CN102839142A - 解淀粉芽孢杆菌Ba168及其发酵培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了解淀粉芽孢杆菌Ba168及其制备方法和应用，其目的是提供一种植物病原菌的生物防治方法。该菌株已于2012年8月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.6462。该菌株从秦岭原始森林土壤中分离获得，经过菌种活化、摇瓶发酵、种子液发酵和大发酵罐发酵得到发酵液，发酵液经过过滤浓缩、超滤膜分离、喷雾干燥和包装后制成杀菌剂。本发明具有对由尖孢镰刀菌引起的白术根腐病、西洋参根腐病和三七根腐病等根腐病害有很好的防治作用的优点。
Description
技术领域
本发明属于利用有益微生物对植物病害进行生物防治的领域，具体涉及解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylolquefaciens)Ba168菌株，以及该菌株的发酵生产及其发酵产物对防治植物病原菌的作用。
背景技术
植物病害的流行不但引起作物减产，给人类造成重大经济损失，甚至带来灾难性后果。植物病害的危害还会导致农产品品质低劣，不堪使用或加工，甚至导致人畜中毒。为防治植物病害，化学农药因为具有成本低、见效快、省时省力等优点曾一度成为人们的首选，但是，化学农药一般不可降解，随着化学农药的大量使用，引发了环境污染、生态破坏、食品污染等事件。这使研究开发利用生物农药成为植物保护工作者的重要研究课题。生物农药是指利用生物活体或其代谢产物针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂，具有安全、高效、无污染等特点，与保护生态环境和社会协调发展的要求相吻合，是未来农药发展的必然趋势。
微生物农药是生物农药中应用最为广泛的一类，也是生物防治的重要材料。微生物源农药的主要成分是微生物活体及其次生代谢产物，由于微生物种类多样，其活性也很广泛，包括杀虫、杀菌、除草以及植物生长调节作用等。自然界中用于生防细菌的，主要有芽孢杆菌属、假单胞菌属。特别是近几年，利用微生物防治植物真菌性病害由于对环境安全，可以减缓病原菌产生抗药性，已经成为当前防治植物病害的主流方法。
解淀粉芽孢杆菌是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，其生理特征多样，该菌在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。解淀粉芽孢杆菌不仅可以在土壤、植物根际体表等外界环境中广泛存在，而且是植物体内常见内生细菌，尤其是在植物的根、茎内部。解淀粉芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际、体表或体内，改变其周围菌群环境和种类，与病原菌竞争植物周围的位点，并且分泌多种抗菌物质以抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到改良土壤和生防的目的。
尖孢镰刀菌是一类既可侵染植物又可在土壤中生存的兼性寄生真菌，用化学农药难于防治，属于顽固性病害。该类病菌和其他植物病原菌一样，存在着种下分化，可侵染许多寄主植物，具有多种专化型。其中，侵染中草药的块根、块茎的一部分专化型为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum Shl，该菌可引起常见中草药的根腐病等病害，而块根、块茎和鳞茎等恰好是许多名贵中药材的药用部位，经济价值高，而尖孢镰刀菌的侵染使中药材的药用价值下降，另外，病原菌可以在病残体和土壤中过冬，一旦发病，笠年仍会引起作物病害，持续影响作物产量，给我国中药材产业造成巨大的损失。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种解淀粉芽孢杆菌Ba168 CGMCC No.6462。
本发明的第二个目的在于公开了解淀粉芽孢杆菌Ba168的发酵方法，以及由该方法制备所得的发酵液。
本发明的第三个目的在于公开了解淀粉芽孢杆菌Ba168杀菌剂及其制备方法。
本发明的第四个目的在于公开了上述解淀粉芽孢杆菌Ba168、由解淀粉芽孢杆菌Ba168制备所得的发酵液以及解淀粉芽孢杆菌Ba168杀菌剂在制备防治由尖孢镰刀菌属引起的作物根腐病药物中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种解淀粉芽孢杆菌Ba168，CGMCC No.6462，该解淀粉芽孢杆菌Ba168的16S rDNA如序列表1所示。
