CN111778195B - 一种阿氏芽孢杆菌、菌剂和制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295，其特征在于，包括:保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2019年10月16日，保藏编号为CGMCC NO.18691。本发明提供阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295对作物根结线虫有良好防效，并且对多种植物病原菌有显著抑菌作用、防治效率高；本发明提供的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295对作物促生效果较好。

Description

一种阿氏芽孢杆菌、菌剂和制备方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)、菌剂和制备方法与应用。
背景技术
根结线虫(Meloidogyne spp)是1855年由Berkeley发现的一类两侧对称的原体腔无脊椎植物病原线虫，属于线虫动物门，侧尾腺纲，垫刃目，异皮总科，根结线虫科，根结线虫属，目前已发现80多种根结线虫，在世界各地均有分布。而其中最常见的主要有4种，分别为：南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫。河北省根结线虫种类主要为：北方根结线虫、花生根结线虫和南方根结线虫，且南方根结线虫为河北省蔬菜上发生的主要根结线虫。
根结线虫病是常见于农作物根系的病害，可对农作物造成不同程度危害，从而导致农作物减产。以二龄幼虫侵入寄主根系,迁移至维管束后固定取食,吸收植物体内营养,干扰了寄主根系的正常生理过程,致使寄主植物显现特异性的根结病害症状,如根部膨大,出现肿瘤。此外，线虫代谢过程中的分泌物还会刺激寄主植物的细胞和组织,导致植株畸形,使农产品减产和质量下降。
番茄根结线虫在河北省11个地级市60余县的番茄生产基地均有分布，危害面积大、发病率高，并且可全年危害，严重地块或蔬菜大棚甚至出现绝收。化学杀虫剂曾应用于番茄根结线虫的防控，但存在防效差以及残留、污染和抗药性等问题。因此，创制高效生物杀线虫剂成为保障蔬菜生产降本增效、优质安全的重要措施。
发明内容
为了解决上述农业生产存在的技术问题及现有技术的不足，本发明提供了一种对根结线虫有良好防效、并且对多种植物病原菌有显著抑菌作用的阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)。
为达此目的，本发明采用以下技术方案。
在第一方面，本发明提供一种阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295，包括:保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2019年10月16日，保藏编号为CGMCC NO.18691。
阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295菌株的菌落革兰氏染色反应阳性，细胞形状为杆状，菌落呈圆形或椭圆形，颜色为乳白色，表面光滑，边缘整齐且透明性差。
在第二方面，本发明提供一种菌剂，包括阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295和/或阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295的代谢物。
以阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295经活化培养、发酵培养后制成的菌剂。
在第三方面，本发明提供一种菌剂的制备方法，包括活化培养、发酵培养步骤，具体包括：
1S)活化培养：将阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295接种到无机盐培养液中，于温度25～35℃、搅拌速度为120～220rpm的条件下震荡培养12～24h得到液体发酵种子；
2S)发酵培养：将液体发酵种子按培养基体积1～10％的量接种入发酵罐，在25～35℃下培养24～72h，搅拌速度为120～220rpm，得到阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)B295发酵液；
3S)将阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295发酵液离心、弃去上清液，用50～100倍的pH值为7.2的磷酸缓冲液悬浮得到目标物阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)B295为活性成分的菌剂。
1S)步骤中无机盐培养液的配方为NaCl 1.5g、Na2HPO4 1g、NaH2PO40.5g、K2SO41.5g、MgSO4 0.5g，蒸馏水补足至1000mL，混合后搅拌均匀，pH值为7.2，高压蒸汽灭菌后制得。
