WO2018004016A1 - 고추 식물체로부터 분리한 슈도지마 추라시맨시스 ｒｇｊ1 균주 및 이의 용도 - Google Patents

고추 식물체로부터 분리한 슈도지마 추라시맨시스 ｒｇｊ1 균주 및 이의 용도 Download PDF

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pepper
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류충민
이가형
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한국생명공학연구원
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the present invention relates to Pseudojima Churashimansis RGJ1 strain isolated from pepper plants, and more particularly, to induce systemic resistance against plant pathogens or plant viruses isolated from pepper plants.
  • Pseudozyma that Pseudozyma Churashimansis RGJ1 says churashimaensis RGJ1) strain, a microbial agent for controlling plant diseases or increasing the yield of the plant comprising the strain or its culture as an active ingredient, a method for producing a microbial agent comprising the step of culturing the strain and the strain or its culture It relates to a method for controlling the disease of the plant comprising the step of immersing in the seedlings of plants, soil irrigation treatment or foliage treatment on the ground.
  • the method mainly used for suppressing and controlling the occurrence of plant pathogens is a chemical synthetic pesticide.
  • synthetic pesticides are used to limit ecosystems, cause human toxicity due to residues, and cause various diseases such as carcinogenesis and malformations. Therefore, research on the development of environmentally friendly biological pesticides that can replace synthetic pesticides is being actively conducted.
  • One of the methods that many researchers have tried to solve the problem of chemical control method is the biological control method using microorganisms.
  • biological control methods using microorganisms have recently been studied as an alternative to chemical control methods to control crop diseases, with increasing consumer awareness of food safety and increasing preference for eco-friendly agricultural products.
  • red pepper The most important diseases of red pepper are plague, which is a contagious soil, and anthrax, powdery mildew, and bacterial spot pattern diseases that occur on the ground.
  • Red pepper is one of the crops that has been treated with disinfectant during the growing season because it is difficult to control the disease because the disease occurrence pattern is very different depending on the weather conditions. Therefore, it is important to select microorganisms having excellent bottle control effects and to use them for bottle control in order to produce environment-friendly clean peppers.
  • Most of the microorganisms developed to control pepper disease have been developed for the purpose of controlling pepper blight. Shen et al. Reported that Serratia plymuthica was effective in controlling pepper blight (Shen et al., Plant Pathol. J., 21, 64-67, 2005). However, there are very few reports of microorganisms having excellent control effects against ground diseases of red pepper.
  • Korean Patent Publication No. 2009-0105726 discloses' Bacillus megaterium 22-5 strain for controlling bacterial spot pattern disease and anthrax in pepper '
  • Korean Patent Application Publication No. 2012-0075936 discloses' P25 bacteria in soil-derived Bacillus genus and Its use 'is disclosed, but Pseudozyma Pseudozyma to induce induced systemic resistance to plant pathogens or plant viruses isolated from pepper plants as in the present invention ( Pseudozyma) churashimaensis RGJ1) strains are not known at all.
  • the present invention is derived from the above requirements, the present invention is isolated and identified from the pepper plant Pseudozyma RGJ1 ( Pseudozyma) The present invention was completed by confirming that the churashimaensis RGJ1) strain induces systemic resistance against pepper plant bacterial pathogens or plant viruses to have plant disease control effects.
  • Pseudozyma Pseudozyma inducing systemic resistance against plant bacterial pathogens or plant viruses isolated from pepper plants, induced systemic resistance ( Pseudozyma) churashimaensis RGJ1) strain.
  • the present invention also provides a microbial preparation for plant disease control comprising the strain or its culture as an active ingredient.
  • the present invention also provides a microbial preparation for increasing the yield of the plant comprising the strain or its culture as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for producing a microbial agent comprising the step of culturing the strain.
  • the present invention also provides a method for controlling the disease of the plant comprising the step of immersing the strain or its culture in the seedlings of plants, soil irrigation treatment or foliage treatment on the ground.
  • Pseudozyma churashimaensis RGJ1 strain isolated from the pepper plant of the present invention induces systemic resistance against pepper plant bacterial pathogens or plant viruses, resulting in plant disease control effects. Confirmed.
  • the strain of the present invention can be used as a natural friendly biological pesticide without the risk of human toxicity due to environmental pollution and residual pesticides caused by the side effects of pesticides, increasing the control effect of the pepper plant against infectious diseases fungi and plant disease resistance It is thought that it can be usefully used industrially.
  • Figure 1 shows the locations of each region sampled in order to separate the yeast surviving in the red pepper and the type of yeast isolated from that place.
  • Figure 2 shows the results of the primary resistance induction of yeast strain surviving in pepper.
  • RGJ1 Pseudozyma churashimaensis
  • RGJ5 Cryptococcus magnus
  • GS5 Pseudozyma aphidis
  • GS6 Pseudozyma Pseudozyma tsukubaensis
  • Figure 3 shows the results of the secondary induction resistance to the yeast strain RGJ1 isolated from pepper.
  • BTH benzothiadiazole
  • Kanamycin Direct bactericidal control antibiotic
  • Figure 4 is a result confirming the resistance to bacterial bacterial pathogens of red pepper treated with yeast RGJ1 of the present invention in the field.
