BR112017021537B1

BR112017021537B1 - Agente de micro-organismo nematicida contra nematódeos parasíticos de planta, método para controle de nematódeos parasíticos de planta e método para preparação do dito agente

Info

Publication number: BR112017021537B1
Application number: BR112017021537-3A
Authority: BR
Inventors: Jin Cheol Kim; Hun Kim; Kee-Sun SHIN; Ja Yeong Jang; Gyung Ja Choi; Yong Ho Choi; Kyoung Soo Jang; Mi Bang Kim
Original assignee: Industry Foundation Of Chonnam National University; Korea Research Institute Of Chemical Technology; Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology
Priority date: 2015-04-06
Filing date: 2016-04-06
Publication date: 2022-03-03
Also published as: BR112017021537A2; KR101708325B1; US20180127707A1; CN109844095A; JP6496451B2; CN109844095B; EP3282007B1; CA2981227A1; CA2981227C; KR20160119624A; WO2016163726A1; JP2018512177A; AU2016244636B2; ES2827276T3; MX2017012755A; EP3282007A1; US20220119761A1; AU2016244636A1; EP3282007A4

Abstract

CEPA F22 DE ASPERGILLUS NIGER QUE TEM ATIVIDADE NEMATICIDA CONTRA NEMATÓDEOS PARASÍTICOS DE PLANTA E USO DA MESMA. A presente invenção refere-se a: uma cepa F22 de Aspergillus niger que tem uma atividade nematicida contra nematódeos parasíticos de planta; um agente de micro-organismo nematicida contra nematódeos parasíticos de planta, que contém, como um ingrediente ativo, a cepa, um esporo, uma massa de hifas fúngicas ou um líquido de cultura da mesma; um método para o controle de nematódeos parasíticos de planta, que compreende uma etapa de administrar o agente de micro-organismo a uma colheita, uma semente de colheita ou um campo; e um método para a preparação de um agente de micro-organismo nematicida contra nematódeos parasíticos de planta, que compreende uma etapa de cultivar a cepa.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente invenção refere-se a uma cepa F22 de Aspergillus niger que tem uma atividade nematicida contra nematódeos parasíticos de planta e um uso da mesma e, mais particularmente, a uma cepa de F22 de Aspergillus niger que tem uma atividade nematicida contra nematódeos parasíticos de planta, um agente de microorganismo nematicida contra nematódeos parasíticos de planta que inclui a cepa, ou um esporo, uma massa de hifas fúngicas ou um caldo de cultura da mesma como um ingrediente ativo, um método para o controle de nematódeos parasíticos de planta, que inclui uma etapa de tratar uma colheita, uma semente de colheita ou um campo com o agente de micro-organismo nematicida e um método para a preparação de um agente de micro-organismo nematicida contra nematódeos parasíticos de planta, que inclui cultivar a cepa.

TÉCNICA ANTERIOR

[002] Os nematódeos típicos que causam danos às principais colheitas de jardim, frutas e vegetais em instalações de horticultura na Coreia são conhecidos como nematódeos parasíticos de planta que incluem nematódeos de nódulos radiculares (isto é, Meloidogyne spp.). Em particular, os nematódeos de nódulos radiculares no solo de estufa causam danos graves a colheitas agrícolas. O nematódeo parasítico de planta inclui Meloidogyne spp., Globodera spp., Anguina spp., Ditylenchus spp., Aphalenchoides spp., Pratylenchus spp., Tylenchorhychus spp., Rotylenchulus spp., etc., dependendo dos padrões de dano e hospedeiros. Meloidogyne incognita, Meloidogyne hapla, Meloidogyne javanica e Meloidogyne arenaria em nematódeos de nódulos radiculares são os nematódeos principais que afetam de modo adverso a agricultura.

[003] Nos últimos anos, com a finalidade de controlar nematódeos parasíticos de planta, o controle cultural, físico ou químico tem sido usado. O controle cultural é realizado com o uso de água fresca, terreno alqueivado, solo seco, aragem profunda, solo transportado, cultivo de rotação de arroz, cultivares resistentes e similares, o controle físico é realizado através de tratamento de calor (métodos de imersão em água quente, calor seco e vapor), esterilização por calor solar e similares, e o controle químico é realizado por meio do tratamento de agentes químicos, tais como carbofurano, fostiazato e similares para controlar nematódeos. O controle cultural é dispendioso ou limitado em aplicação dependendo das condições regionais e colheitas e os cultivares resistentes têm uma desvantagem no fato de que suas aplicações são particularmente limitadas a colheitas, resultando em baixa praticabilidade. Embora os nematicidas químicos tenham um alto efeito de controle contra nematódeos parasíticos de planta, os mesmos, principalmente organofósforos ou carbamatos, são altamente tóxicos quando permanecem no solo, causam danos acumulativos para as colheitas, bem como poluição ambiental devido às ações bactericidas contra micro-organismos eficazes no solo, que são benéficos para o crescimento de colheitas e tornam gradualmente o solo infértil. Portanto, o uso de pesticidas químicos tem sido evitado devido aos problemas, tais como poluição ambiental, destruição do ecossistema, o envenenamento de pesticida para seres humanos e animais e um aumento na demanda por produtos agrícolas ecologicamente corretos. Além disso, o brometo de metila que tem sido usado, em geral, como um fumigante de solo para controlar nematódeos será banido devido à depleção da camada de ozônio (Caboni et al. (2013) J. Agric. Food Chem. 61, 1.794 a 1.803). Portanto, existe uma demanda para o desenvolvimento de nematicidas que sejam seguros para os ambientes e possam ser usados no lugar dos pesticidas agrícolas mencionados anteriormente.

