CN109053237A - 一种含甲壳寡糖天然植物叶面肥的制备方法 - Google Patents

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    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
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    • C05G5/00—Fertilisers characterised by their form
    • C05G5/20—Liquid fertilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F1/00—Fertilisers made from animal corpses, or parts thereof
    • C05F1/005—Fertilisers made from animal corpses, or parts thereof from meat-wastes or from other wastes of animal origin, e.g. skins, hair, hoofs, feathers, blood

Abstract

本发明公开了一种含甲壳寡糖天然植物叶面肥的制备方法。该方法使用重组枯草芽孢杆菌发酵虾头等甲壳类加工副产物，同时将发酵液与黄芪、蒲公英等中草药材提取物进行复配，得到可应用于作物生长中的叶面肥。本发明相较于化学法与酶解法，成本低、设备简单、绿色环保，便于工业化成产和推广应用，可弥补现有技术的不足。

Description

一种含甲壳寡糖天然植物叶面肥的制备方法
技术领域
本发明属于叶面肥技术领域，具体涉及一种含甲壳寡糖天然植物叶面肥的制备方法。
背景技术
甲壳寡糖和壳寡糖是甲壳素或壳聚糖降解产生的低聚糖，具有水溶性好、生物活性高、功能作用强等特点。甲壳寡糖与壳寡糖结构类似，将壳寡糖单体的氨基换成乙酰氨基即为甲壳寡糖，因此两者在很多方面具有相似的理化性质和生理活性。甲壳寡糖与壳寡糖在农业方面有广泛的应用，能显著增强植物抗病性、促进植物生长、改善农产品品质、延长果实保鲜期，是一种绿色安全的生物农药与生物肥料。
现阶段甲壳寡糖与壳寡糖的生产方法主要为化学法和酶解法。化学法利用强酸高温环境断裂甲壳素或壳聚糖组成单元之间的化学键，从而得到聚合度降低的低聚糖。化学法对设备要求较高，同时大量使用强酸容易造成环境污染，且由于降解过程是随机过程，产物聚合度难以控制。酶解法是利用甲壳素酶降解甲壳素或壳聚糖酶降解壳聚糖，从而得到具有一定聚合度的甲壳寡糖或壳寡糖，但酶解法需要以纯度较高的甲壳素或壳聚糖为底物，同时商品化的甲壳素酶与壳聚糖酶价格较高，导致酶解制备过程成本太高，使甲壳寡糖或壳寡糖产品价格居高不下，影响了甲壳寡糖及壳寡糖的推广应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含甲壳寡糖天然植物叶面肥的制备方法。
一种含甲壳寡糖天然植物叶面肥的制备方法，按照如下步骤进行：
1)设计引物从白长链霉菌(Streptomyces albus)中克隆甲壳素酶基因saChiA4，将其连接至线性化的pP43NMK质粒上，得到重组质粒pP43NMK::saChiA4；
2)制作枯草芽孢杆菌感受态细胞，将重组质粒转化入枯草芽孢杆菌感受态细胞中，得到重组枯草芽孢杆菌菌株B.S.saChiA4；
3)将虾头加水粉碎制成虾头匀浆液，置于发酵罐中，于121℃灭菌15-25min；
4)接种枯草芽孢杆菌B.S.saChiA4种子液于虾头匀浆液中，进行发酵处理，发酵完毕离心，取上清液备用；
5)取黄芪、蒲公英、甘草、桃仁、百合和红花，粉碎浸提，取浸提液离心，离心上清液备用；
6)将发酵上清液与浸提上清液混合，混合液于121℃灭菌15-25min，所得溶液即为天然植物叶面肥母液。
步骤1)中，甲壳素酶基因saChiA4连接至pP43NMK质粒上使用双酶切连接法或无缝拼接法。
步骤2)中，枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法及质粒转化方法采用Spizizen枯草芽孢杆菌DNA转化方法。
步骤3)中，虾头匀浆液的浓度为5％-50％。
步骤4)中，枯草芽孢杆菌种子液的接种量为1％-20％。
步骤4)中，发酵条件为温度25-40℃，搅拌转速50-500rpm，通气量0.5-2vvm，发酵时间3-5天。
步骤5)中，黄芪、蒲公英、甘草、桃仁、百合与红花的质量比为(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2)，浸提固液比为1:2-1:10，浸提温度50-70℃，浸提时间5-10h。
步骤6)中，发酵上清液与浸提上清液的混合比为(1-5):1。
本发明的有益效果：本发明利用可以产生高活性甲壳素酶的重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株直接以虾头、虾壳等甲壳类加工副产物为底物进行发酵转化，生产含有甲壳寡糖的发酵产物，经与天然植物提取物复配可作为叶面肥用于农业生产中。相较于化学法与酶解法，本方法成本低、设备简单、绿色环保，便于工业化成产和推广应用，可弥补现有技术的不足。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