  • Figure 5 is a result of confirming the induction resistance to the virus of the pepper treated with the yeast strain RGJ1 of the present invention in the field.
  • Figure 6 is a result of confirming the induction resistance to the virus of the pepper treated with yeast RGJ1 of the present invention in the field by quantification of the virus through qPCR.
  • CMV Cucumber Mosaic Virus
  • BBWV Broad Bean Wilt Virus
  • PR4 and PR5 are genes related to induction resistance during invasion of pathogens of peppers treated with the yeast bacterium RGJ1 of the present invention.
  • Figure 9 shows the increase in pepper yield with the treatment of yeast RGJ1 of the present invention in the field.
  • the present invention is Pseudozyma Pseudozyma inducing systemic resistance against plant pathogens or plant viruses isolated from pepper plants, induced systemic resistance ( Pseudozyma) churashimaensis RGJ1) strain.
  • Pseudozyma induced systemic resistance
  • the Pseudojima Churashimosis RGJ1 was deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology on June 24, 2016 (Accession No .: KCTC13051BP).
  • the plant pathogen or plant virus may be pathogens or viruses for various plants, preferably pepper plant pathogens or pepper plant viruses, but is not limited thereto.
  • the plant pathogen may be a bacterial pathogen, preferably a bacterium causing a bacterial spot, and more preferably, a bacterium pathogen ( Xanthomonas axonopodis pv. Vesicatoria), but is not limited thereto.
  • the pepper plant virus may be cucumber mosaic virus (CMV), tobacco mosaic virus (TMV), alfalfa virus (BBWV), chrysanthemum disease virus (CMMV), sweet potato Y virus (PVY), tomato disease control virus (TSWV), pepper stain Virus (PepMoV), pepper mottled virus (PMMoV) and the like, preferably Cucumber Mosaic Virus (Cucumber Mosaic Virus, CMV), Broad Bean Wilt Virus (BBWV), pepper stain virus (PepMoV), pepper Light stain virus (PMMoV) and the like, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a microbial preparation for plant disease control comprising the strain or its culture as an active ingredient.
  • the plant disease may be caused by plant pathogens or plant viruses, and preferably may be caused by pepper plant pathogens or pepper plant viruses, but is not limited thereto.
  • Pepper plant pathogens or pepper plant viruses are as described above.
  • the microbial agent is Pseudozyma Pseudozyma which induces induced systemic resistance to plant pathogens or plant viruses isolated from the pepper plants of the present invention.
  • churashimaensis RGJ1 strain or its culture may be included as an active ingredient.
  • the microbial preparation according to the present invention may be prepared in the form of a liquid fertilizer and may be used in the form of powdered powder by adding an extender thereto or granulated by formulating it.
  • the formulation is not particularly limited. In other words, it can be formulated as a biofertilizer to overcome this in eco-friendly organic farming where the chemical fertilizer supply is limited.
  • the present invention also provides a microbial preparation for increasing the yield of the plant comprising the strain or its culture as an active ingredient.
  • the plant may be preferably a pepper plant, but is not limited thereto.
  • the strain of the present invention was treated to a pepper plant, the yield of pepper fruit showed an increase of about 30% compared to the untreated group.
  • the present invention provides a method for producing a microbial agent comprising the step of culturing the strain.
  • the method for culturing the yeast strain may use any method known in the art, and is not particularly limited to a specific method.
  • the present invention also provides a method for controlling the disease of the plant comprising the step of immersing the strain or its culture in the seedlings of plants, soil irrigation treatment or foliage treatment on the ground.
  • the plant disease may be caused by plant pathogens or plant viruses, and preferably may be caused by pepper plant pathogens or pepper plant viruses, but is not limited thereto.
  • Pepper plant pathogens or pepper plant viruses are as described above.
  • the culture medium in which the strain is cultured and the microbial preparation using the strain may be carried out by dipping treatment in plant seedlings, soil irrigation treatment or foliage treatment on the ground.
  • the culture and microbial preparations can be poured into the soil around the plant or the seeds can be immersed in the culture and preparations.
  • Example 1 Isolation of Viable Yeast Strains from Red Pepper
  • the leaves were collected in the pepper fields of Chungnam and Jeolla province. From September to November 2013, the leaves of the middle part of the red peppers at the end of the harvest were prepared from Jeolla-do, Geoje, Goseong, Hamyang, Jinan, Namhae, and Suncheon.
  • a 10mm diameter cork baller was cut into round disks, and three pepper leaf disks were placed in a 1.5ml tube containing 1ml of sterile water, and beads (Zirconia Beads) were placed on the leaf surface. This allowed for better separation and vortexing in sufficient time.
  • the leaf discs were entered as stock solutions, and diluted sequentially in 1/10 and 1/100 and plated onto agar plate medium for 100 ⁇ l each.
  • the agar medium used was agar medium prepared by adding a rifampicin (rifampin capsule; Yuhan), an antibiotic that prevents bacteria from growing, to a yeast cell-specific YPD medium to separate only yeasts. It was.
  • the yeast colonies from the diluted and smeared plates were passaged separately and grown into pure single cells, which were directly analyzed by genotyping ITS sequencing (Xenotech).
