CN117603878B - 一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种复合微生物菌剂，其包括贝莱斯芽孢杆菌HM‑6和球孢白僵菌。所述贝莱斯芽孢杆菌HM‑6的保藏编号为CGMCC No.28606。本发明同时还涉及上述复合菌剂的制备方法和应用。本发明的复合微生物菌剂对甘薯茎线虫病害具有良好防效且可实现甘薯增产增收。
Description
技术领域
本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
农作物在生长过程中，线虫是一种十分常见的植物虫害。一些植物寄生线虫会破坏植物的根组织，导致植物根系发育受阻，营养吸收出现障碍。有些线虫还会传播其它病害。线虫估计每年能给农作物造成相当于1000亿美元的损失。
甘薯茎线虫（Ditylenchus destructor）引起的甘薯茎线虫病是我国北方薯区甘薯生产上最严重的病害之一。该线虫在甘薯整个生育期均能寄生危害，主要危害薯块，同时也危害茎蔓及秧苗。甘薯茎线虫使甘薯大幅减产，重病田甚至造成绝产无收。
实际生产中，化学农药仍然是防治甘薯茎线虫的重要手段，但化学防控对环境和食品安全会产生不利的影响。某些微生物在抑制土壤根结线虫中可起到关键作用，但是单一微生物的防效有限，易受土壤中土著微生物和环境的影响，难以有效发挥防治效果。目前能够应用于甘薯茎线虫防控的微生物制剂产品较少，且受土壤环境和其他土壤微生物等影响，田间防效不稳定，急需研究针对甘薯茎线虫的安全有效的且能用于实际生产的微生物制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种对甘薯茎线虫病害具有良好防效且可实现甘薯增产增收的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。
本发明采用如下技术方案：
一种复合微生物菌剂，其包括贝莱斯芽孢杆菌HM-6和球孢白僵菌。
其中，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HM-6于2023年10月11日保存在中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.28606。
其中，复合微生物菌剂的总活菌数不小于3×108cfu/g。
其中，贝莱斯芽孢杆菌HM-6和球孢白僵菌的菌数之比为0.5~7∶1。
进一步的，所述复合微生物菌剂还包括颗粒型有机肥、焦糖色以及防结块剂。
一种上述复合微生物菌剂的制备方法，其包括如下步骤：
（1）制备贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌粉；
（2）将贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌粉、球孢白僵菌菌粉、颗粒型有机肥、焦糖色以及防结块剂混合均匀。
制备方法中，贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌粉通过如下方法制备：
（a）活化菌株；
（b）制备种子液；
（c）制备发酵液；
（d）将发酵液与硅藻土按5～15∶1质量比混合均匀，经冷冻干燥机喷雾得到贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌粉。
制备方法中，所述贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌粉的有效活菌数不小于3×1010cfu/g；所述球孢白僵菌菌粉的孢子数不小于1×1010cfu/g。
制备方法中，所述步骤（2）具体为：将贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌粉和球孢白僵菌菌粉与颗粒型有机肥料混合，搅拌5分钟，加入焦糖色搅拌5分钟，再加入防结块剂，搅拌5~8分钟，配制的产品颗粒不粘结，手握不成团，外观黑亮，无粉末，即得。
进一步的，所述步骤（2）具体为：将贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌粉和球孢白僵菌菌粉按照菌数比为0.5~7∶1与1kg颗粒型有机肥料混合，搅拌5分钟，加入焦糖色5g搅拌5分钟，再加入防结块剂10g，搅拌5~8分钟，配制的产品颗粒不粘结，手握不成团，外观黑亮，无粉末，即得。
