ES2827276T3 - Aspergillus niger - Google Patents

Abstract

Una cepa de Aspergillus niger (A. niger) F22 que tiene actividad nematicida contra los nematodos parásitos de plantas Bursaphelenchus xylophilus (B. xylophilus) y Meloidogyne spp., en la que la cepa de A. niger F22 está depositada con el número de acceso KCTC 12771BP.

Description

DESCRIPCIÓN

Aspergillus niger

[Campo técnico]

La presente invención se refiere a una cepa de Aspergillus niger F22 que tiene actividad nematicida contra nematodos parásitos de plantas y un uso de la misma, y más particularmente, a una cepa de Aspergillus niger F22 que tiene actividad nematicida contra nematodos parásitos de plantas, un agente de microorganismos nematicida contra nematodos parásitos de plantas, incluida la cepa, o una espora, una masa de hifas fúngicas o un caldo de cultivo de los mismos como ingrediente activo, un método de control de los nematodos parásitos de plantas, que incluye una etapa de tratamiento de un cultivo, una semilla de cultivo o un campo con el agente de microorganismo nematicida, y un método de preparación de un agente de microorganismo nematicida contra nematodos parásitos de plantas, que incluye el cultivo de la cepa.

[Antecedentes de la técnica]

Los nematodos típicos que causan daños en los principales cultivos de huerta, frutas y verduras en instalaciones hortícolas en Corea se conocen como nematodos parásitos de plantas, incluidos los nematodos de los nudos de la raíz (es decir, Meloidogyne spp.). En particular, los nematodos de los nudos de la raíz en el suelo del invernadero causan graves daños a los cultivos agrícolas. El nematodo parásito de plantas incluye Meloidogyne spp., Globodera spp., Anguina spp., Ditylenchus spp., Aphalenchoides spp., Pratylenchus spp., Tylenchorhychus spp., Rotylenchulus spp., etc., según los patrones de daño y los huéspedes. Meloidogyne incognita, Meloidogyne hapla, Meloidogyne javanica, y Meloidogyne arenaria en los nematodos de los nudos de la raíz son nematodos importantes que afectan negativamente a la agricultura.

En los últimos años, con el fin de controlar los nematodos parásitos de plantas, se ha usado el control cultural, físico o químico. El control cultural se realiza usando agua dulce, terreno en barbecho, suelo seco, arado profundo, suelo transportado, cultivo de rotación de arroz, cultivares resistentes y similares, el control físico se realiza mediante tratamiento térmico (vapor, calor seco y métodos de remojo en agua caliente), esterilización por calor solar y similares, y el control químico se realiza mediante el tratamiento de agentes químicos tales como carbofurano, fostiazato y similares para controlar nematodos. El control cultural es costoso o de aplicación limitada dependiendo de las condiciones regionales y de los cultivos, y los cultivares resistentes tienen el inconveniente de que sus aplicaciones están particularmente limitadas a los cultivos, lo que resulta en una baja practicidad. Si bien los nematicidas químicos tienen un alto efecto de control contra los nematodos parásitos de plantas, principalmente organofosforados o carbamatos, son altamente tóxicos cuando permanecen en el suelo, causan daño acumulativo a los cultivos así como contaminación ambiental debido a acciones bactericidas contra microorganismos efectivos en el suelo, que son beneficiosos para el crecimiento de los cultivos y gradualmente hacen que el suelo sea infértil. Por lo tanto, se ha evitado el uso de pesticidas químicos debido a problemas tales como la contaminación ambiental, la destrucción del ecosistema, la intoxicación por pesticidas a humanos y animales, y un aumento en la demanda de productos agrícolas amigables con el medio ambiente. Además, se prohibirá el bromuro de metilo que se ha usado generalmente como fumigante del suelo para controlar los nematodos debido al agotamiento de la capa de ozono (Caboni et al. (2013) J. Agric. Food Chem. 61, 1794-1803). Por lo tanto, existe una demanda para el desarrollo de nematicidas que sean más seguros para el medio ambiente y puedan ser reemplazados por los pesticidas agrícolas mencionados anteriormente.

En los últimos años, entre los métodos para controlar los nematodos parásitos de plantas de forma respetuosa con el medio ambiente, existe un método que usa microorganismos. Algunos estudios mostraron que, a medida que los microorganismos crecen, producen varios metabolitos secundarios y actúan directamente sobre los patógenos de las plantas para exhibir diversas actividades antibacterianas e insecticidas (Zhao et al. (2014). Acción antagonista de la cepa SG6 de Bacillus subtillis sobre Fusarium graminearum. PLoS one. 9 (3), e92486). Por lo tanto, se está investigando para aislar cepas que tengan actividad nematicida mediante el cribado de actividades nematicidas de diversos caldos de cultivo de microorganismos y desarrollar cepas para controlar enfermedades causadas por nematodos parásitos de plantas usando las mismas.

