CN107760629B - 一种甲基营养型芽孢杆菌b18及其可湿性粉剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)B18及其可湿性粉剂和应用，该菌株已经于2017年9月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.14641。以甲基营养型芽孢杆菌B18为活性成分的可湿性粉剂通过种子液培养，在载体、助剂和填料的混合物中培养发酵后干燥得到。本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌B18及其可湿性粉剂对花椒膏药病有特效，适宜于商品化生产，对环境亲和性好，具有可持续、成本低的特点。

Description

一种甲基营养型芽孢杆菌B18及其可湿性粉剂和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及的是一种甲基营养型芽孢杆菌B18菌株及其可湿性粉剂和在花椒膏药病中的应用。

背景技术

花椒，原产于我国，为芸香科、花椒属落叶灌木或小乔木，是世界范围内花椒属植物的主要经济栽培种，在我国有2000多年的栽植和使用历史，有秦椒、川椒、岩椒等几十种品种。其果实呈圆形，绿豆大小，其外皮是一种常用香料，并可提取芳香油，又可入药，种子可食用，也可加工制作肥皂。花椒可除各种肉类的腥气；促进唾液分泌，增加食欲；使血管扩张，从而起到降低血压的作用。多见于海拔2500米的坡地，耐旱、喜阳光，各地多栽种。分布于我国北部至西南，我国华北、华中、华南均有分布，四川汉源以花椒为主要产业，称为“贡椒”。其果实含挥发油，挥发油中含柠檬烯、枯醇，亦含有牻牛儿醇、植物甾醇及不饱和脂肪酸等。

近年来，随着农业结构的调整，花椒产业在我国空前发展，花椒病虫害也逐渐蔓延猖獗。其中，花椒膏药病广泛分布于四川汉源花椒产区，在四川其他产区均有发生。病害发生在树干和枝条上，形成圆形、椭圆形或不规则形的菌膜组织，贴附于树上，菌膜组织直径可达6.7～10.0cm左右，初呈灰白色，浅褐色或黄褐色，后转紫褐色，暗褐色或内褐色；有时呈天鹅绒状，边缘色较淡，中部常有龟裂纹；有的后期干缩，逐渐剥落，整个菌膜好像中医中的膏药。在雨季、潮湿、通风透光不良、土壤粘重排水不良的地方易发生此病，该病直接影响花椒树的生长、挂果和花椒的质量。由于病害发生与介壳虫密切相关，目前主要是以防治介壳虫、营林措施为主，病害发生后以多菌灵、代森锌等涂抹病枝为主要防治手段。保护生态平衡、对环境友好、人畜安全、可持续利用的生物防治并未涉及，有关花椒膏药病生物防治及其制剂研究仍为空白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在防治花椒膏药病中的缺陷，提供了甲基营养型芽孢杆菌B18菌株、可湿性粉剂及其制作方法和在花椒膏药病中的应用。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)B18菌株于2016年11月20日采用平板稀释涂布法分离于四川大邑仰天窝药场健康杜仲树皮，该菌对花椒膏药病菌抑菌率达到99％以上，已经于2017年9月18日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.14641。

本发明甲基营养型芽孢杆菌B18在NA平板培养基上培养了2d的单菌落呈白色，圆形，边缘不整齐，表面干燥，有褶皱，无粘性，不透明。

本发明甲基营养型芽孢杆菌B18的16S rDNA的序列为：SEQ ID NO:1。

本发明甲基营养型芽孢杆菌B18的可湿性粉剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)一级斜面种子：制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种甲基营养性芽孢杆菌后，培养制成一级种子；

(2)二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下将营养肉质培养液盛于三角瓶中，在无菌状态接种甲基营养性芽孢杆菌斜面种子，振荡培养，制成甲基营养型芽孢杆菌液体种子；

(3)可湿性粉剂：将载体、助剂和填料按比例在通氧控制下，装入广角瓶混合均匀，在无菌状态接种甲基营养型芽孢杆菌二级液体种子，接种量为载体和助剂和填料总体积的20％，搅拌均匀；在45℃温鼓风干燥箱中持续2-3h烘干，直至样品重量无变化，经粉碎机进行超微粉碎，制成甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂。

进一步，所述的牛肉膏蛋白胨斜面培养基为：牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCL 5g，琼脂18g，水1000mL。

