ES2895118T3 - Pseudozyma - Google Patents

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ES2895118T3 ES16907381T ES16907381T ES2895118T3 ES 2895118 T3 ES2895118 T3 ES 2895118T3 ES 16907381 T ES16907381 T ES 16907381T ES 16907381 T ES16907381 T ES 16907381T ES 2895118 T3 ES2895118 T3 ES 2895118T3
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Choong-Min Ryu
Ga-Hyung Lee
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Abstract

Una cepa de Pseudozyma churashimaensis RGJ1 aislada de una planta de pimiento, en la que la cepa de Pseudozyma churashimaensis RGJ1 conduce a resistencia sistémica inducida contra un patógeno de la planta de pimiento o virus de la planta de pimiento, en la que el patógeno de la planta de pimiento es Xanthomonas axonopodis pv. Vesicatoria, y en la que la cepa se deposita con el número de acceso KCTC13051BP en el Instituto de Investigación de Biociencia y Biotecnología de Corea.

Description

DESCRIPCIÓN
Pseudozyma
[Campo técnico]
La presente descripción se refiere a una cepa de Pseudozyma churashimaensis RGJ1, que se aísla de una planta de pimiento y conduce a una resistencia sistémica inducida contra patógenos vegetales o virus vegetales; a una preparación microbiana para controlar enfermedades de las plantas o aumentar el rendimiento de las plantas, que incluye, como ingrediente activo, la cepa o un cultivo de la misma; a un método para preparar la preparación microbiana, que incluye una etapa de cultivar la cepa; y a un método para controlar enfermedades de las plantas, que incluye una etapa de realizar un tratamiento de inmersión, un tratamiento de empapado del suelo o un tratamiento de pulverización sobre el follaje aéreo para una plántula de planta con la cepa o el cultivo de la misma.
[Antecedentes de la técnica]
Actualmente, un método que se usa principalmente para inhibir la generación y controlar las bacterias patógenas de las plantas es usar plaguicidas sintetizados químicamente. Sin embargo, estos plaguicidas sintéticos destruyen los ecosistemas, y provocan problemas de toxicidad humana debido a los residuos de los mismos. Como resultado, la posibilidad de causar diversas enfermedades tales como cáncer, malformaciones y similares son muy alta, y, así, su uso es limitado. Por lo tanto, se está investigando activamente el desarrollo de plaguicidas biológicos respetuosos con el medioambiente capaces de sustituir a los plaguicidas sintéticos químicos. Uno de los métodos que han probado muchos investigadores para resolver los problemas del método de control químico es un método de control biológico que usa microorganismos. El método de control biológico que usa los microorganismos se ha estudiado como una alternativa al método de control químico para controlar las enfermedades de los cultivos, ya que, recientemente, la conciencia de los consumidores sobre la seguridad alimentaria ha aumentado y ha aumentado rápidamente la preferencia por los productos agrícolas respetuosos con el medioambiente.
Las enfermedades importantes del pimiento incluyen la antracnosis, el mildiú polvoriento, una enfermedad de la mancha bacteriana, y enfermedades virales que se producen en la porción aérea, incluyendo el tizón tardío del pimiento como una enfermedad infecciosa del suelo. Estas se han conocido como enfermedades económicamente críticas que amenazan la producción de pimientos. Dado que no solo el período de cultivo del pimiento es largo, también los patrones de la enfermedad del pimiento son muy diferentes según el cambio de clima. Es difícil controlar la enfermedad del pimiento. En este sentido, el pimiento es uno de los cultivos que se han tratado con mayor frecuencia con el bactericida durante el período de cultivo. Por lo tanto, para producir pimientos limpios y respetuosos con el medioambiente, es necesario usar los microorganismos para el control de enfermedades, que se seleccionan para que tengan un excelente efecto de control de enfermedades. La mayoría de los microorganismos desarrollados para controlar la enfermedad del pimiento se han desarrollado para controlar el tizón tardío del pimiento. Se ha dado a conocer que Serratia plymuthica es eficaz para controlar el tizón tardío del pimiento (Shen et al., Plant Pathol, J., 21, 64-67, 2005). Sin embargo, existen pocos informes de microorganismos que tengan un excelente efecto de control contra la enfermedad de la porción aérea del pimiento.
La Publicación de Solicitud de Patente Koreana No. 2009-0105726 describe “Aislado 22-5 de Bacillus megaterium que controla la mancha bacteriana y la antracnosis del pimiento rojo”. La Publicación de Solicitud de Patente Koreana No.