  • ITS1 forward
  • ITS4 reverse
  • Example 2 Primary Induction Resistance of Yeast Strains Surviving in Red Pepper
  • Pseudozyma which is a yeast bacterium isolated from Geojedo Churashimaensis RGJ1 yeast showed the best disease resistance effect.
  • the symptom was reduced by 70% compared to the water treatment, which showed the same significance as the treatment of the chemical BTH, a positive control (FIG. 2).
  • Example 3 Secondary Induction Resistance of Yeast Strains Isolated from Red Pepper
  • Pseudozyma a selection strain that showed the best effect among the various yeast isolates used in the primary induction resistance assay Churashimaensis RGJ1) was confirmed the difference in induction resistance according to the change of treatment method.
  • Example 4 Yeast of the Invention in the Field RGJ1 Of processed chili To bacterial spot pattern pathogen Induction resistance for
  • the positive control was sprayed with a concentration of 1 mM of BTH having an induction resistance effect, and the control was treated with water.
  • the length of the mockup of one treatment zone was 8 meters, and the distance between the peppers and the peppers was 40 cm, which included 20 weeks of pepper per treatment.
  • Two liters of culture and control material were treated per treatment, followed by four replicates of randomly divided treatments.
  • Example 5 Yeast of the Invention in the Field RGJ1 Confirmation of Induction Resistance of Viruses Treated Pepper
  • CMV coat protein forward 5'-CGTTGCCGCTATCTCTGCTAT-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • CMV coat protein reverse 5'-GGATGCTGCATACTGACAAACA-3' (SEQ ID NO: 4)
  • BBWV forward 5'-AATGAAGTGGTGCTCAACTACACA- 3 '(SEQ ID NO: 5)
  • BBWV reverse 5'-TTTTGGAGCATTCAACCATTTGGA-3' (SEQ ID NO: 6).
  • the degree of infection was quantified using specific primers of Pepper mottle virus (PepMoV) and Pepper mild mottle virus (PMMoV). The conditions of the primers used with qPCR are as follows.
  • PepMoV forward 5'-AAGATCAGACACATGGA-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • PepMoV reverse 5'-CAAGCAAGGGTATGCATGT-3' (SEQ ID NO: 8)
  • PMMoV forward 5'-ACAGTTTCCAGTGCCAATCA-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • PMMoV reverse 5'-AAGCGTCTCGGCAGTTG-3 '(SEQ ID NO: 10).
  • Example 6 Yeast strain of the present invention RGJ1 Expression Analysis of Genes Related to Induction Resistance in Pathogenic Invasion of Treated Pepper
  • CaPR4 forward 5'-AACTGGGATTTGAGAACTGCCAGC-3 '(SEQ ID NO: 11), reverse: 5'-ATCCAAGGTACATATAGAGCTTCC-3' (SEQ ID NO: 12), CaPR5 forward: 5'-CTCCACAAGAAACAAGGCA-3 '(SEQ ID NO: 13), reverse: 5 '-GTACGAAGCACGCACACAA-3' (SEQ ID NO: 14).
  • Example 7 Yeast of the Present Invention RGJ1 According to treatment Field pepper yield survey
  • the number of pepper was harvested by examining the yield of 20 peppers in each treatment. A total of four repetitions were performed. It was confirmed that the yield of the yeast RGJ1 treatment increased the yield by 30% compared to the untreated (FIG. 9).

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Abstract

본 발명은 고추 식물체로부터 분리한, 식물체 병원균 또는 식물 바이러스에 대해 전신유도저항성(induced systemic resistance)을 유도하는 슈도지마 추라시맨시스 RGJ1(Pseudozyma churashimaensis RGJ1) 균주, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 병해 방제용 또는 식물의 수확량 증가용 미생물 제제, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제를 제조하는 방법 및 상기 균주 또는 이의 배양액을 식물의 유묘에 침지 처리, 토양 관주 처리 또는 지상부에 경엽 처리하는 단계를 포함하는 식물의 병해를 방제하는 방법을 제공한다.

Description

고추 식물체로부터 분리한 슈도지마 추라시맨시스 ＲＧＪ1 균주 및 이의 용도
본 발명은 고추 식물체로부터 분리한 슈도지마 추라시맨시스 RGJ1 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고추 식물체로부터 분리한, 식물체 병원균 또는 식물 바이러스에 대해 전신유도저항성(induced systemic resistance)을 유도하는 슈도지마 추라시맨시스 RGJ1(Pseudozyma churashimaensis RGJ1) 균주, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 병해 방제용 또는 식물의 수확량 증가용 미생물 제제, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제를 제조하는 방법 및 상기 균주 또는 이의 배양액을 식물의 유묘에 침지 처리, 토양 관주 처리 또는 지상부에 경엽 처리하는 단계를 포함하는 식물의 병해를 방제하는 방법에 관한 것이다.
현재 식물 병원균의 발생 억제 및 방제를 위해 주로 이용하고 있는 방법은 화학적 합성 농약이다. 그러나 이러한 합성 농약은 생태계를 파괴하고, 잔류로 인한 인체 독성 문제를 야기하며, 발암, 기형 등의 각종 질환을 유발할 가능성이 매우 높아 그 사용이 제한되고 있다. 따라서, 합성 농약을 대체할 수 있는 환경친화성 생물 농약의 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다. 화학적 방제법의 문제점을 해결하기 위하여 많은 연구자들에 의해서 시도되어 온 방법 중의 하나가 미생물을 이용하는 생물적 방제법이다. 이처럼 미생물을 이용하는 생물적 방제법은 최근 들어 많은 소비자들의 식품 안전성에 대한 인식이 높아지고 친환경농산물에 대한 선호도가 급증하면서 작물의 병을 방제하기 위한 화학적 방제법의 대안으로 연구되고 있다.