进一步，所述的营养肉质培养液为：牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL。

所述的载体为高岭土，所说的助剂包括湿润剂、分散剂和保护剂。所述的湿润剂为十二烷基苯磺酸钠，所述的分散剂为三聚磷酸钠，所述的保护剂为腐殖酸，所述的填料为白炭黑。其中按重量百分含量具体为：高岭土30％，十二烷基苯磺酸钠10％，三聚磷酸钠5％，腐殖酸2.5％，白炭黑补足100％。

通过上述制备方法得到的可湿性粉剂的技术指标为：湿润时间40s，悬浮率79％，ph 6.72，含水率2.61％。

上述制备方法得到的甲基营养型芽孢杆菌B18可湿性粉剂也在本发明的保护范围之内。

所述的甲基营养型芽孢杆菌B18可湿性粉剂中活芽孢的含量不低于1×10⁸cfu/g。

本发明所述的甲基营养型芽孢杆菌B18在防治花椒膏药病中的应用，当然本发明所述的甲基营养型芽孢杆菌B18的菌悬液或次级代谢产物在防治花椒膏药病中的应用也在本发明的保护范围内。

本发明以甲基营养型芽孢杆菌B18为活性成分的可湿性粉剂在防治花椒膏药病中的应用，将病斑刮除干净，用无菌棉球蘸取可湿性粉剂稀释液对发病部位进行涂抹，间隔7d一次，共3次。

本发明的有益效果为：

本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌B18及其可湿性粉剂对花椒膏药病有特效，且具有抗逆性，贮藏性好，抗高温、低温、耐干燥，适宜于商品化生产，不仅能避免化学药物(农药、化肥)所造成的污染环境的严重后果，而且具有可持续、成本低的特点。

附图说明

图1是本发明甲基营养型芽孢杆菌B18rDNA-ITS序列PCR扩增产物电泳图；

图2是本发明基于16S rDNA序列构建的菌株B18的系统发育树。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明技术方案作进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本发明的保护范围内。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1甲基营养型芽孢杆菌B18的分离与鉴定

1.1甲基营养型芽孢杆菌B18的分离

在四川大邑仰天窝药场黄柏烂皮病发生区取健康黄柏树皮。采回的样本用无菌水冲洗干净，称取1.0g组织，在70％的酒精中浸泡1-2min，再用1-3％次氯酸钠溶液消毒3-5min，无菌水洗涤若干遍后，吸取最后一次洗涤液100μL涂抹NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，27℃黑暗培养24h，用于表面消毒的对照，检查表面消毒是否彻底。

将已表面消毒的树皮组织剪碎，放入无菌的研钵，加入灭菌的石英砂和10mL无菌水，充分研磨，静置30min，稀释10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5共5个梯度，分别吸取100μL 10^-3，10^-4，10^-5这3个梯度研磨液分别涂布NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，每个处理3次重复，27℃培养48h，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入初筛。

依据菌落的大小、颜色、是否突起，边缘特征、表面光滑与否、透明度等方面的差异，挑取单菌落在NA平板上划线纯化，纯化后转接NA斜面于4℃保藏备用。按五点对峙法，在PDA平板中心接种直径5mm花椒膏药病病原菌菌饼，四周等距离接种上述待筛选菌株，25℃恒温培养，每个处理3个重复。根据各筛选菌产生的抑菌圈的大小确定拮抗程度，保留效果优良的菌株(B18)。

1.2菌株的鉴定

经形态学观察，结合生理生化指标(表2)和分子生物学鉴定该内生菌B18为甲基营养型芽孢杆菌。

表2菌株B18生理生化指标

在NA平板培养基上培养了2d的B18菌株的单菌落白色，呈圆形，边缘不整齐，表面干燥，有褶皱，无粘性，不透明。

分子生物学鉴定(16S rDNA)：通过提取细菌DNA进行PCR扩增及电泳，回收产物送至生物技术公司测序；将所测序列与GenBank数据库中已经报道的序列进行同源性BLAST分析，并用Clustalx(1.83)软件进行多重序列比较，再用Mega4.0软件中的邻接法构建系统发育树，确定B18菌株在微生物系统发育学上的地位。分子生物学鉴定得到长度为959bp的DNA片段(图1)，将B18菌株的16S rDNA序列递交GenBank数据库进行BLAST分析，选取其中与之同源性较高的细菌16S rDNA序列，并用Clustalx软件进行多重匹配排列分析，用Mega分析软件构建系统发育树(图2)。可以看出，B18菌株与HQ662592和KC790268以99％的16SrRNA基因核苷酸序列相似性和较高的自展值支持聚为1个分支，而与其他芽孢杆菌相距较远，表明B18与Bacillus methylotrophicus的亲缘关系最近。