2012-0075936 describe 'Cepa PB25 de Bacillus sp. aislada del suelo, y usos de la misma”. Más allá de las bacterias procariotas, los documentos de patente anteriores no describen una cepa de levadura eucariota de Pseudozyma churashimaensis RGJ1 según la presente invención, que se aísla de una planta de pimiento y conduce a una resistencia sistémica inducida contra patógenos vegetales o virus vegetales.
La Publicación de Solicitud de Patente Japanesa No. 2011-182660 se refiere a microorganismos aislados de la caña de azúcar capaces de producir biosurfactantes de tipo azúcar, y describe usos de los mismos.
La Publicación de Solicitud de Patente Koreana No. 2012-0047985 se refiere a un extracto vegetal que comprende un derivado de antraquinona para inducir la resistencia de las plantas a los patógenos de las plantas.
La Publicación de Solicitud de Patente Japanesa No. 2012-15593 se refiere a un agente de control de enfermedades de las plantas que contiene glicolípidos, que es una sustancia natural producida por la levadura.
La Publicación de Solicitud de Patente Koreana No. 2013-0057994 se refiere a una combinación de compuestos activos en una composición fungicida que comprende (A) ditino-tetracarboxamida y (B) al menos un plaguicida biológico beneficioso para la agricultura.
La Publicación de Solicitud de Patente Koreana No. 2001-0069238 se refiere a un método para producir plantas que tienen propiedades antivirales mediante la introducción del gen PKR.
[Descripción detallada de la invención]
[Problema técnico]
La presente descripción deriva de los requisitos anteriores. La presente invención se completó confirmando que la cepa RGJ1 de Pseudozyma churashimaensis, aislada e identificada a partir de una hoja de pimiento, conduce a una resistencia sistémica inducida contra patógenos bacterianos o virus vegetales de plantas de pimiento, y por lo tanto tiene un efecto de control de enfermedades de las plantas.
[Solución técnica]
En un aspecto de la presente invención, se proporciona la cepa RGJ1 de Pseudozyma churashimaensis aislada de una planta de pimiento, en la que la cepa RGJ1 de Pseudozyma churashimaensis conduce a una resistencia sistémica inducida contra un patógeno vegetal o virus vegetal, en la que el patógeno vegetal del pimiento es Xanthomonas axonopodis pv. Vesicatoria, y en la que la cepa se deposita con el número de acceso KCTC13051BP en el Instituto de Investigación de Biociencia y Biotecnología de Corea.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una preparación microbiana para controlar una enfermedad vegetal, en la que la preparación incluye, como ingrediente activo, la cepa RGJ1 de Pseudozyma churashimaensis, depositada con un número de acceso KCTC13051BP en el Instituto de Investigación de Biociencia y Biotecnología de Corea, o un cultivo de la misma, en la que el patógeno de la planta de pimiento es Xanthomonas axonopodis pv. Vesicatoria o un virus de la planta de pimiento.
En todavía otro aspecto de la presente invención, se proporciona una preparación microbiana para aumentar el rendimiento de una planta de pimiento, en la que la preparación incluye, como ingrediente activo, la cepa RGJ1 de Pseudozyma churashimaensis, depositada con el número de acceso KCTC13051BP en el Instituto de Investigación de Biociencia y Biotecnología de Corea, o un cultivo de la misma.
En todavía otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para preparar una preparación microbiana, comprendiendo el método cultivar la cepa RGJ1 de Pseudozyma churashimaensis, depositada con el número de acceso KCTC13051 BP en el Instituto de Investigación de Biociencia y Biotecnología de Corea.
En todavía otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para controlar una enfermedad vegetal, comprendiendo el método realizar el tratamiento en una plántula de la planta con la cepa RGJ1 de Pseudozyma churashimaensis, depositada con un número de acceso KCTC13051 BP en el Instituto de Investigación de Biociencia y Biotecnología de Corea, o un cultivo de la misma, en el que el tratamiento incluye un tratamiento de inmersión, un tratamiento de empapado del suelo, o un tratamiento de pulverización sobre el follaje aéreo, en el que la enfermedad de la planta de pimiento es causada por Xanthomonas axonopodis pv. Vesicatoria o un virus de la planta de pimiento.
