处理虾壳废弃物生产氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的方法。
本发明的又一目的在于提供上述利用链霉菌固态发酵处理虾壳废弃物生产氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种利用链霉菌固态发酵处理虾壳废弃物生产氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的方法,包括如下步骤:
(1)向含有虾壳废弃物的发酵培养基中接种链霉菌种子发酵液,培养,得到发酵液,将发酵液固液分离得到第一上清液和第一沉淀物;
(2)将第一上清液中进行膜分离,得到氨基酸产物和膜分离残液;将膜分离残液通过有机醇提取,离心,干燥,即得寡肽产物;
(3)向第一沉淀物中加入乳酸溶液,固液分离后即得第二上清液和第二沉淀物;
(4)将第二沉淀物干燥,即得几丁质产物;将第二上清液蒸发结晶,即得乳酸钙。
步骤(1)中所述的含有虾壳废弃物的发酵培养基的组分为:虾壳废弃物、磷酸二氢钾0.3g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、氯化钠0.5g/L和水;
其中,所述的虾壳废弃物与水优选按质量体积比1:1~20计算;更优选按1:4计算。
步骤(1)中所述的虾壳废弃物优选为虾壳废弃物粉;所述的虾壳废弃物粉的粒径优选为0.05~5mm;更优选为2.0~5.0mm。
步骤(1)中所述的虾壳废弃物优选包括十足目、口足目、磷虾目甲壳纲动物中的至少一种;更优选为南美白对虾的壳。
步骤(1)中所述的链霉菌优选为链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1,其保藏编号为GDMCC No:60612,该菌株于2019年3月20日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心。
步骤(1)中所述的链霉菌种子发酵液优选为在波长660nm下,OD值等于7~10的链霉菌种子发酵液;更优选为在波长660nm下,OD值等于9的链霉菌种子发酵液。
所述的链霉菌种子发酵液通过将链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1孢子接种于培养基中培养,得到。
所述的培养基优选为LB培养基、高氏一号培养基、TB培养基、ISP-1培养基、ISP-2培养基、ISP-3培养基、ISP-4培养基及其改良培养基中的至少一种;更优选为LB培养基。
所述的培养的条件优选为:pH=7.2、40℃培养4~48h;更优选为pH=7.2、40℃培养18h。
所述的链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1孢子优选通过将链霉菌(Streptomycessp.)SCUT-1接种于高氏一号固体培养基,pH=7.2、37℃培养6~8天得到;更优选通过将链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1接种于高氏一号固体培养基,pH=7.2、37℃培养7天得到。
步骤(1)中所述的培养的条件优选为:30~40℃、220rpm培养1~6d;更优选为:40℃、220rpm震荡培养5d。
步骤(1)中所述的发酵液固液分离的方法优选为离心。所述的离心的条件优选为10000~14000rpm离心20~40min;更优选为12000rpm离心30min。
步骤(2)中所述的膜分离优选为用超滤管对第一上清液进行分离;更优选为用1kDa含有聚醚砜膜的超滤管对第一上清液进行分离。
步骤(2)中所述的有机醇优选为乙醇;更优选为无水乙醇。
步骤(2)中所述的有机醇的体积优选为膜分离残液的1~3倍;更优选为膜分离残液的2倍。
步骤(2)中所述的离心的条件优选为10000~14000rpm,1~3min;更优选为12000rpm,2min。
步骤(3)中所述的乳酸溶液中乳酸的浓度优选为30~70%(v/v);更优选为50%(v/v)。
步骤(3)中所述的第一沉淀物与乳酸溶液优选按料液比1:1~3计算;更优选按不低于料液比1:2计算。
步骤(3)中所述的固液分离通过抽滤、离心、板框过滤、膜过滤和沉降池过滤中的至少一种方式实现。
一种虾壳废弃物来源的氨基酸、寡肽、乳酸钙和/或几丁质,通过上述方法制备得到。