Mientras tanto, la Publicación de Patente Coreana no Examinada No. 2006-0002789 describe un "nematicida" y la Publicación de Patente Coreana no examinada No. 2010-0116562 describe una “cepa de Bacillus velezensis G341 y un método de control de las enfermedades de las plantas usando la misma”. Sin embargo, no se encuentra una cepa de Aspergillus niger F22 que tenga actividad nematicida contra nematodos parásitos de plantas y un uso de la misma, como se describe en la presente invención. El documento CN 101 182469 describe la cepa ANUV90 que tiene una actividad nematicida contra Meloidogyne spp. El documento JP 2005082530 describe las cepas JAM4055 y JAM4054 que tienen una actividad nematicida contra Bursaphelenchus xylophilus.

[Divulgación]

[Problema técnico]

Por lo tanto, la presente invención está diseñada para resolver los problemas de la técnica anterior, y los presentes inventores han encontrado que, entre 61 hongos, un Aspergillus niger F22 (KCTC 12771BP) es una cepa que tiene actividad nematicida contra larvas de nematodos parásitos de plantas en condiciones de laboratorio y reprime notablemente la aparición de enfermedades por nematodos de los nudos de la raíz incluso en condiciones de invernadero usando cultivos de tomate. Además, los presentes inventores han confirmado que, cuando se preparan formulaciones de 5 formulaciones básicas tales como concentrado en suspensión (SC), microbiana en suspensión (SM), gránulo absorbente (GR absorbente), gránulo en polvo (GR en polvo) y polvo humectable (WP) para comprobar una actividad de control contra Meloidogyne incógnita, la formulación de polvo humectable tiene el valor de control más excelente. Por lo tanto, los presentes inventores han confirmado que la cepa de la presente invención puede reemplazar los pesticidas químicos como pesticida biológico para controlar los nematodos parásitos de plantas, y se puede proporcionar como un agente de control biológico innovador que puede resolver los problemas causados por la contaminación ambiental. Por lo tanto, la presente invención se ha completado en base a estos hechos.

[Solución técnica]

Para resolver los problemas anteriores, según un aspecto de la presente invención, se proporciona una cepa de Aspergillus niger F22 que tiene actividad nematicida contra nematodos parásitos de plantas.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una actividad de agente de microorganismo nematicida contra nematodos parásitos de plantas, que incluye la cepa, o una espora, una masa de hifas fúngicas o un caldo de cultivo de la misma como ingrediente activo.

Según otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un método de control de nematodos parásitos de plantas, que incluye una etapa de tratar un cultivo, una semilla de cultivo o un campo con el agente de microorganismos.

Según otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un método de preparación de un agente de microorganismo nematicida contra nematodos parásitos de plantas, que incluye el cultivo de la cepa.

[Efectos ventajosos]

La cepa de Aspergillus niger F22 de la presente invención tiene una actividad nematicida contra Meloidogyne incógnita de una manera dependiente de la concentración en un experimento en el invernadero así como en un experimento in vitro, y de este modo se considera que tiene un alto potencial de desarrollo como un agente de control contra los nematodos parásitos de plantas. Incluso cuando la cepa de la presente invención se prepara en una formulación de polvo humectable y Meloidogyne incógnita se trata con la formulación de polvo humectable, la cepa de la presente invención tiene un excelente efecto de control. Por lo tanto, cuando se llevan a cabo procesos de optimización de formulación y fermentación óptimos posteriores, la cepa de la presente invención se puede usar como un pesticida biológico, que es un nematicida microbiano novedoso, en lugar de pesticidas químicos. De acuerdo con lo anterior, la cepa de la presente invención se puede usar de manera muy eficaz como un agente de control biológico innovador que puede resolver los problemas causados por la contaminación ambiental.

[Breve descripción de los dibujos]

La figura 1 es un gráfico que ilustra las actividades nematicidas de cepas seleccionadas contra Meloidogyne incognita (M. incognita) cuando M. incognita se trata con diversas concentraciones de filtrado de cultivo de la cepa según la presente invención.

La figura 2 muestra los resultados de comparar una forma de M. incognita muerta, que se trata con cada uno de los filtrados de cultivo al 10 % de las cepas seleccionadas, con la forma de un grupo no tratado según la presente invención.

La figura 3 muestra un análisis filogenético usando (A) regiones ITS y (B) secuencias de ARN 26S de la cepa seleccionada según la presente invención.

La figura 4 es un gráfico que ilustra las actividades nematicidas de la cepa de Aspergillus niger F22 dependiendo de un medio de cultivo según la presente invención.

La figura 5 es un gráfico que ilustra las actividades de control de enfermedades de la cepa de Aspergillus niger F22 contra la enfermedad por nemátodos de los nudos de la raíz causada por M. incognita cuando las plantas de tomate se trataron con un filtrado de cultivo de la cepa de Aspergillus niger ^f22 antes de la infección de M. incognita según la presente invención.

La figura 6 muestra los resultados de comparar formas de raíces de plantas de tomate, que se tratan con una solución diluida 10 veces del filtrado de cultivo de la cepa de Aspergillus niger F22, con una forma del grupo sin tratar según la presente invención.