[004] Nos últimos anos, entre os métodos para o controle de nematódeos parasíticos de planta de uma maneira ecologicamente correta, existe um método que usa micro-organismos. Alguns estudos mostraram que, à medida que os microorganismos crescem, os mesmos produzem diversos metabólitos secundários e agem diretamente em patógenos de planta para exibir diversas atividades antibacterianas e inseticidas (Zhao et al. (2014) Antagonistic action of Bacillus subtillis strain SG6 on Fusarium graminearum. PLoS one. 9(3), e92486). Portanto, a pesquisa está em fase de isolar as cepas que têm uma atividade nematicida através da triagem acerca de atividades nematicidas de diversos caldos de cultura de micro-organismos e desenvolver cepas para o controle de doenças causadas por nematódeos parasíticos de planta com o uso das mesmas.

[005] Entretanto, a publicação de patente não examinada coreana no 20060002789 revele um "nematicida" e a publicação de patente não examinada coreana no 2010-0116562 revela uma "cepa G341 de Bacillus velezensis e método para o controle de doenças de planta com o uso da mesma". No entanto, uma cepa F22 de Aspergillus niger que tem uma atividade nematicida contra nematódeos parasíticos de planta e um uso da mesma não são encontrados, conforme revelado na presente invenção.

REVELAÇÃO PROBLEMA DA TÉCNICA

[006] Portanto, a presente invenção é projetada para solucionar os problemas da técnica anterior e os presentes inventores constataram que, entre 61 fungos, uma Aspergillus niger F22 (KCTC 12771BP) é uma cepa que tem uma atividade nematicida contra larvas de nematódeo parasítico de planta sob condições de laboratório e suprime consideravelmente o início de doenças de nematódeo de nódulos radiculares mesmo sob condições de estufa com o uso de colheitas de tomate. Além disso, os presentes inventores têm confirmado que, quando 5 formulações básicas, tais como formulações de suspensão concentrada (SC), suspensão microbiana (SM), grânulo absorvente (GR absorvente), grânulo em pó (GR em pó) e pó molhável (WP) são preparadas para verificar uma atividade de controle contra Meloidogyne incognita, a formulação de pó molhável tem o valor de controle mais excelente. Portanto, os presentes inventores têm confirmado que a cepa da presente invenção pode substituir os pesticidas químicos como um pesticida biológico para o controle de nematódeos parasíticos de planta e pode ser fornecida como um agente de controle biológico inovador que pode solucionar os problemas causados pela poluição ambiental. Portanto, a presente invenção tem sido concluída com base nesses fatos.

SOLUÇÃO DA TÉCNICA

[007] Para solucionar os problemas acima, de acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecida uma cepa F22 de Aspergillus niger que tem uma atividade nematicida contra nematódeos parasíticos de planta.

[008] De acordo com um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um agente de micro-organismo nematicida que tem atividade contra nematódeos parasíticos de planta, que inclui a cepa, ou um esporo, uma massa de hifas fúngicas ou um caldo de cultura da mesma como um ingrediente ativo.

[009] De acordo com mais outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para o controle de nematódeos parasíticos de planta, que inclui uma etapa de tratar uma colheita, uma semente de colheita ou um campo com o agente de microorganismo.

[0010] De acordo com mais outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para a preparação de um agente de micro-organismo nematicida contra nematódeos parasíticos de planta, que inclui cultivar a cepa.

EFEITOS VANTAJOSOS

[0011] A cepa F22 de Aspergillus niger da presente invenção tem uma atividade nematicida contra Meloidogyne incognita de uma maneira dependente de concentração em um experimento na estufa, bem como um experimento in vitro e, dessa forma, é considerada como tendo um alto potencial para o desenvolvimento como um agente de controle contra os nematódeos parasíticos de planta. Mesmo quando a cepa da presente invenção é preparada em uma formulação de pó molhável e Meloidogyne incognita é tratado com a formulação de pó molhável, a cepa da presente invenção tem um efeito de controle excelente. Portanto, quando os processos de otimização de formulação e fermentação ideal subsequente são realizados, a cepa da presente invenção pode ser usada como um pesticida biológico, que é um nematicida microbiano inovador, em vez dos pesticidas químicos. Consequentemente, a cepa da presente invenção pode ser usada de forma muito eficaz como um agente de controle biológico inovador que pode solucionar os problemas causados pela poluição ambiental.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0012] A Figura 1 é um gráfico que ilustra atividades nematicidas de cepas selecionadas contra Meloidogyne incognita (M. incognita) quando M. incognita é tratado com diversas concentrações de filtrado de cultura da cepa de acordo com a presente invenção.

[0013] A Figura 2 mostra resultados da comparação de um formato de M. incognita morto, que é tratado com cada um dos filtrados de cultura a 10% das cepas selecionadas, com um forma de um grupo não tratado de acordo com a presente invenção.

[0014] A Figura 3 mostra uma análise filogenética com o uso de (A) regiões ITS e (B) sequências de RNA 26S da cepa selecionada, de acordo com a presente invenção.

