CN107760631B - 一种甲基营养型芽孢杆菌b18及其颗粒剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)B18及其颗粒剂和应用，该菌株已经于2017年9月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.14641。本发明还提供了甲基营养型芽孢杆菌B18颗粒剂，按重量百分含量包括：种子发酵液10％，固态发酵制剂15％，粘合剂15％，载体补足100％。本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌B18及其颗粒剂对杜仲根腐病有特效，适宜于商品化生产，对环境亲和性好，具有可持续、成本低的特点。

Description

一种甲基营养型芽孢杆菌B18及其颗粒剂和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种甲基营养型芽孢杆菌B18菌株及其颗粒剂和在杜仲根腐病防治上的应用。

背景技术

杜仲，属于杜仲科杜仲属多年生落叶乔木，该科仅有1属1种植物，是我国仅存的第三纪孑遗植物，属国家二级保护名贵经济树种，还是我国特产树种和著名药材。杜仲有近千年的栽培历史，实用型极强，在我国亚热带至温带的27个省均可种植，主要产于四川、云南、贵州、湖南、湖北、陕西、江苏及浙江等省。杜仲被列为贵州地道中药材GAP基地示范品种之一。它全身都是宝，用途广泛，具有极大的药用价值和经济价值。杜仲被成为神奇之树，其叶、雄花、果实和树皮都含有许多人体不可缺少的活性物质，这些活性物质具有十分独特的医疗保健功能，在促进体内胶原蛋白的合成、抗衰老、降血压、抗疲劳、人体免疫调节、预防细胞癌变、降低血脂和胆固醇、治疗心脑血管疾病，补肝肾等方面有独特的功效，并且无毒副作用树皮可以入药，有滋补肝肾、强健筋骨、治疗腰膝痛和高血压等功效。树皮、叶和果实还能提取杜仲胶(又名硬橡胶)，可代替橡胶用，是世界上十分珍贵的优质天然橡胶资源。还可以加工成各种优质饮料。另外，杜仲的木材纹理直行、结构细致，不翘不裂，是制造家具和其他木制品的优质材料。目前国内外市场需求量大，皮、叶价格逐渐上涨。

在杜仲苗期，根腐病发生尤为严重。初期支根和须根感病，逐渐向主根扩展。主根早期不表现症状，后随着腐烂程度的加剧，吸收水分和养分的功能逐渐减弱，地上部分新叶首先发黄，地下部分发黑腐烂。病情严重时，整株叶片发黄、枯萎，根皮变褐，并与髓部分离，最后全株死亡。目前，在该病防治手段上主要以土壤消毒、营林措施、化学防治为主，但化学农药对环境污染较大，且易残留；对人畜安全、环境友好的生物防治并未涉及。这项技术是利用生态平衡原理，引进有益微生物或其产物，达到稳定、长期、有效控制病害的目的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在防治杜仲根腐病中的缺陷，提供了甲基营养型芽孢杆菌B18菌株及其颗粒剂的制作方法和在杜仲根腐病中的应用。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)B18菌株于2016年11月20日采用平板稀释涂布法分离于四川大邑仰天窝药场健康杜仲树皮，已经于2017年9月18日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.14641。

本发明甲基营养型芽孢杆菌B18在NA平板培养基上培养了2d的单菌落呈白色，圆形，边缘不整齐，表面干燥，有褶皱，无粘性，不透明。

本发明甲基营养型芽孢杆菌B18的16S rDNA的序列为：SEQ ID NO:1。

本发明以甲基营养型芽孢杆菌B18为活性成分的颗粒剂，按重量百分比包括以下组分：种子发酵液10％，固态发酵制剂15％，粘合剂0.3％羧甲基纤维素钠15％，载体草木灰补足100％，所述的种子发酵液和固态发酵制剂均是通过以甲基营养型芽孢杆菌B18为菌种，经种子培养、发酵培养得到。

本发明所述的以甲基营养型芽孢杆菌B18为活性成分的颗粒剂中含活芽孢数不低于1×10⁸cfu/g。

本发明还提供了以甲基营养型芽孢杆菌B18为活性成分的颗粒剂的制备方法，具体包括以下步骤：

1)一级斜面种子：制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种甲基营养性芽孢杆菌后，培养制成一级种子；