解淀粉芽孢杆菌Ba168的发酵方法，其中，所述发酵方法是以权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌Ba168为原料，包括下述步骤：
(1)、菌种活化：将解淀粉芽孢杆菌Ba168菌种接种到LB试管斜面上面，于30℃活化培养48h，所述LB培养基配方为酵母浸膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15～20g，水1000ml，pH 7.4～7.6，连续转接3代，确保菌株纯度后，再接种到种子液中使用。
(2)、种子液的制备：从斜面上挑取菌接种到装有LB培养基的三角瓶中，于恒温振荡培养箱中振荡培养，即得到种子液，所述的LB培养基配方为：蛋白胨10g，NaCl 10g，水1L，酵母浸膏5g，pH7.0；
(3)、发酵培养：将种子液先后进行种子罐发酵培养和大规模工业发酵培养，得到发酵液；其中种子罐发酵培养和大规模工业发酵培养步骤如下：
种子罐发酵培养：FJ液体培养基，装料系数0.7，培养条件：26～28℃，48h，接种量：9%，通气量：2.5L/min，搅拌转速：200r/min；
大规模工业发酵培养：FJ液体培养基（20~36T），装料系数0.7，培养条件：26～28℃，60~70h，接种量：9%，通气量：2.0L/min，搅拌转速：150r/min；
所述的FJ液体培养基配方为：黄豆饼粉2%，葡萄糖1%，淀粉1.5%，CaCO30.25%，K2HPO40.05%，MgSO4·7H2O 0.25%，FeSO4·7H2O 0.25%，其余为水，所列百分比为质量分数。
由上述技术方案所述的解淀粉芽孢杆菌Ba168发酵方法制备所得的发酵液。
解淀粉芽孢杆菌Ba168杀菌剂的制备方法，其中，所述制备方法是以由上述技术方案所述的解淀粉芽孢杆菌Ba168发酵液为原料，包括下述步骤：
(1)、过滤浓缩发酵液：用草酸调节pH至4.5~5.0后，将发酵液通过截留分子量40000~100000k的无机陶瓷超滤膜过滤分离，操作温度为25~45℃，膜通量为50~60LMH，被截留在膜的进液侧的溶液为芽孢溶液，芽孢溶液浓缩倍数为6-7倍；
(2)、喷雾干燥：向浓缩后的发酵液中添加发酵液质量1.0%的白炭黑、微细滑石粉、轻质碳酸钙或2500目超细重钙填料；再将芽孢溶液经喷雾制成粉末，即得到解淀粉芽孢杆菌Ba168杀菌剂，其中喷雾干燥的进口温度为170~190℃，出口温度为65~85℃，进料速度60mL/min，喷头压力0.10MPa。
解淀粉芽孢杆菌Ba168发酵液，其中，所述解淀粉芽孢杆菌Ba168发酵液由上述技术方案所述的解淀粉芽孢杆菌Ba168发酵所得。
解淀粉芽孢杆菌Ba168杀菌剂，其中，所述解淀粉芽孢杆菌Ba168是以由上述技术方案所述的解淀粉芽孢杆菌Ba168发酵液为原料，通过下述方法制备所得：
(1)、过滤浓缩发酵液：用草酸调节pH至4.5~5.0后，将发酵液通过截留分子量40000~100000k的无机陶瓷超滤膜过滤分离，操作温度为25~45℃，膜通量为50~60LMH，被截留在膜的进液侧的溶液为芽孢溶液，芽孢溶液浓缩倍数为6-7倍；
(2)、喷雾干燥：向浓缩后的发酵液中添加发酵液质量1.0%的白炭黑、微细滑石粉、轻质碳酸钙或2500目超细重钙填料；再将芽孢溶液经喷雾制成粉末，即得到解淀粉芽孢杆菌Ba168杀菌剂，其中喷雾干燥的进口温度为170~190℃，出口温度为65~85℃，进料速度60mL/min，喷头压力0.10MPa。
上述技术方案所述一种解淀粉芽孢杆菌Ba168、上述技术方案所述的发酵液以及上述技术方案所述的解淀粉芽孢杆菌Ba168杀菌剂在制备防治由尖孢镰刀菌属引起的作物根腐病药物中的应用。
根据上述技术方案所述的应用，其中，所述由尖孢镰刀菌属引起的作物根腐病为白术根腐病、西洋参根腐病和三七根腐病。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明的解淀粉芽孢杆菌Ba168 CGMCC No.6462，环境相容性好，具有很高的生物活性，特别是对由镰刀菌属真菌引起的根腐病具有较好的防效，通过实验证明，该解淀粉芽孢杆菌菌株制剂对西洋参根腐病、白术根腐病菌和三七根腐病菌等都具有很好的防治作用。
2、本发明为防治由镰刀菌属真菌引起的根腐病提供了一种新的微生物农药。
菌株保藏信息：本发明解淀粉芽孢杆菌Ba168，分类命名Bacillusamyloliquefaciens，已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）进行保藏，保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.6462，保藏日期为2012年8月21日。