[Efectos ventajosos]
Se confirmó que la presente cepa RGJ1 de Pseudozyma churashimaensis aislada e identificada de una hoja de pimiento, y depositada con el número de acceso KCTC13051BP en el Instituto de Investigación de Biociencia y Biotecnología de Corea, conduce a una resistencia sistémica inducida contra patógenos bacterianos o virus vegetales de plantas de pimiento, y por lo tanto tiene un efecto de control de enfermedades de las plantas. La cepa según la presente invención puede eliminar el riesgo de contaminación ambiental causado por los efectos secundarios de los plaguicidas químicos, y de toxicidad humana debida a los plaguicidas residuales, y por tanto puede usarse como un protector vegetal ecológico. La cepa según la presente invención tiene el efecto de controlar las bacterias infecciosas en la planta de pimiento y de aumentar la resistencia de la planta a las enfermedades, y de este modo puede ser útil industrialmente.
[Breve descripción de los dibujos]
La FIG. 1 ilustra especies de levadura aisladas de regiones, y regiones de muestreo para aislar levadura viable de un pimiento.
La FIG. 2 ilustra los resultados de un análisis primario de resistencia inducida a cepas de levadura que sobreviven en un pimiento: RGJ1: Pseudozyma churashimaensis, RGJ5: Cryptococcus magnus, GS5: Pseudozyma aphidis, GS6: Pseudozyma tsukubaensis.
La FIG. 3 ilustra los resultados de un análisis secundario de la resistencia inducida a RGJ1 como cepa de levadura aislada de un pimiento. BTH (benzotiadiazol): control positivo de resistencia inducida, Kanamicina: agente de exterminio directo de bacterias (un antibiótico de amplio espectro).
La FIG. 4 ilustra el resultado de comprobar una resistencia inducida de un pimiento tratado con una levadura RGJ1 según la presente invención en un campo contra un patógeno de la mancha bacteriana, X. axonopodis pv. vesicatoria.
La FIG. 5 ilustra el resultado de comprobar, a través de un síntoma, una resistencia inducida de un pimiento tratado con un levadura RGJ1 según la presente invención en un campo contra un virus.
La FIG. 6 ilustra el resultado de comprobar, a través de la medida de la cantidad de virus usando qRT-PCR, una resistencia inducida de un pimiento tratado con una levadura RGJ1 según la presente invención en un campo contra un virus. CMV: virus del mosaico del pepino, BBWV: virus de la marchitez del haba.
La FIG. 7 ilustra el resultado de comprobar, a través de la medida de la cantidad de virus usando qRT-PCR, una resistencia inducida de un pimiento tratado con una levadura RGJ1 según la presente invención en un campo contra un virus. PepMoV: virus del moteado del pimiento, PMMoV: virus del moteado suave del pimiento.
La FIG. 8 ilustra los resultados del análisis de los niveles de expresión de PR4 y PR5 del pimiento, como genes relacionados con una resistencia inducida de un pimiento tratado con una levadura RGJ1 según la presente invención contra una infestación de patógenos en condiciones de campo.
La FIG. 9 ilustra un aumento en el rendimiento de pimiento mediante el tratamiento con una levadura RGJ1 según la presente invención en un campo.
La FIG. 10 ilustra el resultado de comprobar la capacidad de una levadura RGJ1 para colonizar la hoja en el invernadero.
[Mejor modo]
A fin de lograr el objeto de la presente invención, se proporciona una cepa de Pseudozyma churashimaensis RGJ1 aislada de una planta de pimiento, en el que la cepa de Pseudozyma churashimaensis RGJ1 conduce a una resistencia sistémica inducida contra un patógeno vegetal o un virus vegetal. Pseudozyma churashimaensis RGJ1 se depositó el 24 de junio de 2016 en el Instituto de Investigación de Biociencia y Biotecnología de Corea (número de acceso KCTC13051BP).
En la cepa según una realización según la presente descripción, el patógeno vegetal o virus vegetal puede ser un patógeno o virus de diversas plantas. Preferiblemente, en la cepa según una realización según la presente invención, el patógeno vegetal o el virus vegetal puede ser, pero no se limita a, un patógeno de la planta de pimiento o un virus de la planta de pimiento. El patógeno vegetal puede ser un patógeno bacteriano, preferiblemente una bacteria causante de la mancha bacteriana del pimiento. Más preferiblemente, el patógeno bacteriano puede ser Xanthomonas axonopodis pv. Vesicatoria. El virus de la planta de pimiento descrito aquí puede incluir el virus del mosaico del pepino (CMV), el virus del mosaico del tabaco (TMV), el virus del marchitamiento del haba (BBWV), el virus del moteado suave del crisantemo (CMMV), el virus Y de la patata (PVY), el virus del marchitamiento manchado del tomate (TSWV), el virus del moteado del pimiento (PepMoV), el virus del moteado suave del pimiento (PMMoV), etc. Preferiblemente, el virus de la planta de pimiento puede ser el virus del mosaico del pepino (CMV), el virus de la marchitez del haba (BBWV), el virus del moteado del pimiento (PepMoV), el virus del moteado suave del pimiento (PMMoV), y similares, pero puede que no se limite a ellos.