所述的利用链霉菌固态发酵处理虾壳废弃物生产氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的方法在虾壳废弃物资源化处理及制备氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明首次实现使用虾壳废弃物生产大量氨基酸,回收率达到61.55%,游离氨基酸浓度达到82.5g/L,氨基酸生产率达到16.5g/(L*d),必需氨基酸含量达到58.52%,是优秀的医药保健品原料、食品营养添加剂和饲料添加剂。
(2)本发明在实现大量氨基酸直接生产的同时,首次实现使用虾壳废弃物通过发酵法生产寡肽,其中寡肽分子量基本都小于5000Da,并存在较强的ABTS及DPPH清除能力。
(3)在本发明中,以碳酸钙为主要成分的矿物质完全回收,并进一步转化为更高值的乳酸钙,提高的虾壳的利用价值及利用率。
(4)通过本发明所述工艺制备的几丁质,其纯度高、结晶度低、乙酰化度高、并且结构完整,具有优良的理化性质,是新型材料的优良来源。
(5)本发明采用固态发酵的方法,能有效减少废液的产生,减少加工工序,缩减干燥成本,降低能源消耗。
(6)本发明利用链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1对含有虾壳废弃物的发酵培养基进行高效降解后,其中虾壳废弃物的蛋白质-几丁质-矿物质的复合物结构被完全破坏,有效地将其中的蛋白质直接转化为氨基酸及寡肽。在此过程中,被蛋白质紧密包围的几丁质与矿物质充分暴露,进一步通过简单的乳酸抽提,去除矿物质,即可得到乳酸钙和几丁质。通过本发明所述方法得到的氨基酸产品产量可达0.33g/g虾壳粉,且其中必需氨基酸含量高;同时得到小分子量寡肽,寡肽产量可达0.16g/g虾壳粉,分子量低,易于吸收,抗氧化性及自由基清除能力强;乳酸钙纯度高;得到的几丁质脱乙酰度低、结构完整,易于加工。另外,本发明所述的利用链霉菌固态发酵处理虾壳废弃物生产氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的方法设计科学巧妙,底物消耗量少,不需要额外碳氮源,各个产物回收效果好,环保高效,节约生产成本,简化生产工艺,提高生产效率,是一种优秀的虾壳废弃物绿色处理工艺,在虾壳废弃物回收利用中具有很好的应用前景。
(7)不同于目前几丁质的传统提取法,本发明所述的利用链霉菌固态发酵处理虾壳废弃物生产氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的方法无需用到大量的强酸强碱溶液,而是采用温和的固态发酵手段,获得的氨基酸、寡肽无消旋的现象、且盐含量低、适口性好,乳酸钙与几丁质结构完整;与酶解法(ZL201410357993.8一种利用餐饮废弃虾壳连续生产复合氨基酸短肽螯合钙及几丁质的方法、ZL201110258893.6一株几丁质降解菌株及其制备几丁寡糖的方法、ZL200610080091.X几丁寡糖制备方法)相比,避免了昂贵的蛋白酶、几丁质酶、壳聚糖酶的使用,提高料液比至1:4,减少了后期的干燥成本,增加了单周期内的虾壳废弃物处理量,氨基酸回收率达到62%,游离氨基酸浓度达到82.5g/L。而与液态深层发酵法(ZL201310475664.9一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法、ZL201910795983.5一株乳酸球菌Lactococcus garvieae LGHK2及其应用、ZL201911100671.4一种产蛋白酶深海微小杆菌突变株及其用途)相比,本发明所述的利用链霉菌固态发酵处理虾壳废弃物生产氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的方法将提高料液比至1:4,减少了后期的干燥成本,增加了单周期内的虾壳废弃物处理量,提高了各个产物的回收率,同时实现了大量氨基酸的直接回收;与以往的虾壳粉直接作为补钙剂(ZL201711471260.7一种鱼虾蟹饲料配方、ZL201610696871.0一种补钙狗粮的制作方法)相比,本发明所述的利用链霉菌固态发酵处理虾壳废弃物生产氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的方法可以打开虾壳废弃物致密的蛋白质-几丁质-矿物质复合体,成品为溶解性好的乳酸钙,使补钙效果大大增强;与酶-酸碱二次脱蛋白脱矿法(ZL201310450776.9二次脱钙制备几丁聚糖的方法相比),本发明所述的利用链霉菌固态发酵处理虾壳废弃物生产氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的方法不需要用到强酸强碱溶液,对设备要求低,对环境更加友好。