附图说明：
图1为解淀粉芽孢杆菌Ba168 CGMCC No.6462的16SrRNA同源序列比对分析树状图。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对镰刀菌属真菌引起的根腐病防治中的应用作进一步的说明。
实施例1：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba168的分离与纯化：
(1)、土样采集：
从秦岭深山原始森林土壤中选取多个地点，每个地点取3到15cm处土壤，混合过粗筛，取25g做分离用；
(2)、培养基平板制备：
将NA培养基和LB培养基加热融化倒入培养皿内冷却，制成NA培养基和LB培养基平板。所述的NA培养基配方为：葡萄糖10g，琼脂15g，牛肉浸膏3g，酵母膏1g，蛋白胨5g，水1L，pH 6.8~7.0；LB液体培养基配方为：蛋白胨10g，NaCl 10g，水1L，酵母浸膏5g，pH 7.0；
(3)、细菌的分离：
平板接种分别采用涂抹法和混菌法接种。
涂抹法：分别取上述5个浓度土壤稀释液0.05ml，分别加入已做好的NA、LB平板上，用灭菌的玻璃刮刀将稀释液均匀的涂布开。放入32℃恒温箱中培养，设三个重复。
混菌法：分别取上述5个浓度土壤稀释液1ml，加入培养皿中，将已熔化的45~50℃的NA、LB培养基倒入，轻轻摇转使样品和培养基混合均匀，待培养基凝固后放入培养箱32℃恒温培养，设三个重复；
(4)、菌种的纯化：
随时观察并记录菌株的原始培养结果，统一编号。根据细菌的特征及时挑取单个细菌落至LB平板上，采用划线分离的方法纯化。
实施例2：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba168的鉴定：
对实施例1所得的解淀粉芽孢杆菌Ba168 CGMCC No.6462的鉴定过程为：
(1)、形态特征：在LB培养基上菌落呈圆形，表面有明显光泽，不光滑；边缘不规则，有扩散，表面褶皱；菌落呈乳白色，不透明，浑浊；具有一定的粘附性；所述的LB培养基配方为：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，琼脂18g，水1000ml，pH为7.0。
培养前期(5~12h)菌落呈无色透明液滴，有光泽；后期(24h后)呈白色不透明状，较为暗淡。
菌体杆状，长约2μm，单生，周生鞭毛，产芽孢。革兰氏染色呈阳性。
(2)、生理生化实验：通过对解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Ba168的生理生化特性试验(如表1所示)并结合该菌株的形态特征，对照《伯杰氏细菌手册》（Buchanan & Gibbons，1984）和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英，2001)进行检索，鉴定Ba168菌株为芽孢杆菌属。
表1解淀粉芽孢杆菌BA168菌株的生理生化特征
注：“+”表示阳性反应，“–”表示阴性反应。
(3)、分子生物学鉴定：采用碱裂解法提取细菌基因组，用细菌通用引物(Primer F27：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，Primer R1492:5’-TACGGTACCTTGTTACGACT-3’)进行PCR，PCR条件95℃5min，（95℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1.5min）35个循环，72℃ 10min PCR产物经胶回收纯化与PMD-18T载体连接，送测序公司测16SrRNA序列，其16SrDNA序列如序列表1所示。
测得的序列在国际核酸数据库NCBI中进行同源序列搜索Blast，比较实验菌株与已知菌株在相应区域序列的相似性；根据同源序列搜索的结果，下载相关菌种的序列，与实验菌株用Clustal X软件进行匹配，用MEGA 4.0软件进行分子系统学分析并生成系统树。从进化树图1可看出解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Ba168与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylolquefaciens subsp.plantarum FZB42T)进化关系最近，同源性达到99.728%。