En otro aspecto de la presente descripción, se proporciona una preparación microbiana para controlar una enfermedad vegetal, en la que la preparación incluye, como ingrediente activo, la cepa RGJ1 de Pseudozyma churashimaensis o un cultivo de la misma. La enfermedad vegetal puede ser causada por un patógeno vegetal o por un virus vegetal. Preferiblemente, se describe que la enfermedad vegetal puede ser causada por un patógeno de la planta de pimiento o por el virus de la planta de pimiento. La presente descripción no se limita a ello. El patógeno de la planta de pimiento o el virus de la planta de pimiento es como se describió anteriormente.
La preparación microbiana para controlar la enfermedad vegetal puede incluir, como ingrediente activo, la cepa RGJ1 de Pseudozyma churashimaensis o un cultivo de la misma, en la que la cepa se aísla de una planta de pimiento, en la que la cepa RGJ1 de Pseudozyma churashimaensis conduce a una resistencia sistémica inducida contra un patógeno vegetal o un virus vegetal. La preparación microbiana según la presente invención se puede preparar en forma de fertilizante líquido. La preparación microbiana se puede usar en forma de polvo añadiendo un extendedor a la preparación microbiana. La preparación microbiana se puede formular y granular. Sin embargo, la formulación no está particularmente limitada. En otras palabras, en una agricultura orgánica respetuosa con el medioambiente, en la que el suministro de fertilizante químico es limitado, la preparación microbiana puede formularse como un fertilizante biológico para superar dicha limitación.
En todavía otro aspecto de la presente descripción, se proporciona una preparación microbiana para aumentar el rendimiento de una planta, en la que la preparación incluye, como ingrediente activo, la cepa RGJ1 de Pseudozyma churashimaensis o un cultivo de la misma. La planta puede ser una planta de pimiento. Cuando la planta de pimiento se trató con la cepa según la presente invención, el rendimiento de frutos de pimiento aumentó en alrededor de 30% en comparación con un control sin tratamiento.
En todavía otro aspecto de la presente descripción, se proporciona un método para preparar una preparación microbiana, incluyendo el método cultivar la cepa RGJ1 de Pseudozyma churashimaensis. La cepa de levadura se puede cultivar mediante cualquier método conocido en la técnica, y puede no limitarse a un método específico.
En todavía otro aspecto de la presente descripción, se proporciona un método para controlar una enfermedad vegetal, incluyendo el método realizar el tratamiento en una plántula de la planta con la cepa RGJ1 de Pseudozyma churashimaensis o un cultivo de la misma, en el que el tratamiento incluye tratamiento de inmersión, tratamiento de empapado del suelo, o tratamiento de pulverización sobre follaje aéreo o suelo subterráneo. La enfermedad vegetal puede ser causada por un patógeno vegetal o por un virus vegetal. Preferiblemente, la enfermedad vegetal puede ser causada por un patógeno de la planta de pimiento o por el virus de la planta de pimiento. La presente descripción no se limita a ello. El patógeno de la planta de pimiento o el virus de la planta de pimiento es como se describió anteriormente.
El método para controlar las enfermedades vegetales puede incluir realizar un tratamiento que incluye un tratamiento de inmersión, un tratamiento de empapado del suelo o un tratamiento de rociado sobre el follaje aéreo en una plántula de la planta con la cepa RGJ1 de Pseudozyma churashimaensis, un cultivo de la misma, o una preparación microbiana que usa la cepa. En el caso del tratamiento de inmersión, el medio de cultivo y la preparación microbiana se pueden verter en el suelo alrededor de la planta, o las semillas de la planta se pueden sumergir en el medio de cultivo y la formulación.
A continuación, la presente invención se ilustra en detalle con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, los presentes ejemplos son simplemente ejemplos de la presente invención, y el contenido de la presente invención no se limita a los ejemplos que se presentan.