(8)本发明所述的利用链霉菌固态发酵处理虾壳废弃物生产氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的方法,在实现了强酸强碱使用量低、料液比低、废水排放量低、干燥成本低的同时,可从发酵产物中直接得到大量氨基酸、寡肽,稍加处理即可得到乳酸钙及几丁质。本发明所述的利用链霉菌固态发酵处理虾壳废弃物生产氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的方法节约了生产成本,简化了生产工艺,提高了生产效率,是一种优秀的虾壳废弃物绿色处理工艺。
附图说明
图1为链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1固态发酵处理虾壳废弃物的条件优化结果图;其中,A为链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1固态发酵处理虾壳废弃物的料液比优化结果图;B为链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1固态发酵处理虾壳废弃物的虾壳废弃物粒径优化结果图;C为链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1固态发酵处理虾壳废弃物的温度优化结果图;D为链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1固态发酵处理虾壳废弃物的培养时间优化结果图。
图2为链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1固态发酵处理粒径为2.0~5.0mm的虾壳废弃物粉5天发酵底物的变化结果图。
图3为寡肽对DPPH自由基和ABTS自由基的非线性拟合结果图;其中,A为寡肽对DPPH自由基的非线性拟合结果图;B为寡肽对ABTS自由基的非线性拟合结果图。
图4是固态发酵制备的乳酸钙晶体与商品乳酸钙的傅立叶变换红外光谱图。
图5是固态发酵制备的几丁质与商品几丁质的傅立叶变换红外光谱图。
图6是固态发酵制备的几丁质与商品几丁质的X射线衍射光谱图。
图7为虾壳废弃物固态发酵得到的回收产物游离氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的实物图;其中A为虾壳废弃物固态发酵得到的游离氨基酸的实物图;B为虾壳废弃物固态发酵得到的寡肽的实物图;C为虾壳废弃物固态发酵得到的乳酸钙的实物图;D为虾壳废弃物固态发酵得到的几丁质的实物图。
图8为虾壳废弃物固态发酵制备游离氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的流程图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所述的虾壳废弃物为南美白对虾(即凡纳滨对虾,Litopenaeusvannamei)的壳,购于湛江国联水产开发股份有限公司。
实施例1:虾壳废弃物各项成分测定
将虾壳废弃物65℃烘干后,得到虾壳废弃物粉末,-20℃保存备用。测定虾壳废弃物中的蛋白质、矿物质、几丁质和水分的方法如下:
(1)蛋白质:因几丁质中含有氮元素,为排除干扰,先用1M NaOH溶液90℃处理虾壳粉3h,上清液使用凯氏定氮法测定蛋白质浓度(GB 5009.5-2016),测得虾壳中蛋白质含量为54.52%;
(2)矿物质:使用1M盐酸溶液40℃处理虾壳粉6h除去矿物质,干燥后测量失重,可测得虾壳中矿物质含量,为20.10%;
(3)几丁质:先用1M NaOH溶液40℃处理虾壳粉3h除去蛋白质,沉淀再用1M盐酸溶液室温处理3h,得到白色几丁质沉淀,测得虾壳中几丁质含量为17.65%;
(4)水分:使用直接干燥法(GB5009.3-2016),测得虾壳中水分含量低于0.1%。
实施例2:通过链霉菌固态发酵处理虾壳