综合Ba168细菌的形态、培养特征、生理生化测定和16SrRNA同源序列比对分析（图1），初步鉴定解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba168为解淀粉芽孢杆菌。
实施例3：本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba168的培养方法为：
(1)、菌株活化：
培养基：LB固体培养基，所述LB固体培养基配方为：酵母浸膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15～20g，水1000ml，pH 7.4～7.6；
培养条件：30℃，48h；
连续转接3代，确保菌株纯度后，再接种到发酵液中使用。
(2)、种子液的制备(摇瓶发酵或茄子瓶发酵)：
培养基：LB液体培养基，所述的LB液体培养基配方为：酵母浸膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，水1000ml，pH 7.0（烧瓶体积250ml，装液量50ml；茄子瓶体积1000ml，装液量200-300ml）；
培养条件：30℃，50h-60h；
接种量：6~8%。
(3)、种子罐发酵：
培养基：FJ液体培养基，所述的FJ液体培养基配方为：黄豆饼粉2%，葡萄糖1%，淀粉1.5%，CaCO3 0.25%，K2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.25%，FeSO4·7H2O 0.25%，其余为水，所列百分比为质量分数；
装料系数：0.7；
培养条件：26～28℃，48h；
接种量：9%；
通气量：2.5L/min；
搅拌转速：200r/min；
发酵过程中如果有泡沫产生，可流加泡敌消泡。
(4)、工业发酵：
液体培养基：FJ液体培养基(20~36T)，所述的FJ液体培养基配方为：黄豆饼粉2%，葡萄糖1%，淀粉1.5%，CaCO3 0.25%，K2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O0.25%，FeSO4·7H2O 0.25%，其余为水，所列百分比为质量分数；
装料系数：0.7；
培养条件：26～28℃，60~70h；
接种量：9%；
通气量：2.0L/min；
搅拌转速：150r/min；
发酵过程中如果有泡沫产生，可流加泡敌消泡。此时发酵产量可达到1×1010CFU/ml，可以进行预处理和产品加工(即杀菌剂的制备)。
实施例4：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba168杀菌剂的制备(即发酵液预处理和产品加工)：
(1)、发酵液浓缩：用草酸调节pH至4.5~5.0后，将发酵液通过截留分子量40000~100000k的无机陶瓷超滤膜过滤分离，操作温度为25~45℃，膜通量为50~60LMH，被截留在膜的进液侧的溶液为芽孢溶液，芽孢溶液浓缩倍数为6-7倍。
(2)、喷雾干燥：
向浓缩后的发酵液中添加发酵液质量1.0%的白炭黑、微细滑石粉、轻质碳酸钙或2500目超细重钙填料，能明显提高喷雾千燥原粉的质量收率，减少孢子失活率。将芽孢溶液经喷雾制成粉末，即得到解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）Ba168制剂，喷雾干燥的进口温度为170~190℃，出口温度为65~85℃，进料速度60ml/min，喷头压力0.10MPa。
实施例5：解淀粉芽孢杆菌Ba168CTMCC No.6462对白术根腐病菌、西洋参根腐病菌和三七根腐病菌的皿内拮抗实验：
分别以白术根腐病菌Fusarium oxysporum Shl、西洋参根腐病菌Fusariumsolani (Mart.)Sacc和三七根腐病菌Fusarium scirpi lamb为供试病原菌，用生长速率法测定解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ba168发酵液（108～109cfu/ml）对各种病原菌的抑制效果，取发酵滤液2ml于灭菌培养皿中，然后将热的PDA培养基18ml注入皿中与其混合均匀，待平板冷凝后，中央接种靶标病原菌，分别以加入无菌水和不接菌的LB培养液的PDA平板为对照，28℃恒温培养3~5d后测量菌落直径，计算抑制率。
菌落直径（mm）＝相垂直的两直径平均值－菌饼直径
表2解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ba168的抑菌谱测定结果
注：表中每增加一个“+”表示抑制率增加20~25%，“0”表示无明显相关性。