Ejemplo 1. Aislamiento de cepas de levadura que sobreviven en el pimiento
Para aislar levaduras que desempeñan un papel útil en el pimiento y sobreviven en las hojas del pimiento, se recolectaron hojas de pimiento de Chungcheongnam-do y Jeollado. De septiembre a noviembre de 2013, las hojas de la porción media del pimiento al final de la cosecha del mismo se recolectaron en Geoje, Goseong, Hamyang, Jinan, Namhae y Suncheon, etc. Las hojas recolectadas se cortaron en forma de disco circular con un barrenador de corcho de 10 mm de diámetro. Se colocaron tres hojas en forma de disco en un tubo de 1,5 ml que contenía 1 ml de agua esterilizada. Se colocaron en el tubo perlas (perlas de zirconia (perlas pequeñas que tienen un diámetro de 1 mm)). La agitación por vórtice se realizó usando las perlas durante un período de tiempo suficiente para permitir un mejor aislamiento de los microorganismos adheridos a la superficie de la hoja. El estado en el que entra por primera vez el disco de la hoja se consideró sin diluir. La disolución sin diluir se diluyó secuencialmente a 1/10 y 1/100, etc. 100 ¡A de cada disolución diluida se untó en un medio de placa de agar. El medio de agar usado se preparó añadiendo rifampicina (cápsula de rifampicina; Yuhan Pharmaceutical Company) (concentración final 100 ¡g/m l), como antibiótico que evita el crecimiento de bacterias, sobre un medio YPD, como medio dedicado a la levadura, para aislar solo células de levadura. Las colonias de levadura aisladas de las placas diluidas y untadas se subcultivaron por separado y se cultivaron en células simples puras. La secuenciación de ITS de las células individuales se encargó directamente a Xenotech. Las secuencias de los cebadores de secuenciación de ITS que se usan son las siguientes: (ITS1 (dirección directa): 5'-TCC GTA GGT GAA CCT TGC GG-3' (SEQ ID NO: 1), ITS4 (dirección inversa): 5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3' (SEQ ID NO: 2).
Posteriormente, se recolectaron hojas de pimiento de los campos de pimiento en Jeollado, Geoje, Goseong, Hamyang, Jinan, Namhae, Suncheon. Las levaduras se identificaron mediante la secuenciación de la levadura aislada procedente de las hojas recolectadas. Diversas levaduras estaban vivas en una hoja del pimiento. Entre ellas, un levadura del género Pseudozyma era dominante, y una gran cantidad de levadura del mismo sobrevivió en la hoja de pimiento (véase la FIG. 1).
Ejemplo 2. Análisis primario de la resistencia inducida de la cepa de levadura que sobrevive en el pimiento
Para confirmar la capacidad de resistencia inducida de la levadura aislada, se llevó a cabo en el invernadero un experimento de selección de cepa primario. Los presentes inventores plantaron un pimiento de 7 días (nuevo pimiento PR: plántula de Hongnong) en una maceta de 50 hoyos. Tres semanas después, cuando a excepción de los cotiledones, salieron las cuatro hojas verdaderas, los presentes inventores rociaron la cepa de levadura aislada sobre la parte aérea de las plántulas de pimiento. Los microorganismos tratados en este momento se prepararon de la siguiente manera: las células de levadura cultivadas en un medio sólido durante 3 días se suspendieron en agua esterilizada, y la concentración de las células se ajustó a O.D.600 = 1 (106 UFC/ml). Después, se rociaron 50 ml de suspensión sobre cada plántula de pimiento. Siete días después del tratamiento microbiano, la concentración de Xanthomonas axonopodis pv. vesicatori del pimiento se ajustó a O.D.600 = 0,01, y después, Xanthomonas axonopodis pv. vesicatori se inyectó e inoculó directamente en la parte posterior de la hoja de pimiento, usando una jeringa. El patógeno se inoculó en tres hojas por plántula de pimiento. Después de 5 a 7 días, comenzaron a aparecer los síntomas. En este momento, se confirmó la resistencia inducida al patógeno investigando los síntomas mencionados anteriormente. La investigación de síntomas se llevó a cabo clasificando arbitrariamente la gravedad de la enfermedad de 0 a 5 en la parte de la hoja inoculada con las bacterias patógenas: (0: ningún síntoma; 1: una hoja se torna verdosa ligeramente más opaca que el color original; 2: el amarilleo de la hoja es visible; 3: la parte amarilla muestra una pequeña parte negra; 4: más de 1/3 de las hojas están ennegrecidas; 5: todas las hojas se vuelven negras). Se examinaron individualmente cuatro hojas por plántula de pimiento. Se identificaron un total de 20 hojas mediante 5 repeticiones.