使用中国专利申请CN201910491700.8一株链霉菌菌株及其在降解羽毛中的应用所记载的链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1作为发酵菌株。链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1,保藏编号为GDMCC No:60612,该菌株于2019年3月20日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心。
将链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1接种于高氏一号固体培养基,pH=7.2、37℃培养7天得到链霉菌SCUT-1孢子平板。
将链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1孢子接种于LB培养基中,pH=7.2、40℃培养18h,得到在660nm波长下OD=7~10的种子发酵液;
使用标准筛筛分虾壳废弃物得到不同粒径大小(0.05~5.0mm)的虾壳废弃物。
将粒径在0.15~5.0mm的虾壳废弃物进行筛分,得到虾壳废弃物粉粒径分别为0.05~0.15mm,0.15~0.30mm,0.30~2.0mm,2.0~5.0mm,并以未筛分虾壳废弃物作为对照。
取不同粒径(0.05~0.15mm、0.15~0.30mm、0.30~2.0mm、2.0~5.0mm和未筛分)的虾壳废弃物粉、磷酸二氢钾0.3g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、氯化钠0.5g/L和水100mL配制为发酵培养基;调整虾壳废弃物粉与发酵培养基中所用水的料液比(g:mL),分别为1:1、1:2、1:4、1:10和1:20;将发酵培养基121℃湿热灭菌20分钟,冷却至室温后加入在660nm波长下OD=9的种子发酵液,其中种子发酵液的用量按每克虾壳废弃物粉中接种1mL种子发酵液计算;将上述发酵体系在发酵温度30~40℃(具体设置为30℃、37℃、40℃),220rpm震荡培养(1d、2d、3d、4d、5d、6d),得到发酵液。
使用平均每天氨基酸产量作为料液比优化的指标,平均每天氨基酸产量(g/(L*d))=游离氨基酸浓度/发酵时间;使用游离氨基酸回收率作为虾壳废弃物粒径、温度、发酵时间优化指标,游离氨基酸回收率(%)=游离氨基酸质量/(虾壳废弃物质量×虾壳废弃物蛋白含量),优化结果详见图1。
从图1可以看出,当虾壳废弃物粉与发酵培养基中所用水的料液比为1:4,发酵温度为40℃,虾壳废弃物粉粒径为2.0~5.0mm,发酵时间5d时游离氨基酸回收率最大,发酵效果最佳。
未经固态发酵的虾壳废弃物为颗粒状,粒径为2.0~5.0mm的虾壳废弃物粉经过发酵处理(虾壳废弃物粉25g、磷酸二氢钾0.3g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、氯化钠0.5g/L和100mL水配制为发酵培养基;即:虾壳废弃物粉与发酵培养基中所用水的料液比为1:4,121℃湿热灭菌20分钟,冷却至室温后加入在660nm波长下OD=9的种子发酵液,其中种子发酵液的用量按每克虾壳废弃物粉中接种1mL种子发酵液计算;将上述发酵体系在发酵温度40℃,220rpm震荡培养5d,得到发酵液)后,在发酵过程中,虾壳废弃物颗粒逐日液化,第五天成为均匀的、黏稠的、呈流体态的悬浊液,如图2所示。
将上述粒径为2.0~5.0mm的虾壳废弃物粉发酵得到的发酵液在12000rpm离心30min,致使固液分离,得到第一上清液和第一沉淀物。经过合理稀释、定容后,使用茚三酮法测定第一上清液中游离氨基酸浓度为82.5g/L。使用BCA法测定第一上清液中可溶多肽含量为40.2g/L。经换算,粒径为2.0~5.0mm的虾壳废弃物粉经上述固态发酵方法发酵后,发酵上清液中游离氨基酸回收率达到61.55%,可溶多肽回收率为30.64%,即每克虾壳废弃物可回收0.33g游离氨基酸与0.16g可溶多肽,平均每天氨基酸产量为16.5g/(L*d)。
实施例3:对生产得到氨基酸、寡肽进行分离并分析组成成分
将链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1接种于高氏一号固体培养基,pH=7.2、37℃培养7天得到链霉菌SCUT-1孢子平板。
将链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1孢子接种于LB培养基中,pH=7.2、40℃培养18h,得到在660nm波长下OD=9的种子发酵液;