[0015] A Figura 4 é um gráfico que ilustra atividades nematicidas da cepa F22 de Aspergillus niger dependendo de um meio de cultura de acordo com a presente invenção.

[0016] A Figura 5 é um gráfico que ilustra atividades de controle de doença da cepa F22 de Aspergillus niger contra doença de nematódeo de nódulos radiculares causada por M. incognita quando as plantas de tomate foram tratadas com um filtrado de cultura da cepa F22 de Aspergillus niger antes da infecção de M. incognita de acordo com a presente invenção.

[0017] A Figura 6 mostra resultados da comparação de formatos de raízes de plantas de tomate, que são tratadas com uma solução diluída 10 vezes do filtrado de cultura da cepa F22 de Aspergillus niger, com um formato do grupo não tratado de acordo com a presente invenção.

[0018] A Figura 7 é um gráfico que ilustra valores de controle de formulações básicas, que são preparadas com o uso do caldo de cultura da cepa F22 de Aspergillus niger, contra Meloidogyne incognita de acordo com a presente invenção.

[0019] A Figura 8 mostra resultados da comparação de formatos de raízes de plantas de tomate em grupos, em que M. incognita é tratado com soluções diluídas 100 vezes e 50 vezes de um agente em pó molhável da cepa F22 de Aspergillus niger, com formatos de raízes de plantas de tomate em um grupo não tratado e grupos em que M. incognita é tratado com uma solução diluída 3.000 vezes de abamectina (All Star) de acordo com a presente invenção.

[0020] A Figura 9 é um gráfico que ilustra atividades nematicidas dos filtrados de cultura da cepa F22 de Aspergillus niger contra Meloidogyne hapla e Bursaphelenchus xylophilus dependendo da concentração.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES PREFERENCIAIS

[0021] Para alcançar os objetivos, a presente invenção fornece uma cepa F22 de Aspergillus niger que tem uma atividade nematicida contra nematódeos parasíticos de planta.

[0022] Na presente invenção, é confirmado que, entre 61 fungos, um filtrado de cultura de uma certa cepa exibe uma atividade nematicida contra larvas de nematódeo parasítico de planta sob condições de laboratório e também suprime consideravelmente o início de doenças de nematódeo de nódulos radiculares, mesmo sob condições de estufa com o uso de colheitas de tomate. Nesse caso, a cepa foi identificada como uma cepa F22 de Aspergillus niger. A cepa F22 de Aspergillus niger foi depositada no Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology em 18 de março de 2015 (Número de acesso: KCTC 12771BP)

[0023] Na cepa de acordo com uma modalidade exemplificadora da presente invenção, os nematódeos parasíticos de planta podem incluir Bursaphelenchus xylophilus ou Meloidogyne spp. Aqui, a Meloidogyne spp. preferencial pode incluir uma ou mais selecionadas a partir de Meloidogyne incognita, Meloidogyne hapla, Meloidogyne javanica, Meloidogyne arenaria e Meloidogyne incognita (M. incognita), mas a presente invenção não se limita ao mesmo.

[0024] Na cepa de acordo com uma modalidade exemplificadora da presente invenção, os nematódeos parasíticos de planta da máxima preferência podem incluir Meloidogyne incognita, Meloidogyne hapla ou Bursaphelenchus xylophilus, mas a presente invenção não se limita ao mesmo.

[0025] Além disso, a presente invenção fornece um agente de microorganismo nematicida contra nematódeos parasíticos de planta, que inclui a cepa, ou um esporo, uma massa de hifas fúngicas ou um caldo de cultura da mesma como um ingrediente ativo.

[0026] O agente de micro-organismo pode incluir a cepa F22 de Aspergillus niger que tem uma atividade nematicida contra nematódeos parasíticos de planta, ou um esporo, uma massa de hifas fúngicas ou um caldo de cultura do mesmo como um ingrediente ativo.

[0027] De preferência, o agente de micro-organismo pode ser formulações de suspensão concentrada (SC), suspensão microbiana (SM), grânulo absorvente (GR absorvente), grânulo em pó (GR em pó) ou pó molhável (WP), com a máxima preferência, uma formulação de pó molhável, mas a presente invenção não se limita ao mesmo.

[0028] O agente de micro-organismo inclui um caldo de cultura preparado por meio da cultura de cada uma das cepas mencionadas anteriormente sob as condições de cultura mencionadas anteriormente e, dessa forma, pode ser usado como um pesticida microbiano, um agente de revestimento de semente, um nutriente microbiano, um agente de condicionamento de solo, um agente de fertilização de adubo, uma formulação de aspersão foliar ou uma formulação de aspersão de calda.