La figura 7 es un gráfico que ilustra los valores de control de las formulaciones básicas, que se preparan usando el caldo de cultivo de la cepa de Aspergillus niger F22, contra Meloidogyne incógnita según la presente invención. La figura 8 muestra los resultados de comparar formas de raíces de plantas de tomate en grupos, en los que M. incógnita se trata con soluciones diluidas 100 veces y 50 veces de un agente en polvo humectable de la cepa de Aspergillus niger F22, con formas de raíces de plantas de tomate. en un grupo sin tratar y en grupos en los que M. incógnita se trata con una solución diluida 3,000 veces de abamectina (All Star) según la presente invención.

La figura 9 es un gráfico que ilustra las actividades nematicidas de los filtrados de cultivo de la cepa de Aspergillus niger F22 contra Meloidogyne hapla y Bursaphelenchus xylophilus dependiendo de la concentración.

[Descripción detallada de realizaciones preferidas]

Para lograr los objetivos, la presente invención proporciona una cepa de Aspergillus niger F22 que tiene actividad nematicida contra nematodos parásitos de plantas.

En la presente invención, se confirma que, entre 61 hongos, un filtrado de cultivo de una determinada cepa exhibe una actividad nematicida contra las larvas de nematodos parásitos de plantas en condiciones de laboratorio, y también suprime notablemente la aparición de enfermedades por nematodos de los nudos de la raíz, incluso en condiciones de invernadero usando cultivos de tomate. En este caso, la cepa se identificó como una cepa de Aspergillus niger F22. La cepa de Aspergillus niger F22 se depositó en the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology el 18 de marzo de 2015 (Número de acceso: KCTC 12771BP)

En la cepa según una realización de ejemplo de la presente invención, los nematodos parásitos de plantas pueden incluir Bursaphelenchus xylophilus o Meloidogyne spp. Aquí, el Meloidogyne spp. Preferido, puede incluir uno o más seleccionados de Meloidogyne incognita, Meloidogyne hapla, Meloidogyne javanica, Meloidogyne arenaria, y Meloidogyne incognita (M. incognita), pero la presente invención no se limita a los mismos.

En la cepa según una realización de ejemplo de la presente invención, los nematodos parásitos de plantas más preferidos pueden incluir Meloidogyne incognita, Meloidogyne hapla o Bursaphelenchus xylophilus, pero la presente invención no se limita a los mismos.

Además, la presente invención proporciona un agente de microorganismos nematicidas contra nematodos parásitos de plantas, que incluye la cepa, o una espora, una masa de hifas fúngicas o un caldo de cultivo de la misma como ingrediente activo.

El agente de microorganismos puede incluir la cepa de Aspergillus niger F22 que tiene una actividad nematicida contra nematodos parásitos de plantas, o una espora, una masa de hifas fúngicas o un caldo de cultivo de la misma como ingrediente activo.

Preferiblemente, el agente de microorganismos puede ser una formulación de concentrado en suspensión (SC), microbiana en suspensión (SM), gránulo absorbente (GR absorbente), gránulo en polvo (GR en polvo) o polvo humectable (WP), más preferiblemente una formulación en polvo humectable, pero la presente invención no se limita a los mismos.

El agente de microorganismos incluye un caldo de cultivo preparado mediante el cultivo de cada una de las cepas mencionadas en las condiciones de cultivo antes mencionadas y, de este modo, se puede usar como pesticida microbiano, un agente de recubrimiento de semillas, un nutriente microbiano, un agente acondicionador de suelos, agente fertilizante de compost, una formulación de pulverización foliar o una formulación de pulverización por empapado.

En el agente de microorganismos de la presente invención, la cepa de Aspergillus niger F22 o el caldo de cultivo de la misma se puede modificar en diversas formas mediante métodos conocidos usados en la técnica relacionada, y se puede usar en fases líquidas y pulverulentas. Preferiblemente, un caldo de cultivo o concentrado de la cepa de Aspergillus niger F22 se puede adsorber sobre un portador tal como almidón, proteínas crudas o polvo de piedra y luego secarse. El portador que se puede usar como una mezcla con el caldo de cultivo o concentrado de la cepa de la presente invención puede incluir cualquier portador usado en la técnica relacionada. Específicamente, el portador que se puede usar en la presente invención incluye cereales tales como arroz, trigo, maíz, cebada, frijoles, mijo, sorgo, mijo, trigo sarraceno, etc., cultivos de tubérculos tales como patata, etc., raíces tuberosas tales como batata, mandioca, etc., o productos elaborados de los mismos (por ejemplo, en polvo), almidones derivados de los mismos y derivados de los mismos. Además, se pueden usar como portador agar, gelatina, pectato (poligalacturonato), quitosano, carboximetilcelulosa y derivados de los mismos, geolita, cera natural, goma natural, caolín, minerales arcillosos tales como bentonita o materiales de tierra de diatomeas como geolita. Tales diversos portadores se pueden usar solos, o se pueden mezclar dos o más portadores en una proporción apropiada para obtener un portador que tenga propiedades físicas mejoradas. Cuando se usan los portadores mencionados anteriormente, los portadores pueden ser metabolizados en nutrientes por microorganismos y pueden tener una propiedad adhesiva aumentada a la superficie de una planta debido a que tales portadores tienen una viscosidad muy alta.

