CN107858304B - 一种甲基营养型芽孢杆菌b18及其液体制剂和应用 - Google Patents

一种甲基营养型芽孢杆菌b18及其液体制剂和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甲基营养型芽孢杆菌B18及其液体制剂和应用，该菌株已经于2017年9月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.14641。以甲基营养型芽孢杆菌B18为菌种，经种子培养、发酵培养可制备得到液体制剂。本发明生防菌甲基营养型芽孢杆菌B18菌株具有防病、促生双重功能，兼有生物防治和生物肥料特点，对防治杜仲猝倒病和杜仲促生具有显著的效果，不仅能避免化学药物所造成的污染环境的严重后果，而且具有可持续、成本低的特点。

Description

一种甲基营养型芽孢杆菌B18及其液体制剂和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及种甲基营养型芽孢杆菌B18及其液体制剂的制备和在杜仲猝倒病、促生上的应用。
背景技术
杜仲，属于杜仲科杜仲属多年生落叶乔木，该科仅有1属1种植物，是我国仅存的第三纪孑遗植物，属国家二级保护名贵经济树种，还是我国特产树种和著名药材。杜仲有近千年的栽培历史，实用型极强，在我国亚热带至温带的27个省均可种植，主要产于四川、云南、贵州、湖南、湖北、陕西、江苏及浙江等省。杜仲被列为贵州地道中药材GAP基地示范品种之一。它全身都是宝，用途广泛，具有极大的药用价值和经济价值。杜仲被成为神奇之树，其叶、雄花、果实和树皮都含有许多人体不可缺少的活性物质，这些活性物质具有十分独特的医疗保健功能，在促进体内胶原蛋白的合成、抗衰老、降血压、抗疲劳、人体免疫调节、预防细胞癌变、降低血脂和胆固醇、治疗心脑血管疾病，补肝肾等方面有独特的功效，并且无毒副作用树皮可以入药，有滋补肝肾、强健筋骨、治疗腰膝痛和高血压等功效。树皮、叶和果实还能提取杜仲胶(又名硬橡胶)，可代替橡胶用，是世界上十分珍贵的优质天然橡胶资源。还可以加工成各种优质饮料。另外，杜仲的木材纹理直行、结构细致，不翘不裂，是制造家具和其他木制品的优质材料。目前国内外市场需求量大，皮、叶价格逐渐上涨。
猝倒病常在杜仲苗期发生，对其生长危害极大。在低温、高温、土壤粘重和排水不良的苗圃地或阴雨天易发病。病株靠近地面的茎干皱缩、变褐、腐烂以致倒伏而死。受害苗木茎的基部，根部皮层以及须根腐烂枯萎而死亡。种子感病后胚芽腐烂，感病幼苗苗尖腐烂。有关该病的研究很少，且防治上通常采用物轮作、科学管理、福尔马林、代森锌等进行控制，化学农药对环境污染极大，对人畜不安全。因此，环保型生物制剂(生物农药和生物肥料)越来越受到人们的青睐，是未来农林业可持续发展的重要组成部分。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在防治杜仲猝倒病中的缺陷，提供了甲基营养型芽孢杆菌B18及其液体制剂在防治杜仲猝倒病中的应用。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)B18菌株于2016年11月20日采用平板稀释涂布法分离于四川大邑仰天窝药场健康杜仲树皮，该菌对花椒膏药病菌抑菌率达到99％以上，已经于2017年9月18日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.14641。
本发明甲基营养型芽孢杆菌B18在NA平板培养基上培养了2d的单菌落呈白色，圆形，边缘不整齐，表面干燥，有褶皱，无粘性，不透明。
本发明甲基营养型芽孢杆菌B18的16S rDNA的序列为：SEQ ID NO:1。
本发明以甲基营养型芽孢杆菌为活性成分的液体制剂，由甲基营养型芽孢杆菌B18为菌种，经种子培养、发酵培养得到液体制剂。
本发明所述的以甲基营养型芽孢杆菌B18为菌种的液体制剂中含活芽孢数不低于1×108cfu/g。
进一步，本发明所述的以甲基营养型芽孢杆菌B18为菌种的液体制剂通过以下方法制备：
1)一级斜面种子：制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种甲基营养型芽孢杆菌后，培养制成一级种子；
2)二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下置于三角瓶中，在无菌状态接种甲基营养型芽孢杆菌斜面种子，振荡培养，制成甲基营养型芽孢杆菌液体种子；
3)液体发酵：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下置于三角瓶中，在无菌状态接种甲基营养型芽孢杆菌液体种子，接种量为液体总体积的10％，振荡培养，制成甲基营养型芽孢杆菌液体制剂，然后保存。
所述的牛肉膏蛋白胨斜面培养基为：牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCL 5g，琼脂18g，水1000mL。
所述的营养肉质培养液为：牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCL 5g，杜仲须根浸渍液1000mL。
上述液体制剂的制备方法得到的以甲基营养型芽孢杆菌B18活性成分的液体制剂也在本发明保护的范围之内。
本发明所述的甲基营养型芽孢杆菌B18在防治杜仲猝倒病或杜仲促生中的应用。
本发明所述的甲基营养型芽孢杆菌B18液体制剂在防治杜仲猝倒病或杜仲促生中的应用，采用灌根法施用液体制剂，预防时春季施用一次，治疗时春、秋各一次。
当然，本发明所述的甲基营养型芽孢杆菌B18的菌悬液或次级代谢产物在作为制备防治杜仲猝倒病或杜仲促生药物中的应用也在本发明的保护范围内。
本发明甲基营养型芽孢杆菌B18防治杜仲猝倒病或杜仲促生的方法也属于本发明的保护范围，该方法是在杜仲生长过程中进行灌根施用；所述灌根为该甲基营养型芽孢杆菌B18的菌悬液或发酵液或代谢产物或制剂。