[0029] No agente de micro-organismo da presente invenção, a cepa F22 de Aspergillus niger ou o caldo de cultura da mesma pode ser modificado em diversas formas por meio de métodos conhecidos usados na técnica relacionada e pode ser usado em fases líquidas e de pó. De preferência, um concentrado ou caldo de cultura da cepa F22 de Aspergillus niger pode ser adsorvido em um veículo, tal como amido, proteínas brutas ou pós de pedra e, então, seco. O veículo que pode ser usado como uma mistura com o concentrado ou caldo de cultura da cepa da presente invenção pode incluir quaisquer veículos usados na técnica relacionada. Especificamente, o veículo que pode ser usado na presente invenção inclui cereal, tal como arroz, trigo, milho, cevada, feijão, painço, sorgo, trigo sarraceno, etc., colheitas de tubérculos, tais como batata, etc., raízes tuberosas, tais como batata-doce, mandioca, etc., ou produtos processados dos mesmos (por exemplo, pó), amidos derivados dos mesmos e derivados dos mesmos. Além disso, ágar, gelatina, pectato (poligalacturonato), quitosano, carboximetil celulose e derivados dos mesmos, Geolite, cera natural, goma natural, caulim, minerais de argila, tais como bentonita, ou materiais de diatomito, tais como Geolite, podem ser usados como o veículo. Tais diversos veículos podem ser usados sozinhos, ou dois ou mais veículos podem ser misturados em uma razão adequada para obter um veículo que tem propriedades físicas aperfeiçoadas. Quando os veículos mencionados anteriormente são usados, os veículos podem ser metabolizados em nutrientes por micro-organismos e podem ter uma propriedade adesiva aumentada a uma superfície de uma planta devido ao fato de que tais veículos têm viscosidade muito alta.

[0030] A presente invenção também pode incluir um produto seco obtido por meio da secagem da cepa ou do caldo de cultura de cepa e um pesticida biológico que inclui a mesma. O produto seco pode ser usado como uma formulação selecionada a partir do grupo que consiste em um pó molhável (WP), um material granular (GM), um grânulo dispersível em água (WG), um grânulo (GR), um pó polvilhável (DP) e um pó dispersível em água para tratamento de semente de pasta fluida (WS) para preparar um pesticida biológico. Tal formulação de pesticida biótico tem excelente estabilidade e propriedades físico-químicas, em comparação com as formulações líquidas convencionais e pode ser usada para controlar doenças de planta.

[0031] Entre os pesticidas bióticos, o pó molhável se refere a uma formulação de pesticida agrícola que está em uma fase de pó e começa a hidratar assim que é adicionada à água e o material granular se refere a uma formulação em que um caldo de cultura de micro-organismos é misturado com ou adsorvido em um material sólido, isto é, uma formulação que não corresponde às formulações de pó molhável e grânulo. Além disso, o grânulo dispersível em água se refere a uma formulação de pesticida agrícola que está em uma fase granular e é usada após ser diluída em água, o grânulo se refere a uma formulação de pesticida agrícola que está em uma fase granular e é usada intata, o pó polvilhável se refere a uma formulação de pesticida agrícola que está em uma fase de pó e é usada inata e os pós dispersíveis em água para tratamento de semente de pasta fluida se refere a uma formulação de pesticida agrícola que está em uma fase de pó e é hidratada para o uso como uma suspensão antes do tratamento de sementes.

[0032] O pó molhável de acordo com uma modalidade exemplificadora da presente invenção pode incluir uma cepa F22 de Aspergillus niger como um ingrediente ativo, carbono branco como um absorvente de umidade, bis[2-etil- hexil]sulfosuccinato de sódio como um umectante, lignossulfonato de sódio como um agente de dispersão e caulim como um agente avolumador. De preferência, o pó molhável pode incluir 10% em peso da cepa F22 de Aspergillus niger, 1% em peso de carbono branco, 1% em peso de bis[2-etil-hexil]sulfosuccinato de sódio, 1% em peso de lignossulfonato de sódio e 87% em peso de caulim.

[0033] A suspensão concentrada de acordo com uma modalidade exemplificadora da presente invenção é usada para controlar nematódeos parasíticos de planta. Para usar o agente de micro-organismo da presente invenção para controlar os nematódeos parasíticos de planta, o agente de microorganismo pode ser uniformemente diluído em água e, então, aspergido sobre uma colheita, uma semente de colheita ou um campo com o uso de uma máquina de aspersão adequada, tal como um aspersor a motor. Quando a suspensão concentrada da presente invenção é diluída em água, uma concentração da suspensão concentrada pode ser ajustada para se situar em uma faixa de 103 a 105cfu/ml, de preferência, aproximadamente 104cfu/ml, de modo que o ingrediente ativo possa estar presente em uma dose biologicamente eficaz, mas a presente invenção não se limita ao mesmo.

[0034] Além disso, a presente invenção fornece um método para o controle de nematódeos parasíticos de planta, que inclui uma etapa de tratar uma colheita, uma semente de colheita ou um campo com o agente de micro-organismo nematicida contra nematódeos parasíticos de planta.

[0035] O método para o controle de nematódeos parasíticos de planta pode ser realizado por meio da imersão de uma colheita ou uma semente de colheita em um caldo de cultura obtido por meio da cultura da cepa da presente invenção ou um agente de micro-organismo com o uso da cepa, ou encharcamento, isto é, aspersão do caldo de cultura ou do agente de microorganismo sobre a colheita ou semente de colheita. No caso do método de imersão, o caldo de cultura e o agente podem ser aspergidos sobre o solo ao redor das plantas, ou a semente pode ser embebida no caldo de cultura e agente. As plantas que podem ser aplicadas ao método da presente invenção não são particularmente limitadas.