La presente invención también puede incluir un producto seco obtenido secando la cepa o el caldo de cultivo de cepas, y un pesticida biológico que la incluya. El producto seco se puede usar como una formulación seleccionada del grupo que consiste en un polvo humectable (WP), un material granular (GM), un gránulo dispersable en agua (WG), un gránulo (GR), un polvo para espolvoreo (DP) y un polvo dispersable en agua para el tratamiento de semillas en lechada (WS) para preparar un pesticida biológico. Dicha formulación de pesticida biótica tiene una estabilidad y propiedades fisicoquímicas excelentes, en comparación con las formulaciones líquidas convencionales, y se puede usar para controlar enfermedades de las plantas.

Entre los pesticidas bióticos, el polvo humectable se refiere a una formulación de pesticida agrícola que se encuentra en una fase pulverulenta que comienza a hidratarse tan pronto como se agregan al agua, y el material granular se refiere a una formulación en la que un caldo de cultivo de microorganismos se mezcla o se adsorbe sobre un material sólido, es decir, una formulación que no corresponde a las formulaciones de gránulos y polvos humectables. Además, el gránulo dispersable en agua se refiere a una formulación de pesticida agrícola que está en una fase granular y se usa después de ser diluido con agua, el gránulo se refiere a una formulación de pesticida agrícola que está en una fase granular y se usa intacta, el polvo para espolvoreo se refiere a una formulación de pesticida agrícola que está en una fase en polvo y se usa intacta, y los polvos dispersables en agua para el tratamiento de semillas en lechada se refieren a una formulación de pesticida agrícola que está en una fase en polvo e hidratada para su uso como suspensión antes del tratamiento de semillas.

El polvo humectable según una realización de ejemplo de la presente invención puede incluir una cepa de Aspergillus niger F22 como ingrediente activo, carbón blanco como absorbente de humedad, bis [2-etilhexil] sulfosuccinato de sodio como humectante, lignosulfonato de sodio como un agente dispersante y caolín como agente de carga. Preferiblemente, el polvo humectable puede incluir 10 % en peso de la cepa Aspergillus niger F22, 1 % en peso de carbón blanco, 1 % en peso de bis [2-etilhexil] sulfosuccinato de sodio, 1 % en peso de lignosulfonato de sodio y 87 % en peso de caolín.

El concentrado en suspensión según una realización de ejemplo de la presente invención se usa para controlar nematodos parásitos de plantas. Para usar el agente de microorganismos de la presente invención para controlar los nematodos parásitos de plantas, el agente de microorganismos se puede diluir uniformemente con agua y luego pulverizarse sobre un cultivo, una semilla de cultivo o un campo usando una máquina de pulverización apropiada tal como un pulverizador de motor. Cuando el concentrado en suspensión de la presente invención se diluye con agua, una concentración del concentrado en suspensión se puede ajustar para que esté en un intervalo de 103 a 105 cfu/mL, preferiblemente aproximadamente 104 cfu/mL para que el ingrediente activo pueda estar presente en una dosis biológicamente eficaz, pero la presente invención no se limita a esta.

Además, la presente invención proporciona un método de control de nematodos parásitos de plantas, que incluye una etapa de tratar un cultivo, una semilla de cultivo o un campo con el agente de microorganismos nematicidas contra nematodos parásitos de plantas.

El método de control de los nematodos parásitos de plantas se puede llevar a cabo sumergiendo un cultivo o una semilla de cultivo en un caldo de cultivo obtenido cultivando la cepa de la presente invención o un agente de microorganismos usando la cepa, o empapando, es decir, pulverizando el caldo de cultivo o el agente de microorganismos sobre el cultivo o semilla de cultivo. En el caso del método de inmersión, el caldo de cultivo y el agente se pueden esparcir sobre el suelo alrededor de las plantas, o la semilla se puede empapar en el caldo de cultivo y el agente. Las plantas que se pueden aplicar al método de la presente invención no están particularmente limitadas.

Además, la presente invención proporciona un método de preparación de un agente de microorganismo nematicida contra nematodos parásitos de plantas, que incluye el cultivo de la cepa. Se puede usar cualquier método conocido en la técnica relacionada como el método de cultivo de la cepa de Aspergillus niger F22 y el método de preparación del agente de microorganismos, pero no son particularmente para determinados métodos.

Además, la cepa se puede cultivar en un medio de caldo de extracto de malta (MEB), un medio de caldo de dextrosa de patata (PDB), un medio de caldo Czapek Dox (CDB) o un medio de caldo de dextrosa Sabouraud (SDB), preferiblemente un medio PDB, pero la presente invención no se limita al mismo. En la presente invención, después de cultivar la cepa, se trata una suspensión de larvas de M. incógnita con un caldo de cultivo a una concentración del 10 % usando un bioensayo de microplaca de 96 pocillos, y se examinan las actividades nematicidas después de 3 días. Como resultado, la cepa tiene la mayor actividad nematicida porque la cepa exhibe una actividad de control del 94 % en el medio PDB. A continuación, se selecciona el medio PDB como medio óptimo.