本发明的有益效果为：
本发明筛选的生防菌甲基营养型芽孢杆菌B18菌株具有防病、促生双重功能，兼有生物防治和生物肥料特点，对土传病害有特效，不仅能避免化学药物(农药、化肥)所造成的污染环境的严重后果，而且具有可持续、成本低的特点。含有甲基营养型芽孢杆菌B18的液体制剂用于防治杜仲猝倒病或杜仲促生，避免了化学农药对环境的破坏污染环境，符合国家的发展方向，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1是本发明甲基营养型芽孢杆菌B18rDNA-ITS序列PCR扩增产物电泳图；
图2是基于16S rDNA序列构建的菌株B18的系统发育树。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明技术方案作进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本发明的保护范围内。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1甲基营养型芽孢杆菌B18的分离与鉴定
1.1甲基营养型芽孢杆菌B18的分离
在四川大邑仰天窝药场黄柏烂皮病发生区取健康黄柏树皮。采回的样本用无菌水冲洗干净，称取1.0g组织，在70％的酒精中浸泡1-2min，再用1-3％次氯酸钠溶液消毒3-5min，无菌水洗涤若干遍后，吸取最后一次洗涤液100μL涂抹NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，27℃黑暗培养24h，用于表面消毒的对照，检查表面消毒是否彻底。
将已表面消毒的树皮组织剪碎，放入无菌的研钵，加入灭菌的石英砂和10mL无菌水，充分研磨，静置30min，稀释10-1，10-2，10-3，10-4，10-5共5个梯度，分别吸取100μL 10-3，10-4，10-5这3个梯度研磨液分别涂布NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，每个处理3次重复，27℃培养48h，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入初筛。
依据菌落的大小、颜色、是否突起，边缘特征、表面光滑与否、透明度等方面的差异，挑取单菌落在NA平板上划线纯化，纯化后转接NA斜面于4℃保藏备用。按五点对峙法，在PDA平板中心接种直径5mm杜仲猝倒病病原菌菌饼，四周等距离接种上述待筛选菌株，25℃恒温培养，每个处理3个重复。根据各筛选菌产生的抑菌圈的大小确定拮抗程度，保留效果优良的菌株(B18)。
1.2菌株的鉴定
经形态学观察，结合生理生化指标(表2)和分子生物学鉴定该内生菌B18为甲基营养型芽孢杆菌。
表2菌株B18生理生化指标
Figure BDA0001481064120000061
在NA平板培养基上培养了2d的B18菌株的单菌落白色，呈圆形，边缘不整齐，表面干燥，有褶皱，无粘性，不透明。
分子生物学鉴定(16S rDNA)：通过提取细菌DNA进行PCR扩增及电泳，回收产物送至生物技术公司测序；将所测序列与GenBank数据库中已经报道的序列进行同源性BLAST分析，并用Clustalx(1.83)软件进行多重序列比较，再用Mega4.0软件中的邻接法构建系统发育树，确定B18菌株在微生物系统发育学上的地位。分子生物学鉴定得到长度为959bp的DNA片段(图1)，将B18菌株的16S rDNA序列递交GenBank数据库进行BLAST分析，选取其中与之同源性较高的细菌16S rDNA序列，并用Clustalx软件进行多重匹配排列分析，用Mega分析软件构建系统发育树(图2)。可以看出，B18菌株与HQ662592和KC790268以99％的16SrRNA基因核苷酸序列相似性和较高的自展值支持聚为1个分支，而与其他芽孢杆菌相距较远，表明B18与Bacillus methylotrophicus的亲缘关系最近。
基于以上特征，所述菌种其分类命名为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)B18，已于2017年9月18日保存在中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14641。
实施例2甲基营养性芽孢杆菌B18液体制剂的制备
根据实施例1得到的甲基营养型芽孢杆菌B18，经过种子培养、发酵培养制成液体制剂，具体包括以下步骤：
1)一级斜面种子：常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种甲基营养型芽孢杆菌B18菌株后在26-28℃下培养24-36小时制成一级种子。其牛肉膏蛋白胨斜面培养基的成分为牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCL 5g，琼脂18g，水1000mL。
2)二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例(通氧控制)装瓶，在无菌状态接种甲基营养型芽孢杆菌B18斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养36h，制成甲基营养型芽孢杆菌B18菌株液体种子。其中营养肉质培养液为：牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCL5g，蒸馏水1000mL。
3)液体发酵：营养肉质培养液经高压灭菌后，按200mL液体盛于500mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态接种B18液体种子，接种量体积比10％，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养72h，制成B18菌株液体制剂。