[0036] Além disso, a presente invenção fornece um método para a preparação de um agente de micro-organismo nematicida contra nematódeos parasíticos de planta, que inclui cultivar a cepa. Quaisquer métodos conhecidos na técnica relacionada podem ser usados como o método para cultivar a cepa F22 de Aspergillus niger e o método para a preparação do agente de micro-organismo, mas não são particularmente limitados a certos métodos.

[0037] Adicionalmente, a cepa pode ser cultivada em um meio de caldo de extrato de malte (MEB), um meio de caldo de dextrose de batata (PDB), um meio de caldo Czapek Dox (CDB) ou um meio de caldo de dextrose Sabouraud (SDB), de preferência, um meio PDB, mas a presente invenção não se limita ao mesmo. Na presente invenção, depois que a cepa é cultivada, uma suspensão de larva de M. incognita é tratada com um caldo de cultura em uma concentração de 10% com o uso de um bioensaio de microplacas de 96 poços e as atividades nematicidas são examinadas após 3 dias. Como resultado, a cepa tem a atividade nematicida maior devido ao fato de que a cepa exibe 94% de atividade de controle no meio PDB. Posteriormente, o meio PDB é selecionado como um meio ideal.

[0038] Mais adiante neste documento, a presente invenção será descrita em detalhes com referência às modalidades da mesma. No entanto, deve-se compreender que os exemplos a seguir são exemplos preferenciais para o propósito de ilustração apenas e não se destinam a limitar ou definir o escopo da invenção.

Exemplo 1: Seleção de cepas que têm atividade nematicida e análise de atividades nematicidas de cepas

[0039] Para selecionar fungos filamentosos que têm uma excelente atividade nematicida, os presentes inventores receberam 61 filtrados de cultura de fungos filamentosos para realizar a triagem de suas atividades nematicidas. Especificamente, as raízes de uma planta de tomate infectadas com Meloidogyne spp. foram lavadas com água corrente para remover substâncias estranhas. Posteriormente, as raízes bem lavadas foram cortadas em pedaços em intervalos de 1 cm ou menos e colocadas em um misturador. Então, uma solução de hipoclorito de sódio a 0,5% foi adicionada em uma quantidade de modo que as raízes fossem imersas e as raízes foram trituradas durante um minuto. Subsequentemente, as raízes trituradas foram filtradas através de uma peneira de 65 μm para remover detritos de raiz e os ovos passados através da peneira foram coletados através de uma peneira de 25 μm e, então, lavados com água esterilizada várias vezes. Uma concentração dos ovos de Meloidogyne spp. coletados foi medida com o uso de um microscópio estereoscópico.

[0040] As atividades nematicidas dos filtrados de cultura dos 61 fungos foram submetidas à triagem com o uso de um bioensaio de microplacas de 96 poços. 45 μl de uma suspensão de larva de Meloidogyne spp., que inclui aproximadamente 50 larvas, foram adicionados a cada um dos orifícios e, então, tratados com um filtrado de cultura a 10%. Após 3 dias do tratamento de amostra, a atividade nematicida foi determinada com o uso da equação a seguir. O experimento foi realizado em triplicata, 10% de água esterilizada foi usada como o controle não tratado e abamectina foi usada em uma concentração letal de 1 μg/ml como o fármaco de controle.Atividade nematicida (%) = [Número de nematódeos mortos/(Número de nematódeos viáveis + Número de nematódeos mortos)] x 100

[0041] Como resultado, conforme mostrado na Figura 1, foi revelado que a cepa F22 exibiu atividade nematicida perfeita (100%) quando os nematódeos foram tratados com o filtrado de cultura a 10% e exibiu atividade nematicida potente (96%) mesmo quando os nematódeos foram tratados com o filtrado de cultura a 5%. Pode ser observado que as larvas de nematódeo não se mexeram em uma formato linearmente reto quando tratadas com uma amostra, enquanto que as larvas de nematódeo ficaram vivas devido ao fato de que as larvas se mexeram ao longo de um formato curvado flexível no grupo não tratado (Figura 2). Entretanto, o grupo em que os nematódeos foram tratados com abamectina usada como o fármaco de controle exibiu 95% de atividade nematicida quando tratado com 1 μg/ml de abamectina.

Exemplo 2: Identificação de cepas

[0042] A cepa F22 que tem uma excelente atividade nematicida foi cultivada em um meio PDB a 25 °C no agitador a 150 rpm durante sete dias. Para identificar a cepa F22, as sequências de DNA de uma região de espaçador interno transcrito (ITS) e região de 26S rRNA foram determinadas e analisadas. Especificamente, o DNA genômico foi extraído com o uso de um mini kit DNeasy Plant (Qiagen, Valencia, CA, EUA) e foi usado como um modelo de PCR. A PCR foi realizada com o uso de um conjunto de iniciadores, ITS1 (5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG C-3’: SEQ ID NO: 1) e ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC- 3’: SEQ ID NO: 2), para analisar a sequência de DNA da região ITS da cepa F22. A PCR foi realizada com o uso de um conjunto de iniciadores, NL1 (5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’: SEQ ID NO: 3) e NL4 (5’-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3’: SEQ ID NO: 4), para analisar a sequência de DNA da região 26S rRNA.