2)二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下盛于三角瓶，在无菌状态接种甲基营养性芽孢杆菌斜面种子，振荡培养，制成甲基营养型芽孢杆菌液体种子；

3)种子发酵液：液体发酵培养基经高压灭菌后，在通氧控制下盛于三角瓶，在无菌状态接种甲基营养型芽孢杆菌二级液体种子，接种量为总体积的10％，振荡培养，制成甲基营养型芽孢杆菌液体制剂；

4)固态发酵制剂：固态发酵培养基经高压灭菌后，在通氧控制下装入广角瓶，在无菌状态接种甲基营养型芽孢杆菌二级液体种子，以总体积15％的接种量于培养基中，搅拌均匀，培养，制成甲基营养性芽孢杆菌固体制剂；

5)颗粒剂：将得到的液体制剂和固体制剂与载体、粘合剂按比例混合，待发酵产物外裹一层粘合膜后，充分搅拌将混合物拌散即得颗粒剂，然后保存。

所述的牛肉膏蛋白胨斜面培养基为：牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCL 5g，琼脂18g，水1000mL。

所述的营养肉质培养液为：牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL。

所述的液体发酵培养基为：甘油5g、糊精5g、黄豆饼粉5g、草酸铵10g、氯化钠2g、碳酸钙3g、水1000mL。

所述的固态发酵培养基为：米糠15g，麦麸15g，豆粕7.5g，玉米渣10g，可溶性淀粉5g，黄豆饼粉13g。

本发明所述的甲基营养型芽孢杆菌B18在防治杜仲根腐病中的应用，当然本发明所述的甲基营养型芽孢杆菌B18的菌悬液或次级代谢产物在防治杜仲根腐病中的应用也在本发明的保护范围内。

本发明以甲基营养型芽孢杆菌B18为活性成分的颗粒剂在防治杜仲根腐病中的应用，在未发病杜仲林地用颗粒剂在根系周围土壤均匀撒施，50g/m²，春季施用一次，可预防根腐病的发生；发病杜仲林地用颗粒剂在根系周围土壤均匀撒施，75g/m²，春、秋各一次。

本发明的有意效果为：

本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌B18从杜仲树皮中分离得到，且具有抗逆性，贮藏性好，抗高温、低温、耐干燥，适宜于商品化生产的特点，本发明甲基营养型芽孢杆菌B18对杜仲根腐病菌具有很好的拮抗作用，抑制率达到96.72％，将甲基营养型芽孢杆菌B18制成颗粒剂经过田间防治实验也表现出了良好的防治效果，相比化学农药，具有无污染、可持续、成本低的优点，适合大规模的推广使用。

附图说明

图1是本发明甲基营养型芽孢杆菌B18rDNA-ITS序列PCR扩增产物电泳图；

图2是基于16S rDNA序列构建的菌株B18的系统发育树。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明技术方案作进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本发明的保护范围内。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1甲基营养型芽孢杆菌B18的分离与鉴定

1.1甲基营养型芽孢杆菌B18的分离

在四川大邑仰天窝药场黄柏烂皮病发生区取健康黄柏树皮。采回的样本用无菌水冲洗干净，称取1.0g组织，在70％的酒精中浸泡1-2min，再用1-3％次氯酸钠溶液消毒3-5min，无菌水洗涤若干遍后，吸取最后一次洗涤液100μL涂抹NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，27℃黑暗培养24h，用于表面消毒的对照，检查表面消毒是否彻底。

将已表面消毒的树皮组织剪碎，放入无菌的研钵，加入灭菌的石英砂和10mL无菌水，充分研磨，静置30min，稀释10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5共5个梯度，分别吸取100μL 10^-3，10^-4，10^-5这3个梯度研磨液分别涂布NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，每个处理3次重复，27℃培养48h，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入初筛。