一种上述复合微生物菌剂在防治甘薯线虫病害中的应用。
上述复合微生物菌剂的使用方法为在甘薯秧移栽定植前将所述复合微生物菌剂穴施到土壤中。
本发明的有益效果在于：本发明利用贝莱斯芽孢杆菌和球孢白僵菌复合使用时具有的对甘薯线虫病害防控的协同防控作用，解决了单一菌株的局限问题，对甘薯茎线虫防控的田间实际应用效果可在86.5%以上，大幅减少甘薯茎线虫病害，实现增产增收。本发明的复合菌剂，还可用于高效防控其他地下害虫。
附图说明
图1为贝莱斯芽孢杆菌HM-6在固体LB培养基上培养24h的菌落形态。
图2为贝莱斯芽孢杆菌HM-6革兰氏染色后的光学显微镜下的形态。
图3为贝莱斯芽孢杆菌HM-6基于16S rDNA构建的系统发育树。
图4为贝莱斯芽孢杆菌HM-6与球孢白僵菌之间的生物相容性检测结果。
图5为贝莱斯芽孢杆菌HM-6发酵液对根结线虫的毒杀效果。
图6为球孢白僵菌发酵液对根结线虫的毒杀效果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。本发明保护范围不限于实施例，本领域技术人员在权利要求限定的范围内做出任何改动也属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到。
实施例1贝莱斯芽孢杆菌HM-6
贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HM-6由在河北省卢龙县卢龙镇已重茬4年的甘薯地块采集的土壤样品中分离纯化所得，2023年10月11日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.28606。
（1）形态特征
菌落边缘粗糙且不规则，菌落起皱呈白色，如图1所示。菌体为杆状，有芽孢，革兰氏染色呈阳性，如图2所示。贝莱斯芽孢杆菌HM-6基于16S rDNA构建的系统发育树如图3所示。
（2）生理生化特征
对菌株HM-6的生理和生化特性进行鉴定实验，结果如表1所示。
表1 菌株HM-6生理生化特征
。
实施例2检测贝莱斯芽孢杆菌HM-6与球孢白僵菌之间的生物相容性
球孢白僵菌菌剂粉剂（济宁市夏农生物科技有限公司，水溶性球孢白僵菌，有效活菌数100亿/g），用PDA培养基从上述球孢白僵菌菌剂中分离、纯化球孢白僵菌，取纯化后的球孢白僵菌菌株在PDA培养基上涂布，放置于28℃恒温培养箱中培养5天，备用。
将贝莱斯芽孢杆菌HM-6利用LB培养基活化，球孢白僵菌利用PDA培养基进行活化。
121℃高温高压20min灭菌PDA培养基，放置至45℃左右时倒入培养皿，每个培养皿倒入约15mL～20mL。活化好的贝莱斯芽孢杆菌HM-6与球孢白僵菌打5mm菌饼，均匀放置于冷却凝固后的PDA培养皿上，做好标号。放置于28℃恒温培养箱中培养5天，贝莱斯芽孢杆菌HM-6与球孢白僵菌共同生长，已长满培养皿，无抑菌带产生，说明贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌株与球孢白僵菌菌株具有协同作用，互相不抑制。结果见图4，其中左侧为培养皿正面视图，右侧为培养皿反面视图。
LB培养基配方：酵母膏5g、蛋白胨10g、氯化钠10g，置于1000mL烧杯中，加900mL蒸馏水加热溶解，调pH为7.2~7.4，用蒸馏水定容至1L，121℃灭菌30分钟，备用。
PDA培养基配方：土豆 200g、葡萄糖 20g、琼脂 20g、水 1000ml，pH自然，121℃灭菌20分钟。
实施例3 贝莱斯芽孢杆菌HM-6发酵液制备
（1）制备LB液体培养基：同实施例2。
（2）活化菌株：挑取一环贝莱斯芽孢杆菌HM-6的菌落，接种在装有50mL LB液体培养基的150mL三角瓶中，160rpm、37℃恒温振荡培养24h进行活化。
（3）种子液的制备：取活化后的菌液4mL接种于装有200mL LB液体培养基的1000mL三角瓶中，160rpm、37℃恒温振荡培养24h，得到种子液。
（4）发酵液的制备：取制备好的种子液180mL接种于装有3.5L的LB液体培养基的6L小发酵罐中，160rpm、37℃恒温振荡培养48h，制得贝莱斯芽孢杆菌HM-6发酵液，有效活菌数为3.51×109cfu/mL。
实施例4贝莱斯芽孢杆菌HM-6对甘薯茎线虫幼虫致死率测定
菌株HM-6对甘薯茎线虫幼虫致死率测定试验：将菌株HM-6制备成有效活菌数为106cfu/ml的菌悬液；取出提前制备的含量为1000条/mL的甘薯茎线虫二龄幼虫（J2）悬浮液，然后将0.5mL的菌悬液和0.1mL J2悬浮液混匀于24孔板中，放置于28℃恒温培养箱中，24h后统计J2死亡条数（如图4），计算幼虫死亡率。