El síntoma se examinó 7 días después de la inoculación del patógeno. De los resultados del examen, la levadura Pseudozyma churashimaensis RGJ1, esto es, la levadura aislada de Geojedo, mostró el efecto de resistencia a enfermedades más excelente. Este tratamiento con levadura mostró una reducción de los síntomas del 70% en comparación con el control de agua. Este mostró la misma significancia que un control químico de BTH como un control positivo (véase la FIG. 2).
Ejemplo 3. Análisis secundario de la resistencia inducida de cepas de levadura aisladas de pimiento
Para la cepa de Pseudozyma churashimaensis RGJ1, que es la cepa más eficaz entre las varias cepas de levadura aisladas usadas en el ensayo de resistencia inducida primario, se confirmó una diferencia en la resistencia inducida basada en el cambio de método de tratamiento. El medio de cultivo en el que se cultivó la levadura RGJ1 se ajustó a O.D.600 = 1. Bajo las mismas condiciones experimentales que el primer experimento de resistencia inducida, se comparó una diferencia en la resistencia entre cuando el medio de cultivo se roció sobre la superficie de la hoja de la porción aérea del pimiento y cuando el cultivo se enterró directamente en el suelo en la raíz del pimiento. Como un control positivo, se usó BTH, una sustancia química que induce una resistencia inducida, y, como un control negativo, un control de agua. El experimento se desarrolló en el invernadero. Además, para confirmar si existe una acción de esterilización directa por parte de la levadura RGJ1, el patógeno de la mancha bacteriana del pimiento Xav. se ajustó a O.D.600 = 0,5, y el Xav. se untó en una placa con un diámetro de 90 mm. Después, se dispuso sobre la placa un disco de papel que tenía un diámetro de 10 mm. Después, los tratamientos con la levadura RGJ1 (concentración ajustada a O.D.600 = 1, y siendo la cantidad 20 microlitros), BTH (1 mM), antibiótico kanamicina 25, y agua, se realizaron en las mismas cantidades. A continuación, el producto tratado se cultivó a 30°C. Sus efectos se compararon observando la zona clara en la que aparecieron los efectos bactericidas (véase la FIG. 3).
La resistencia a la enfermedad se indujo con un resultado similar a los resultados del ensayo de resistencia primario. No hubo diferencias en los efectos entre el tratamiento de rociado sobre las hojas y el empapado directo del suelo. Además, a partir de los resultados del cultivo de reemplazo, no había un anillo transparente alrededor de la levadura RGJ1. Como resultado, se confirmó que la levadura RGJ1 no tuvo un efecto esterilizante, matando directamente al patógeno, y tuvo el efecto de inducir la resistencia (véase la FIG. 3).
Ejemplo 4. Identificación de resistencia inducida contra patógenos de la mancha bacteriana, como se induce a partir de pimiento tratado con levadura RGJ1 según la presente invención en el campo
Para las cepas de levadura seleccionadas mediante la identificación en el laboratorio y en el invernadero, se verificó una capacidad de resistencia inducida de las mismas en un campo de pimiento. El ensayo de verificación se llevó a cabo en un campo de pimiento de 200 pyeong de área, ubicado en Oebuli, Geonbuk-myeon, Geumsan-gun, Chungcheongnam-do (36° 8’ 50,81” N, 127° 29’ 29,20” E). En junio de 2014, la cepa de levadura RGJ1 se roció sobre la porción aérea de pimiento de un mes trasplantado al campo a una concentración de O.D.600 = 1 (107 UFC/ml) en las mismas condiciones experimentales que en el experimento del invernadero. Como un control positivo, BTH, que tiene un efecto de resistencia inducida, se roció sobre la parte aérea del pimiento a una concentración de 1 mM. Se realizó un tratamiento con agua como un control negativo. En las unidades de tratamiento aleatorias, una longitud del surco de una unidad de tratamiento fue 8 metros. La distancia entre un pimiento y otro fue 40 cm. Una unidad de tratamiento contenía 20 plantas de pimiento. Se trataron dos litros de cada uno de los materiales de cultivo y de control por unidad de tratamiento. Se realizaron cuatro experimentos de repetición en unidades de tratamiento divididas al aleatoriamente. Diez días después del tratamiento, el patógeno de la mancha bacteriana, es decir, Xanthomonas axonopodis pv. Vesicatoria, se diluyó hasta una O.D.600 = 0,01. El patógeno de la mancha bacteriana diluido se inoculó en el pimiento a través del dorso de la hoja usando una jeringa. Se inocularon cinco hojas por una sola planta de pimiento. Se inoculó un total de 10 plantas de pimiento por una sola unidad de tratamiento. Después de 7 días, se observó el síntoma. La gravedad de la enfermedad se determinó dividiendo la gravedad del síntoma en 0 a 5 niveles, de la misma forma que en el experimento de identificación del invernadero.