依据菌落的大小、颜色、是否突起，边缘特征、表面光滑与否、透明度等方面的差异，挑取单菌落在NA平板上划线纯化，纯化后转接NA斜面于4℃保藏备用。共获31个内生细菌。

1.2内生细菌对杜仲根腐病病菌的平板拮抗作用

平板对峙法：在培养皿中央接种7d的杜仲根腐病菌(Pythium debaryanum)菌饼(直径6mm)，离该病菌饼约3cm处，分别用接种环沾取培养2d的内生菌，在病菌对称两侧各划一条细线，27℃培养，以只接种病菌的平板为对照，待对照长满皿时测量病菌的菌落生长直径，每处理重复3次。按下式计算菌落生长抑制率：

菌落生长抑制率＝(对照菌落净生长直径－处理菌落净生长直径)/对照菌落净生长直径×100％。

表1内生细菌对杜仲根腐病病菌的拮抗作用

结果如表1所示，分离得到的内生细菌中对杜仲根腐病菌(Pythium debaryanum)有较好拮抗作用的菌株，其中B18的抑制率达到96.72％。

1.3内生拮抗菌的种类鉴定

经形态学观察，结合生理生化指标(表2)和分子生物学鉴定该内生菌B18为甲基营养型芽孢杆菌。

表2菌株B18生理生化指标

在NA平板培养基上培养了2d的B18菌株的单菌落白色，呈圆形，边缘不整齐，表面干燥，有褶皱，无粘性，不透明。

分子生物学鉴定(16S rDNA)：通过提取细菌DNA进行PCR扩增及电泳，回收产物送至生物技术公司测序；将所测序列与GenBank数据库中已经报道的序列进行同源性BLAST分析，并用Clustalx(1.83)软件进行多重序列比较，再用Mega4.0软件中的邻接法构建系统发育树，确定B18菌株在微生物系统发育学上的地位。分子生物学鉴定得到长度为959bp的DNA片段(图1)，将B18菌株的16S rDNA序列递交GenBank数据库进行BLAST分析，选取其中与之同源性较高的细菌16S rDNA序列，并用Clustalx软件进行多重匹配排列分析，用Mega分析软件构建系统发育树(图2)。可以看出，B18菌株与HQ662592和KC790268以99％的16SrRNA基因核苷酸序列相似性和较高的自展值支持聚为1个分支，而与其他芽孢杆菌相距较远，表明B18与Bacillus methylotrophicus的亲缘关系最近。

基于以上特征，本发明分离得到的B18菌种其分类命名为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)B18，已于2017年9月18日保存在中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14641。

实施例2甲基营养型芽孢杆菌B18颗粒剂的制作

营养肉质培养液(牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCL 5g，水1000mL)经高压灭菌后，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例(通氧控制)装瓶，在无菌状态接种B18斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度27℃，初始pH值7.0，120r/min振荡培养48h，制成B18发酵液。

液体发酵培养基(甘油5g、糊精5g、黄豆饼粉5g、草酸铵10g、氯化钠2g、碳酸钙3g、水1000mL)经高压灭菌后，在通氧控制下，按200mL液体盛于500mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态接种甲基营养型芽孢杆菌二级液体种子，接种量为10％，温度27℃，初始pH值7.0，120r/min振荡培养48h，制成甲基营养型芽孢杆菌液体制剂。

固态发酵培养基(米糠15g，麦麸15g，豆粕7.5g，玉米渣10g，可溶性淀粉5g，黄豆饼粉13g)经高压灭菌后，在通氧控制下，装入250mL广角瓶，在无菌状态接种甲基营养型芽孢杆菌二级液体种子，以15％的接种量于培养基中，搅拌均匀，27℃培养，制成甲基营养性芽孢杆菌固体制剂。

按照质量分数种子发酵液10％、固态发酵制剂15％与粘合剂0.3％羧甲基纤维素钠15％、载体草木灰补足100％混合，待发酵产物外裹一层粘合膜后，充分搅拌将混合物拌散即得颗粒剂，袋装干燥常温保存1年或低温(4度)2年不影响预防和治疗效果。