고추의 중요한 병으로는 토양 전염성 병인 역병을 비롯하여, 지상부에서 발생하는 탄저병, 흰가루병, 세균성점무늬병 등이 고추의 생산을 위협하는 식물병으로 알려져 있다. 고추는 재배 기간이 길뿐만 아니라 기상의 변화에 따라서 병 발생 양상이 매우 달라지기 때문에 방제가 어려워서 재배 기간 중에 살균제의 처리가 매우 빈번한 작물 중에 하나이다. 따라서 친환경 청결고추를 생산하기 위해서는 병 방제 효과가 우수한 미생물을 선발하여 병 방제를 위해서 사용하는 것이 중요하다. 고추의 병을 방제하기 위해서 개발된 미생물은 대부분 고추 역병을 방제하기 위한 목적으로 개발되었다. Shen 등은 쎄라티아 플리무티카(Serratia plymuthica)가 고추 역병의 방제에 효과가 있다고 보고하였다(Shen et al., Plant Pathol. J., 21, 64-67, 2005). 그러나 고추의 지상부 병에 대한 방제 효과가 우수한 미생물의 보고는 매우 적은 실정이다.
한국공개특허 제2009-0105726호에서는 '고추의 세균성점무늬병과 탄저병을 방제하는 바실러스 메가테리움 22-5 균주'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2012-0075936호에서는 '토양 유래 바실러스 속 ＰＢ25 균주 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 고추 식물체로부터 분리한, 식물체 병원균 또는 식물 바이러스에 대해 전신유도저항성(induced systemic resistance)을 유도하는 슈도지마 추라시맨시스 RGJ1(Pseudozyma churashimaensis RGJ1) 균주에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 고추 식물체로부터 분리 동정한 슈도지마 추라시맨시스 RGJ1(Pseudozyma churashimaensis RGJ1) 균주가 고추 식물체 세균성 병원균 또는 식물 바이러스에 대해 전신유도저항성(induced systemic resistance)을 유도하여 식물병 방제 효과를 갖게 하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고추 식물체로부터 분리한, 식물체 세균성 병원균 또는 식물 바이러스에 대해 전신유도저항성(induced systemic resistance)을 유도하는 슈도지마 추라시맨시스 RGJ1(Pseudozyma churashimaensis RGJ1) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 병해 방제용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물의 수확량 증가용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 식물의 유묘에 침지 처리, 토양 관주 처리 또는 지상부에 경엽 처리하는 단계를 포함하는 식물의 병해를 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 고추 식물체로부터 분리한 슈도지마 추라시맨시스 RGJ1(Pseudozyma churashimaensis RGJ1) 균주는 고추 식물체 세균성 병원균 또는 식물 바이러스에 대해 전신유도저항성(induced systemic resistance)을 유도하여 식물병 방제 효과를 야기하는 것을 확인하였다. 본 발명의 균주는 농약의 부작용으로 발생하는 환경 오염 및 잔류 농약으로 인한 인체 독성의 위험성이 없는 자연 친화적인 생물 농약으로 사용될 수 있으며, 고추 식물의 전염병 균류에 대한 방제 효과 및 식물의 병 저항성을 증가시키는 효과가 있어 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
도 1은 고추에서 생존하는 효모를 분리하기 위해 샘플링한 지역별 장소 및 그 장소에서 분리된 효모균 종류를 나타낸다.
도 2는 고추에서 생존하는 효모 균주에 대한 유도저항성 1차 분석 결과를 나타낸다. RGJ1 : 슈도지마 추라시맨시스(Pseudozyma churashimaensis), RGJ5 : 크립토코커스 매그너스(Cryptococcus magnus), GS5 : 슈도지마 애피디스(Pseudozyma aphidis), GS6 : 슈도지마 츄쿠바엔시스(Pseudozyma tsukubaensis)
도 3은 고추에서 분리한 효모 균주인 RGJ1에 대한 유도저항성 2차 분석 결과를 나타낸다. BTH(benzothiadiazole): 유도저항성 대조구, 카나마이신(Kanamycin): 직접 살균 대조 항생제
도 4는 필드에서 본 발명의 효모균 RGJ1을 처리한 고추의 세균성점무늬병원균에 대한 유도저항성을 확인한 결과이다.
도 5는 필드에서 본 발명의 효모균 RGJ1을 처리한 고추의 바이러스에 대한 유도저항성을 병징으로 확인한 결과이다.
도 6은 필드에서 본 발명의 효모균 RGJ1을 처리한 고추의 바이러스에 대한 유도저항성을 qPCR을 통한 바이러스의 정량으로 확인한 결과이다. CMV : 오이모자이크바이러스(Cucumber Mosaic Virus), BBWV : 잠두위조바이러스(Broad Bean Wilt Virus)
도 7은 필드에서 본 발명의 효모균 RGJ1을 처리한 고추의 바이러스에 대한 유도저항성을 qPCR을 통한 바이러스의 정량으로 확인한 결과이다. PepMoV : 고추얼룩바이러스(Pepper mottle virus), PMMoV : 고추연한얼룩바이러스(Pepper mild mottle virus)
도 8은 본 발명의 효모균 RGJ1을 처리한 고추의 병원균 침입시 유도저항성 관련 유전자인 PR4 및 PR5의 발현량을 분석한 결과이다.