基于以上特征，所述菌种其分类命名为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)B18，已于2017年9月18日保存在中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14641。

实施例2甲基营养型芽孢杆菌B18可湿性粉剂的制作

根据实施例1得到的甲基营养型芽孢杆菌B18，经过种子培养、发酵干燥制成可湿性粉剂，具体包括以下步骤：

1)一级斜面种子：常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种甲基营养型芽孢杆菌B18菌株后在26-28℃下培养24-36小时制成一级种子。其中牛肉膏蛋白胨斜面培养基为：牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCL 5g，琼脂18g，水1000mL。

2)二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例(通氧控制)装瓶，在无菌状态接种甲基营养型芽孢杆菌B18斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养36h，制成甲基营养型芽孢杆菌B18菌株液体种子。其中营养肉质培养液为：牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL。

3)可湿性粉剂：将高岭土30％，十二烷基苯磺酸钠10％，三聚磷酸钠5％，腐殖酸2.5％，白炭黑补足100％混合均匀，在通氧控制下，装入300mL广角瓶，在无菌状态接种甲基营养型芽孢杆菌二级液体种子，接种量为总体积的20％，搅拌均匀；在电热恒温鼓风干燥箱中持续2-3h烘干(45℃)，直至样品重量的变化幅度较小，经粉碎机进行超微粉碎，制成甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，然后保存；

4)可湿性粉剂指标：1×10⁸cfu/g活芽孢，湿润时间为40s，悬浮率为79％，ph6.72，含水率2.61％。

5)制剂保存：袋装干燥常温保存1年或低温(4度)2年不影响防治效果。

实施例3甲基营养型芽孢杆菌B18可湿性粉剂对花椒花椒膏药病的防效实验

1)B18可湿性粉剂稀释液准备：将上述制得的1g可湿性粉剂分别用50、100、200、500、800、1000、1500mL稀释，制成稀释液。

2)花椒膏药病菌孢子悬液准备：将PDA斜面培养的花椒膏药病菌(Pythiumdebaryanum)分生孢子用水制成孢子浓度为1×10⁶cfu/mL孢子悬液。

3)选取一年生盆栽花椒实生苗为实验对象，取(1)可湿性粉剂稀释液采用喷雾法对种苗进行喷雾，每隔7天喷施1次(共3次)，30mL/次，并以无菌水为对照。1个月后采用针刺法将病原菌孢子悬液接种到花椒苗枝干处，每处理接种100个部位，并对接种部位进行保湿，每处理重复3次。

4)病原菌接种30d后，按照表1中病害分级标准进行病害调查统计，并计算发病率，病情指数和防治效果。接种后60d，对病斑扩展和新增情况进行调查统计，计算病斑增长率和相对防效，结果如表2和表3所示。

表1花椒膏药病病害分级标准

发病率(％)＝(病株数/株数总和)×100；

病情指数＝[∑(病级株数×代表数值)/株数总和×发病最重级的代表值]×100；

防治效果(％)＝[(对照病情指数增长率-处理病情指数增长率)/对照病情指数增长率]×100；

病斑增长率(％)＝[(60d病斑总数-30d病斑总数)/30d病斑总数]×100。

表2盆栽试验30d后的防治效果

接种病原菌30d后，B18可湿性粉剂稀释液对花椒膏药病表现出良好的保护效果，防治效果随稀释倍数的增加而降低。从表2可以看出，1gB18可湿性粉剂配制成50mL稀释液的防治效果最高，达到了100％，说明完全控制病菌的定殖、生长、繁殖，病害不发生。稀释到1g/500mL，病情指数与稀释到1g/200mL差异不显著，且防效达到86.59％；稀释到1g/800mL防效仍超过60％。因此，选用50、100、200、500、800稀释液用于林间防治测定。