将粒径为2.0~5.0mm的虾壳废弃物粉25g、磷酸二氢钾0.3g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、氯化钠0.5g/L和100mL水配制为发酵培养基;即:虾壳废弃物粉与发酵培养基中所用水的料液比为1:4,121℃湿热灭菌20分钟,冷却至室温后加入在660nm波长下OD=9的种子发酵液,其中种子发酵液的用量按每克虾壳废弃物粉中接种1mL种子发酵液计算;将上述发酵体系在发酵温度40℃,220rpm震荡培养5d,得到发酵液。将发酵液在12000rpm离心30min,固液分离,清洗后得到第一上清液和第一沉淀物。
将第一上清液经1kDa聚醚砜膜超滤管分离,得到馏出液和膜分离残液;所得馏出液即为氨基酸产物。
使用德国MembraPure A300 advanced氨基酸分析仪对馏出液进行检测,发现其中必需氨基酸含量达到58.52%,鲜味氨基酸含量为19.86%,甜味氨基酸含23.85%,分支氨基酸含23.29%(如表1所示)。因此,该氨基酸产品在营养补充、食品添加、风味改良、功能保健等方面有广泛的用途,也可以通过进一步纯化得到相应的单一氨基酸产品,如全球需求量极大的谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸等。
向上述膜分离残液中加入2倍体积的无水乙醇,在12000rpm离心2分钟,沉淀干燥,回收多肽,即为多肽干粉。使用得到的多肽干粉配制成1mg/mL的多肽溶液,用HPLC检测,其中色谱柱为Waters Ultra hydrogel TM500/250/120,色谱系统为Agilent 1260。检测条件为流动相为纯水,上样量为10μL,流速1mL/min,温度为30℃,洗脱时间40min,示差检测器。
检测结果表明多肽主要由寡肽组成,其中只有0.18%的寡肽分子量大于5000Da,6.55%的寡肽分子量在2000~5000Da,33.08%的寡肽分子量在1000~2000Da,37.15%的寡肽在500~1000Da,14.99%的寡肽分子量小于250~500Da,8.05%的寡肽分子量小于250Da,出现部分分子量小于1000Da的多肽可能是由于1kDa聚醚砜膜超滤管的截留能力有限造成的。
相较于大分子量蛋白,小分子量肽(寡肽)更易被吸收,同时具有优良的自由基及氧化物清除活性。对国家标准《多肽抗氧化性测定—DPPH和ABTS法(GB/T39100-2020)》中部分方法进行了改进,使用甲醇替代GB/T39100-2020中的乙醇作为ABTS与DPPH的溶剂,测试了寡肽的抗自由基及抗氧化性,经过非线性拟合后确定对于DPPH的半数清除率EC50为0.48g/L,对于ABTS的半数清除率EC50为0.21g/L,线性拟合结果如图3所示。
表1通过固态发酵虾壳废弃物获得的游离氨基酸的组成分析
实施例4:链霉菌固态发酵处理虾壳生产乳酸钙及其分析
将链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1孢子接种于LB培养基中,pH=7.2、40℃培养18h,得到在660nm波长下OD=9的种子发酵液;
将粒径为2.0~5.0mm的虾壳废弃物粉25g、磷酸二氢钾0.3g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、氯化钠0.5g/L和100mL水配制为发酵培养基;即:虾壳废弃物粉与发酵培养基中所用水的料液比为1:4,121℃湿热灭菌20分钟,冷却至室温后加入在660nm波长下OD=9的种子发酵液,其中种子发酵液的用量按每克虾壳废弃物粉中接种1mL种子发酵液计算;将上述发酵体系在发酵温度40℃,220rpm震荡培养5d,得到发酵液。将发酵液在12000rpm离心30min,固液分离,清洗后得到第一上清液和第一沉淀物。将第一沉淀物经过初步干燥后,以料液比(g/mL)1:2加入50%(v/v)的乳酸溶液,室温搅拌反应至无气泡产生时,再加入数滴乳酸溶液,静置10分钟后,抽滤,使固液分离,得到第二上清液和第二沉淀物。将第二上清液进行蒸发结晶得到乳酸钙固体成品。
对制得的乳酸钙固体成品使用傅里叶变换红外光谱检测其阴离子官能团,确定制备的乳酸钙晶体成分。取10mg乳酸钙晶体样品与20mg溴化钾粉末,于玛瑙研钵中研磨成粒度在2μm以下混合均匀的粉末,装入模具,在油压机上压制成片。使用傅里叶变换红外光谱仪进行测定,测试波数为4000~400cm-1,测试步进2cm-1。