[0043] Depois que a região ITS e a região 26S rRNA da cepa F22 foram amplificadas por PCR, os produtos de PCR amplificados foram purificados com o uso de um kit de purificação por PCR QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemanha). A sequência de DNA analisada da cepa fúngica foi comparada com as sequências das cepas relacionadas registradas por meio da pesquisa do banco de dados fornecido pelo US Broad Institute. Como resultado da comparação entre as sequências de DNA, a cepa que tem a homologia maior foi identificada. Como resultado, conforme mostrado na Figura 3, foi revelado que ambas dentre as duas regiões foram agrupadas em Aspergillus niger e a cepa F22 foi identificada como Aspergillus niger devido ao fato de que a região ITS e as regiões 26S rRNA tiveram homologias de 99,8% e 98%, respectivamente.

Exemplo 3: Seleção de meio ideal

[0044] Para selecionar um meio ideal para produzir substâncias que têm uma atividade nematicida a partir da cepa F22, as atividades nematicidas de acordo com o tipo do meio de cultura foram examinadas com o uso de 6 meios geralmente usados para cultura fúngica. Cinco pedaços da placa de cultura (diâmetro: 6 mm) da cepa F22 foram inoculados em seis meios de cultura diferentes e incubados durante sete dias sob condições de 25 °C e 150 rpm mediante agitação. Nesse caso, os seis meios usados nesse experimento foram conforme exposto a seguir: Um meio de caldo de extrato de malte (MEB), um meio de caldo de dextrose de batata (PDB), um meio de caldo Czapek Dox (CDB), um meio de caldo de dextrose Sabouraud (SDB), um meio de suco V8 e um meio de suco CV8 (um meio de suco V8 clarificado disponível junto à Campbell Soup Company). Os caldos de cultura da cepa F22 cultivada em tais seis meios foram filtrados através de gaze esterilizada para obter filtrados de cultura. Então, uma suspensão de larva de Meloidogyne spp. foi tratada com cada um dos filtrados de cultura em uma concentração de 10% com o uso do bioensaio de microplacas de 96 poços mencionado anteriormente e as atividades nematicidas foram examinadas após 3 dias. Como resultado, a cepa F22 teve a atividade nematicida maior à medida que a cepa F22 exibiu 94% de atividade de controle no meio PDB, conforme mostrado na Figura 4. Posteriormente, o meio PDB foi selecionado como um meio ideal.

Exemplo 4: Atividade de controle de filtrados de cultura contra Meloidogyne incógnita

[0045] A atividade de controle de doença do filtrado de cultura da cepa F22 de Aspergillus niger (A. niger) foi investigada por meio do experimento de cultura em recipiente que inclui plantas de tomate infectadas com Meloidogyne incognita. 400 g de areia esterilizada foram colocados em um recipiente de plástico que tem um diâmetro de 9,5 cm e aplicados ao solo de leito. Posteriormente, um cultivar, Seogwang (Monsanto Korea, Inc.), de tomate cultivado durante 3 semanas na estufa foi transplantado. Os ovos de Meloidogyne spp. foram coletados a partir de raízes de tomate infectadas com Meloidogyne spp. de acordo com o método anteriormente mencionado e os 10.000 ovos foram inoculados em cada um dos recipientes. Então, a cepa F22 foi cultivada em um meio PDB durante 7 dias sob condições de 25 °C e 150 rpm, mediante agitação, e o caldo de cultura da cepa F22 foi filtrado através de gaze esterilizada para obter um filtrado de cultura. O filtrado de cultura foi diluído 10 vezes e 10 vezes com água esterilizada e o solo ao redor das raízes de tomate foi, então, encharcado duas vezes com o filtrado de cultura em um intervalo de uma semana. O solo foi tratado uma vez com uma solução diluída 3.000 vezes de All Star (isto é, Abamectina a 1,8%) como o controle e, no caso do grupo não tratado, o solo foi tratado com água esterilizada. Os experimentos foram realizados em quintuplicata e as raízes da planta foram lavadas cuidadosamente com água corrente 6 semanas após a inoculação dos ovos de nematódeo. Então, um índice de nódulos radiculares foi examinado de acordo com o método de Taylor e Sasser (1978, Identification and Control of RootKnot Nematodes (Meloidogyne Species); Department of Plant Pathology, Universidade do Estado da Carolina do Norte: Raleigh, NC, 1978; Vol. 2, página 111). O índice de nódulos radiculares foi examinado em níveis 0 a 5 (0: 0%, 1: 1 a 20%, 2: 21 a 40%, 3: 41 a 60%, 4: 61 a 80% e 5: 81 a 100%).

[0046] Como resultado, conforme mostrado na Figura 5, foi revelado que a cepa F22 exibiu 71% de atividade de controle quando Meloidogyne incognita foi tratado com uma solução diluída 10 vezes do filtrado de cultura da cepa F22 e o crescimento vigoroso da planta foi observado. Conforme descrito acima, foi demonstrado que a cepa F22 de A. niger foi considerada como sendo usada de forma eficaz para controlar Meloidogyne incognita.