表3盆栽试验60d后的防治效果

由表3可知，接种病原菌60d后尽管病斑有少量增加，旧病斑有所增大，但与对照相比，病斑增长速度明显减缓，说明B18菌株对病原菌的作用能在长时间内维持稳定状态。从稀释液浓度看，1g/500mL与1g/200mL差异不显著，发病率均在20％以下，病斑增长率控制在30％以下。

实施例4林间防治实验

1)供试药剂

本发明实施例2制备得到的甲基营养型芽孢杆菌B18可湿性粉剂。

2)田间涂抹治疗

将上述制得的1g可湿性粉剂分别用50、100、200、500、800mL稀释，制成稀释液。先将病斑刮除干净，用无菌棉球蘸取稀释液对发病部位进行涂抹，以蘸取无菌水涂抹作对照。每处理设50个病斑，间隔7d一次，共3次。每处理重复4次。

3)试验调查

分别在涂抹前和在最后一次涂抹后的第30d进行调查统计，记录发病植株数、发病程度以及治愈病斑数，并计算病情指数增长率、防治效果和病斑治愈率，结果如表4。

病害调查、发病率、病情指数、防治效果同上计算。

病情指数增长率(％)＝[(处理后病情指数-处理前病情指数)/处理前病情指数]×100；

病斑治愈率(％)＝(治愈病斑数/总病斑数)×100。

表4采用涂抹法对花椒膏药病的林间防治效果

由表4可知，采用涂抹法防治花椒膏药病，50-800mL的稀释液均有明显治愈效果，随浓度降低治愈率降低。其中，1g/50mL稀释液治愈率高达94％，100、200和500稀释液的治愈率分别为88％、84％和82％，1g/200mL和1g/500mL稀释液处理差异不显著。可以看出，涂抹法的防效与B18可湿性粉剂活芽孢数量有关。尽管1gB18可湿性粉剂配50mL水的防效最佳，但生产成本较高，200和500稀释液防效相差不大，且防效和治愈率均在80％以上，从经济角度考虑，应选择1gB18可湿性粉剂配500mL水用于花椒膏药病的林间防治。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种甲基营养型芽孢杆菌B18及其可湿性粉剂和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 959

<212> DNA

<213> 甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)

<400> 1

actgcggcgt gctataatgc aagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag 60

cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa 120

accggggcta ataccggatg gttgtctgaa ccgcatggtt cagacataaa aggtggcttc 180

ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240

aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300

cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 360

agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa 420

caagtgccgt tcaaataggg cggcaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac 480

tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt 540

aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg 600

gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg 660

tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact 720

gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780

gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat 840

taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900

ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggt 959

Claims (2)

1.甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）B18可湿性粉剂在防治花椒膏药病中的应用，其特征在于，使用时将病斑刮除干净，用无菌棉球蘸取可湿性粉剂稀释液对发病部位进行涂抹，间隔7 d一次，共3次；

所述的甲基营养型芽孢杆菌B18可湿性粉剂的制备方法，包括以下步骤：

1）一级斜面种子：制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种甲基营养型芽孢杆菌B18后，培养制成一级斜面种子；

2）二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下将营养肉质培养液盛于三角瓶中，在无菌状态接种一级斜面种子，振荡培养，制成甲基营养型芽孢杆菌B18的二级液体种子；所述的营养肉质培养液为：牛肉膏7 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1000mL；

3）可湿性粉剂：将载体、助剂和填料按比例在通氧控制下，装入广角瓶，在无菌状态接种二级液体种子，接种量为载体和助剂和填料总体积的20%，搅拌均匀；在45℃温鼓风干燥箱中持续2-3 h烘干，直至样品重量无变化，经粉碎机进行超微粉碎，制成甲基营养型芽孢杆菌B18可湿性粉剂；

所述的甲基营养型芽孢杆菌B18已于2017年9月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.14641；

所述的载体、助剂和填料按重量百分含量具体为：高岭土30%，十二烷基苯磺酸钠10%，三聚磷酸钠5%，腐殖酸2.5%，白炭黑补足100%；

所述的甲基营养型芽孢杆菌B18可湿性粉剂中活芽孢的含量不低于1×10⁸cfu/g。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的牛肉膏蛋白胨斜面培养基为：牛肉膏7 g，蛋白胨10 g，NaCL 5 g，琼脂18 g，水1000 mL。

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