2S)步骤中的培养基为NA液体培养基，是将牛肉膏3g，NaCl 5g，大豆蛋白胨7g，以蒸馏水补足至1000mL，混合后搅拌均匀，pH 7.2，高压蒸汽灭菌后制得。
3S)步骤中离心的转速为8000～12000rpm/min，离心时间为8～10min。
在第四方面，本发明提供了一种防治根结线虫的方法，将阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)B295或菌剂施用于作物。
根结线虫为南方线虫。
本发明的有益效果如下：
本发明提供的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295对作物根结线虫有良好防效，并且对多种植物病原菌有显著抑菌作用、防治效率高。
本发明提供的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295对作物促生效果较好。
本发明提供的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295耐受低温能力较强。
本发明提供的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295克服了传统化学杀菌剂在根结线虫防治过程中防效差以及残留、污染和抗药性等缺陷，能够安全、高效、快速的杀灭根结线虫，并且其菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。
保藏信息
本发明分离鉴定的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)，命名为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295，己于2019年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.18691。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1(a)是本发明的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295菌株在NA培养基平板上的培养形态(10倍镜)；
图1(b)是本发明的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295菌株在NA培养基平板上的培养形态(40倍镜)；
图2(a)是空白对照清水处理组培养24h的线虫；
图2(b)是本发明的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295处理组培养24h的线虫；
图3(a)是温室盆栽条件下采用市售化学杀虫剂处理的番茄根部；
图3(b)是温室盆栽条件下采用本发明的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295菌株处理的番茄根部；
图3(c)是空白对照清水处理的番茄根部。
图4(a)是不同处理对番茄地上鲜重的影响；
图4(b)是不同处理对番茄根系干重的影响；
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
实施例1
阿氏芽孢杆菌B295菌株的分离及筛选方法如下：
(1)样品采集：分别在河北省保定、石家庄、衡水、邢台、邯郸5个地区蔬菜生产基地大棚中，采集被根结线虫侵害的番茄植株和健康植株。将采集到的番茄植株带回试验室，置4℃低温保存，备用。
将受线虫侵染番茄植株和健康植株根部土壤小心分离，包括根围和根际土壤，同时标记来自不同地区植株、不同部位的土壤，用于统计区分生防菌来源。将分离下的土壤放置于通风橱中风干3天，用30-80目筛去除土壤中对试验不利的残渣，置于室温，备用。
(2)菌株分离：称取每份处理好的土壤样品各5g，并加入锥形瓶中，再分别加入45mL蒸馏水摇匀，置于160r/min的摇床中摇动20min。将摇好的土壤悬液取出，采用稀释涂布平板法对悬液进行梯度稀释，稀释倍数为10倍。
(3)菌株发酵液制备：将经上一步分离的株菌放置于培养基上进行活化培养24h。量取液体培养基，每份25mL，将其加入100mL的锥形瓶中，把对应的菌株接种至锥形瓶中，在30℃，160r/min的摇床上振荡发酵培养6h。使用移液枪吸取菌液至EP管中，在4℃，10000r/min的离心机中离心10min，取上清液，做好标记，得到菌株发酵液。
(4)初筛：取每份菌株发酵液1mL，加入24孔组织培养板管中，并每份加入0.2mL显微镜镜检约100条根结线虫二龄幼虫悬液，混匀，置于25℃的培养箱中，24h后，吸取上清液丢弃，并加入0.2mL(1mol/L)的NaOH溶液，该步骤的目的是防止假死的根结线虫影响试验结果(NaOH溶液可刺激假死的根结线虫，使其恢复活性)，混匀，显微镜观察。无菌蒸馏水处理为对照组，每个处理重复3次，统计处理组和对照组死亡的线虫数目，并计算校正死亡率。以校正死亡率超过70％为生防菌株筛选的指标。菌株对线虫的校正死亡率达到70％，则可认为其对根结线虫二龄幼虫的活性具有显著的拮抗作用。