J2死亡率（%）＝（Ca－Ta）÷Ca×100。其中，Ca代表对照中未死亡的线虫数量，Ta代表处理中未死亡的线虫数量，试验重复5次，取平均值，结果如表2所示。
线虫校正死亡率%=（处理线虫死亡率－对照线虫死亡率）/（1－对照线虫死亡率）×100。
表2 HM-6菌悬液对甘薯茎线虫幼虫致死率测定结果
。
实施例5球孢白僵菌对甘薯茎线虫幼虫致死率测定
用PDA培养基从市购的球孢白僵菌菌剂（济宁市夏农生物科技有限公司，水溶性球孢白僵菌，有效活菌数100亿/g）中分离、纯化球孢白僵菌，取纯化后的球孢白僵菌菌株在PDA培养基上涂布，放置于28℃恒温培养箱中培养10d，待产孢充分后保存，备用。
在菌落边缘打取3个直径为5mm的菌饼，接种于装有50mL改良查氏液体培养基的250mL三角瓶内，25℃，160rpm摇床振荡培养7d。抽滤，去除菌丝体，滤液过0.22μm微孔滤膜，去除孢子。将清液置于4℃冰箱中保存，备用。
将200μL线虫悬液（内含甘薯茎线虫约200条）分别加入灭菌的贝氏小皿中，滴加200μL菌株发酵液无菌清液，混匀。以灭菌后的改良查氏液体培养基为对照，放置于28℃恒温培养箱中培养，24h后统计幼虫死亡条数（如图6），计算线虫校正死亡率（计算方法同上）。试验重复5次，取平均值，结果见表3。
表3 球孢白僵菌无菌清液对甘薯茎线虫幼虫致死率测定结果
。
发酵培养基为改良查氏液体培养基：(NH4)2SO43.67g、K2HPO40.64g、MgSO4·7H2O1.04g、KCl 0.96g、FeSO40.02g、蔗糖28.3g、蒸馏水1000mL，pH为7.2。
实施例6 颗粒型复合杀线虫微生物菌剂1的制备
步骤1、贝莱斯芽孢杆菌HM-6粉剂型菌剂的制备。
其具体步骤为：先按照实施例3制备出贝莱斯芽孢杆菌HM-6发酵液（有效活菌数为3.51×109cfu/mL）；再将发酵液与硅藻土按10∶1质量比混合均匀，经冷冻干燥机喷雾得到贝莱斯芽孢杆菌HM-6粉剂，经检测有效活菌数为3.32×1010cfu/g。
步骤2、颗粒型杀线虫微生物菌剂1的制备。
（1）材料：
粘结剂：焦糖色，购自潍坊恒泰食品有限公司，使用时用重量比1∶1温水溶解；
颗粒型有机肥料：购自沈阳红梅味精厂，有机质50.0%，N+P+K=9.2%；
防结块剂：购自石家庄贝尔诺农业科技有限公司。
（2）制备方法采用涂布法
取步骤1制备的贝莱斯芽孢杆菌HM-6粉剂10g与1kg颗粒型有机肥料混合，搅拌5分钟，加入焦糖色5g搅拌5分钟，再加入防结块剂10g，搅拌5~8分钟，配制的产品颗粒不粘结，手握不成团，外观黑亮，无粉末，即获得仅含有贝莱斯芽孢杆菌的颗粒型复合杀线虫微生物菌剂1，检测有效活菌数为3.22×108cfu/g。
实施例7 颗粒型复合微生物菌剂2的制备
按照实施例6步骤2的制备方法，取球孢白僵菌粉剂34g与颗粒型有机肥料1kg混合，采用涂布法制成含有孢白僵菌的颗粒型复合杀线虫微生物菌剂2，检测有效活菌数3.26×108cfu/g。
实施例8 颗粒型复合微生物菌剂3的制备
按照实施例6步骤2的制备方法，取贝莱斯芽孢杆菌菌剂7.8g与球孢白僵菌粉剂7.8g（质量比为1∶1）复配后与颗粒型有机肥料1kg混合，采用涂布法制成含有贝莱斯芽孢杆菌、球孢白僵菌的颗粒型复合杀线虫微生物菌剂3，检测有效活菌数为3.23×108cfu/g。
实施例9 颗粒型复合微生物菌剂4的制备
按照实施例6步骤2的制备方法，取贝莱斯芽孢杆菌菌剂6.4g与球孢白僵菌粉剂12.8g（质量比为1∶2）复配后与颗粒型有机肥料1kg混合，采用涂布法制成含有贝莱斯芽孢杆菌、球孢白僵菌的颗粒型复合杀线虫微生物菌剂4，检测有效活菌数为3.28×108cfu/g。
实施例10 颗粒型复合微生物菌剂5的制备
按照实施例6步骤2的制备方法，取贝莱斯芽孢杆菌菌剂8.8g与球孢白僵菌粉剂4.4g（质量比为2∶1）复配后与颗粒型有机肥料1kg混合，采用涂布法制成含有贝莱斯芽孢杆菌、球孢白僵菌的颗粒型复合杀线虫微生物菌剂5，检测有效活菌数为3.25×108cfu/g。
实施例11 颗粒型复合微生物菌剂对甘薯线虫病害防控作用试验
试验品种：红瑶。
试验时间：2023年5月5日～2023年10月10日。
所有试验数据的调查统计工作在2023年10月10日前结束。
试验地点：河北省卢龙县卢龙镇连续种植甘薯6年的地块。
