CN102586378A - 一种从发酵虾头壳中提取物质的方法 - Google Patents

Abstract

一种微生物从虾头中提取虾青素、蛋白质、乳酸钙和甲壳素的方法，是利用嗜热链球菌在合适的条件下进行虾头壳发酵处理后，经过离心分别收集上清液和固体沉淀。固体沉淀用乙醇浸泡，再经离心，液体部分蒸发回收有机溶剂，得虾青素；残余固体部分经干燥得甲壳素粗品；离心上清液经喷雾干燥浓缩得富含乳酸钙和氨基酸的复合蛋白肽粉；此工艺具有过程合理、无污染、原料利用完全、产品质量高等优点。

Description

一种从发酵虾头壳中提取物质的方法

技术领域

本发明涉及一种利用微生物发酵技术从虾头提取虾青素、蛋白质、乳酸钙和甲壳素的技术领域。

背景技术

虾青素，全称为3，3’-二羟基-β胡萝卜素-4，4’-酮，属于酮式类胡萝卜素，呈艳红色，为脂溶性，具有高效抗氧化、抗癌变、增强免疫及着色等功能。由于两端的羟基(-OH)旋光性原因，虾青素具有3S-3′S、3R-3′S、3R-3′R(也称为左旋、消旋、右旋)这3种异构形态。最新的药理学和生理学研究发现虾青素具有极强的生物抗氧化性，已被广泛应用于食品、医药、化妆品和饲料等的行业。经过多项人体和动物实验已证实，天然虾青素对人体和动物绝对安全。

目前虾青素的生产主要有化学合成途径、藻类、真菌和甲壳类动物四种来源。

(1)化学合成法：虾青素合成过程十分复杂，要经由多步化学和生物催化反应才能完成。人工合成虾青素为3种结构虾青素的混合物，极少抗氧化活性，与生物体内的虾青素(以反式结构3S-3S型为主)截然不同。美国食品与药物管理局(FDA)仅批准部分人工合成的虾青素用于水产养殖的添加剂，不允许任何化学合成产品进入保健食品市场。因此，化学合成的虾青素在多种食品、饲料、医药品及化妆品上的应用受到很大的限制。

(2)真菌：某些真菌如红发夫酵母、深红酵母等也可以合成虾青素。但据报道酵母菌源的虾青素是100％右旋(3R-3′R)，有部分抗氧化活性，酵母菌来源虾青素主要用在非食用动物和物资的着色上。此外，虽然酵母细胞繁殖速度快，生物量高，但细胞虾青素含量低，为了提高虾青素产量，需要大量提高碳源和氮源尤其是价格很高的有机氮源(酵母膏和蛋白胨等)的添加量，易造成浪费，增加成本，不利于商业化生产。

(3)藻类：虽然藻类来源的虾青素是100％左旋(3S-3′S)结构，具有最强的生物学活性，但是目前已知的这些微藻通常生长速度都比较慢，需要较长的自养培养周期，生物量低，生长条件苛刻，对水质、环境及光的要求很高，大规模生产仍有难度。

(4)甲壳类动物：在自然界中，虾青素主要以酯的形式大量存在于水生动物(如虾及蟹)的壳内，虽然含量低，甲壳中的灰分和蛋白质也限制了虾青素的提取，但由于目前还没有找到更好的方法，且国内外的水产加工业每年有1000万吨的甲壳类废弃物，资源丰富，因此国外从虾壳中提取天然虾青素的方式仍然存在。

从甲壳类加工下脚料(虾头虾壳)中提取回收虾青素是虾青素生产的主要途径之一，关于这方面国内外均有较长的研究历史。但是，甲壳类废弃物中的石灰质(碳酸钙)会影响虾青素的产量，因此在提取时应尽量将其除去。而且虾青素在这些物质中或以游离的形式存在，或与蛋白质、脂类等结合的形式存在。因此严重的影响了虾青素的提取率。

针对虾青素与碳酸钙的结合，目前常规的方法是使用酸化处理，破坏虾壳上虾青素与碳酸钙的结合，对甲壳进行去钙化处理，才能提高虾青素的提取率。在去钙化的理论基础上，挪威海洋渔业工业发展了“青贮法”处理废弃物的技术。通过青贮过程中加入无机酸或有机酸，来破坏虾青素与蛋白质或骨骼部分的结合，从而增加虾青素的释放量。但是酸的使用一方面使得提取费用较高，而且对环境造成了极大的污染。