线虫死亡率(％)＝死亡线虫数/供试线虫数×100
校正死亡率(％)＝(处理线虫死亡率—对照线虫死亡率)/(1—对照线虫死亡率)×100
(5)复筛：将初筛中抗线虫株菌株发酵液吸取0.2mL至PE管中，并对其浓度进行5倍稀释，将菌株发酵液分成4组，将处理的稀释溶液加入组织培养板中，每孔加250mL，然后每孔再加入0.2mL含约100条根结线虫二龄幼虫的悬液，混匀后置于25℃培养箱中，每组分别培养4h、8h、12h、24h，无菌蒸馏水处理作为对照组，重复3次。按初筛方法统计计算线虫死亡率和校正死亡率。经过复筛，得到校正死亡率最高的菌株，即为菌株B295。图2(a)是空白对照清水处理组培养24h的线虫。图2(b)是菌株B295处理组培养24h的线虫。
实施例2
阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295的鉴定
(1)菌株B295生物学形态特征
接种菌株B295在改良的NA培养基平板上培养48h，培养温度37℃，可以观察到芽孢，在显微镜下观察菌株(参见附图1(a)和附图1(b))为杆状，菌落不透明，菌落呈圆形或椭圆形，颜色为乳白色，表面光滑。通过革兰氏染色结果为革兰氏染色阳性菌。
(2)B295菌株的16S rDNA的鉴定
提取菌株B295基因组DNA为模板，用引物63F和1387R进行扩增，扩增出约1.4kb的片段。将纯化后的DNA片段连接到pMD-19T载体上，热击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选，得到了插入片段的转化子，摇菌后提取质粒，用通用引物进行测序，测序拼接后16S rDNA序列长度为1459bp，将所得序列在NCBI的genbank与其他细菌的16S rDNA序列比对得出：菌株B295和Bacillus aryabhattai相似度在99％以上。初步确定菌株B295为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)，该菌株被命名为阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)B295。
实施例3阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295菌剂的制备方法
阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295菌剂的制备方法，包括活化培养、发酵培养步骤，具体包括：
1S)活化培养：将阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295接种到无机盐培养液中，于温度30℃、搅拌速度为180rpm的条件下震荡培养18h得到液体发酵种子；
2S)发酵培养：将液体发酵种子按培养基体积1～10％的量接种入发酵罐，在30℃下培养36h，搅拌速度为180rpm，得到阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295发酵液；
3S)将阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295发酵液离心10min(8000rpm)，弃去上清液，用100倍的pH值为7.2的磷酸缓冲液悬浮得到目标物阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)B295为活性成分的菌剂。
其中，步骤1S)中无机盐培养液的配方为NaCl 1.5g、Na2HPO4 1g、Na H2PO4 0.5g、K2SO4 1.5g、MgSO4 0.5g，蒸馏水补足至1000mL，混合后搅拌均匀，pH值为7.2，高压蒸汽灭菌后制得。
其中，步骤2S)中所述的培养基为NA液体培养基，是将牛肉膏3g，NaCl 5g，大豆蛋白胨7g，以蒸馏水补足至1000mL，混合后搅拌均匀，pH7.2，高压蒸汽灭菌后制得。
其中，步骤3S)中，pH为7.2的0.1mol/L的磷酸缓冲液的配方为：取0.1mol/L的磷酸二氢钠39ml和0.1mol/L的磷酸氢二钠61ml，用水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌(121℃、20min)后即得。
实验例1阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295在温室盆栽条件下的生防效果：
根据Benjumin D根结危害程度分级标准调查植株发病程度，根据记录的原始数据，按公式计算病情指数和防治效果。
表1根结危害程度分级标准
级数 分级标准
0级 无根结
Ⅰ级 根结占全根系的1％～25％
Ⅱ级 根结占全根系的26％～50％
Ⅲ级 根结占全根系的51％～75％
Ⅳ级 根结占全根系的76％～100％
病情指数＝100×∑(各级病根数×各级代表值)/(调查总根数×最高级代表值)；
防治效果(％)＝(对照病情指数—处理病情指数)/对照病情指数×100。