En lo sucesivo, la presente invención se describirá en detalle con referencia a realizaciones de la misma. Sin embargo, se debe entender que los siguientes ejemplos son solo ejemplos preferidos con fines ilustrativos únicamente y no pretenden limitar o definir el alcance de la invención.

Ejemplo 1: Selección de cepas que tienen actividad nematicida y análisis de actividades nematicidas de cepas Para seleccionar hongos filamentosos que tienen una excelente actividad nematicida, los presentes inventores han recibido 61 filtrados de cultivo de hongos filamentosos para cribar sus actividades nematicidas. Específicamente, las raíces de una planta de tomate infectada con Meloidogyne spp. se lavaron con agua corriente para eliminar las sustancias extrañas. A continuación, las raíces bien lavadas se cortaron en trozos a intervalos de 1 cm o menos y se colocaron en una licuadora. A continuación, se agregó una solución de hiphoclorito de sodio al 0.5 % en dicha cantidad tal que las raíces se sumergieron y las raíces se molieron durante un minuto. Posteriormente, las raíces molidas se filtraron a través de un tamiz de 65 |im para eliminar los restos de las raíces, y los huevos que pasaron por el tamiz se recogieron a través de un tamiz de 25 |im y luego se lavaron con agua esterilizada varias veces. Una concentración de los huevos Meloidogyne spp. se midieron usando un microscopio estereoscópico.

Se cribaron las actividades nematicidas de los filtrados de cultivo de los 61 hongos usando un bioensayo de microplaca de 96 pocillos. Se agregaron 45 |iL de una suspensión de larvas de Meloidogyne spp. que incluye aproximadamente 50 larvas, a cada uno de los orificios y luego se trató con un filtrado de cultivo al 10 %. Después de 3 días del tratamiento de la muestra, se determinó la actividad nematicida usando la siguiente ecuación. El experimento se realizó por triplicado, se usó agua esterilizada al 10 % como el control sin tratar y se usó abamectina a una concentración letal de 1 |ig/mL como fármaco de control.

Actividad nematicida flfcj = [Número de nematodos muertosfjNúmero de nematodos viables Número de nematodos muertos)] x 100

Como resultado, como se muestra en la figura 1, se reveló que la cepa F22 exhibió una actividad nematicida perfecta (100 %) cuando los nematodos se trataron con el filtrado de cultivo al 10 %, y exhibió una actividad nematicida potente (96 %) incluso cuando los nematodos fueron tratados con el filtrado de cultivo al 5 %. Se puede ver que las larvas de nematodos no se retuercen en una forma linealmente recta cuando se tratan con una muestra, mientras que las larvas de nematodos estaban vivas porque las larvas se movían en una forma curva flexible en el grupo no tratado (Figura 2). Mientras tanto, el grupo en el que los nematodos fueron tratados con abamectina usada como fármaco de control exhibió una actividad nematicida del 95 % cuando se trató con 1 |ig/mL de abamectina. Ejemplo 2: Identificación de cepas

La cepa F22 que tiene una excelente actividad nematicida se cultivó en un medio PDB a 25 °C en un agitador a 150 rpm durante siete días. Para identificar la cepa F22, se determinaron y analizaron las secuencias de ADN de una región espaciadora transcrita interna (ITS) y una región de ARNr 26S. Específicamente, el ADN genómico se extrajo usando un mini kit DNeasy Plant (Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.), y se usó como plantilla de PCR. La PCR se realizó usando un conjunto de cebadores, ITS1 (5'- TCC GTA GGT gAa CCT GCG C-3': SEQ ID NO: 1) e ITS4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3': SEQ ID nO: 2), para analizar la secuencia de ADN de la región ITS de la cepa F22. La PCR se realizó usando un conjunto de cebadores, NL1 (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3': SEQ ID NO: 3) y NL4 (5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3': SEQ ID NO: 4), para analizar la secuencia de ADN de la región de ARNr 26S.

Después de que la región ITS y la región de ARNr 26S de la cepa F22 se amplificaron por PCR, los productos de PCR amplificados se purificaron usando un kit de purificación de QIAquick PCR (Qiagen, Hilden, Alemania). La secuencia de ADN analizada de la cepa fúngica se comparó con las secuencias de las cepas relacionadas registradas buscando en la base de datos proporcionada por the US Broad Institute. Como resultado de la comparación entre las secuencias de ADN, se identificó la cepa que tenía la mayor homología. Como resultado, como se muestra en la figura 3, se reveló que ambas regiones se agruparon en Aspergillus niger, y la cepa F22 se identificó como Aspergillus niger porque la región ITS y las regiones de ARNr 26S tenían homologías de 99.8 % y 98 %, respectivamente.