对于虾蟹等下脚料中与虾青素结合的蛋白质，传统的方法是使用碱溶液来脱蛋白，但是使用化学法脱蛋白同样也造成了严重的环境污染。最近，国内外有很多研究是利用蛋白酶来水解虾蛋白从而断裂色素与蛋白的结合，以提高色素回收率。酶解法虽然避免了大量碱试剂的使用，但是商品化的酶制剂成本很高，也限制了从虾蟹下脚料中提取虾青素的大规模应用。

专利【利用微生物从虾壳中提取虾青素、蛋白质及甲壳素的方法】中提出利用微生物处理虾头以提取虾青素等营养物质。但专利中所使用的方法存在不足：(1)其所使用的发酵微生物为革兰氏阴性杆菌邻单胞杆菌，该菌为一种条件致病菌，会影响产品安全性。(2)其发酵温度为37℃，该温度为大肠杆菌等致病菌的最适生长温度，极易染菌，污染发酵后产品。(3)该实验在发酵前要求对虾头灭菌，这样不仅增加成本，而且会使虾头中的内源酶失活，影响水解效率。(4)其发酵过程需要通氧，增加了生产成本，不利于大规模生产。(5)邻单胞杆菌发酵过程pH较高，甲壳中的钙无法有效回收。

因此，急需开发一种虾青素提取率高、生产成本低、便于规模化生产、绿色环保、符合国家可持续发展的政策的虾青素提取工艺。

发明内容

本发明的目的是提供一种从发酵虾头壳中提取物质的方法，以弥补现有技术的不足。

本发明的方法包括如下步骤：

(1)将虾头，清洗干净机械粉碎至2mm-10mm；

(2)将嗜热链球菌菌种接入MRS培养基(蛋白胨1.0g、牛肉膏1.0g、酵母膏0.5g、葡萄糖2.0g、磷酸氢二钾0.2g、硫酸锰0.025、柠檬酸二胺0.2g、硫酸镁0.068g、吐温800.1ml、蒸馏水100ml)，在37℃-45℃下，活化15h-65h。

(3)将活化好的菌悬液以1-20％的接种量，接入未灭菌的虾头料中，加入0.1-20％葡萄糖和固液比1∶0.1-20的蒸馏水。

(4)发酵降解过程中不需要通氧或搅拌，在30-45℃下发酵12-72h。

(5)发酵结束后将(4)中的发酵液经2000-10000r/min离心和/或过滤分离成发酵上清液和沉淀固体。

(6)虾头发酵液上清液部分进行喷雾干燥得蛋白钙粉。

(7)虾头发酵后固体部分用乙醇以固液比1∶3-7在10-60℃下浸泡虾头0.5-10小时，离心分离。重复上述步骤2-6次，合并液体部分得虾青素提取液。虾青素提取液可经喷雾干燥得虾青素粉末得虾青素粉末。用乙醇提取后剩下的固体部分可烘干得甲壳素粗品。

本发明采用嗜热链球菌发酵虾头，嗜热链球菌是一种益生菌，有助于维持人体肠道菌群的平衡。发酵温度可控制在40℃到45℃，高温下能够控制杂菌存活率。发酵前不需要对虾头原样灭菌，这样既节省了生产成本，又可以保留虾头中的内源酶，实验表明嗜热链球菌发酵过程产生的各种蛋白酶以及虾头内的自溶酶共同作用促进了蛋白质的水解，从而提高了虾青素的提取率；而且除蛋白酶外，嗜热链球菌发酵过程可能分泌解脂酶(如脂肪酶和磷脂酶)和纤维素酶等可断开甲壳素与虾青素之间的结合，从而有利于虾青素等脂溶性物质的提取。各种酶之间往往会有协同作用，可在某种程度上达到增效的作用。该技术不需外加蛋白酶，发酵液虾香浓郁，无腥臭味和苦涩味，可方便地用于生产含钙的调味品、水解蛋白制品、保健品等各个领域。