本发明使用重组枯草芽孢杆菌发酵虾头等甲壳类加工副产物，同时将发酵液与黄芪、蒲公英等中草药材提取物进行复配，得到可应用于作物生长中的叶面肥。上述使用的虾头为南美白对虾、中国对虾、日本沼虾等常见食用虾类的加工或食用副产物。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)可购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CGMCC1.372。也可以是从其它途径获得，具有相同或类似代谢功能的菌株。白长链霉菌(Streptomyces albus)可购于美国典型菌种保藏中心，菌种编号为ATCC 27414。
实施例1甲壳素酶基因saChiA4的克隆及质粒pP43NMK::saChiA4构建
设计引物5’-CCGGAATTCATGGAACGCGTACTACCC-3’和5’-CCCAAGCTTGCAGGCGCCGTTGTCCGC-3’，提取白长链霉菌基因组作为模板，进行PCR扩增。扩增获得目的片段后，使用无缝拼接试剂盒将目的片段与线性化的pP43NMK质粒进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并均匀涂布于带有氨苄抗性(100μg/ml)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单菌落，并进行菌落PCR验证，验证成功的单菌落即含有质粒pP43NMK::saChiA4。
实施例2含有甲壳素酶基因saChiA4的重组枯草芽孢杆菌制备
取枯草芽孢杆菌涂布LB平板，挑取长势好的单菌落，接于LB培养基中37℃培养10h，取100μL菌体，使用Spizizen法制备枯草芽孢感受态细胞。将质粒pP43NMK::saChiA4电击转化入枯草芽孢杆菌感受态细胞中，并均匀涂布带有卡那抗性(50ug/ml)的LB平板上，37℃培养10h。挑取单菌落进行菌落PCR验证，验证正确的枯草芽孢杆菌即为含有甲壳素酶saChiA4的重组枯草芽孢杆菌B.S.saChiA4。
实施例3使用重组枯草芽孢杆菌发酵虾头
取1kg虾头匀浆，加3kg水灭菌，置于5L发酵罐中121℃灭菌20min。冷却至室温后，以5％接种量接种LB培养基培养的重组枯草芽孢杆菌B.S.saChiA4种子液。发酵罐控制温度37℃、搅拌转速300rpm、通气量0.5vvm发酵5天。发酵结束将发酵液于8000rpm离心10min，取发酵液离心上清。上清检测甲壳寡糖浓度为15.9g/L。
实施例4使用野生枯草芽孢杆菌发酵虾头
取1kg虾头匀浆，加3kg水灭菌，置于5L发酵罐中121℃灭菌20min。冷却至室温后，以5％接种量接种LB培养基培养的野生枯草芽孢杆菌CGMCC1.372种子液。发酵罐控制温度37℃、搅拌转速300rpm、通气量0.5vvm发酵5天。发酵结束将发酵液于8000rpm离心10min，取发酵液离心上清。上清检测甲壳寡糖浓度为3.8g/L。
实施例5植物原料浸提
取黄芪、蒲公英、甘草、桃仁、百合与红花各100g，粉碎并加入5kg水，70℃浸提时间9h。浸提完毕离心，取离心上清液备用。
实施例6植物原料浸提
将实施例3制备的发酵上清液与和实施例5制备的浸提上清液混合，混合液于121℃灭菌20min，所得溶液即为天然植物叶面肥母液。
实施例7重组枯草芽孢杆菌虾头发酵液在番茄抗病中的应用
在番茄成株期，选用长势均一的健壮植株，取实施例3中的发酵上清液，稀释500倍，喷洒植株叶片。24h后将孢子浓度为105个/mL的白粉菌孢子液喷洒至植株叶片上，对照组将稀释的发酵液换成清水进行喷洒。喷洒完毕继续培养，对照组12天时叶片杯面密生肉眼可见的白色粉状孢子，发酵上清液处理的植株18天才开始出现。21天时待对照组植株发病充分时统计病情指数，发酵上清液处理的病情指数仅为5.69，对照组达35.27。
实施例8叶面肥在丝瓜生长中的应用
取实施例3中的发酵上清液1mL稀释至500mL作为样液1，取实施例3中的发酵上清液1mL与实施例5中的植物原料浸提上清液1mL混匀，稀释至500mL作为样液2。将丝瓜幼苗盆栽，长至两叶一心时分别使用样液1和样液2进行第1次叶面喷施处理，7天后进行第二次叶面喷施处理，对照组喷洒清水。处理后第21天测定样液1实验组、样液2实验组和对照组生长指标及叶绿素含量。经测定，样液1实验组平均株高为23.3cm，样液2实验组平均株高为27.9cm，对照组平均株高为17.9cm；样液1实验组功能叶面积51.6cm2，样液2实验组功能叶面积60.2cm2，对照组功能叶面积39.2cm2；样液1实验组平均根长22.9cm，样液2实验组平均根长29.3cm，对照组平均根长12.8cm；样液1实验组叶片叶绿素含量为2.2mg/g，样液2实验组叶片叶绿素含量为2.7mg/g，对照组叶片叶绿素含量为1.5mg/g。可以看出，与对照组相比，发酵液上清可显著促进丝瓜植株的生长及增加叶片叶绿素含量，发酵液上清与植物原料浸提液的混合叶面肥效果更佳。
取黄芪、蒲公英、甘草、桃仁、百合、红花与假丝带藓(Floribundariapseudofloribunda fleisch)各100g，粉碎并加入5kg水，70℃浸提时间9h。浸提完毕离心，取离心上清液备用。取上述上清液1mL与实施例3中的发酵上清液1mL混匀，稀释至500mL作为样液3，将丝瓜幼苗盆栽，长至两叶一心时使用样液3进行第1次叶面喷施处理，7天后进行第二次叶面喷施处理。处理后第21天测定样液3实验组生长指标及叶绿素含量。样液3实验组平均株高为32.7cm，样液3实验组功能叶面积71.3cm2，样液3实验组平均根长33.7cm，样液3实验组叶片叶绿素含量为3.5mg/g，显著高于样液2实验组。