도 9는 필드에서 본 발명의 효모균 RGJ1의 처리에 따른 고추 수확량의 증가를 나타낸다.
도 10은 온실 내 효모균 RGJ1의 잎 정착능력을 확인한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고추 식물체로부터 분리한, 식물체 병원균 또는 식물 바이러스에 대해 전신유도저항성(induced systemic resistance)을 유도하는 슈도지마 추라시맨시스 RGJ1(Pseudozyma churashimaensis RGJ1) 균주를 제공한다. 상기 슈도지마 추라시맨시스 RGJ1를 한국생명공학연구원에 2016년 06월 24일자로 기탁하였다 (기탁번호: KCTC13051BP).
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 식물체 병원균 또는 식물 바이러스는 다양한 식물에 대한 병원균 또는 바이러스일 수 있으며, 바람직하게는 고추 식물체 병원균 또는 고추 식물 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 식물체 병원균은 세균성 병원균일 수 있으며, 바람직하게는 고추 세균성점무늬병 (bacterial spot) 원인균일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 세균성점무늬병원균(Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 고추 식물 바이러스는 오이모자이크바이러스(CMV), 담배모자이크바이러스(TMV), 잠두위조바이러스(BBWV), 국화병반바이러스(CMMV), 고구마Y바이러스(PVY), 토마토병반조위바이러스(TSWV), 고추얼룩바이러스(PepMoV), 고추연한얼룩바이러스(PMMoV) 등일 수 있으며, 바람직하게는 오이모자이크바이러스(Cucumber Mosaic Virus, CMV), 잠두위조바이러스(Broad Bean Wilt Virus, BBWV), 고추얼룩바이러스(PepMoV), 고추연한얼룩바이러스(PMMoV) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 병해 방제용 미생물 제제를 제공한다. 상기 식물 병해는 식물체 병원균 또는 식물 바이러스에 의해 야기된 것일 수 있으며, 바람직하게는 고추 식물체 병원균 또는 고추 식물 바이러스에 의해 야기된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 고추 식물체 병원균 또는 고추 식물 바이러스는 전술한 바와 같다.
상기 미생물 제제는 본 발명의 고추 식물체로부터 분리한, 식물체 병원균 또는 식물 바이러스에 대해 전신유도저항성(induced systemic resistance)을 유도하는 슈도지마 추라시맨시스 RGJ1(Pseudozyma churashimaensis RGJ1) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명에 의한 미생물 제제는 액상 비료 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다. 즉 화학비료 공급이 제한된 친환경 유기농업에서 이를 극복하기 위한 생물비료로 제형화가 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물의 수확량 증가용 미생물 제제를 제공한다. 상기 식물은 바람직하게는 고추 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 균주를 고추 식물에 처리시 무처리구에 비해 30% 정도 고추 열매 수확량의 증가를 보였다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 효모 균주의 배양 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 식물의 유묘에 침지 처리, 토양 관주 처리 또는 지상부에 경엽 처리하는 단계를 포함하는 식물의 병해를 방제하는 방법을 제공한다. 상기 식물 병해는 식물체 병원균 또는 식물 바이러스에 의해 야기된 것일 수 있으며, 바람직하게는 고추 식물체 병원균 또는 고추 식물 바이러스에 의해 야기된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 고추 식물체 병원균 또는 고추 식물 바이러스는 전술한 바와 같다.
상기 식물의 병해를 방제하는 방법으로는 상기 균주를 배양한 배양액 및 상기 균주를 이용한 미생물 제제를 식물의 유묘에 침지 처리, 토양 관주 처리 또는 지상부에 경엽 처리하여 수행할 수 있다. 침지하는 방법의 경우, 배양액 및 미생물 제제를 식물체 주변의 토양에 붓거나 또는 종자를 배양액 및 제제에 담가둘 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 고추에서 생존하는 효모 균주 분리
고추의 잎에서 생존하면서 고추에게 유용한 역할을 하는 효모균을 분리하기 위해 충남, 전라도 지역의 고추밭을 다니며 잎을 채집하였다. 2013년 9월부터 11월 까지 전라도 거제, 고성, 함양, 진안, 남해, 순천 등의 지역에서 수확 막바지의 고추의 중간 부분의 잎을 채취하여 준비하였다. 지름 10mm의 코르크볼러로 원형디스크로 잘라내고, 멸균수 1㎖이 들어있는 1.5㎖ 튜브에 고추잎 디스크를 세장씩 넣고, 비드(Zirconia Beads; 지름 1mm의 작은 구슬)를 넣어 잎 표면에 부착된 미생물이 더 잘 분리되도록 하여 충분한 시간으로 볼텍싱했다. 잎 디스크가 들어간 것을 원액으로 보고 이를 1/10, 1/100로 순차적으로 희석하여 각각 100㎕씩 아가 플레이트 배지에 도말하였다. 이때 사용한 아가 배지는 효모균만을 분리하기 위해 효모균 전용 배지인 YPD 배지에, 세균을 자라지 못하게 하는 항생제인 리팜피신(리팜핀 캡슐;유한양행)을 최종농도가 100㎍/㎖이 되도록 첨가하여 만든 아가 배지를 사용하였다. 희석되어 도말된 플레이트에서 나온 효모균 콜로니를 따로 계대배양하여 순수한 단일 세포(single cell)로 키우고, 이를 직접 ITS 시퀀싱을 맡겨(제노테크) 분석하여 확인하였다. 사용된 ITS 시퀀싱 프라이머의 서열은 다음과 같다(ITS1(정방향) : 5'-TCC GTA GGT GAA CCT TGC GG-3'(서열번호 1), ITS4(역방향) : 5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'(서열번호 2)).