具体实施方式

实例1：

将10g原料虾头粗粉碎至2-10cm，以1∶9固液比加入水，并加入10g葡萄糖。将在脱脂奶粉培养液中活化24h的液态菌种以1％的比例接种，38℃下降解72h。将发酵液抽滤。液体部分用喷雾干燥得蛋白钙粉。固体部分使用乙醇以固液比1∶6在45℃提取虾青素45min，之后于8000r/min离心20分钟。保留液态部分将固体部分重复上述操作2次。合并液体部分。将剩余虾头残渣烘干，得甲壳素粗品。最终，获得的虾青素油含虾青素21.6μg，有机溶剂回收；获得富含乳酸钙和氨基酸的复合蛋白肽粉得0.52g；获得甲壳素粗品1.70g。

实例2：

将20g原料虾头粗粉碎至2-10cm，以2∶8固液比加入水，并加入15g葡萄糖。其他操作同实例1。最终，获得的虾青素油含虾青素15.7μg，有机溶剂回收；获得富含乳酸钙和氨基酸的复合蛋白肽粉得0.59g；获得甲壳素粗品1.78g。

实例3：

原料、加水比例及葡萄糖量同实例1。菌种活化24h，5％接种。降解时间72h，其他操作同实例1。最终，获得的虾青素油含虾青素18.9μg，有机溶剂回收；获得富含乳酸钙和氨基酸的复合蛋白肽粉得0.64g；获得甲壳素粗品1.97g。

实例4：

原料、加水比例及葡萄糖量同实例1。菌种活化24h，9％接种。降解时间48h，其他操作同实例1。最终，获得的虾青素油含虾青素15.39μg，有机溶剂回收；获得富含乳酸钙和氨基酸的复合蛋白肽粉得0.32g；获得甲壳素粗品1.26g。

实例5：

将30g原料虾头粗粉碎至2-10cm，以3∶7固液比加入水，并加入10g葡萄糖。其他操作同实例1。最终，获得的虾青素油含虾青素16.7μg，有机溶剂回收；获得富含乳酸钙和氨基酸的复合蛋白肽粉得0.55g；获得甲壳素粗品1.48g。

实例6：

降解工艺同实例1，降解结束后将发酵后固体部分浸泡在乙醇以中提取虾青素。固液比1∶3。在30℃下浸泡1h.重复上述操作2次。其他操作同实例1。乙醇提得虾青素13.70μg。蛋白钙粉得0.52g。甲壳素粗品得1.803g。

实例7：

降解工艺同实例1，降解结束后将发酵后固体部分浸泡在乙醇以中提取虾青素。固液比1∶9。在60℃下浸泡1h.重复上述操作2次。其他操作同实例1。乙醇提得虾青素21.70μg。富含乳酸钙和氨基酸的复合蛋白肽粉得0.52g。甲壳素粗品得1.63g。

Claims (7)

1.一种利用微生物从虾头中提取虾青素、蛋白质、乳酸钙和甲壳素的方法，其特征在于是利用嗜热链球菌在合适的条件下进行虾头壳发酵处理后，将发酵上清液和固体残渣分开。固体残渣用乙醇浸泡，再经离心，液体部分蒸发回收有机溶剂，得虾青素；残余固体部分经干燥得甲壳素粗品；离心上清液经喷雾干燥浓缩得富含乳酸钙和氨基酸的复合蛋白肽粉。

2.如权利要求1所述的利用嗜热链球菌在合适的条件下进行虾头壳发酵处理，其特征在于将活化好的嗜热链球菌悬液以1-20％的接种量，接入未灭菌的虾头壳中，加入0.1-20％葡萄糖和固液比1∶0.1-20的蒸馏水。

3.如权利要求1所述的利用嗜热链球菌在合适的条件下进行虾头壳发酵处理，其特征在于发酵过程中不需要通氧或搅拌，在30-45℃下发酵12-72h。

4.如权利要求1所述的将发酵上清液和固体残渣分开，其特征在于发酵液通过2000-10000r/min离心和/或过滤的方式发酵上清液和固体残渣分离开。

5.如权利要求1所述的虾青素，其特征在于虾头壳发酵后固体残渣部分用乙醇以固液比1∶3-7在10-60℃下浸泡虾头0.5-10小时，离心分离。重复上述步骤2-6次，合并液体部分得虾青素提取液。虾青素提取液可经喷雾干燥得虾青素粉末。

6.如权利要求1所述的复合蛋白肽粉，其特征在于虾头发酵液上清液部分进行喷雾干燥得富含乳酸钙和氨基酸的复合蛋白肽粉。

7.如权利要求1所述的甲壳素，其特征在于用乙醇提取后剩下的固体部分可烘干得甲壳素粗品。