试验设计：试验设6个处理，处理1～处理5分别对应实施例6～10颗粒型复合微生物菌剂1~5，每个处理30m2，行距0.6m，株距20cm，每个处理3次重复。在甘薯秧定植前穴施，穴深10cm，每株施颗粒型复合微生物菌剂6g，每亩30kg。处理6为对照（CK），不施用任何菌剂的处理。
施用后的管理：后续的栽培管理方法：按施用作物的常规栽培管理方式进行管理即可，但不可在根部施用杀细菌剂和杀真菌剂等药物。
甘薯茎线虫病调查方法：2023年10月9日收获，采用5点取样法，每个处理选取5点，每个点调查10株。统计甘薯产量和茎线虫的发病情况。按照茎线虫病分级标准，记录发病块数和级别，与对照CK比较，计算病情指数和防治效果，见表4。
甘薯茎线虫病发病薯块分级标准为：0级：薯块无病斑。1级：薯块病区占全薯块1/4以下。2级：薯块病区占全薯块1/4～1/2。3级：薯块病区占全薯块1/2～3/4。4级：薯块病区占全薯块3/4以上。
计算方法：
发病率（%）＝∑（发病块数）/调查总块数×100。
病情指数（%）＝∑（各病级块数×各级代表值）/（调查总块数×最高级代表值）×100。
防治效果（%）＝（对照区病指－防治区病指）/对照区病指×100。
增产率（%）＝（防治区产量－对照区产量）/对照区产量×100。
表4 供试菌剂对甘薯茎线虫病防治效果和促生作用调查统计结果
。
由表4可见，处理4和处理5发病率和病情指数低于其他四组，且有显著性差异，但处理5防治效果和亩产量优于处理4，并有显著性差异，处理5比对照处理6增产63.1%，比处理4增产12.5%，说明处理5对甘薯茎线虫病有良好的防治效果外，还对甘薯的生产具有一定的增产作用。2种菌剂复配后制备的颗粒型复合杀线虫微生物菌剂，协同防治效果及增产作用均显著高于单一菌剂，处理5的配方效果最好。
Claims (9)
1.一种复合微生物菌剂，其特征在于，其包括贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HM-6和球孢白僵菌（Beauveria bassiana）；所述贝莱斯芽孢杆菌HM-6的保藏编号为CGMCCNo.28606。
2.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，其总活菌数不小于3×108 cfu/g。
3.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌HM-6和球孢白僵菌的菌数之比为0.5~7∶1。
4.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，其还包括颗粒型有机肥、焦糖色以及防结块剂。
5.一种如权利要求1~4任一项所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
（1）制备贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌粉；
（2）将贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌粉、球孢白僵菌菌粉、颗粒型有机肥、焦糖色以及防结块剂混合均匀。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌粉通过如下方法制备：
（a）活化菌株；
（b）制备种子液；
（c）制备发酵液；
（d）将发酵液与硅藻土按5～15∶1质量比混合均匀，经冷冻干燥机喷雾得到贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌粉。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌粉的有效活菌数不小于3×1010cfu/g；所述球孢白僵菌菌粉的孢子数不小于1×1010cfu/g。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）为：将贝莱斯芽孢杆菌HM-6菌粉和球孢白僵菌菌粉与颗粒型有机肥料混合，搅拌5分钟，加入焦糖色搅拌5分钟，再加入防结块剂，搅拌5~8分钟，配制的产品颗粒不粘结，手握不成团，外观黑亮，无粉末，即得。
9.一种如权利要求1~4任一项所述的复合微生物菌剂在防治甘薯线虫病害中的应用。
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