A partir de los resultados de los ensayos de campo, se confirmó que la resistencia se indujo mediante el tratamiento por aspersión de la levadura de la misma manera que en el experimento del invernadero, y el síntoma de la enfermedad de la mancha bacteriana se redujo en un 50% (véase la FIG. 4).
Ejemplo 5. Identificación de la resistencia inducida frente al virus de un pimiento tratado con levadura RGJ1 según la presente invención en el campo
Se recolectaron 5 hojas tiernas recientes del pimiento que había pasado 60 días después del tratamiento con levadura en el experimento de campo al aire libre. Las hojas se pusieron inmediatamente en nitrógeno líquido, y se congelaron rápidamente. Posteriormente, la hoja se molió con un mortero. De las hojas pulverizadas o molidas, se extrajo el ARN usando un kit de extracción de ARN (kit RNeasy; QIAGEN). El ARN extraído se sintetizó en ADNc. Se llevó a cabo la RT-qPCR, como método para cuantificar la cantidad de virus, en el ADNc sintetizado usando qPCR (CFX connect Real-Time System; BIO-RAD).
El grado de infección se cuantificó usando cebadores específicos de CMV (virus del mosaico del pepino) y BBWV (virus de la marchitez del haba) de origen natural. Las condiciones de qPCR y los cebadores usados son los siguientes. Dirección directa de la proteína de la cubierta del CMV: 5’-CGTTGCCGCTATCTCTGCTAT-3’ (SEQ ID NO.: 3), dirección inversa de la proteína de cubierta del CMV: 5’-GGATGCTGCATACTGACAAACA-3’ (SEQ ID NO.: 4), dirección directa del BBWV: 5’-AATGAAGTGGTGCTCAACTACACA-3’ (SEQ ID NO.: 5), dirección inversa del BBWV: 5’-TTTTGGAGCATTCAACCATTTGGA-3’ (SEQ ID NO.: 6). Además, el grado de infección se cuantificó usando cebadores específicos de PepMoV (virus del moteado del pimiento) y PMMoV (virus del moteado suave del pimiento). Las condiciones de qPCR y los cebadores usados son los siguientes. Dirección directa del PepMoV: 5’-AAGATCAGACACATGGA-3’ (SEQ ID NO.: 7), dirección inversa del PepMoV: 5’-CAAGCAAGGGTATGCATGT-3’ (SEQ ID NO.: 8), dirección directa del PMMoV: 5’-ACAGTTTCCAGTGCCAATCA-3’ (SEQ ID NO.: 9), dirección inversa del PMMoV: 5’-AAGCGTCTCGGCAGTTG-3’ (SEQ ID NO: 10).
[Tabla 1]
condición de qPCR
1 9S.0 C para 1Q:0Q
r* 2 95.0 C para 030
Figure imgf000007_0001
FIN
En el estudio de los síntomas del virus, a partir de los resultados de comparar las hojas nuevas de pimiento entre el control de agua y el tratamiento con levadura, se confirmó que, en el control de agua, los síntomas del virus son graves, mientras que en el tratamiento con levadura, el síntoma fue débil (véase la FIG. 5). Además, a partir de los resultados de la cuantificación del virus usando qPCR, tanto para los virus representativos CMV como para BBWV, la cantidad de virus se redujo en 10 veces en el tratamiento con levadura, en comparación con el control de agua. Así, se confirmó que las plantas de pimiento se infectaron con menos virus por el tratamiento con levadura (véase la FIG.
6). Además, para ambos virus, PepMoV y PMMoV, se encontró que las plantas de pimiento eran menos vulnerables a la infección del virus por el tratamiento con levadura (véase la FIG. 7).