模拟冬季温室的环境，温室温度控制为15-18℃。实验共3组，每组设置3次重复，分别是市售化学杀虫剂处理组S1、阿氏芽孢杆菌B295处理组S2以及清水处理组S3。将番茄接种根结线虫，在接种后2日分别浇灌市售化学杀虫剂、阿氏芽孢杆菌B295发酵液以及清水，番茄种植90天，取番茄根部，根据病情级别确定根结线虫的发病情况(参见图3(a)、图3(b)、图3(c))。
表2不同处理对南方根结线虫的防治效果
标号 试剂处理 病情指数 相对防治效果(％)
1 S1 35.71 57.14a
2 S2 25.00 70.00b
3 清水对照 83.33 ——
注：数据SPSS20.0单因素方差分析，S-N-K法对均值进行显著性比较(P＜0.05)
实验例2阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295在田间试验条件下的生防效果
2018年在河北省衡水市饶阳县番茄生产基地进行菌株B295的田间防效试验，结果见表3和表4。
表3定植2个月后防治效果
Figure BDA0002612788210000071
Figure BDA0002612788210000081
注：数据用SPSS20.0单因素方差分析，S-N-K法对均值进行显著性的比较(P＜0.05)
表4定植5个月后防治效果
处理 发病率(％) 病情指数 防治效果(％)
B295 44.48 16.23 73.96a
阿维菌素 95.32 45.22 27.47b
空白对照 100 62.35 —
注：数据用SPSS20.0单因素方差分析，S-N-K法对均值进行显著性的比较(P＜0.05)
在定植2个月后，菌株B295处理的番茄植株，发病率为25.10％，病情指数是3.46，相对防治效果为70.40％；对照药剂阿维菌素处理发病率为34.53％，相对防治效果为47.64％。在定植5个月后，菌株B295处理的番茄植株，发病率为44.48％，病情指数是16.23，相对防治效果为73.96％；对照药剂阿维菌素处理发病率为95.32％，病情指数为45.22，相对防治效果为27.47％。可以得出，菌株B295处理在番茄定植5个月后的防治效果高于定植2个月的防治效果，表明菌株B295的防治效果随着定植时间的延长而增强。
实验例3阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295对作物促生效果
(1)B295对番茄地上部生长的影响
在温室进行盆栽实验，用市售促生剂、阿氏芽孢杆菌B295发酵液、清水浇灌番茄幼苗，培养30d后整株挖出，处理植株地上部，称重比较各个处理差异，结果如附图4(a)。市售促生剂与阿氏芽孢杆菌B295发酵液和清水对照相比，均表现出明显的对地上植株的促生作用，地上鲜重分别增加了7.8％和12.1％。
(2)B295对番茄地上部生长的影响
在温室进行盆栽实验，用市售促生剂、阿氏芽孢杆菌B295发酵液、清水浇灌番茄幼苗，培养30d后，处理植株根部，称重比较各个处理差异，结果如附图4(b)。市售促生剂与阿氏芽孢杆菌B295发酵液和清水对照相比，均表现出明显的对植株根部的促生作用，根系干重分别增加了5.6％和11.8％。
实验例4阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295对多种土传病原菌有显著抑菌作用
在PDA培养基平板上中央放置对腐霉菌、对丝核菌、对疫霉菌和对镰刀菌的菌饼(1cm)，分别在菌落边缘两侧相距2cm处接种阿氏芽孢杆菌B295(划线2mm)，置于培养箱28℃黑暗培养，5次重复。培养6d后，测量病原菌菌落直径和抑菌带，用抑菌率比较处理菌株对病原菌抑制作用的强弱：抑菌率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％，结果见表5。
表5阿氏芽孢杆菌B295菌株对多种土传病原菌的拮抗作用
病原菌 相对菌丝生长抑制率(％)
对腐霉菌 45.89±1.32
对丝核菌 52.02±2.25
对疫霉菌 50.11±1.85
对镰刀菌 48.33±1.52
注：数据用SPSS20.0单因素方差分析，S-N-K法对均值进行显著性的比较(P＜0.05)
实验例5阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295耐低温能力测定
菌株的耐低温测定一共设置了四个温度，分别是4℃、10℃、15℃和20℃。将B295菌株接种在平板上，分别放置在对应四种温度下进行培养，记录菌株生长的初始时间，分析判断菌株的耐低温能力。
温度 4℃ 10℃ 15℃ 20℃
生长初始时间(d) 26 13 9 6
蔬菜根结线虫主要发生在我省温室生产中，每年的冬春季温室番茄和秋冬季温室番茄是我省番茄生产的主要茬口。一般番茄根结线虫发生过程中，也存在温室内温度低、湿度大的特征。菌株B295可以耐受的温度较低，可以在4℃环境下生长，说明阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295能够长时间在土壤低温环境中繁殖生长，发挥抑制线虫的作用。