由表2用生长速率法测定解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ba168对白术根腐病菌、西洋参根腐病菌和三七根腐病菌的抑制率，发现本菌株对白术根腐病菌和三七根腐病菌的抑制率在90%以上，对西洋参根腐病菌的抑制率在80%以上。
实施例6：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ba168杀菌剂的使用方法：
内含100亿∕克的解淀粉芽孢杆菌Ba168杀菌剂，对于白术根腐病、西洋参根腐病和三七根腐病有很好的防效。
(1)、浸种：将解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ba168菌剂稀释200倍，在播种前把种子浸泡1天，可以防治由镰刀菌属真菌引起的根部病害，特别是根腐病。
(2)、灌根：在西洋参、白术、三七等在生长中后期，将解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ba168杀菌剂稀释200倍，直接将药剂喷淋在植物茎基部，可以防治由镰刀菌属真菌引起的根腐病害。
实施例7：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba168菌剂对白术根腐病防效实验：
供试病原菌：尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），在麦粒培养基上培养，待菌丝长满后，磨碎待用。
供试化学药剂：50%多菌灵可湿性粉剂。
方法：
筛选均匀饱满的白术种子，取细沙灭菌，将磨碎的的尖孢镰刀菌与细沙灭菌后的按照1:5混合，出空白对照组外，每层均匀撒上一层菌后放上白术种子，再撒一层土覆盖。
共做4个处理，种子处理后点播到整好的畦面上，穴距为10cm×10cm，每穴2粒，覆土浇足水，每一处理3m2，重复3次。
处理1：空白对照，直接接种白术种子，不接种尖孢镰刀菌。
处理2：病原菌对照，接种白术种子，接种尖孢镰刀菌。
处理3：化学药剂对照，接种用50%多菌灵溶液浸泡过的白术种子，接种尖孢镰刀菌。
处理4：接种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ba168菌剂200倍稀释液浸泡过的白术种子，接种尖孢镰刀菌。
每个处理挖取不少于30株调查，记录总株数和各级病株数。
分级方法：
0级：植株茎基部和主根均无病斑；
1级：茎基部和主根上有少量病斑；
3级：茎基部或主根上病斑较多，病斑面积占茎和根总面积的四分之一～二分之一；
5级：茎基部及主根上病斑多且较大，病斑面积占茎基部和根总面积的二分之一～四分之三；
7级：茎基部或主根上病斑连片，形成烧茎现象，但根系并未死亡；
9级：根系坏死，植株地上部萎蔫或死亡。
20天左右观察出苗，记录出苗率。白术出苗后每5天观察一次根腐病情况，计算发病率，实验结果如表3所示，可见，本次实验中解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）Ba168菌剂对白术根腐病的防效达85.25%，高于50%多菌灵药剂。
表3解淀粉芽孢杆菌Ba168菌剂对白术根腐病防效
实施例8：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Ba168菌剂对西洋参根腐病防效实验：
供试病原菌：Fusarium solani (Mart.)Sacc(西洋参根腐病菌)，在麦粒培养基上培养，待菌丝长满后，磨碎待用。
供试化学药剂：50%多菌灵可湿性粉剂。
方法：
筛选均匀饱满的西洋参种子，取细沙灭菌，将磨碎的Fusarium solani(Mart.)Sacc菌与细沙灭菌后的按照1:5混合，出空白对照组外，每层均匀撒上一层菌后放上西洋参种子，再撒一层土覆盖。
共做4个处理，种子处理后点播到整好的畦面上，穴距为10cm×10cm，每穴2粒，覆土浇足水，每一处理3m2，重复3次。
处理1：空白对照，直接接种西洋参种子，不接种Fusarium solani(Mart.)Sacc。
处理2：病原菌对照，接种西洋参种子，接种Fusarium solani(Mart.)Sacc。
处理3：化学药剂对照，接种用50%多菌灵溶液浸泡过的西洋参种子，接种Fusarium solani(Mart.)Sacc菌。
处理4：接种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ba168菌剂200倍稀释液浸泡过的西洋参种子，接种Fusarium solani(Mart.)Sacc菌。