Ejemplo 6. Análisis de los niveles de expresión de genes relacionados con una resistencia inducida de un pimiento tratado con una levadura RGJ1 según la presente invención contra una infestación de patógenos
Se recolectaron hojas de pimiento con el fin de investigar el nivel de expresión génica para estudiar el mecanismo de acción de levadura, al inocular el patógeno de la mancha bacteriana durante el experimento de campo, en los siguientes tres momentos: ® antes de la inoculación del patógeno, © inmediatamente después de la inoculación del patógeno, © 6 horas después de la inoculación del patógeno. A continuación, las hojas se alimentaron y congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. De la misma manera que en el método de cuantificación del virus, el ARN se extrae de la hoja, y el ARN se sintetiza en ADNc. Después, el nivel de expresión del gen relacionado con la resistencia inducida del pimiento se examinó usando qPCR. Específicamente, se confirmó la expresión del gen PR como un gen representativo relacionado con la resistencia inducida del pimiento. Las condiciones de qPCR son las mismas que en el método anterior de cuantificación del virus. La información sobre el cebador usado es la siguiente. CaPR4 dirección directa: 5’-AACTGGGATTTGAGAACTGCCAGC-3’ (SEQ ID NO.: 11), dirección inversa: 5’-ATCCAAGGTACATATAGAGCTTCC-3’ (SEQ ID NO.: 12), CaPR5dirección directa: 5’-CTCCACAAGAAACAAGGCA-3’ (SEQ ID NO.: 13), dirección inversa: 5’-GTACGAAGCACGCACACAA-3’ (SEQ ID NO.: 14).
En el tratamiento con levadura, los niveles de expresión de los genes de resistencia PR4 y PR5 aumentaron significativamente después de 6 horas. Esto dio como resultado un efecto de cebado de la resistencia, que condujo a un tiempo de respuesta más rápido a la invasión de patógenos (véase la FIG. 8).
Ejemplo 7. Investigación del rendimiento de pimiento en campo según el tratamiento de levadura RGJ1 según la presente invención
Tras confirmar la resistencia inducida en el campo, se investigó el rendimiento de pimiento en 20 plantas de pimiento en cada unidad de tratamiento. Estos estudios se repitieron cuatro veces en total. En la unidad de tratamiento con tratamiento con levadura RGJ1, el rendimiento se incrementó en alrededor de 30% en comparación con la unidad sin tratamiento (véase la FIG. 9).
Ejemplo 8. Identificación de la capacidad de fijación de la levadura RGJ1 a la hoja en invernadero
Para confirmar la capacidad de Pseudozyma churashimaensis RGJ1, un cepa de levadura aislada de hojas de pimiento, para asentarse en las hojas, los presentes inventores realizaron experimentos en plántulas de pimiento en el invernadero. La suspensión de levadura se inoculó a dos concentraciones de O.D.600 = 1 y 2 en la hoja del pimiento tres semanas después de la germinación. La suspensión que contenía bacterias dispersas en la misma se roció a 50

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Una cepa de Pseudozyma churashimaensis RGJ1 aislada de una planta de pimiento, en la que la cepa de Pseudozyma churashimaensis RGJ1 conduce a resistencia sistémica inducida contra un patógeno de la planta de pimiento o virus de la planta de pimiento, en la que el patógeno de la planta de pimiento es Xanthomonas axonopodis pv. Vesicatoria, y en la que la cepa se deposita con el número de acceso KCTC13051BP en el Instituto de Investigación de Biociencia y Biotecnología de Corea.
2. Una preparación microbiana para controlar una enfermedad de la planta de pimiento, comprendiendo la preparación, como ingrediente activo, la cepa RGJ1 de Pseudozyma churashimaensis depositada bajo un número de acceso KCTC13051 BP en el Instituto de Investigación de Biociencia y Biotecnología de Corea, o un cultivo de la misma, en la que la enfermedad de la planta de pimiento es causada por Xanthomonas axonopodis pv. Vesicatoria o un virus de la planta de pimiento.
3. Una preparación microbiana para aumentar el rendimiento de una planta de pimiento, comprendiendo la preparación, como ingrediente activo, la cepa de Pseudozyma churashimaensis RGJ1 depositada bajo un número de acceso KCTC13051BP en el Instituto de Investigación de Biociencia y Biotecnología de Corea, o un cultivo de la misma.
4. Un método para preparar una preparación microbiana según la reivindicación 3, comprendiendo el método cultivar la cepa de Pseudozyma churashimaensis RGJ1 depositado bajo el número de acceso KCTC13051BP en el Instituto de Investigación de Biociencia y Biotecnología de Corea.
5. Un método para controlar una enfermedad de la planta de pimiento, comprendiendo el método llevar a cabo un tratamiento en una plántula de la planta con la cepa de Pseudozyma churashimaensis RGJ1 depositada bajo un número de acceso KCTC13051 BP en el Instituto de Investigación de Biociencia y Biotecnología de Corea, o un cultivo de la misma, en el que el tratamiento incluye un tratamiento de inmersión, un tratamiento de empapado del suelo o un tratamiento de pulverización sobre el follaje aéreo, en el que la enfermedad de la planta de pimiento es causada por Xanthomonas axonopodis pv. Vesicatoria o un virus de la planta de pimiento.
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