Exemplo 5: Exame da atividade de controle de formulações básicas com o uso de cepa F22 de A. niger contra doenças de nematódeo de nódulos radiculares 1. Preparação de formulações básicas que incluem a cepa F22 de A. niger

[0047] Para desenvolver as formulações básicas com o uso do caldo de cultura da cepa F22, duas formulações de suspensão (suspensão concentrada (SC) e suspensão microbiana (SM)), duas formulações de grânulo (grânulo absorvente (GR) e grânulo em pó (GR)) e uma formulação de pó molhável (WP) foram preparadas. Φ Preparação de formulação de suspensão concentrada (SC) de F22 de A. niger A) Prescrição preparatória: Uma formulação foi preparada com o uso dos componentes finalmente prescritos conforme listado na seguinte Tabela 1. Tabela 1

B) Fluxograma de processo 1) Porção triturada a úmido (50%)

[0048] Um tensoativo foi suficientemente disperso em água e um caldo de cultura de A. niger foi triturado e, então, misturado com a dispersão. Quando ocorreram as bolhas, uma quantidade pequena de um agente antiespuma foi adicionada em doses divididas.

2) Porção espessada (50%)

[0049] Um agente espessante foi uniformemente disperso em um agente anticongelante e um conservante e água foram adicionados ao mesmo e igualmente agitados.

3) Processo para a mistura de porções de produto

[0050] A porção triturada a úmido e a porção espessada foram misturadas em uma razão adequada (isto é, uma razão recomendada de 50:50) para preparar uma formulação. 4) Preparação de formulação suspensão microbiana (SM) de F22 de A. niger A) Prescrição preparatória: Uma formulação foi preparada com o uso dos componentes finalmente prescritos conforme listado na seguinte Tabela 2. Tabela 2

B) Fluxograma de processo 1) Porção misturada com produto da técnica (50%)

[0051] Um tensoativo foi suficientemente disperso em água e, então, misturado com um pó obtido por meio da secagem por aspersão do caldo de cultura de F22 de A. niger. Quando ocorreram as bolhas, uma quantidade pequena de um agente antiespuma foi adicionada em doses divididas.

2) Porção espessada (50%)

[0052] Um agente espessante foi uniformemente disperso em um agente anticongelante e um conservante e água foram adicionados ao mesmo e igualmente agitados.

3) Processo para a mistura de porções de produto

[0053] A porção misturada com produto da técnica e a porção espessada foram misturadas em uma razão adequada (isto é, uma razão recomendada de 50:50) para preparar uma formulação.

4) Preparação de formulação de grânulo absorvente (GR) de F22 de A. niger

[0054] A) Prescrição preparatória: Uma formulação foi preparada com o uso dos componentes finalmente prescritos conforme listado na seguinte Tabela 3.Tabela 3

B) Fluxograma de processo

[0055] Uma mistura de caldo de cultura de F22 de A. niger e diatomito granular foi seca por aspersão para preparar uma formulação. 5) Preparação de formulação de grânulo em pó (GR) de F22 de A. niger A) Prescrição preparatória: Uma formulação foi preparada com o uso dos componentes finalmente prescritos conforme listado na seguinte Tabela 4. Tabela 4

B) Fluxograma de processo

[0056] O produto da técnica, adjuvantes e agentes avolumadores foram uniformemente misturados e uma quantidade adequada de água foi adicionada a um tensoativo líquido e amassados. Posteriormente, a mistura resultante foi triturada em pó, seca e peneirada para preparar uma formulação. ® Preparação de formulação de pó molhável (WP) de F22 de A. niger A) Prescrição preparatória: Uma formulação foi preparada com o uso dos componentes finalmente prescritos conforme listado na seguinte Tabela 5. Tabela 5

B) Fluxograma de processo

[0057] O produto da técnica, tensoativos, um adjuvante e um agente avolumador foram misturados e triturados para preparar uma formulação.

2. Exame da atividade de controle de formulações básicas que incluem cepa F22 de A. niger contra Meloidogyne incógnita

[0058] Foram examinadas as atividades de controle in vivo de um total das cinco formulações assim preparadas, isto é, formulações de suspensão concentrada (SC), suspensão microbiana (SM), grânulo absorvente (GR absorvente), grânulo em pó (GR em pó) e pó molhável (WP) e caldos de cultura das mesmas contra Meloidogyne incognita. Especificamente, 400 g de areia esterilizada foram colocados em um recipiente de plástico (diâmetro; 9,5 cm) e as mudas de tomate cultivadas durante 3 semanas na estufa foram transplantadas de acordo com o método conforme descrito acima. Dez mil ovos de nematódeo foram inoculados em cada um dos recipientes. Após uma hora, cada um dentre o caldo de cultura de F22 de A. niger e as 5 formulações foi diluído 100 vezes e 50 vezes com água esterilizada, no caso das formulações excluindo a formulação de grânulo, e o solo foi encharcado com cada solução diluída em uma quantidade de 20 ml/recipiente. Nesse caso, a formulação de grânulo foi misturada com o solo. O tratamento de amostra foi realizado duas vezes em um intervalo de uma semana e, no caso da formulação de grânulo, o tratamento secundário foi realizado depois que a formulação de grânulo foi suspensa em água. O solo foi tratado uma vez com uma solução diluída 3.000 vezes de All Star (isto é, Abamectina a 1,8%) como o controle e, no caso do grupo não tratado, o solo foi tratado com água esterilizada. Os experimentos foram realizados em quintuplicata e as raízes da planta foram lavadas cuidadosamente com água corrente 6 semanas após a inoculação dos ovos de nematódeo. Então, um índice de nódulos radiculares foi examinado de acordo com o método de Taylor e Sasser (1978, Identification and Control of RootKnot Nematodes (Meloidogyne Species); Department of Plant Pathology, Universidade do Estado da Carolina do Norte: Raleigh, NC, 1978; Vol. 2, página 111). O índice de nódulos radiculares foi examinado em níveis 0 a 5 (0: 0%, 1: 1 a 20%, 2: 21 a 40%, 3: 41 a 60%, 4: 61 a 80% e 5: 81 a 100%).