Ejemplo 3: Selección del medio óptimo

Para seleccionar un medio óptimo para producir sustancias con actividad nematicida a partir de la cepa F22, se examinaron las actividades nematicidas según el tipo de medio de cultivo usando 6 medios generalmente usados para cultivo de hongos. Se inocularon cinco piezas de placa de cultivo (diámetro: 6 mm) de la cepa F22 en seis medios de cultivo diferentes y se incubaron durante siete días en condiciones de 25 °C y 150 rpm mientras se agitaba. En este caso, los seis medios usados en este experimento fueron los siguientes: un medio de caldo de extracto de malta (MEB), un medio de caldo de patata dextrosa (PDB), un medio de caldo Czapek Dox (CDB), un medio de caldo de dextrosa Sabouraud (SDB), un medio de jugo V8 y un medio de jugo CV8 (un medio de jugo Clarified V8 de Campbell Soup Company). Los caldos de cultivo de la cepa F22 cultivada en estos seis medios se filtraron a través de una gasa esterilizada para obtener filtrados de cultivo. A continuación, una suspensión de larvas de Meloidogyne spp. se trató con cada uno de los filtrados de cultivo a una concentración del 10 % usando el bioensayo de microplaca de 96 pocillos mencionado anteriormente, y las actividades nematicidas se examinaron después de 3 días. Como resultado, la cepa F22 tuvo la actividad nematicida más alta ya que la cepa F22 exhibió una actividad de control del 94 % en el medio PDB, como se muestra en la figura 4. A continuación, se seleccionó el medio PDB como medio óptimo.

Ejemplo 4: Control de la actividad de los filtrados de cultivo contra Meloidogyne incógnita

Se investigó la actividad de control de la enfermedad del filtrado de cultivo de la cepa F22 de Aspergillus niger (A. niger) mediante un experimento de cultivo en maceta que incluye plantas de tomate infectadas con Meloidogyne incógnita. Se pusieron 400 g de arena esterilizada en una maceta de plástico que tenía un diámetro de 9.5 cm y se aplicaron al suelo del lecho. Posteriormente, se trasplantó un cultivar, 'Seogwang (Monsanto Korea, Inc.), de tomate cultivado durante 3 semanas en invernadero. Los huevos de Meloidogyne spp. se recolectaron de raíces de tomate infectadas con Meloidogyne spp. según el método mencionado anteriormente, y se inocularon los 10,000 huevos en cada una de las macetas. A continuación, la cepa F22 se cultivó en un medio PDB durante 7 días en condiciones de 25 °C y 150 rpm mientras se agitaba, y el caldo de cultivo de la cepa F22 se filtró a través de una gasa esterilizada para obtener un filtrado de cultivo. El filtrado del cultivo se diluyó 10 veces y 100 veces con agua esterilizada, y luego se empapó el suelo alrededor de las raíces de tomate dos veces con el filtrado del cultivo en un intervalo de una semana. El suelo se trató una vez con una solución diluida 3,000 veces de All Star (a.i., Abamectina 1.8 %) como control y, en el caso del grupo sin tratar, el suelo se trató con agua esterilizada. Los experimentos se realizaron por quintuplicado y las raíces de la planta se lavaron limpiamente con agua corriente 6 semanas después de la inoculación de los huevos de nematodos. A continuación, se examinó un índice de nudo de raíz según el método de Taylor and Sasser (1978, Identification and Control of Root-Knot Nematodes (Meloidogyne Species); Department of Plant Pathology, North Carolina State University: Raleigh, NC, 1978; Vol. 2, p 111). El índice de nudos de raíz se examinó en los niveles de 0 a 5 (0: 0 %, 1: 1 a 20 %, 2: 21 a 40 %, 3: 41 a 60 %, 4: 61 a 80 %, y 5: 81 a 100 %). Como resultado, como se muestra en la figura 5, se reveló que la cepa F22 exhibió una actividad de control del 71 % cuando se trató Meloidogyne incognita con una solución diluida 10 veces del filtrado de cultivo de la cepa F22, y se observó el crecimiento vigoroso de la planta. Como se describió anteriormente, se demostró que se consideró que la cepa A. niger F22 se usaba eficazmente para controlar Meloidogyne incognita.

Ejemplo 5: Examen de la actividad de control de formulaciones básicas usando la cepa A. niger F22 contra enfermedades por nematodos de los nudos de la raíz

1. Preparación de formulaciones básicas, incluida la cepa A. niger F22

Para desarrollar formulaciones básicas usando el caldo de cultivo de la cepa F22, se prepararon dos formulaciones en suspensión (concentrado en suspensión (SC) y microbiana en suspensión (SM)), dos formulaciones granulares (granulado absorbente (GR) y granulado en polvo (GR)), y una formulación de polvo humectable (WP).

© Preparación de la formulación de concentrado en suspensión (SC) de A. niger F22

A) Receta de preparación: Se preparó una formulación usando componentes finalmente prescritos como se enumeran en la siguiente tabla 1.