每个处理挖取不少于30株调查，记录总株数和各级病株数。
分级方法：
0级：植株茎基部和主根均无病斑；
1级：茎基部和主根上有少量病斑；
3级：茎基部或主根上病斑较多，病斑面积占茎和根总面积的四分之一～二分之一；
5级：茎基部及主根上病斑多且较大，病斑面积占茎基部和根总面积的二分之一～四分之三；
7级：茎基部或主根上病斑连片，形成烧茎现象，但根系并未死亡；
9级：根系坏死，植株地上部萎蔫或死亡。
20天左右观察出苗，记录出苗率。西洋参出苗后每5天观察一次根腐病情况，计算发病率，实验结果如表4所示，可见，本次实验中解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）Ba168菌剂对西洋参根腐病菌的防效达88.5%，高于50%多菌灵药剂。
表4解淀粉芽孢杆菌Ba168菌剂对西洋参根腐病防效
实施例9：解淀粉芽孢杆菌Ba168 CTMCC No.6462菌剂对三七根腐病菌防效实验：
供试病原菌：三七根腐病菌(Fusarium scirpi lamb)，在麦粒培养基上培养，待菌丝长满后，磨碎待用。
供试化学药剂：25％代森锌500倍液。
方法：
筛选均匀饱满的三七种子，取细沙灭菌，将磨碎的Fusarium scirpi lamb菌与细沙灭菌后的按照1:5混合，出空白对照组外，每层均匀撒上一层菌后放上三七种子，再撒一层土覆盖。
共做4个处理，种子处理后点播到整好的畦面上，穴距为10cm×10cm，每穴2粒，覆土浇足水，每一处理3m2，重复3次。
处理1：空白对照，直接接种三七种子，不接种Fusarium scirpi lamb。
处理2：病原菌对照，接种三七种子，接种Fusarium scirpi lamb。
处理3：化学药剂对照，接种用25％代森锌500倍液浸泡过的三七种子，接种Fusarium scirpi lamb菌。
处理4：接种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ba168菌剂200倍稀释液浸泡过的三七种子，接种Fusarium scirpi lamb菌。
每个处理挖取不少于30株调查，记录总株数和各级病株数。
分级方法：
0级：植株茎基部和主根均无病斑；
1级：茎基部和主根上有少量病斑；
3级：茎基部或主根上病斑较多，病斑面积占茎和根总面积的四分之一～二分之一；
5级：茎基部及主根上病斑多且较大，病斑面积占茎基部和根总面积的二分之一～四分之三；
7级：茎基部或主根上病斑连片，形成烧茎现象，但根系并未死亡；
9级：根系坏死，植株地上部萎蔫或死亡。
20天左右观察出苗，记录出苗率。三七出苗后每5天观察一次根腐病情况，计算发病率，实验结果如表5所示，可见，本次实验中解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）Ba168菌剂对三七根腐病菌的防效达83.98%，高于25％代森锌500倍液。
表5解淀粉芽孢杆菌Ba168菌剂对三七根腐病防效
实施例10：解淀粉芽孢杆菌Ba168 CTMCC No.6462菌剂防治白术、西洋参和三七根腐病的田间小区实验：
为验证解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ba168菌剂对白术根腐病、西洋参根腐病和三七根腐病的防效，我们在2009年9月至2010年7月进行大田推广试验，实验条件如下：
(1)、白术：试验用地选在安徽亳州大寺镇，试验地面积800m2（1.21亩），土质为轻壤土，有机质含量为1.01%，pH值7.7，所有试验小区栽培条件及管理措施一致。本实验设解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ba168菌剂200倍液、50%多菌灵和不施药清水共3个处理，每个处理4个重复，共12个小区，各小区随机排列，每个小区40m2小区间及试验地周围设置0.6m宽的隔离带。2010年4月进行播种，平均株距8cm，播种后分别于2010年5月5日、15日和25日根灌一次，亩用药液500kg，喷药器械为工农——16型喷雾器，将喷头取下喷灌。
气象条件
第一次施药（5月5日）当日少云，风力3级，最高气温25℃，最低气温15℃，相对湿度为80%。第二次施药（5月15日）当日阴，风力3级，最高气温23℃，最低气温15℃，相对湿度为80%。第一次施药（5月25日）当日少云，风力5级，最高气温25℃，最低气温14℃，相对湿度为80%。
最后一次施药后7天进行调查，每小区采用4点取样法，每点查20株，记录总株数和各级病株数。
分级方法：
0级：植株茎基部和主根均无病斑；
1级：茎基部和主根上有少量病斑；