4)制剂保存：瓶装制剂常温保存1年或低温(4℃)2年不影响预防和治疗效果。
该液体制剂的施用方法为灌根施用，预防处理：未发病杜仲苗用上述液体制剂50-1000倍稀释度(体积比)沿根系幅面灌根，每株100mL，春季施用一次，可防病促生(地径增加、高生长)；治疗处理：发病杜仲苗按50-800倍体积比稀释度沿根系幅面灌根及附近土壤淋灌，每株200毫升，春、夏各一次，可治病促生(地径增加、高生长)。
实施例3甲基营养型芽孢杆菌B18对杜仲的预防和促生实验
试验在四川农业大学林木种质苗圃进行，杜仲生长期间进行常规管理，并定期轮换花盆的位置。试验土壤采自四川省大邑县仰天窝药场，采样深度为0-20cm，砂壤土。土壤理化性质经测定为：土壤pH7.1，有机质含量11.54g/kg，全氮含量0.76g/kg，全磷含量0.42g/kg，有效磷含量4.71mg/kg。样土风干后过1mm筛，并与过1mm筛的河沙以3：1(V:V)混合后用于盆栽试验。待杜仲苗移栽成活后，分不同浓度(原液、50-1000倍稀释)沿根系幅面灌根上述液体菌剂100mL，重复6次，以每盆灌注培养液(不含菌)100mL对照。生长停止后统计发病率和测定株高、地径，结果见表1。
表1甲基营养型芽孢杆菌B18灌根方式预防和促生功能参数：杜仲(盆栽)
Figure BDA0001481064120000091
由表1可知，600倍液相对防效达100％，能有效预防杜仲猝倒病，且地径、株高增幅较明显。
实施例4苗圃防效和促生实验
试验在四川省大邑县仰天窝药场杜仲苗圃进行。杜仲苗自然发病(猝倒病)，一年生。土壤理化性质为：土壤pH 7.1，有机质含量11.54g/kg，全氮含量0.76g/kg，全磷含量0.42g/kg，有效磷含量4.71mg/kg。发病杜仲按原液、50-800倍稀释度沿根系幅面灌根及附近土壤淋灌，每株200mL，春、夏各一次，以灌注培养液(不含菌)200mL对照，结果见表2。
表2甲基营养型芽孢杆菌B18灌根治疗和促生参数：杜仲(苗圃)
Figure BDA0001481064120000092
Figure BDA0001481064120000101
由表2可知，稀释200倍液相对疗效达到80％，促生效果也显著，从经济角度考虑，选择200倍液作为杜仲猝倒病发生后，病害治疗和杜仲苗的促生浓度。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种甲基营养型芽孢杆菌B18及其液体制剂和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 959
<212> DNA
<213> 甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)
<400> 1
actgcggcgt gctataatgc aagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag 60
cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa 120
accggggcta ataccggatg gttgtctgaa ccgcatggtt cagacataaa aggtggcttc 180
ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240
aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300
cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 360
agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa 420
caagtgccgt tcaaataggg cggcaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac 480
tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt 540
aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg 600
gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg 660
tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact 720
gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780
gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat 840
taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900
ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggt 959

Claims (2)

1.一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)B18在杜仲促生中的应用，其特征在于，所述的甲基营养型芽孢杆菌B18已于2017年9月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.14641。
2.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌B18在杜仲促生中的应用，其特征在于，所述甲基营养型芽孢杆菌B18的液体制剂含活芽孢数不低于1×108cfu/g。
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