[0059] Como resultado, conforme mostrado na Figura 7, foi revelado que a cepa F22 teve valores de controle de 16% e 64%, respectivamente, nos grupos em que o solo foi tratado com as soluções diluídas 100 vezes e 50 vezes da formulação de pó molhável (WP) que inclui a cepa F22, sendo que os valores de controle aumentam de uma maneira dependente de concentração. Portanto, foi esperado que, quando a cepa F22 foi usada para desenvolver produtos, as formulações de grânulo exibissem atividade de controle superior em comparação com quando a cepa F22 foi preparada na formulação de pó molhável.

Exemplo 6: Análise de atividade de controle de filtrados de cultura contra Meloidogyne hapla e Bursaphelenchus xylophilus

[0060] Para verificar a atividade de controle da cepa F22 de A. niger contra diversas doenças de nematódeo parasítico de planta, as atividades de controle contra Meloidogyne hapla e Bursaphelenchus xylophilus foram examinadas.

[0061] As larvas de Meloidogyne hapla e Bursaphelenchus xylophilus foram gentilmente fornecidas a partir do laboratório do Professor Young Ho KIM no departamento de biologia aplicada da Seoul National University para realizar os experimentos. A suspensão de larva de nematódeo que consiste no estágio J2 de Meloidogyne hapla ou Bursaphelenchus xylophilus foi preparada em uma concentração de 100 larvas/100 μl. Então, 80 μl da suspensão de larva de nematódeo foram colocados em uma microplaca de 96 poços e 20 μl do filtrado de cultura foram adicionados a mesma, de modo que a suspensão fosse tratada com o filtrado de cultura para alcançar uma concentração de 20%. Subsequentemente, 20 μl da suspensão no grupo tratado com 20% foram transferidos para poços que contêm 80 μl da suspensão de larva de nematódeo, de modo que a suspensão fosse tratada com o filtrado de cultura para alcançar uma concentração de 5% no qual a suspensão foi diluída 1/4 vezes. Dessa maneira, as atividades nematicidas dos filtrados de cultura contra o estágio J2 de larvas de nematódeo em concentrações de 20%, 5% e 1% foram examinadas. Após o tratamento de amostra, Meloidogyne hapla e Bursaphelenchus xylophilus foram armazenados a 25 °C durante 24 horas em um incubador e a atividade nematicida foi, então, determinada com o uso da seguinte equação. Atividade nematicida (%) = [Número de nematódeos mortos/(Número de nematódeos viáveis + Número de nematódeos mortos)] x 100

[0062] Como resultado, foi revelado que, quando Meloidogyne hapla e Bursaphelenchus xylophilus foram tratados com os filtrados de cultura a 20%, 5% e 1%, respectivamente, a cepa F22 de A. niger exibiu 99,1%, 98,4% e 80,9% de atividades nematicidas contra Meloidogyne hapla e exibiu 79,7%, 18,3% e 7,5% de atividades nematicidas contra Bursaphelenchus xylophilus. Portanto, foi confirmado que a cepa F22 de A. niger exibiu excelente atividade nematicida contra M. hapla e B. xylophilus, bem como M. incognita, particularmente exibiu atividade nematicida potente contra Meloidogyne hapla (Figura 9).

Número de acesso

[0063] Instituição depositária: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology

[0064] Número de acesso: KCTC12771BP

[0065] Data de depósito: 18 de março de 2015

Claims

1. Agente de micro-organismo nematicida contra nematódeos parasíticos de planta que consistem em Bursaphelenchus xylophilus (B. xylophilus) e Meloidogyne spp., CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cepa F22 de Aspergillus niger (A. niger) tendo o número de acesso KCTC 12771BP, ou um esporo, uma massa de hifas fúngicas ou um caldo de cultura da mesma como um ingrediente ativo.

2. Agente de micro-organismo nematicida, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a Meloidogyne spp. compreende uma ou mais selecionadas a partir do grupo que consiste em Meloidogyne hapla, Meloidogyne javanica, Meloidogyne arenaria e Meloidogyne incognita.

3. Agente de micro-organismo nematicida, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de micro-organismo é preparado em uma formulação de suspensão concentrada (SC), suspensão microbiana (SM), grânulo absorvente (GR absorvente), grânulo em pó (GR em pó), pó polvilhável (DP), grânulo dispersível em água (WG), pó dispersível em água para tratamento de semente de pasta fluida (WS) ou pó molhável (WP).

4. Método para controle de nematódeos parasíticos de planta, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: uma etapa de tratar uma colheita, uma semente de colheita, ou um campo com o agente de micro-organismo nematicida conforme definido na reivindicação 3.

5. Método para preparação de um agente de micro-organismo nematicida contra nematódeos parasíticos de planta, como definido na reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: uma etapa de cultivar a cepa F22 de A. niger que foi depositada com o número de acesso KCTC 12771BP .

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a cepa é cultivada em um meio de caldo de dextrose de batata (PDB).