3级：茎基部或主根上病斑较多，病斑面积占茎和根总面积的四分之一～二分之一；
5级：茎基部及主根上病斑多且较大，病斑面积占茎基部和根总面积的二分之一～四分之三；
7级：茎基部或主根上病斑连片，形成烧茎现象，但根系并未死亡；
9级：根系坏死，植株地上部萎蔫或死亡。
调查结果如下表6所示，其中，所有取样点都没有药害发生，经过田间小区试验表明，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ba168菌剂对白术根腐病的平均防效达80.4%，高于50%多菌灵可湿性粉剂。
表6解淀粉芽孢杆菌Ba168菌剂对白术根腐病田间试验防治情况
(2)、西洋参：试验用地选在吉林省白山市靖宇县，试验用地900m2（1.36亩），土质为砂质壤土，有机质含量为0.96%，pH值6.0，所有试验小区栽培条件及管理措施一致；本实验设解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ba168菌剂200倍液、50%多菌灵菌液和不施药清水共3个处理，每个处理4个重复，共12个小区，各小区随机排列，每个小区60m2小区间及试验地周围设置0.5m宽的隔离带。2009年9月进行播种，平均株距7cm，播种出苗后分别于2010年4月15日、5月5日和25日分别根灌一次，亩用药液500kg，喷药器械为工农——16型喷雾器，将喷头取下喷灌。
气象条件
第一次施药（4月15日）当日少云，风力3级，最高气温14℃，最低气温1℃，相对湿度为30%。第二次施药（5月15日）当日阴，风力3级，最高气温19℃，最低气温3℃，相对湿度为30%。第一次施药（5月25日）当日少云，风力5级，最高气温23℃，最低气温10℃，相对湿度为20%。
最后一次施药后7天进行调查，每小区采用4点取样法，每点查20株，记录总株数和各级病株数。
分级方法：
0级：植株茎基部和主根均无病斑；
1级：茎基部和主根上有少量病斑；
3级：茎基部或主根上病斑较多，病斑面积占茎和根总面积的四分之一～二分之一；
5级：茎基部及主根上病斑多且较大，病斑面积占茎基部和根总面积的二分之一～四分之三；
7级：茎基部或主根上病斑连片，形成烧茎现象，但根系并未死亡；
9级：根系坏死，植株地上部萎蔫或死亡。
调查结果如下表7所示，其中，所有取样点都没有药害发生，经过田间小区试验表明，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ba168菌剂对西洋参根腐病的平均防效达71.4%，高于50%多菌灵可湿性粉剂。
表7解淀粉芽孢杆菌Ba168菌剂对西洋参根腐病田间试验防治情况
(3)、三七：试验用地选在云南省文山市，试验用地800m2（1.21亩），土质为砂砂质壤土，有机质含量为1.14%，pH值6.0，所有试验小区栽培条件及管理措施一致。本实验设解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ba168菌剂200倍液、25％代森锌500倍液和不施药清水共3个处理，每个处理4个重复，共12个小区，各小区随机排列，每个小区40m2小区间及试验地周围设置0.6m宽的隔离带。2010年4月进行播种，平均株距8cm，播种后分别于2010年5月5日、15日和25日根灌一次，亩用药液500kg，喷药器械为工农——16型喷雾器，将喷头取下喷灌。
气象条件
第一次施药（5月5日）当日少云，风力3级，最高气温25℃，最低气温15℃，相对湿度为80%。第二次施药（5月15日）当日阴，风力3级，最高气温23℃，最低气温15℃，相对湿度为80%。第一次施药（5月25日）当日少云，风力5级，最高气温25℃，最低气温14℃，相对湿度为80%。
最后一次施药10天后进行调查，每小区采用4点取样法，每点查20株，记录总株数和各级病株数。
分级方法：
0级：植株茎基部和主根均无病斑；
1级：茎基部和主根上有少量病斑；
3级：茎基部或主根上病斑较多，病斑面积占茎和根总面积的四分之一～二分之一；
5级：茎基部及主根上病斑多且较大，病斑面积占茎基部和根总面积的二分之一～四分之三；
7级：茎基部或主根上病斑连片，形成烧茎现象，但根系并未死亡；
9级：根系坏死，植株地上部萎蔫或死亡。
调查结果如下表8所示，其中，所有取样点都没有药害发生，经过田间小区试验表明，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Ba168菌剂对三七根腐病的平均防效达72.6%，高于25％代森锌500倍液。
表8解淀粉芽孢杆菌Ba168菌剂对三七根腐病田间试验防治情况
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (8)