그 후, 전라도 (진안-함양-고성-통영-거제-남해-순천) 지역의 고추밭에서 잎을 채취하였으며 분리된 효모균의 시퀀싱을 통해 동정되었다. 다양한 효모균이 고추의 잎에서 생존하고 있으며 그 중에서도 슈도지마(Pseudozyma) 속의 효모균이 약간 우점하여 다량이 생존하고 있음이 확인되었다(도 1).
실시예 2. 고추에서 생존하는 효모 균주에 대한 유도저항성 1차 분석
분리된 효모균들의 고추에 유도저항성 능력을 확인하기 위해서 온실에서 1차 균주 선발 실험을 진행하였다. 파종하여 7일된 고추(새로운 PR 고추; 흥농종묘)를 50공 포트에 옮겨심고, 3주 뒤 떡잎을 제외하고 본엽이 4엽까지 나왔을 때 분리된 효모 균주를 고추 모종의 지상부에 스프레이 처리하였다. 이때 처리한 미생물은 고체 배지에서 3일 정도 키운 효모균을 멸균수에 현탁하여 O.D.600=1 (106 CFU/㎖)로 맞추어 고추 모종 하나당 50㎖씩 스프레이 하였다. 미생물을 처리하고 나서 7일 뒤에 고추의 세균성점무늬병원균(Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria)을 O.D.600=0.01로 맞추어서 고추의 잎 뒷면에 주사기로 찔러서 직접 주입하여 접종하였다. 고추 모종 하나당 3장의 잎에 병원균을 접종하고 이 후 5~7일 사이 병징이 나타나기 시작하면 병징을 조사하여 병원균에 대한 저항성을 확인하였다. 병징 조사는 병을 접종한 잎 부분에서 병의 심한 정도 (disease severity)를 0 ~ 5까지 임의로 나누어 조사를 하였다(0: 병징이 전혀 나타나지 않음, 1: 잎이 원래의 색보다 약간 흐린 연두색으로 변함, 2: 잎이 노랗게 되는 황화현상이 보임, 3: 노랗게 된 부분에서 검은 부분이 조금씩 보임, 4: 잎의 1/3 이상이 검게 변함, 5: 잎이 전부 검은색으로 변하여 흐물거림). 고추 모종 하나당 4개의 잎을 따로 조사하며, 총 5 반복을 통하여 20개의 병징 정도를 조사하여 확인하였다.
병원균 접종 후 7일 뒤 병징을 조사한 결과, 거제도에서 분리된 효모균인 슈도지마 추라시맨시스 RGJ1(Pseudozyma churashimaensis RGJ1) 효모균이 가장 우수한 병 저항성 효과를 나타내었다. 물 처리구와 비교하여 70% 병징이 감소하였으며, 이는 양성 대조구(positive control)인 화학물질 BTH의 처리구와 같은 유의성을 나타내었다(도 2).
실시예 3. 고추에서 분리한 효모 균주에 대한 유도저항성 2차 분석
1차 유도저항성 분석 실험에서 사용된 여러 효모 분리균 중에서 가장 우수한 효과를 나타낸 선발균주인 슈도지마 추라시맨시스(Pseudozyma churashimaensis RGJ1)를 대상으로 처리방법의 변화에 따른 유도저항성의 차이를 확인하였다. 효모균 RGJ1을 배양한 배양액을 O.D.600=1로 맞추어 1차 유도저항성 실험과 같은 조건으로 고추의 지상부 엽면에 스프레이 처리했을 때, 배양액을 토양에 직접 관주를 하였을 때의 차이를 비교하였고, 양성 대조구로 유도저항성을 일으키는 화학물질인 BTH와 대조구로 물 처리구를 사용하여 온실에서 진행하였다. 또한, 이 효모균 RGJ1에 의한 직접적인 살균작용이 있는지 확인하기 위하여, 지름 90mm의 플레이트에 고추세균성점무늬 병원균인 Xav.를 O.D.600=0.5로 맞추어 미리 도말한 뒤, 그 위에 지름 10mm의 페이퍼디스크를 얹어놓고, 차례로 효모균 RGJ1(O.D.600=1로 맞추어 20마이크로리터), BTH(1mM), 항생제 카나마이신25 그리고 물 처리를 같은 양 처리하여 30℃에서 배양하여 살균효과가 나타나는 클리어존이 나타나는 것으로 비교하였다(도 3).