乳酸钙晶体傅里叶变换红外光谱测试结果如图4所示,与商品乳酸钙相比,来源于虾壳废弃物的乳酸钙晶体的3000~3500cm-1峰表示O-H拉伸较宽;而碳氢键(2950cm-1的吸收峰,1300~1400cm-1的结合峰)、羧基(包括1592cm-1与1430cm-1的峰)和其他吸收峰与商业来源的乳酸钙几乎是相同的,可以认为从虾壳废弃物中制备的乳酸钙有机阴离子官能团结构类似于商业乳酸钙。
对制得的乳酸钙晶体成品参考国家标准《食品中多元素的测定(GB5009.268-2016)》中相关方法,使用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)检测其中的钙元素含量,在测试过程中对部分参数进行了改进。将制备得到的乳酸钙晶体成品0.0429g溶于1mol/L盐酸溶液中,定容至10.00mL,上机测试。电感耦合等离子体发射光谱仪条件设置为:功率1200W,等离子载气流量15L/min,辅助气流量1.5L/min,雾化气气体流量0.75L/min,使用检测波长为317.9nm,采用垂直观测模式。
经过计算,虾壳废弃物矿物质回收率为91.52%(以钙离子计),绝大部分矿物质转化为乳酸钙固体。
实施例5:链霉菌固态发酵处理虾壳生产几丁质及其分析
将实施例4制备得到的第二沉淀物干燥,即为几丁质,几丁质回收率为99.89%。
对几丁质使用1M NaOH溶液于90℃处理3h,离心,取上清液使用(GB 5009.5-2016)食品安全国家标准食品中蛋白质的测定-凯氏定氮法测定蛋白质浓度,几丁质脱蛋白率(%)=(几丁质质量-蛋白质质量)/几丁质质量×100%。测得几丁质的脱蛋白率为99.98%;
用1mol/L盐酸溶液40℃处理几丁质6h除去矿物质,干燥后测量失重,可测得几丁质的脱矿率。几丁质脱矿率(%)=(几丁质质量-失重)/几丁质质量;经测定几丁质脱矿率为99.90%。
采用《GB 29941-2013食品安全国家标准食品添加剂脱乙酰甲壳素(壳聚糖)》测定所得几丁质的脱乙酰度,测得其脱乙酰度为9.5%,表明第二沉淀物绝大部分为几丁质。脱乙酰度低的几丁质可以进一步制成脱乙酰度低的几丁寡糖,脱乙酰度低的几丁寡糖具有优秀的抗肿瘤、免疫激活等活性,在医药保健行业具有广阔的应用前景。
对制得的几丁质成品使用傅里叶变换红外光谱检测其官能团。取10mg几丁质样品与20mg溴化钾粉末,于玛瑙研钵中研磨成粒度在2μm以下混合均匀的粉末,装入模具,在油压机上压制成片。使用傅里叶变换红外光谱仪进行测定,测试波数为4000~400cm-1,测试步进2cm-1。
几丁质傅里叶变换红外光谱测试结果如图5所示,几丁质的吸收峰分别位于3449cm-1和3271cm-1处,分别表示O-H和N-H的拉伸振动,在1664cm-1和1625cm-1处的吸收峰对应于酰胺键I,而1559cm-1对应于酰胺键II,这与α-几丁质的典型性质有关。896~1154cm-1峰和1658cm-1峰分别对应几丁质β-糖苷键的C-O-C伸长和C=O伸长。在1658cm-1处,虾壳废弃物固态发酵来源的几丁质的峰值低于商品几丁质,表明处理过程中发生的去乙酰化较少。因此本实施例制得的几丁质可以认为是一种结构完整的,生物活性高的几丁质。
X射线衍射光谱仪用于检测几丁质的结晶度,测量范围2θ为5~60°,扫描速度为5°/min,结果如图6所示。
选取2θ=9.2°、12.7°、19.1°、23.2°、26.1°为结晶区,使用MDI JADE 6对X射线衍射光谱进行分析发现,通过固态发酵法得到的几丁质的结晶度为65.88%,低于商品化几丁质(购于上海生工生物科技有限公司)的结晶度(结晶度为88.06%),本实施例制得的几丁质的结晶度低的结果表明该几丁质产品更容易加工成几丁寡糖或其他产品,是优良绿色的原料。
本发明实施例的虾壳废弃物经固态发酵得到的回收产物游离氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的实物图如图7所示,虾壳废弃物经固态发酵制备游离氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的流程图如图8所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种利用链霉菌固态发酵处理虾壳废弃物生产氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)向含有虾壳废弃物的发酵培养基中接种链霉菌种子发酵液,培养,得到发酵液,将发酵液固液分离得到第一上清液和第一沉淀物;