1.一种解淀粉芽孢杆菌Ba168，CGMCC No.6462，该解淀粉芽孢杆菌Ba168的16SrDNA如序列表1所示。
2.解淀粉芽孢杆菌Ba168的发酵方法，其特征在于：所述发酵方法是以权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌Ba168为原料，包括下述步骤：
(1)、菌种活化：将解淀粉芽孢杆菌Ba168菌种接种到LB试管斜面上面，于30℃活化培养48h，所述LB培养基配方为酵母浸膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15～20g，水1000ml，pH 7.4～7.6，连续转接3代，确保菌株纯度后，再接种到种子液中使用。
(2)、种子液的制备：从斜面上挑取菌接种到装有LB培养基的三角瓶中，于恒温振荡培养箱中振荡培养，即得到种子液，所述的LB培养基配方为：蛋白胨10g，NaCl 10g，水1L，酵母浸膏5g，pH7.0；
(3)、发酵培养：将种子液先后进行种子罐发酵培养和大规模工业发酵培养，得到发酵液；其中种子罐发酵培养和大规模工业发酵培养步骤如下：
种子罐发酵培养：FJ液体培养基，装料系数0.7，培养条件：26～28℃，48h，接种量：9%，通气量：2.5L/min，搅拌转速：200r/min；
大规模工业发酵培养：FJ液体培养基（20~36T），装料系数0.7，培养条件：26～28℃，60~70h，接种量：9%，通气量：2.0L/min，搅拌转速：150r/min；
所述的FJ液体培养基配方为：黄豆饼粉2%，葡萄糖1%，淀粉1.5%，CaCO30.25%，K2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.25%，FeSO4·7H2O 0.25%，其余为水，所列百分比为质量分数。
3.由权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌Ba168发酵方法制备所得的发酵液。
4.解淀粉芽孢杆菌Ba168杀菌剂的制备方法，其特征在于：所述制备方法是以由权利要求3所述的解淀粉芽孢杆菌Ba168发酵液为原料，包括下述步骤：
(1)、过滤浓缩发酵液：用草酸调节pH至4.5~5.0后，将发酵液通过截留分子量40000～100000k的无机陶瓷超滤膜过滤分离，操作温度为25~45℃，膜通量为50~60LMH，被截留在膜的进液侧的溶液为芽孢溶液，芽孢溶液浓缩倍数为6-7倍；
(2)、喷雾干燥：向浓缩后的发酵液中添加发酵液质量1.0%的白炭黑、微细滑石粉、轻质碳酸钙或2500目超细重钙填料；再将芽孢溶液经喷雾制成粉末，即得到解淀粉芽孢杆菌Ba168杀菌剂，其中喷雾干燥的进口温度为170~190℃，出口温度为65~85℃，进料速度60mL/min，喷头压力0.10MPa。
5.解淀粉芽孢杆菌Ba168杀菌剂，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌Ba168杀菌剂由权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌Ba168发酵制备所得。
6.解淀粉芽孢杆菌Ba168杀菌剂，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌Ba168是以由权利要求3所述的解淀粉芽孢杆菌Ba168发酵液为原料，通过下述方法制备所得：
(1)、过滤浓缩发酵液：用草酸调节pH至4.5~5.0后，将发酵液通过截留分子量40000~100000k的无机陶瓷超滤膜过滤分离，操作温度为25~45℃，膜通量为50~60LMH，被截留在膜的进液侧的溶液为芽孢溶液，芽孢溶液浓缩倍数为6-7倍；
(2)、喷雾干燥：向浓缩后的发酵液中添加发酵液质量1.0%的白炭黑、微细滑石粉、轻质碳酸钙或2500目超细重钙填料；再将芽孢溶液经喷雾制成粉末，即得到解淀粉芽孢杆菌Ba168杀菌剂，其中喷雾干燥的进口温度为170~190℃，出口温度为65~85℃，进料速度60mL/min，喷头压力0.10MPa。
7.权利要求1所述一种解淀粉芽孢杆菌Ba168、权利要求3所述的发酵液以及权利要求6所述的解淀粉芽孢杆菌Ba168杀菌剂在制备防治由尖孢镰刀菌属引起的作物根腐病药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述由尖孢镰刀菌属引起的作物根腐病为白术根腐病、西洋参根腐病和三七根腐病。
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