[Tabla 1]

B) Diagrama de flujo del procedimiento

1) Porción de tierra húmeda (50 %)

Se dispersó suficientemente un surfactante en agua y se molió un caldo de cultivo de A. niger y luego se mezcló con la dispersión. Cuando aparecieron las burbujas, se agregó una pequeña cantidad de un agente antiespumante en dosis divididas.

2) Porción espesada (50 %)

Se dispersó uniformemente un agente espesante en un agente anticongelante, y a continuación se le agregaron un conservante y agua, y se agitó uniformemente.

3) Procedimiento de mezcla de porciones del producto.

La porción triturada en húmedo y la porción espesada se mezclaron en una proporción apropiada (es decir, una proporción recomendada de 50:50) para preparar una formulación.

(2) Preparación de la formulación microbiana en suspensión (SM) de A. niger F22

A) Receta de preparación: Se preparó una formulación usando componentes finalmente prescritos como se enumeran en la siguiente tabla 2.

T l 21

B) Diagrama de flujo del procedimiento

1) Porción de mezcla del producto técnico (50 %)

Se dispersó suficientemente un surfactante en agua y a continuación se mezcló con un polvo obtenido secando por pulverización el caldo de cultivo de A. niger F22. Cuando aparecieron las burbujas, se agregó una pequeña cantidad de un agente antiespumante en dosis divididas.

2) Porción espesada (50 %)

Se dispersó uniformemente un agente espesante en un agente anticongelante, y luego se le agregaron un conservante y agua, y se agitó uniformemente.

3) Procedimiento de mezcla de porciones del producto.

La porción de mezcla del producto técnico y la porción espesada se mezclaron en una proporción apropiada (es decir, una proporción recomendada de 50:50) para preparar una formulación.

(3) Preparación de la formulación de gránulos absorbentes (GR) de A. niger F22

A) Receta de preparación: Se preparó una formulación usando componentes finalmente prescritos como se enumeran en la siguiente tabla 3.

[Tabla 31

B) Diagrama de flujo del procedimiento

Se secó por pulverización una mezcla de caldo de cultivo de A. niger F22 y tierra de diatomeas granular para preparar una formulación.

® Preparación de la formulación de gránulos en polvo (GR) de A. niger F22

A) Receta de preparación: Se preparó una formulación usando componentes finalmente prescritos como se enumeran en la siguiente tabla 4.

B) Diagrama de flujo del procedimiento

El producto técnico, los adyuvantes y los agentes de carga se mezclaron uniformemente y se agregó una cantidad apropiada de agua a un surfactante líquido y se amasó. A continuación, la mezcla resultante se molió en polvo, se secó y se tamizó para preparar una formulación.

® Preparación de la formulación de polvo humectable (WP) de A. niger F22

A) Receta de preparación: Se preparó una formulación usando componentes finalmente prescritos como se enumeran en la siguiente tabla 5.

B) Diagrama de flujo del procedimiento

El producto técnico, los surfactantes, un adyuvante y un agente de carga se mezclaron y molieron para preparar una formulación.

2. Examen de la actividad de control de formulaciones básicas, incluida la cepa A. niger F22 contra Meloidogyne incógnita

Actividades de control in vivo de un total de las cinco formulaciones preparadas de este modo, es decir, concentrado en suspensión (SC), microbiana en suspensión (SM), granulado absorbente (GR absorbente), granulado en polvo (GR en polvo) y polvo humectable (WP), y sus caldos de cultivo contra Meloidogyne incógnita se examinaron. Específicamente, se pusieron 400 g de arena esterilizada en una maceta de plástico (diámetro; 9.5 cm) y se trasplantaron plántulas de tomate cultivadas durante 3 semanas en el invernadero según el método descrito anteriormente. Se inocularon diez mil huevos de nematodos en cada una de las macetas. Después de una hora, cada uno de los caldos de cultivo de A. niger F22 y las 5 formulaciones se diluyó 100 veces y 50 veces con agua esterilizada en el caso de las formulaciones que excluían la formulación granulada, y se empapó el suelo con cada solución diluida a una cantidad de 20 mL/maceta. En este caso, la formulación de gránulos se mezcló con suelo. El tratamiento de la muestra se realizó dos veces con un intervalo de una semana y, en el caso de la formulación de gránulos, el tratamiento secundario se realizó después de que la formulación de gránulos se suspendiera en agua. El suelo se trató una vez con una solución diluida 3,000 veces de All Star (a.i., Abamectina 1.8 %) como control y, en el caso del grupo sin tratar, el suelo se trató con agua esterilizada. Los experimentos se realizaron por quintuplicado y las raíces de la planta se lavaron limpiamente con agua corriente 6 semanas después de la inoculación de los huevos de nematodos. A continuación, se examinó un índice de nudo de raíz según el método de Taylor and Sasser (1978, Identification and Control of Root-Knot Nematodes (Meloidogyne Species); Department of Plant Pathology, North Carolina State University: Raleigh, NC, 1978; Vol. 2, p 111). El índice de nudos de raíz se examinó en los niveles de 0 a 5 (0: 0 %, 1: 1 a 20 %, 2: 21 a 40 %, 3: 41 a 60 %, 4: 61 a 80 %, y 5: 81 a 100 %).