Claims (8)

1.一种含甲壳寡糖天然植物叶面肥的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
1)设计引物从白长链霉菌中克隆甲壳素酶基因saChiA4，将其连接至线性化的pP43NMK质粒上，得到重组质粒pP43NMK::saChiA4；
2)制作枯草芽孢杆菌感受态细胞，将重组质粒转化入枯草芽孢杆菌感受态细胞中，得到重组枯草芽孢杆菌菌株B.S.saChiA4；
3)将虾头加水粉碎制成虾头匀浆液，置于发酵罐中，于121℃灭菌15-25min；
4)接种枯草芽孢杆菌B.S.saChiA4种子液于虾头匀浆液中，进行发酵处理，发酵完毕离心，取上清液备用；
5)取黄芪、蒲公英、甘草、桃仁、百合和红花，粉碎浸提，取浸提液离心，离心上清液备用；
6)将发酵上清液与浸提上清液混合，混合液于121℃灭菌15-25min，所得溶液即为天然植物叶面肥母液。
2.根据权利要求1所述含甲壳寡糖天然植物叶面肥的制备方法，其特征在于，步骤1)中，甲壳素酶基因saChiA4连接至pP43NMK质粒上使用双酶切连接法或无缝拼接法。
3.根据权利要求1所述含甲壳寡糖天然植物叶面肥的制备方法，其特征在于，步骤2)中，枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法及质粒转化方法采用Spizizen枯草芽孢杆菌DNA转化方法。
4.根据权利要求1所述含甲壳寡糖天然植物叶面肥的制备方法，其特征在于，步骤3)中，虾头匀浆液的浓度为5％-50％。
5.根据权利要求1所述含甲壳寡糖天然植物叶面肥的制备方法，其特征在于，步骤4)中，枯草芽孢杆菌种子液的接种量为1％-20％。
6.根据权利要求1所述含甲壳寡糖天然植物叶面肥的制备方法，其特征在于，步骤4)中，发酵条件为温度25-40℃，搅拌转速50-500rpm，通气量0.5-2vvm，发酵时间3-5天。
7.根据权利要求1所述含甲壳寡糖天然植物叶面肥的制备方法，其特征在于，步骤5)中，黄芪、蒲公英、甘草、桃仁、百合与红花的质量比为(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2)，浸提固液比为1:2-1:10，浸提温度50-70℃，浸提时间5-10h。
8.根据权利要求1所述含甲壳寡糖天然植物叶面肥的制备方法，其特征在于，步骤6)中，发酵上清液与浸提上清液的混合比为(1-5):1。
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