1차 저항성 확인 실험과 유사한 결과로, 병 저항성이 유도되었으며 잎에 스프레이 처리할 때와 토양에 직접 관주 처리할 때의 차이는 나타나지 않았다. 또한 대치배양 결과, 효모균 RGJ1 주변에 투명환이 생기지 않은 것으로 보아 병원균을 직접 죽이는 살균효과는 없고 저항성을 유도하는 것으로 확인되었다(도 3).
실시예 4. 필드에서 본 발명의 효모균 RGJ1을 처리한 고추의 세균성점무늬병원균에 대한 유도저항성 확인
실험실 내와 온실에서 확인하여 선발된 효모 균주를 대상으로 고추밭 포장에서 유도저항성 능력을 검증하였다. 충청남도 금산군 군북면 외부리(36° 8' 50.81'' N, 127° 29' 29.20'' E)에 위치한 면적 200평의 고추밭에서 진행되었다. 2014년 6월, 밭에 이식된지 한달된 고추의 지상부에 효모균 RGJ1 배양액을 온실 실험때와 같은 조건으로 O.D.600=1(107 CFU/㎖)의 농도로 스프레이 처리하였다. 양성 대조구로는 유도저항성 효과가 있는 BTH를 1mM의 농도로 스프레이하였으며, 대조구로는 물 처리하였다. 랜덤하게 나누어진 처리구역에 한 처리구의 이랑 길이는 8미터이며, 고추와 고추 사이의 간격은 40cm로 한 처리구당 고추 20주씩을 포함하였다. 한 처리구 당 배양액 및 대조구 물질을 2리터씩 처리하였으며, 랜덤하게 나뉘어진 처리구로 4반복 수행하였다. 처리 후 10일 뒤에, 세균성점무늬병원균(Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria)을 O.D.600=0.01로 희석하여 고추의 잎에 반정도 들어가도록 주사기를 사용하여 잎의 뒷면에 찔러주어 접종을 하였다. 고추 한 개체당 5장의 잎에 접종을 하여 한 처리구당 총 10개의 고추에 접종을 하며, 이후 7일 뒤부터 병징을 관찰하였다. 병징 조사는 앞에 온실 내 확인실험과 같은 방법으로 병징의 정도를 0-5로 나누어 병의 심한 정도를 확인하였다.
필드실험 결과, 온실내 실험과 마찬가지로 효모균의 스프레이 처리에 의해 저항성이 유도되어 세균성점무늬병원균의 병징이 50% 감소한 것을 확인하였다(도 4).
실시예 5. 필드에서 본 발명의 효모균 RGJ1을 처리한 고추의 바이러스에 대한 유도저항성 확인
야외 필드실험에서 효모균을 처리한 뒤 60일이 경과한 고추의 새로 난 어린 순잎을 처리구당 5장씩 채취하여, 액체 질소에 바로 담아 급속냉동을 시킨 후 막자사발로 갈아 분쇄하여 RNA 추출 키트 (RNeasy kit; QIAGEN)를 사용하여 추출하였다. 추출된 RNA를 cDNA로 합성하고, 합성된 cDNA를 사용하여 qPCR (CFX connect Real-Time System; BIO-RAD)로 바이러스의 양을 정량하는 방법인 RT-qPCR을 수행하였다. 자연 발생한 오이모자이크바이러스 (CMV : Cucumber Mosaic Virus)와 잠두위조바이러스 (BBWV : Broad Bean Wilt Virus)의 특이적 프라이머를 사용하여 감염정도를 정량하였다. qPCR과 사용된 프라이머의 조건은 다음과 같다. CMV 외피(coat) 단백질 정방향: 5'-CGTTGCCGCTATCTCTGCTAT-3'(서열번호 3), CMV 외피(coat) 단백질 역방향: 5'-GGATGCTGCATACTGACAAACA-3'(서열번호 4), BBWV 정방향: 5'-AATGAAGTGGTGCTCAACTACACA-3'(서열번호 5), BBWV 역방향: 5'-TTTTGGAGCATTCAACCATTTGGA-3'(서열번호 6). 또한, 고추얼룩바이러스(PepMoV, Pepper mottle virus)와 고추연한얼룩바이러스(PMMoV, Pepper mild mottle virus)의 특이적 프라이머를 사용하여 감염정도를 정량하였다. qPCR과 사용된 프라이머의 조건은 다음과 같다. PepMoV 정방향: 5'-AAGATCAGACACATGGA-3'(서열번호 7), PepMoV 역방향: 5'-CAAGCAAGGGTATGCATGT-3'(서열번호 8), PMMoV 정방향: 5'-ACAGTTTCCAGTGCCAATCA-3'(서열번호 9), PMMoV 역방향: 5'-AAGCGTCTCGGCAGTTG-3'(서열번호 10).
Figure PCTKR2016006818-appb-T000001
바이러스 병징 조사에서 고추의 새로 나온 잎을 비교한 결과 물 처리구에서 바이러스 증상이 심하게 나타나는 반면 효모 처리구에서는 병징이 약하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 5). 또한 qPCR을 통한 바이러스의 정량결과에서도 대표적인 CMV 및 BBWV의 두 가지 바이러스 모두 물 처리구에 비해 10배 정도 바이러스의 양이 감소되는 것으로 나타난 것으로 보아 효모균 처리에 의해 바이러스에 적게 감염된 것을 확인하였다(도 6). 또한, PepMoV 및 PMMoV의 두 가지 바이러스 모두 효모균 처리에 의해 바이러스에 적게 감염된 것을 확인하였다(도 7).