Como resultado, como se muestra en la figura 7, se reveló que la cepa F22 tenía valores de control de 16 % y 64 %, respectivamente, en los grupos en los que se trató el suelo con las soluciones diluidas 100 y 50 veces de la formulación de polvo humectable (WP), incluyendo la cepa F22, los valores de control aumentan de una manera dependiente de la concentración. Por lo tanto, se esperaba que, cuando se usaba la cepa F22 para desarrollar productos, las formulaciones de gránulos exhibieran una actividad de control superior, en comparación con cuando se preparaba la cepa F22 en la formulación de polvo humectable.

Ejemplo 6: Análisis de la actividad de control de filtrados de cultivo contra Meloidogyne hapla y Bursaphelenchus xylophilus

Para comprobar la actividad de control de la cepa A. niger F22 contra diversas enfermedades por nematodos parásitos de plantas, se examinaron las actividades de control contra Meloidogyne hapla y Bursaphelenchus xylophilus.

Las larvas de Meloidogyne hapla y Bursaphelenchus xylophilus fueron amablemente proporcionadas por el laboratorio del profesor Young Ho KIM en el departamento de Biología Aplicada de la Universidad Nacional de Seúl para realizar experimentos. La suspensión de larvas de nematodos que constaba del estadio J2 de Meloidogyne hapla o Bursaphelenchus xylophilus se preparó a una concentración de 100 larvas/100 |iL. A continuación, se colocaron 80 |iL de la suspensión de larvas de nematodos en una microplaca de 96 pocillos, y se le agregaron 20 |iL del filtrado de cultivo de modo que la suspensión se trató con el filtrado de cultivo para alcanzar una concentración del 20 %. Posteriormente, se transfirieron 20 |iL de la suspensión en el grupo tratado al 20 % a pocillos que contenían 80 |iL de la suspensión de larvas de nematodos para que la suspensión se tratara con el filtrado de cultivo para alcanzar una concentración del 5 % a la que se diluyó la suspensión 1/4 veces. De esta manera, se examinaron las actividades nematicidas de los filtrados de cultivo contra el estadio J2 de larvas de nematodos a concentraciones del 20 %, 5 % y 1 %. Después del tratamiento de la muestra, Meloidogyne hapla y Bursaphelenchus xylophilus se almacenaron a 25 °C, durante 24 horas en una incubadora, y luego se determinó la actividad nematicida usando la siguiente ecuación.

Actividad nematicida (%} = [Número de nematodos muertostjNúmero de nematodos

viables Número de nematodos muertos)] x 100

Como resultado, se reveló que, cuando Meloidogyne hapla y Bursaphelenchus xylophilus se trataron con los filtrados de cultivo al 20 %, 5 % y 1 %, respectivamente, la cepa de A. niger F22 exhibió 99.1 %, 98.4 %, y 80.9 % de actividades nematicidas contra Meloidogyne hapla, y exhibieron 79.7 %, 18.3 %, y 7.5 % de actividades nematicidas contra Bursaphelenchus xylophilus. Por lo tanto, se confirmó que la cepa de A. niger F22 exhibió una excelente

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Una cepa de Aspergillus niger (A. niger) F22 que tiene actividad nematicida contra los nematodos parásitos de plantas Bursaphelenchus xylophilus (B. xylophilus) y Meloidogyne spp., en la que la cepa de A. niger F22 está depositada con el número de acceso KCTC 12771BP.

2. La cepa de la reivindicación 1, en la que Meloidogyne spp. comprende uno o más seleccionados de Meloidogyne hapla, Meloidogyne javanica, Meloidogyne arenaria, y Meloidogyne incognita.

3. Un agente de microorganismo nematicida contra nematodos parásitos de plantas, que comprende la cepa definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, o una espora, una masa de hifas fúngicas o un caldo de cultivo de la misma como ingrediente activo.

4. El agente de microorganismo nematicida de la reivindicación 3, en el que el agente de microorganismo se prepara en una formulación seleccionada del grupo que consiste en concentrado en suspensión (SC), microbiana en suspensión (SM), gránulo absorbente (GR absorbente), gránulo en polvo (GR en polvo), polvo para espolvoreo (DP), gránulo dispersable en agua (WG), polvo dispersable en agua para el tratamiento de semillas en lechada (WS) y un polvo humectable (WP).

5. El agente de microorganismos nematicidas de la reivindicación 4, en el que el agente de microorganismos se prepara en una formulación de polvo humectable.

6. Un método de control de los nematodos parásitos de plantas, que comprende:

una etapa de tratamiento de un cultivo, una semilla de cultivo o un campo con el agente de microorganismos nematicidas contra nematodos parásitos de plantas definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

7. Un método de preparación de un agente de microorganismos nematicidas contra nematodos parásitos de plantas, que comprende: una etapa de cultivo de la cepa definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

8. El método de la reivindicación 7, en el que la cepa se cultiva en un medio de caldo de patata dextrosa (PDB).