该方法本制备得到的以甲基营养型芽孢杆菌B18为活性成分的颗粒剂中含活芽孢数不低于1×10⁸cfu/g。

实施例3盆栽防效实验

选取一年生盆栽杜仲实生苗为实验对象，PDA斜面杜仲根腐病菌(Pythiumdebaryanum)分生孢子(孢子浓度为2×10⁶cfu/mL)50mL接种根系一周后，用实施例2制得的颗粒剂采用撒施法分不同用量对杜仲苗进行处理，每盆25、50、75、100、125、150g，每7天撒施1次(共3次)，并以无菌水作对照，重复3次，统计杜仲发病情况。每处理杜仲苗10株。

病原菌接种30d后，按照表3中病害分级标准进行病害调查统计，并计算发病率，病情指数和防治效果。

表3杜仲根腐病病害分级标准

发病率(％)＝(发病株数/总接种株数)×100；

病情指数＝[Σ(各病级株数×代表级值)/(总株数×最高病级数)]×100；

防治效果(％)＝[(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数]×100。

表4是B18内生细菌在盆栽试验30d后的防治效果，接种病原菌30d后，生防菌B18颗粒剂对杜仲根腐病菌表现出良好的保护效果。不同用量的颗粒剂表现的发病率和防治效果有所差异，150g/m²可基本控制病害不发生，防效达到95.3％；50g/m²-75g/m²防效均超过60％，因此选用50、75、100、125、150g/m²用于大田试验的测定。

表4 B18内生细菌在盆栽试验30d后的防治效果

实施例4田间防治实验

预防处理：未发病杜仲苗圃地分别用实施例2制备的颗粒剂50、75、100、125、150g/m²在根系周围土壤均匀撒施，春季施用一次，可预防根腐病发生。

治疗处理：发病杜仲苗圃地分别用实施例2制备的颗粒剂50、75、100、125、150g/m²在根系周围土壤均匀撒施，春、秋各一次，可有效治疗根腐病发生。

表5 B18内生细菌田间预防效果：未发病杜仲苗圃(1年生)

由表5可以看出，用量在50g/m²能显著控制病害发生，与其他各处理差异不显著，从经济角度考虑，选择50g/m²作为杜仲根腐病预防的用量。

表6 B18内生细菌田间治疗效果：发病杜仲苗圃地(一年生)

由表6可以看出，用量75g/m²防治效果达到91.3％，与其他各处理差异不显著，从经济角度考虑，选择75g/m²作为杜仲根腐病治疗的用量。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种甲基营养型芽孢杆菌B18及其颗粒剂和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 959

<212> DNA

<213> 甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)

<400> 1

actgcggcgt gctataatgc aagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag 60

cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa 120

accggggcta ataccggatg gttgtctgaa ccgcatggtt cagacataaa aggtggcttc 180

ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240

aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300

cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 360

agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa 420

caagtgccgt tcaaataggg cggcaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac 480

tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt 540

aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg 600

gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg 660

tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact 720

gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780

gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat 840

taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900

ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggt 959

Claims (5)

1.一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)B18在防治德巴利腐霉(Pythium debaryanum)引起的杜仲根腐病中的应用，其特征在于，所述的甲基营养型芽孢杆菌B18已于2017年9月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.14641。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，甲基营养型芽孢杆菌B18颗粒剂用于防治德巴利腐霉(Pythium debaryanum)引起的杜仲根腐病，所述颗粒剂按重量百分比包括以下组分：种子发酵液10％，固态发酵制剂15％，粘合剂15％，载体补足100％，所述的种子发酵液和固态发酵制剂均是通过以甲基营养型芽孢杆菌B18为菌种，经种子培养、发酵培养得到。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的粘合剂为0.3％羧甲基纤维素钠，所述的载体为草木灰。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的甲基营养型芽孢杆菌B18颗粒剂中含活芽孢数不低于1×10⁸cfu/g。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，使用时在未发病杜仲林地用颗粒剂在根系周围土壤均匀撒施，50g/m²，春季施用一次；发病杜仲林地用颗粒剂在根系周围土壤均匀撒施，75g/m²，春、秋各一次。

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