(2)将第一上清液中进行膜分离,得到氨基酸产物和膜分离残液;将膜分离残液通过有机醇提取,离心,干燥,即得寡肽产物;
(3)向第一沉淀物中加入乳酸溶液,固液分离后即得第二上清液和第二沉淀物;
(4)将第二沉淀物干燥,即得几丁质产物;将第二上清液蒸发结晶,即得乳酸钙;
步骤(1)中所述的链霉菌为链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1,其保藏编号为GDMCCNo:60612,该菌株于2019年3月20日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心;
步骤(1)中所述的发酵培养基含有水,所述的虾壳废弃物粉与发酵培养基中所用水的料液比为1:4;
步骤(1)中所述的虾壳废弃物为虾壳废弃物粉,所述的虾壳废弃物粉的粒径为2.0~5.0mm;
步骤(1)中所述的培养的条件为:40℃,培养5 d。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,
步骤(1)中所述的培养的条件为:40℃、220 rpm震荡培养5 d。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,
步骤(1)中所述的含有虾壳废弃物的发酵培养基的组分为:虾壳废弃物、磷酸二氢钾0.3g/L、磷酸氢二钾0.4g/L、氯化钠0.5g/L和水。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中所述的链霉菌种子发酵液为在波长660nm下,OD值等于7~10的链霉菌种子发酵液;
所述的链霉菌种子发酵液通过将链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1孢子接种于培养基中培养,得到;
所述的培养基为LB培养基、高氏一号培养基、TB培养基、ISP-1培养基、ISP-2培养基、ISP-3培养基、ISP-4培养基及其改良培养基中的至少一种;
所述的培养的条件为:pH=7.2、40℃培养4~48 h。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,
步骤(1)中所述的虾壳废弃物包括十足目、口足目、磷虾目甲壳纲动物中的至少一种;
步骤(1)中所述的发酵液固液分离的方法为离心;所述的离心的条件为10000~14000rpm离心20~40 min;
步骤(2)中所述的离心的条件为10000~14000rpm,1~3min;
步骤(2)中所述的膜分离为用超滤管对第一上清液进行分离;
步骤(2)中所述的有机醇为乙醇;
步骤(2)中所述的有机醇的体积为膜分离残液的1~3倍;
步骤(3)中所述的乳酸溶液中乳酸的浓度为30~70%(v/v);
步骤(3)中所述的第一沉淀物与乳酸溶液按料液比1:1~3计算;
步骤(3)中所述的固液分离通过抽滤、离心、板框过滤、膜过滤和沉降池过滤中的至少一种方式实现。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,
步骤(1)中所述的虾壳废弃物为南美白对虾的壳;
步骤(1)中所述的离心的条件为12000rpm离心30 min;
步骤(2)中所述的离心的条件为12000rpm离心30 min;
步骤(2)中所述的膜分离为用1kDa聚醚砜膜超滤管对第一上清液进行分离;
步骤(2)中所述的有机醇为无水乙醇;
步骤(2)中所述的有机醇的体积为膜分离残液的2倍;
步骤(3)中所述的乳酸溶液中乳酸的浓度为50%(v/v);
步骤(3)中所述的第一沉淀物与乳酸溶液按料液比1:2计算;
步骤(3)中所述的固液分离通过抽滤方式实现。
7.权利要求1~6任一项所述的利用链霉菌固态发酵处理虾壳废弃物生产氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质的方法在虾壳废弃物资源化处理及制备氨基酸、寡肽、乳酸钙和几丁质中的应用。
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