실시예 6. 본 발명의 효모균 RGJ1을 처리한 고추의 병원균 침입시 유도저항성 관련 유전자의 발현량 분석
효모균의 작용기전을 연구를 위한 유전자 발현량을 조사하기 위해서 필드실험 진행과정 중 세균성점무늬병원균 접종할 때, ① 병원균을 접종하기 전 ② 병원균을 접종 하자마자 ③ 병원균을 접종하고 6시간 뒤의 세가지 타임 포인트에 고추잎을 채취하여 바로 액체 질소에 급송 냉동시킨 뒤 바이러스 정량법과 같은 방법으로 RNA 추출을 하고 cDNA 합성, qPCR을 통해 고추의 저항성 관련 유전자의 발현량을 조사하였다. 대표적인 고추의 유도저항성 관련 유전자로서 PR 유전자의 발현을 확인하였다. qPCR의 조건은 바이러스 정량과 같으며 사용된 프라이머 정보는 다음과 같다. CaPR4 정방향: 5'-AACTGGGATTTGAGAACTGCCAGC-3'(서열번호 11), 역방향: 5'-ATCCAAGGTACATATAGAGCTTCC-3'(서열번호 12), CaPR5 정방향: 5'-CTCCACAAGAAACAAGGCA-3'(서열번호 13), 역방향: 5'-GTACGAAGCACGCACACAA-3'(서열번호 14).
효모균 처리구에서 6시간째 저항성 유전자인 PR4와 PR5의 발현량이 크게 증가한 것으로 보아, 병원균의 침입에 대응하는 시간이 빨라지는 저항성 프라이밍 효과가 유도되었음을 확인할 수 있었다(도 8).
실시예 7. 본 발명의 효모균 RGJ1을 처리에 따른 필드 고추 수확량 조사
필드에서 유도저항성을 확인한 후 각 처리구의 20개체에서의 고추 수확량을 조사하여 개수를 확인하였다. 총 4반복으로 진행되었다. 효모균 RGJ1의 처리구에서 수확량이 무처리구에 비하여 30% 정도 수량이 증가한 것이 확인되었다(도 9).
실시예 8. 온실 내 효모균 RGJ1의 잎 정착능력 확인
고추잎에서 분리한 효모 균주 슈도지마 추라시맨시스 RGJ1의 잎 정착능력을 재확인하고자, 온실 내 고추 모종을 대상으로 실험을 진행하였다. 발아 후 이식한지 3주 된 고추에 효모 균주를 OD600 값을 1과 2 두개로 맞춘 균 현탁액을 고추의 지상부에 50㎖씩 스프레이 처리한 후 잎을 샘플링하여, 지름 10mm의 코르크볼러로 뚫은 잎 디스크 세 장씩을 멸균수 1㎖이 들어있는 1.5㎖ 튜브에 넣은 후 충분히 볼텍싱하였다. 이를 원액으로 하여 1/10씩 희석하여 효모균 전용 배지인 YPD 아가 플레이트에 100 마이크로리터씩 도말하여 나온 콜로니 개수를 세어 CFU값을 측정하였다. 스프레이 날(Day0)부터 10일 간격으로 샘플링하여 조사하였다(도 10). 처음에 스프레이한 OD600 값에 따른 차이는 크게 없었으며, 10mm의 잎 디스크에 정착하여 살아가는 효모균주는 20일째부터 30일째까지 104 이상으로 유지됨을 확인하였다. 이러한 결과는 분리된 효모균주가 고추의 잎에 잘 붙어서 살아가며 그 밀도는 104 정도가 가장 적정한 효모균주의 생장 농도라고 생각할 수 있다. 또한 이러한 우수한 엽권 정착능으로 인해 작물에 살포처리시 잎에서 잘 생존하면서 장기간 작물에 유도저항성을 일으켜 세균병이나 바이러스병에 잘 걸리지 않는 결과를 나타낸다고 분석되었다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13051BP
수탁일자 : 20160624

Claims (10)

  1. 고추 식물체로부터 분리한, 식물체 병원균 또는 식물 바이러스에 대해 전신유도저항성(induced systemic resistance)을 유도하는 슈도지마 추라시맨시스 RGJ1(Pseudozyma churashimaensis RGJ1) 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 기탁번호가 KCTC13051BP인 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 식물체 병원균 또는 식물 바이러스는 고추 식물체 병원균 또는 고추 식물 바이러스인 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 병해 방제용 미생물 제제.
  5. 제4항에 있어서, 상기 식물은 고추 식물인 것을 특징으로 하는 식물 병해 방제용 미생물 제제.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물의 수확량 증가용 미생물 제제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 식물은 고추 식물인 것을 특징으로 하는 식물의 수확량 증가용 미생물 제제.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제를 제조하는 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 식물의 유묘에 침지 처리, 토양 관주 처리 또는 지상부에 경엽 처리하는 단계를 포함하는 식물의 병해를 방제하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 식물은 고추 식물인 것을 특징으로 하는 식물의 병해를 방제하는 방법.
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