由上述实施例1-3以及实验例1-5可以看出：通过实验例1和实验例4可以看出，本申请经过筛选得到的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295以及由其发酵培养得到的菌剂对作物根结线虫有良好防效，并且对多种植物病原菌有显著抑菌作用、防治效率高。通过实验例2可以看出，对照药剂随着时间增加药效减低，而B295随着时间增加药效未见明显降低，说明B295可以稳定定植在植物根部，具有良好的稳定性，是长效的线虫防治剂。通过实验例3可以看出，本申请的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295对作物促生效果较好。通过实验例5可以看出，菌株B295可以耐受的温度较低，可以在4℃环境下生长，说明本申请的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295能够长时间在土壤低温环境中繁殖生长，发挥抑制线虫的作用。因此，本发明提供的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295克服了传统化学杀菌剂在根结线虫防治过程中防效差以及残留、污染和抗药性等缺陷，能够安全、高效、快速的杀灭根结线虫，并且其菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。
需要说明的是：在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包含一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个…”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295，其特征在于，包括:保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2019年10月16日，保藏编号为CGMCC NO.18691；
所述阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295的菌落革兰氏染色反应阳性，细胞形状为杆状，菌落呈圆形或椭圆形，颜色为乳白色，表面光滑，边缘整齐且透明性差。
2.一种菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295。
3.根据权利要求2所述菌剂，其特征在于，以所述阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295经活化培养、发酵培养后制成的菌剂。
4.一种权利要求3所述菌剂的制备方法，其特征在于包括活化培养、发酵培养步骤，具体包括：
1S)活化培养：将所述阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295接种到无机盐培养液中，于温度25～35℃、搅拌速度为120～220rpm的条件下震荡培养12～24h得到液体发酵种子；
2S)发酵培养：将所述液体发酵种子按培养基体积1～10％的量接种入发酵罐，在25～35℃下培养24～72h，搅拌速度为120～220rpm，得到阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295发酵液；
3S)将所述阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295发酵液离心、弃去上清液，用50～100倍的pH值为7.2的磷酸缓冲液悬浮得到目标物阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295为活性成分的菌剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述1S)步骤中所述无机盐培养液的配方为NaCl 1.5g、Na2HPO4 1g、NaH2PO4 0.5g、K2SO4 1.5g、MgSO4 0.5g，蒸馏水补足至1000mL，混合后搅拌均匀，pH值为7.2，高压蒸汽灭菌后制得。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述2S)步骤中所述的培养基为NA液体培养基，是将牛肉膏3g，NaCl 5g，大豆蛋白胨7g，以蒸馏水补足至1000mL，混合后搅拌均匀，pH 7.2，高压蒸汽灭菌后制得。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述3S)步骤中离心的转速为8000～12000rpm/min，离心时间为8～10min。
8.一种防治根结线虫的方法，其特征在于，将根据权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B295或根据权利要求3所述的菌剂施用于作物。
9.根据权利要求8所述防治根结线虫的方法，其特征在于，所述根结线虫为南方线虫。
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